Abstract

Η πρόγνωση του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών είναι κακή εν μέρει λόγω της υψηλής συχνότητας του χημειοαντίσταση. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η Toll-όπως υποδοχέα-4 (TLR4), και ιδίως πρωτεΐνη προσαρμογέα MyD88 του, ως ένα δυναμικό μεσολαβητής αυτής της αντίστασης. Η μελέτη αυτή έχει ως στόχο να παρέχει περαιτέρω αποδείξεις ότι MyD88 θετικά καρκινικά κύτταρα είναι κλινικά σημαντική, στέλεχος-όπως και επαναλήψιμα ανιχνεύσιμη για τους σκοπούς των προγνωστικών διαστρωμάτωσης. Έκφραση των TLR4 και MyD88 αξιολογήθηκε ανοσοϊστοχημικά σε 198 ιστούς παραφίνη-ενσωματωμένες ωοθηκών και σε ένα εμβρυϊκό μοντέλο καρκινώματος των βλαστική ικανότητα καρκίνου. Παράλληλα, η έκφραση του TLR4 και MyD88 mRNA και ρυθμιστικές microRNAs (MIR-21 και miR-146a) αξιολογήθηκε, καθώς και σε μια σειρά από χημειοευαίσθητων και ανθεκτικών κυττάρων σειρές καρκίνου. Λειτουργική ανάλυση της οδού αξιολογήθηκε σε χημειοθεραπεία SKOV-3 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. έκφραση TLR4 και MyD88 μπορούν να αξιολογηθούν μέσω αναπαραγώγιμα ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ημι-ποσοτική βαθμολόγηση. έκφραση TLR4 ήταν παρούσα σε όλα τα ωοθηκών επιθήλιο (φυσιολογικών και νεοπλασματικών), ενώ MyD88 περιορίστηκε σε νεοπλασματικά κύτταρα, ανεξάρτητα από βαθμό του όγκου και σχετίζεται με μειωμένη χωρίς εξέλιξη και τη συνολική επιβίωση, σε μια ανοσοϊστολογικές συγκεκριμένο υποσύνολο ορώδες καρκίνωμα, ρ D, τα επίπεδα τόσο miR-21 & amp? miR-146a up-ρυθμίζονται σε MyD88 αρνητική EOC (p & lt? 0,05).

Η

TLR4 και έκφραση MyD88 σε μια ομάδα των διασωστών και δεν ανταποκρίθηκαν

MyD88 mRNA ρυθμίζεται αυξητικά 4,9 φορές σε μία ομάδα από μη-ανταποκρινόμενοι σε σύγκριση με ανταποκρίθηκαν (ρ & lt? 0,05). Ομοίως, TLR4 mRNA ρυθμίζεται αυξητικά 3,4 φορές σε αυτή την ομάδα (ρ & lt? 0,05). Όλοι οι ασθενείς που αναλύθηκαν εδώ είχε προχωρήσει ορώδες θηλώδη αδενοκαρκινώματα και έλαβαν καρβοπλατίνη και πακλιταξέλη ως πρώτη χημειοθεραπεία γραμμή που ακολουθεί η βέλτιστη χειρουργική επέμβαση debulking.

Η

παρατηρήθηκαν

Gene και την έκφραση των miRNAs σε κυτταρικές σειρές Σημαντικές αλλαγές στην έκφραση TLR4 mRNA μεταξύ χημειοευαίσθητων και χημειοθεραπεία κύτταρα, αν και ο βαθμός της αλλαγής ήταν μεταβλητή (Σχήμα 8Α). A2780cis κύτταρα παρουσίασαν 24,1 φορές αύξηση στην TLR4 σε σύγκριση με Α2780. Αντίθετα υπήρξε μια μείωση 18,8 φορές σε TLR4 στα χημειοθεραπεία κύτταρα IGROV-1CDDP σε σχέση με IGROV-1. ΚΒ-8-5-11 κύτταρα έδειξαν τη μικρότερη αλλαγή από τη μητρική γραμμή τους με μόνο μια διπλάσια αύξηση 1,6 σε TLR4.

Τα δεδομένα εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε έκφραση σε σχέση με το Α2780 καρκινικά κύτταρα (με τυπική απόκλιση) .

η

η αυξημένη έκφραση MyD88 mRNA παρατηρήθηκε σε όλους τους στη χημειοθεραπεία του καρκίνου κυτταρικές σειρές? αυτές οι αλλαγές ήταν μικρή αλλά στατιστικά σημαντική (Σχήμα 8Β). Υπήρξε μια αύξηση 2,6 φορές σε MyD88 σε A2780cis κύτταρα συγκριτικά με κύτταρα Α2780 MyD88-αρνητικό. κύτταρα IGROV-1CDDP έδειξε μια 1.6 φορές αύξηση στην MyD88 σε σχέση με τα κύτταρα χημειοευαίσθητων IGROV-1. Παρόμοια με τα δεδομένα TLR4, η αλλαγή στην έκφραση MyD88 σε ΚΒ-8-5-11 κύτταρα από την νόσο ευαίσθητη ΚΒ-3-1 γονική σειρά ήταν το μικρότερο με μόνο μια διπλάσια αύξηση 1,4 σε MyD88.

αλλαγές μεταβλητών στα επίπεδα του miR-21 παρατηρήθηκαν μεταξύ χημειοευαίσθητων και στη χημειοθεραπεία κύτταρα (Σχήμα 9Α). A2780cis κύτταρα έδειξαν μία 1,5 φορές μείωση στην miR-21 σε σύγκριση με το Α2780, ωστόσο αυτή η αλλαγή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0,5958). Μια αύξηση κατά 2 φορές στην miR-21 ανιχνεύθηκε στα κύτταρα στη χημειοθεραπεία IGROV-1CDDP σχέση με IGROV-1. ΚΒ-8-5-11 κύτταρα έδειξαν μία 2,9 φορές μείωση στην miR-21 σε σύγκριση με τις μητρικές τους (χημειοευαίσθητων) γραμμή.

Τα δεδομένα εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε έκφραση σε σχέση με το Α2780 καρκινικά κύτταρα (με τυπική απόκλιση ).

Η

Παρόμοια με miR-21, οι αλλαγές στα επίπεδα miR-146a μεταξύ χημειοευαίσθητων και στη χημειοθεραπεία καρκινικών κυττάρων ήταν μεταβλητή (Σχήμα 9Β). Υπήρξε μια 6.5 φορές αύξηση στην miR-146a σε A2780cis κύτταρα συγκριτικά με κύτταρα Α2780 MyD88-αρνητικό. κύτταρα IGROV-1CDDP έδειξε 1,2 φορές αύξηση σε MyD88 σε σχέση με τα κύτταρα χημειοευαίσθητων IGROV-1, ωστόσο αυτή η αλλαγή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0,4557). Ένα 2,5 φορές μείωση miR-146a ανιχνεύθηκε σε ΚΒ-8-5-11 κυττάρων σε σύγκριση με νόσο ευαίσθητη (ΚΒ-3-1) μητρική γραμμή τους.

Μειωμένα αποτελέσματα έκφρασης TLR4 σε αυξημένη χημειοευαισθησία των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

για να αξιολογηθεί ο ρόλος λειτουργικά του μονοπατιού /MyD88 TLR4 στην χημειοευαισθησία των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, η χημειοθεραπεία του καρκίνου κυτταρική γραμμή ωοθηκών SKOV-3 διαμολύνθηκε με siRNA που στοχεύουν ειδικά MyD88 ή TLR4. Μετά από 72 ώρες MyD88 ήταν σημαντική μείωση τόσο στο mRNA (Σχήμα 10Α) και στο επίπεδο πρωτεΐνης (Σχήμα 10Β) στα κύτταρα επιμολυσμένα με siMyD88. Ωστόσο, η απώλεια της έκφρασης MyD88 δεν είχε καμία επίδραση στην χημειοευαισθησία των κυττάρων (Εικόνα 10C). Σημαντικές μειώσεις στην έκφραση του TLR4 στο mRNA (Σχήμα 10Α) και στο επίπεδο πρωτεΐνης (Εικόνα 10Β) παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ωστόσο, το μειωμένο επίπεδο έκφρασης TLR4 επηρέασε σημαντικά την απόκριση του SKOV-3 προς πακλιταξέλη (Σχήμα 10C). Υπήρξε μια μείωση 27,1% της βιωσιμότητας των κυττάρων σε siTLR4 επιμολυσμένα κύτταρα κατεργασμένα paclitaxel σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα έλαβαν πακλιταξέλη και μείωση 19,6% σε σύγκριση με siNeg επιμολυσμένων κυττάρων. Έτσι, η φίμωση του TLR4 δημιουργείται ένα πιο χημειοευαίσθητων φαινότυπο στα SKOV-3 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

SKOV-3 κύτταρα αφέθηκαν μη επιμολυσμένα (Unt), επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο siRNA (siNeg), MyD88 στόχευσης siRNA ( siMyD88) ή TLR4 στόχευση siRNA (siTLR4). Τα επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες πριν την συγκομιδή είτε για mRNA ανάλυση (Α), για την ανάλυση πρωτεϊνών (Β) ή θεραπεία με πακλιταξέλη (C). (Α) MyD88 και τα επίπεδα έκφρασης του mRNA TLR4 αξιολογήθηκαν με TaqMan RT-PCR. MyD88 και έκφραση TLR4 mRNA ομαλοποιήθηκε με εκείνη ενός ενδογενούς ελέγχου, Β2Μ, και βαθμονομημένη με εκείνη των μη επεξεργασμένων κυττάρων να καθοριστεί το σχετικό ποσοστό της έκφρασης mRNA (η = 3, μέσος όρος + SD). (Β) MyD88 και τα επίπεδα έκφρασης του mRNA TLR4 αξιολογήθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) Τα επιμολυσμένα κύτταρα είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO (έλεγχος οχήματος) ή 3,5 ηΜ paclitaxel (IC25). 48 ώρες μετά την αγωγή, η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε μέσω του προσδιορισμού CCK-8. ποσοστό βιωσιμότητας% των κυττάρων υπολογίστηκε με σύγκριση των τιμών απορρόφησης για τον έλεγχο του οχήματος με τα αντίστοιχα δείγματα αγωγή paclitaxel. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή + SD, η = 3? * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01 (un-paired t-test του Student)

Η

καρκινικών κυττάρων Εμβρυονικά δείχνουν μειωμένη έκφραση MyD88 ακόλουθη διαφοροποίηση

Τα δεδομένα από μια μεγάλης κλίμακας. πείραμα μικροσυστοιχιών (Μ Gallagher, αδημοσίευτα δεδομένα) που αφορούν εμβρυϊκό καρκίνο καρκίνωμα βλαστικών κυττάρων (NTera2 και 2102Ep) ανακρίθηκε για διαφορική έκφραση του γονιδίου TLR4 σηματοδότησης, η οποία έδειξε ότι η έκφραση MyD88 ήταν υψηλή σε αδιαφοροποίητα κύτταρα NTera2 και μειώθηκε γρήγορα κατά τη διαφοροποίηση σε ρετινοϊκό οξύ ( RA). Για την επικύρωση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών, αδιαφοροποίητα και διαφοροποιημένα NTera2 και τα δείγματα 2102Ep αξιολογήθηκαν για γονιδιακή MyD88 και την έκφραση της πρωτεΐνης. Όπως TLR4 είχε υποτεθεί να ρυθμίσει MyD88 σε αυτά τα κύτταρα, η έκφραση του TLR4 αξιολογήθηκε επίσης παρά συστατική έκφραση στις μελέτες συστοιχία. Κάτω ρύθμιση του MyD88 κατά τη διαφοροποίηση των πολυδύναμων κυττάρων NTera2 επιβεβαιώθηκε σε πολλαπλές χρονικές πορείες (Εικόνα 11Α). TLR4 ήταν εκφράζουν συντακτικά, την επικύρωση των στοιχείων του πίνακα. Αντιθέτως, η έκφραση του TLR4 και MyD88 ήταν αναλλοίωτος σε nullipotent κύτταρα 2102Ep σε επεξεργασία με RA (Σχήμα 11Α). Οι μεταβολές αυτές αντικατοπτρίζονται στο επίπεδο πρωτεΐνης (Εικόνα 11Β, C). έκφραση της πρωτεΐνης MyD88 ήταν σημαντικά μειωμένη μετά τη διαφοροποίηση των κυττάρων NTera2 (MyD88-), ενώ καμία σημαντική αλλαγή δεν παρατηρήθηκε σε TLR4 χρώση (Σχήμα 11Β). Σε αντίθεση τα κύτταρα 2102Ep, τόσο αδιαφοροποίητο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ρετινοϊκό οξύ, ήταν TLR4 +, MyD88 + (Σχήμα 11C). Σε όρους που σχετίζονται microRNA μετατροπές, η ομάδα μας έχει προηγουμένως καταδείξει ότι, ενώ miR-21 είναι αμετάβλητα σε κάθε κυτταρική σειρά σε ανταπόκριση προς RA, miR-146a ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των κυττάρων NTera2 αλλά αμετάβλητη στα κύτταρα 2102Ep [29]. Αυτό υποδηλώνει ότι, παρόμοια με EOC, miR-146a είναι αντιστρόφως συνδέεται με MyD88 σε διαφοροποιημένα εμβρυονικά καρκίνο καρκινώματος βλαστοκύτταρα

Α, qPCR δεδομένα:. MyD88 έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά NTera2 διαφοροποίηση, με ελάχιστες αλλαγές σε TLR4 ? σε αντίθεση με τα κύτταρα 2102Ep αποφύγει τη διαφοροποίηση και τη διατήρηση τόσο TLR4 & amp? έκφραση MyD88 (πάσο αλλαγές που παρουσιάζονται είναι ανάλογη με εσωτερικό γονίδιο ελέγχου GAPDH και υπολογίζεται με το 2

-ΔΔCt μέθοδος). Β, TLR4 και MyD88 έκφραση της πρωτεΐνης στα κύτταρα NTera2: χρώση TLR4 ήταν αμετάβλητη μετά τη διαφοροποίηση (αριστερό πάνελ)? χρώση MyD88 σε αδιαφοροποίητα κύτταρα NTera2 παρουσίασαν σημαντικά μειωμένη χρώση μετά τη διαφοροποίηση (δεξιά πλευρά) (όλο το 40x). C, TLR4 και έκφραση MyD88 στα κύτταρα 2102Ep: ελάχιστες αλλαγές σε TLR4 (αριστερό πάνελ) ή MyD88 (δεξιά πλευρά) παρατηρήθηκαν μετά από RA-θεραπεία (όλα σε 40x)

Η

Συζήτηση

Ο χαρακτηρισμός εδώ του TLR4 και έκφραση MyD88 σε επιθηλιακά νεοπλασία ωοθηκών έχει δείξει ότι, ενώ TLR4 έκφραση κάποιου βαθμού είναι πανταχού παρούσα σε όλους τους τύπους των ωοθηκών επιθηλίου, συμπεριλαμβανομένων των μη-δυσπλαστικά επιθήλιο, MyD88 εκφράζεται μόνο σε νεοπλασματικό ιστό. Ένας τέτοιος περιορισμός της MyD88 με νεοπλασματικές ωοθηκικού ιστού επιβεβαιώνει παρόμοια ευρήματα αναφέρθηκαν πρόσφατα στην βιβλιογραφία [24]. Ωστόσο, σε αυτή τη μελέτη, TLR4 /MyD88 συν-έκφραση έδειξε μια προτίμηση για ορώδες νεοπλάσματα σε γενικές γραμμές, ιδιαίτερα διαχωριστική γραμμή και κακοήθεις όγκους ορώδης, και εκφράστηκε σε τόσο υψηλής και χαμηλής ποιότητας ορώδες καρκίνωμα. Σε αντίθεση TLR4 απουσία MyD88 συσχετίστηκε με μη κακοήθη ιστό, μη ορώδες καλοήθεις και οριακά όγκους, μια υποομάδα ορώδους καρκινώματα και μη ορώδες καρκίνωμα (MyD88 αρνητικός EOC). Καθώς η έκφραση TLR4 ήταν παρούσα σε όλους τους τύπους των ωοθηκών επιθήλιο, φαίνεται ότι TLR4 σηματοδότηση συνδέεται είτε κακοήθεις όγκους ορώδες ή μη ορώδες όγκους ανάλογη του ότι είναι εξαρτώμενη από MyD88 ή ανεξάρτητη από.

Chen et al. [21] αρχικά η υπόθεση ότι η αναλογία του MyD88 κυττάρων θετικών και αρνητικών EOC μπορεί να καθορίσει τα χαρακτηριστικά του όγκου από την άποψη της εξέλιξης, χημειοαντίσταση και επανάληψης. Αυτό είναι απολύτως σύμφωνη με τα αποτελέσματά μας που απεικονίζει την κατανομή της έκφρασης MyD88 στην ωοθηκική νεοπλασία και οι ενώσεις με survivial ασθενή. MyD88 θετική καρκίνοι που αναλύονται στην παρούσα μελέτη υποτροπιάσει 18 μήνες νωρίτερα από ό, τι MyD88 αρνητική καρκίνους, με μια παρόμοια μείωση στη συνολική επιβίωση 19 μήνες (p & lt? 0,05). Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης είναι ακριβή αντιστοιχία με τις πρόσφατες εκθέσεις δείχνουν μειώσεις στα διαστήματα ελεύθερη νόσου και την επιβίωση των ασθενών με MyD88 θετική καρκίνους, που κυμαίνονται 11 έως 35 μειώσεων μήνα στην επιβίωση χωρίς εξέλιξη [20], [24], [27] [28], και 26-36 μειώσεις μήνες στη συνολική επιβίωση [24], [27]. Η πολύ μεγάλη διαφορά στην επιβίωση που παρατηρήθηκε στη σειρά των δοκιμών σε σχέση με την έκφραση MyD88 είναι πιθανό να οφείλεται στο μικρό μέγεθος του δείγματος στην ομάδα αυτή, καθώς είναι αισθητά ασύμφωνα με όλες τις προηγούμενες μελέτες και με την σειρά επικύρωσης εξετάζονται εδώ.

Επιπλέον, οι αλλαγές που παρατηρήθηκαν στην έκφραση MyD88 σε εμβρυϊκό καρκίνωμα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (EC), μία από τις καλύτερα χαρακτηρισμένες μοντέλα CSC σε χρήση σήμερα [30] – [32], υποδηλώνουν επίσης ότι MyD88 θετικά καρκινικά κύτταρα είναι πιο βιολογικώς επιθετικοί από MyD88 αρνητική κύτταρα. Αδιαφοροποίητα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν πληθυσμών από κακοήθειες είναι συχνά αρκετή για να αναγεννηθούν αποτελεσματικά όγκους. κύτταρα NTera2 ΕΚ διαφοροποιούνται

in vivo

να σχηματίσουν τερατοκαρκινώματα, τρεις όγκους μικρόβιο στρώμα που μπορεί να προκύψουν κατά την ωοθήκη [33]. NTera2 κύτταρα είναι εξαιρετικά όγκων στην αδιαφοροποίητη κατάσταση, μια ιδιότητα που μειώνεται σημαντικά ή εξαλείφεται κατά τη διαφοροποίηση [32], [33]. Σε αντίθεση, τα κύτταρα 2102Ep ΕΚ μπορεί να αποφευχθεί η διαφοροποίηση

in vivo

να παράγουν πολύ επιθετική καθαρό εμβρύου καρκινώματα [31]. Έχουμε δείξει ότι ενώ TLR4 εκφράζεται συστατικά στα κύτταρα ΕΚ, η απώλεια της έκφρασης MyD88 συνδέεται με ένα «διακόπτη διαφοροποίησης»: μετάβαση των κυττάρων NTera2 ΕΚ από πολύ-ογκογόνο (αδιαφοροποίητα) σε λιγότερο-ογκογόνο (διαφοροποιημένη) τα κράτη τους. Αυτή η αλλαγή στην έκφραση κατά την διαφοροποίηση είναι λεπτή, αλλά πολύ επαναλήψιμη, και αποδεικνύει ότι

ex vivo

χειραγώγηση των ωοθηκών διαφοροποίηση CSC μπορεί να μειώσει την έκφραση MyD88. Πιστεύουμε ότι υποστηρίζει την υπόθεση ότι ΕΓΚ MyD88 θετικά κύτταρα μπορεί να είναι στέλεχος-όπως λόγω πρότυπο έκφρασης MyD88 τους [12], [21] και επίσης δείχνει μια πρακτική και εύκολα χειραγωγείται μοντέλο στέλεχος του καρκίνου που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον καρκίνο των ωοθηκών.

έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι miR-21 ρυθμίζει TLR4 στοχεύοντας το ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνη PDCD4 [19], ενώ miR-146a είναι NF-κΒ-εξαρτώμενο [34] και τους στόχους και μειώνει την έκφραση του IRAK-1, IRAK -2 και TRAF-6, τα οποία αποτελούν βασικά συστατικά MyD88 οδού [18], [35]. Τελικά miR-21 και miR-146a συμμετέχουν από κοινού στη ρύθμιση της έκφρασης TLR4 /MyD88, που χρησιμεύει ως αρνητικοί ρυθμιστές της MyD88 που εξαρτώνται σηματοδότησης TLR4. Η νέα ανάλυση της έκφρασης miR-21 και miR-146a σε αυτή τη μελέτη, με βάση την κατηγοριοποίηση των EOC σε MyD88 θετικές και αρνητικές MyD88, αποδεικνύει ότι η έκφραση και των δύο MyD88 και αυτών των microRNAs συνδέονται με τον καρκίνο των ωοθηκών. Λεπτές αλλά σημαντικές αλλαγές στην έκφραση MyD88 mRNA παρατηρήθηκαν μεταξύ χημειοευαίσθητων και στη χημειοθεραπεία των ωοθηκών και του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα.