Αφηρημένο

Περίπου το 50% των ασθενών με πρωτοπαθή καρκίνο του παχέος αναπτύξει μεταστάσεις στο ήπαρ. Η κατανόηση των γενετικών διαφορών μεταξύ πρωτοπαθή καρκίνο του παχέος εντέρου και των μεταστάσεων τους στο ήπαρ είναι απαραίτητη για την επινόηση μιας καλύτερης θεραπευτική προσέγγιση για τη νόσο αυτή. Πραγματοποιήσαμε αλληλούχιση exome και αντίγραφο ανάλυση ακέραιο αριθμό για 15 τρίδυμα, καθένα περιλαμβάνει φυσιολογικό ορθοκολικό ιστό, πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνωμα, και της ταυτόχρονης του ταιριάζει μετάσταση στο ήπαρ. Αναλύσαμε τις ομοιότητες και τις διαφορές μεταξύ των πρωτογενών καρκίνωμα του παχέος εντέρου και συμφωνημένα ηπατικές μεταστάσεις σε σχέση με σωματικές μεταλλάξεις και τον αριθμό σωματικών αντίγραφο alterationss. Η γονιδιωματική προφίλ κατέδειξε μεταλλάξεις σε APC (73%), KRAS (33%), ARID1A και PIK3CA (6,7%) γονιδίων μεταξύ πρωτογενών ορθοκολικών και μεταστατικών όγκων του ήπατος.

TP53

παρατηρήθηκε μετάλλαξη στο 47% των πρωτογενών δειγμάτων και 67% στο ήπαρ μεταστατικό δείγματα. Τα ομαδοποιημένα ζεύγη, σε ιεραρχική συσταδοποίηση παρουσίασαν παρόμοιες σωματικών μοτίβα αλλοίωση αριθμό αντιγράφων, σε αντίθεση με τα ομαδοποίηση ζεύγη. Πολλές μεταλλάξεις (συμπεριλαμβανομένων εκείνων των γνωστών βασικών γονιδίων οδηγός καρκίνο) μοιράστηκαν στα ομαδοποιημένα ζεύγη. Οι ομαδοποίηση ζεύγη παρουσίασαν διαφορετικά πρότυπα μετάλλαξης χωρίς κοινόχρηστα μεταλλάξεις σε γονίδια-κλειδιά του οδηγού. Τέσσερα δείγματα ομαδοποίηση μετάσταση στο ήπαρ είχε μεταλλάξεις στα γονίδια επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων του DNA μαζί με hypermutations και σημαντικό αριθμό αριθμού αντιγράφων αλλοιώσεις. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι περίπου το ήμισυ του μεταστατικού ορθοκολικού καρκινώματος είχε την ίδια κλωνική προέλευση με πρωτοπαθή καρκινώματα του εντέρου τους, ενώ υπόλοιπες περιπτώσεις ήταν γενετικά διακριτές από την πρωτογενή καρκινώματα τους. Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν την ανάγκη να αξιολογηθεί μεταστατικών βλαβών ξεχωριστά για βελτιστοποιημένη θεραπεία, αντί να γίνει παρέκταση εκ των δεδομένων πρωτοπαθούς όγκου

Παράθεση:. Lee SY, Χακ F, Kim D, Jun C, Jo HJ, Ahn SM, et al. (2014) Συγκριτική Γονιδιωματική ανάλυση της Πρωτοβάθμιας και σύγχρονη μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνου. PLoS ONE 9 (3): e90459. doi: 10.1371 /journal.pone.0090459

Επιμέλεια: Harriet Wikman, Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Αμβούργου-Eppendorf, Γερμανία

Ελήφθη: 30, Σεπτεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 30, Ιανουαρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Μαρτίου, 2014

Copyright: © 2014 Lee et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από τη βασική επιστήμη ερευνητικό πρόγραμμα μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Επιστημών, των ΤΠΕ & amp? Μελλοντικό σχεδιασμό (Νο 2012R1A1A1013369). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η αναδυόμενη έννοια της πολύκλωνης αποκτά μεγαλύτερη σημασία στη βιολογία του καρκίνου [1]. Το μονοκλωνικό εξέλιξη ενός όγκου από ένα και μόνο των καρκινικών κυττάρων έχει μελετηθεί εκτενώς, και γενικά θεωρείται να εμπλέξει την επιλεκτική κλωνική επέκταση της δεσπόζουσας κλώνων όγκου. Πιο πρόσφατα, η εναλλακτική έννοια πολυκλωνικών εξέλιξη έχει προκύψει. Το μοντέλο αυτό αποτελείται από δύο βασικές έννοιες: την αυτο-σπορά υπόθεση και το μοντέλο φαινότυπο μεταλλάκτη. Ο πρώην προτείνει ότι οι κλώνοι του όγκου εγκαταλείψουν την αρχική τοποθεσία, εισάγετε συστηματική κυκλοφορία μέσω των αγγείων του όγκου και αποικίζουν ένα μακρινό χώρο, δημιουργώντας έτσι ένα νέο υποπληθυσμό [2], [3]. Το μοντέλο φαινότυπο μεταλλάκτη προτείνει έναν μικρό αριθμό πολύ μεγάλες διαφορές κυτταρικών κλώνων όγκου (πολυκλωνικών) αντί ολίγων ανταγωνιστικών κλωνική υποπληθυσμών? Στην πραγματικότητα, αρκετές στερεό τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του παχέος εντέρου, έχουν προταθεί να είναι ιδιαίτερα πολυκλωνικά [4].

Ο προσδιορισμός της προέλευσης του καρκίνου είναι ζωτικής σημασίας για την κατανόηση των γενετικών γεγονότων που εμπλέκονται στην έναρξη και την εξέλιξη του όγκου [5] . Όπως και με πρωτογενείς καρκίνους, μεταστάσεις μπορούν επίσης να έχουν είτε ένα μονό ή πολύκλωνο προέλευσης [6], [7]. Σε γενικές γραμμές, οι μεταστάσεις φέρουν παρόμοιες μεταλλάξεις με εκείνες των πρωτογενών καρκίνων από τους οποίους προέρχονται, αλλά επιπλέον μεταλλάξεις συμβαίνουν μετά από μετασχηματισμό [6], [8]. Η συνεχής, και συχνά επιτάχυνση εμφάνισης μεταλλάξεων οδηγεί σε γενετική ετερογένεια μεταξύ πρωτογενών και μεταστατικών καρκίνων? αυτό αυξάνει κυρίως την αντίσταση στη θεραπεία από την τελευταία, η οποία είναι η κυρίαρχη αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται παγκοσμίως [6], [9].

ορθοκολικό καρκίνωμα (CRC) είναι η τρίτη πιο κοινή κακοήθεια και η δεύτερη κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σε πολλές χώρες [10], [11]. Σχεδόν το 50% των ασθενών με CRC αναπτύξουν ορθοκολικό μετάσταση στο ήπαρ (CLM) [12]. Χωρίς θεραπεία, οι ασθενείς με γενικώτερα έχουν μια μέση επιβίωση μόνο 5-10 μηνών, με λιγότερο από 0,5% επιβιώνουν πάνω από 5 έτη [13]. Αρκετές μελέτες έχουν ασχοληθεί με την κλωνική προέλευση και γενετική ετερογένεια του ΚΕΣ [14], [15]. Δεν σαφής συναίνεση έχει προκύψει από αυτό ως, αν και μία έκθεση κατέληξε στο συμπέρασμα ότι οι όγκοι προέρχονται κυρίως από ένα μοναδικό κλώνο [15], τα αποτελέσματα άλλων μελετών πρότεινε ότι η πλειονότητα των όγκων έχουν ένα πολυκλωνικό προέλευσης [16], [17]. Πρόσφατα, ολόκληρο γονιδιώματος του συμφωνημένα πρωτογενούς και μεταστατικού μελανώματος των άκρων που αποκάλυψε επίσης σημαντική γενετική ετερογένεια μεταξύ των πρωτογενών και μεταστατικών όγκων, όπως αποδεικνύεται από

de novo

, μη συνώνυμες παραλλαγή μοναδικού νουκλεοτιδίου [18]. Παγκρέατος μεταστάσεις του καρκίνου έχουν επίσης την αλληλουχία για την αξιολόγηση των κλωνικών σχέσεις μεταξύ των πρωτογενών και μεταστατικών καρκίνων, που οδηγεί στην ταυτοποίηση κλωνικοί πληθυσμοί που οδήγησε σε μακρινές μεταστάσεις [19], [20]. Επομένως, είναι ζωτικής σημασίας να κατανοήσουμε διαφορετικές έννοιες που σχετίζονται με την προέλευση του καρκίνου και τη γενετική ετερογένεια μεταξύ ενός πρωτογενούς όγκου και απομακρυσμένες μεταστάσεις του για την ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπευτικών στρατηγικών [21], [22].

Για να εκτιμηθεί η πολύκλωνη και γενετική ετερογένεια στην CRC, αξιολογήσαμε τη γενετική και την κλωνική σχέση μεταξύ πρωτογενούς CRCs και να συνδυαστούν και γενικώτερα τους εκτελώντας στοχευμένες αλληλουχίας exome και υψηλή ανάλυση διακύμανσης αριθμό αντιγράφων (SCNA) ανάλυση των 15 τρίδυμα της κανονικής ορθοκολικού ιστού, πρωτογενή CRC, και συμφωνημένα CLM δείγματα. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν πολύτιμες πληροφορίες για την κλωνική σχέση και γενετικές διαφορές μεταξύ των πρωτογενών CRCs και συμφωνημένα και γενικώτερα τους, και, κατά συνέπεια, θα βοηθήσει στον καθορισμό πιθανών στόχων για συστηματικές θεραπείες.

Αποτελέσματα

Ασθενής περιγραφή ομάδα

Η διάμεση ηλικία των ασθενών στη μελέτη ήταν 61 (Πίνακας 1). Η ομάδα περιλαμβάνονται 1 στάδιο Τ2, 10 στάδιο Τ3 και Τ4 4 όγκους CRC, τα οποία είναι όλα πρωτογενούς δείγματα εκτομή. Έξι ασθενείς είχαν μόνο ηπατική μετάσταση, ενώ 9 ασθενείς είχαν δύο ή περισσότερες ηπατικές μεταστάσεις σε εκτομή. Κλινικές και ιστο-παθολογικές πληροφορίες για το σύνολο ομάδα που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη παρέχονται στον Πίνακα 1.

Η

SCNA ανάλυση

Πραγματοποιήσαμε ανάλυση SCNA στις 15 τρίδυμα της κανονικής ορθοκολικού ιστού, CRC , και τα δείγματα CLM. Χρησιμοποιώντας ζεύγη ανάλυση (δηλαδή, φυσιολογικό ορθοκολικό ιστό εναντίον CRC ή φυσιολογικό ορθοκολικό ιστό vs. CLM), εντοπίσαμε σωματικών SCNAs είτε στο CRC ή δειγμάτων CLM (Πίνακας 2 και Σχήμα S1). CRC και CLM ζεύγη από 11 ασθενείς έδειξαν παρόμοιο αριθμό SCNAs (Πίνακας 2)? Ωστόσο, τα υπόλοιπα 4 ζεύγη (# 250, # 262, # 526 και # 721) παρουσίασαν σημαντική αύξηση του συνολικού αριθμού των SCNAs στα δείγματα CLM, ειδικά εκείνες που περιλαμβάνουν ομόζυγη απώλεια αντίγραφο και απώλεια της ετεροζυγωτίας (ΑΕ) (Πίνακας 2).

η

Εμείς εκτελείται χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση των σωματικών SCNA δεδομένα από 15 ζεύγη δειγμάτων CRC και CLM, προκειμένου να αξιολογηθεί η γενετική ποικιλότητα μεταξύ των πρωτογενών και μεταστατικών CRCs. Χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση των δεδομένων SCNA έχει χρησιμοποιηθεί προηγουμένως για να καθορίσουν τις γενετικές σχέσεις μεταξύ των πρωτογενών και μεταστατικών καρκίνων [23]. Η παρούσα ανάλυση βασίζεται στην παραδοχή ότι οι γενετικά παρόμοια CRCs και συμφωνημένα και γενικώτερα τους θα πρέπει να συνδέεται στενά με ιεραρχική ομαδοποίηση. Πενήντα τρία τοις εκατό (8 από 15) των πρωτογενών CRCs ήταν στενά συνδεδεμένη με συμφωνημένα γενικώτερα τους, υποδεικνύοντας κλωνική και γενετική ομοιότητα σε αυτά τα ζεύγη CRC-CLM. Το υπόλοιπο 47% (7 από 15) των ζευγών CRC-CLM ήταν μόνο μακρινή συγγένεια, προτείνοντας συγκεκριμένες γενετικές σχέσεις μεταξύ αυτών των CRCs και συμφωνημένα και γενικώτερα τους (Σχήμα 1).

8 ζεύγη CRC-CLM (53 %), όπου κάθε ζεύγος έχει την αμεσότερη σχέση με την ιεραρχική δέντρο (Κόκκινο)? σε 7 CRC-CLM ζεύγη (47%), κάθε ζεύγος είναι μακρινά σχετίζεται, υποδεικνύοντας ότι η πρωταρχική CRCs και συμφωνημένα και γενικώτερα τους έχουν διακριτά γενετικά χαρακτηριστικά (μπλε). Οι σωματικές μεταλλάξεις σε γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο έχουν επίσης αναφερθεί.

Η

Από τη σημείωση. SCNA πρότυπα των 8 που συνδέονται στενά με ζεύγη ήταν παρόμοιες, ενώ εκείνες των 7 μακρινή συγγένεια ζεύγη CRC-CLM ήταν διαφορετικές (Εικόνα S2). Μπορούμε επίσης να υπολογίζεται και συγκρίνεται με τον μέσο αριθμό των κερδών ένα αντίγραφο, απώλειες ένα αντίγραφο, υψηλά κέρδη αντίγραφο, ομόζυγο απώλειες και LOH μεταξύ ομαδοποιούνται και ομαδοποίηση ζεύγη CRC-CLM (Σχήμα S3). Διεξοδική σύγκριση της ιεραρχικής ομαδοποίησης και γενετικές ομοιότητες περιγράφονται στην επόμενη ενότητα για τα αποτελέσματα.

exome αλληλουχίας

Πραγματοποιήσαμε ολόκληρη αλληλουχίας exome στις 15 τρίδυμα της κανονικής ορθοκολικού ιστού, δείγματα CRC, και CLM . Χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία μικροδορυφόρων PCR-based, επιβεβαιώσαμε ότι όλα τα 15 στοιχειώδη δείγματα CRC ήταν μικροδορυφόρων σταθερή. Μεταλλάξεις εντοπίστηκαν και φιλτράρονται σύμφωνα με βιοπληροφορική στο σπίτι μας ροή εργασίας (Σχήμα S4). Συνολικά, 1079 και 4366 μεταλλάξεις εντοπίστηκαν στα δείγματα CRC και CLM, αντίστοιχα (Πίνακας S1). Τα φάσματα μετάλλαξη που παρατηρείται στα δείγματα CRC και CLM ήταν συνεπή με προηγούμενες παρατηρήσεις σε συμπαγείς όγκους και δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των δειγμάτων CRC και CLM (Σχήμα S5) [24].

Η υπερμετάλλαξη και SCNA

Τέσσερα δείγματα CLM (# 250, # 262, # 525 και # 721) ήταν υπερμεταλλαχθούν (Πίνακας S2). Προκειμένου να προσδιορίσει την αιτία της υπερμεταλλάξεως, αξιολογήσαμε μεταλλάξεις στα γονίδια DNA πολυμεράσης (POLN, POLL, POLQ, Polh, πόλο, POLD1 και POLG) και τα γονίδια της οδού επιδιόρθωση του DNA αναντιστοιχία, συμπεριλαμβανομένων των

MLH1

,

MLH3

,

MSH2

,

MSH6

,

PMS2

,

PMS6

,

ERCC2

,

ERCC5

,

ERCC6

,

MUTYH

,

RAD9A

,

EXO1

,

SLX4

,

ATR

και

BLM

. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι μόνο οι τέσσερις υπερμεταλλαχθούν δείγματα CLM (# 250, # 262, # 526 και # 721) είχαν μία ή περισσότερες μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος στα γονίδια DNA πολυμεράσης και των γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA αναντιστοιχία (Πίνακας S3). Αυτές οι τέσσερις υπερμεταλλαχθούν δείγματα έδειξαν επίσης υψηλό βαθμό SCNAs σύγκριση με συμφωνημένα πρωτογενή CRCs τους (Πίνακας 2), και ήταν ιδιαίτερα αξιοσημείωτο ότι η υπερμετάλλαξη σχετίζεται σημαντικά με μια υψηλή συχνότητα LOH (

P

= 2.782 × 10

-9) (Σχήμα 2).

δείγματα με υπερμετάλλαξη περιέχουν επίσης υψηλής συχνότητας ΑΕ (P-value = 2.782e-09).

Η

σωματικά προφίλ μετάλλαξης και σημαντικά αλλαγμένη μονοπάτια

Βρήκαμε ότι 2.224 γονίδια είχαν τουλάχιστον 1 μη συνώνυμες, μάτισμα ή μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου στα CRCs ή γενικώτερα (Πίνακας S5). Αυτά τα δεδομένα στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση της κατάστασης μεταλλάξεων των μεγάλων οδών σηματοδότησης αλλοιώνονται με CRC (δηλαδή, αυτά που επικεντρώνονται στην Ρ53, Wnt, ΤΟΡ-β, και VEGF), με σύγκριση των συχνοτήτων με τις οποίες μεταλλάχθηκαν τα γονίδια που εμπλέκονται σε αυτές τις οδούς (Σχήμα 3). Αυτό αποκάλυψε ότι

APC

μεταλλάχθηκε σε 73% και των δύο δειγμάτων CRC και CLM,

TP53

στο 47% των δειγμάτων CRC και το 67% των δειγμάτων CLM, και

KRAS

σε 33% και των δύο δειγμάτων CRC και CLM.

Smad4

,

FAT4

, και

BRAF

επίσης μεταλλάχθηκαν στα δείγματα CRC και CLM με διαφορετικές συχνότητες. Στο μονοπάτι σηματοδότησης VEGF, βρήκαμε μεταλλάξεις στο

ΚΟΚ

(0% και 27%),

FLT1

(7% και 7%), και

FLT4

( 0% και 7%) γονίδια της CRCs και γενικώτερα, αντίστοιχα (Σχήμα 3). Μεταλλάξεις στα γονίδια μονοπάτι VEGF περιορίζονταν κυρίως στα δείγματα CLM, το πιο χαρακτηριστικό παράδειγμα της οποίας είναι η

ΚΟΚ

γονίδιο το οποίο μεταλλάσσεται μόνο στα υπερμεταλλαχθούν CLM δείγματα (Πίνακας 3).

Η

Αξιολογώντας γενετική σχέσεις βάσει των μεταλλάξεων και SCNA

για την αξιολόγηση της γενετικής σχέσεις μεταξύ των 15 ζευγών δειγμάτων CRC και CLM, αξιολογήσαμε εάν συμβεί οι ίδιες γονοτυπικές μεταβολές και μεταλλάξεις στα γονίδια μεγάλα οδηγού καρκίνο σε κάθε ζεύγος. Η αξιολόγηση αυτή βασίζεται στην υπόθεση ότι CRC και CLM ζεύγη με παρόμοιες γενετικές αλλαγές είναι πιθανό να μοιραστούν μεταλλάξεις στα μεγάλα γονίδια του οδηγού. Σε οκτώ περιπτώσεις, το ζεύγος CRC-CLM όντως μερίδιο μεταλλάξεις σε βασικούς CRC που σχετίζονται με γονίδια (

APC

,

KRAS

,

TP53

,

Smad4

,

BRAF

, και

FAT4

) (Πίνακας S4). Σε αυτά τα ζεύγη, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στον αριθμό των μεταλλάξεων μεταξύ των δειγμάτων CRC και CLM (

P

= 0,28) (Πίνακας 4). Αντίθετα, στις υπόλοιπες επτά περιπτώσεις, κανένα από τα ζεύγη CRC-CLM μοιράστηκε μια μετάλλαξη στο κλειδί CRC-συναφή γονίδια? Ωστόσο, ο συνολικός αριθμός των μεταλλάξεων διέφερε σημαντικά μεταξύ των δειγμάτων CRC και CLM (

P

& lt? 0,05) (Πίνακας 4 και Πίνακας S4)

Η

Είναι σημαντικό, η ανάλυση του συσχετισμού του. δεδομένων μετάλλαξη συμβιβαστεί με την ανάλυση των δεδομένων SCNA. Όλα τα ζεύγη CRC-CLM, οι οποίες συνδέονται στενά με την μη επιβλεπόμενη ιεραρχική ομαδοποίηση των δεδομένων SCNA, κοινόχρηστη μεταλλάξεις σε βασικούς CRC που σχετίζονται με γονίδια (53%). Ωστόσο, οι επτά ζεύγη CRC-CLM που μόνο εξ αποστάσεως που σχετίζονται με την ιεραρχική ομαδοποίηση των δεδομένων SCNA, δεν μοιράζονται μια μετάλλαξη σε βασικούς CRC που σχετίζονται με γονίδια (47%).

Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι σε 53% των περιπτώσεων, κάθε ζεύγος CRC-CLM είχαν παρόμοιες γενετικές αλλοιώσεις, ενώ αυτά στο υπόλοιπο 47% των περιπτώσεων είχαν διακριτές γενετικές αλλοιώσεις.

Συζήτηση

με τη σύγκριση της SCNA προφίλ των δεδομένων και η μετάλλαξη του 15 ζεύγη δειγμάτων CRC και CLM, διαπιστώσαμε ότι περίπου οι μισοί από αυτούς, έδειξε γενετική ετερογένεια σε σχέση με αντίστοιχη πρωτοταγή τους CRC. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη ολοκληρωμένη μελέτη για να χρησιμοποιήσετε γονιδιακό προφίλ του πρωτογενούς CRCs και συμφωνημένα μεταστάσεις τους και να καθορίζουν τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά των μεταστατικών βλαβών από την άποψη της μετάλλαξης και SCNA προφίλ.

Πενήντα -Τρία τοις εκατό των ζευγαριών CRC-CLM στην συγκεντρωμένα ομάδα μοιράστηκε ένα μεγάλο αριθμό μεταλλάξεων, συμπεριλαμβανομένων και ορισμένων στο

APC

,

KRAS

,

TP53

, και

Smad4

γονίδια (Πίνακας 4, Εικόνα 1). Η παρουσία πολλών από κοινού μεταλλάξεων (30-65%) έδειξε ότι σωματικές μεταλλάξεις μπορεί να συσσωρεύεται μέσα στο μικροπεριβάλλον του πρωτογενούς καρκίνου πριν τη διάδοση σε μεταστατικές θέσεις τους, κάτι που συνήθως αναφέρονται ως το γραμμικό μοντέλο εξέλιξης της εξέλιξης του όγκου [22]. Το υπόλοιπο 47% των ζευγαριών CRC-CLM, οι οποίες ομαδοποιούνται ανεξάρτητα μεταξύ τους, έδειξαν σημαντικές διαφορές στα προφίλ τους μετάλλαξη και τα δεδομένα SCNA. Δεν είχαν μοιραστεί μεταλλάξεις σε καρκίνο έναρξη γονιδίων και σημαντικές διαφορές στα προφίλ SCNA (Σχήμα 1). Η ξεχωριστή σχέση και εξέχοντα γενετική ετερογένεια σε αυτά τα ζευγάρια δείχνουν ότι οι γενικώτερα θα μπορούσε να προέλθει από μια ομάδα γενετικά διακριτών πρωτογενών κλώνων CRC αλληλεπιδρούν σε στενή γειτνίαση με πολυκλωνικό μοντέλο της εξέλιξης του όγκου.

Έξι ζεύγη CRC-CLM είχε σωματικών μεταλλάξεις KRAS σε τουλάχιστον ένα δείγμα. Τρία ζεύγη είχαν τις ίδιες μεταλλάξεις KRAS, και οι άλλες τρεις δεν το έκανε. Ως εκ τούτου, το ποσοστό ασυμφωνία του KRAS μεταλλαγή μεταξύ ζευγών CRC-CLM ήταν 50% (3/6) (Σχήμα 1 και Πίνακας S4). Knijn και οι συνεργάτες του [25] ανέφεραν υψηλό ποσοστό αντιστοιχίας του KRAS μεταλλάξεις μεταξύ πρωτοπαθών όγκων CRC και CLM. Αντίθετα, μια σειρά από μελέτες έχουν δείξει υψηλό ποσοστό ασυμφωνία, μεταξύ ζευγών CRC-CLM, μεταλλάξεων KRAS κυμαίνονται από 8% -60% [26] – [28]. Στη μελέτη μας, οι τρεις αυτές CRC-CLM ζεύγη με την κατάσταση ασύμφωνα μετάλλαξη KRAS επίσης συγκεντρωμένα ευδιάκριτα με ανάλυση SCNA. Η ασυμφωνία των μετάλλαξη KRAS, μαζί με ξεχωριστή SCNA μοτίβα clustering, μεταξύ αυτών των ζευγών CRC-CLM υποστηρίζει την υπόθεσή μας ότι η πρωτοβάθμια CRCs και τα αντίστοιχα γενικώτερα τους μπορεί να έχουν διαφορετικές προελεύσεις κλωνική σε αυτά τα δείγματα.

Το πολυκλωνικό μοντέλο εξέλιξης του όγκου μπορεί να να βοηθήσει άμεσα θεραπευτικές στρατηγικές [4]. Το κύριο μειονέκτημα ενός μονοκλωνικού μοντέλο προέλευση του όγκου είναι η υπόθεση ότι οι περισσότερες από τις αρχικά γεγονότα που οδήγησαν στην πρωτογενή καρκίνο θα βρεθούν επίσης στα μετάσταση κυττάρων, η οποία βλέπει την πιθανότητα ότι μικροί πληθυσμοί κυττάρων όγκου με διακριτά γενετικά χαρακτηριστικά σε στενή γειτνίαση στο άλλο μπορεί να είναι υπεύθυνη για την μετάσταση [4]. Όπως μεταστατικά κύτταρα, τα οποία προέρχονται από πρωτογενείς όγκους, μπορεί να έχει διαφορετική απόκριση στη θεραπεία.

Η υπερμετάλλαξη που προκαλείται από την απώλεια της δραστικότητας επιδιόρθωσης του DNA ονομάζεται MSI [29]. Βρήκαμε ότι τα τέσσερα δείγματα CLM ήταν ασταθής μικροδορυφόρων, με αποτέλεσμα hypermutations. Η

ΚΟΚ

γονίδιο, ένας σημαντικός προγνωστικός δείκτης στο καρκίνωμα του παχέος εντέρου [30], είχε μεταλλαχθεί μόνο στις υπερμεταλλαχθούν δείγματα. Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι υπήρχε μια εμφανής σχέση μεταξύ υπερμεταλλάξεως και χρωμοσωμική αστάθεια. Πρόσφατα, μια ξεχωριστή κατάσταση αριθμός αντιγράφων του γονιδίου επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων DNA

MLH1

δείχθηκε να συνδέεται με αυξημένα επίπεδα της μετάλλαξης σε παγκρεατικού καρκίνου [31]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν αντιφατικές ενδείξεις σχετικά με τους όγκους MSI και το χρωμόσωμα αστάθεια στην παχέος εντέρου. Μερικές μελέτες ανέφεραν ότι MSS όγκοι παρουσιάζουν υψηλότερο ποσοστό του χρωμοσώματος αστάθειας από τους όγκους MSI [32] – [35]. Άλλες μελέτες ανέφεραν σημαντική επικάλυψη μεταξύ των όγκων MSI και το χρωμόσωμα αστάθεια [32], [35] – [38]. Αξίζει να σημειωθεί ότι όλες αυτές οι μελέτες έγιναν χρησιμοποιώντας πρωτογενή δείγματα CRC, και η σχέση της MSI και της αστάθειας των χρωμοσωμάτων σε δείγματα CLM είναι ακόμη αποκαλυφθεί. Βρήκαμε ότι MSI όγκοι που σχετίζονται με έναν μεγάλο αριθμό γονιδιακών διαγραφών /επιμηκύνσεις και αυξημένη συχνότητα LOH, με άλλα λόγια, χρωμοσωμική αστάθεια σε όγκους CLM. Περαιτέρω έρευνα απαιτείται για να αποκαλύψει τη σχέση μεταξύ MSI, χρωμόσωμα αστάθεια και η μετάσταση του πρωτογενούς CRCs.

Η αγγειογένεση ρυθμίζεται κυρίως από τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ αγγειακών ενδοθηλιακών αυξητικών παραγόντων και των υποδοχέων VEGF και παίζουν κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση [ ,,,0],39], [40]. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει την γενετικού πολυμορφισμού του γονιδίου ΚΡΚ εμπλέκουν τον κίνδυνο στεφανιαίας αρτηρίας ασθενειών [41], [42]. Ωστόσο, η σαφής ο ρόλος των επιμέρους ΚΟΚ SNPs και φυσιολογικές λειτουργίες τους στην εξέλιξη του καρκίνου και την πρόγνωση παραμένει άγνωστη. Στην παρούσα μελέτη, όλοι οι ασθενείς με ΚΟΚ SNPs (δηλ rs187037 και rs2305948) είχαν υποτροπή μετά θεραπευτική εκτομή CRC και του ήπατος (ρ = 0.925? Δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, λόγω του μικρού δείγματος ΚΟΚ μετάλλαξη δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Ένας μεγαλύτερος αριθμός δειγμάτων που απαιτούνται για την επικύρωση της μετάλλαξης ΚΟΚ και χαρακτηριστικό ρόλο της στην επανεμφάνιση του όγκου.

Ο μέσος χρόνος επιβίωσης των ασθενών με μεταστατικό CRC έχει αυξηθεί από 6-8 μήνες έως περισσότερα από 2 χρόνια λόγω της εμφάνιση στοχευμένη θεραπεία και βελτιωμένη χειρουργική εκτομές. Παρ ‘όλα αυτά, η θεραπευτική επιλογή για μη ανταποκρινόμενοι στην οξαλιπλατίνη ή ιρινοτεκάνη χημειοθεραπεία με βάση, με ή χωρίς cetuximab ή bevacizumab, είναι πολύ περιορισμένη. Ως εκ τούτου, καλύτερες στρατηγικές θεραπείας για μεταστατικό CRC πρέπει να αναπτυχθούν. Μια αναδυόμενη σώμα του στοιχεία υποδηλώνουν ότι οι πρωτογενείς CRC μπορεί να εκδηλωθούν ως πολυκλωνικά σε φύση και ότι τα προκύπτοντα μεταστάσεις θα μπορούσε επομένως να έχει γενετικά διαφορετικό από την πλειοψηφία του πρωτογενούς όγκου. Σε τέτοιες περιπτώσεις, η βιολογία και γενετικό προφίλ του πρωτογενούς όγκου μπορεί να είναι σημαντικά διαφορετική από τις μεταστάσεις. Αυτό θα ήταν μια σημαντική ανησυχία στην στοχευμένη, εξατομικευμένη θεραπεία. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι προφίλ μεταλλάξεων του περίπου 50% των μεταστατικών όγκων του ήπατος θα μπορούσε να είναι διαφορετική από εκείνη του πρωτογενούς όγκου, το οποίο υπογραμμίζει την ανάγκη να αξιολογηθεί θέσεις μεταστατικού χωριστά για την ταυτοποίηση των πιθανών στόχων για συστηματική θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

πληθυσμός Μελέτη

Μεταξύ Ιουνίου 2009 και Ιουνίου 2011 53 ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπευτική εκτομή του CRC και μετάσταση στο ήπαρ σε Gachon Πανεπιστήμιο Gil Νοσοκομείο (Ίντσεον, Νότια Κορέα). Τα κριτήρια για την ένταξη σε αυτή τη μελέτη ήταν τα εξής: (1) ηπατική μετάσταση από CRC επιβεβαιώνεται από σπείρα abdominopelvic υπολογιστικής τομογραφίας? (2) μετάσταση στο ήπαρ ως πρώτη εκδήλωση της νόσου M1 χωρίς οποιαδήποτε τεκμηριωμένη διάχυτης νόσου, όπως προσδιορίζεται με προεγχειρητική απεικόνιση? (3) δεν υπάρχει προηγούμενο ιστορικό εισαγωγική chemoradiation ή χημειοθεραπεία, συμπεριλαμβανομένης της μοριακής στοχευμένων παραγόντων? (4) θεραπευτική εκτομή πραγματοποιείται τόσο για πρωτογενείς όσο και του παχέος κακώσεις ήπατος? (5) οι εκτομή δείγματα πρέπει να είναι συγχρονισμένη όγκους (ταυτόχρονη εκτομή,

n

= 11? Σε δύο στάδια εκτομή εντός 6 μηνών,

n

= 4)? και (6) μικροδορυφόρων σταθερά πρωτογενή CRCs. Επιλέξαμε 15 ασθενείς με CRC και συμφωνημένα μετάσταση στο ήπαρ με βάση αυτά τα κριτήρια ένταξης. Τα βασικά χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Όλοι οι όγκοι εξετάστηκαν από ένα μόνο παθολόγο, και δείγματα μόνο με & gt? 70% περιεκτικότητα όγκου συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση. Τα πρωτόκολλα των μελετών εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review της Gachon Πανεπιστημίου Gil Νοσοκομείο (IRB αριθμός έγκρισης: GIRBA 2535). Γραπτή συγκατάθεση απαιτείτο από όλους τους συμμετέχοντες. Πληροφορίες, όπως το φύλο, η ηλικία, το στάδιο του όγκου, εξήχθη από την κλινική βάση δεδομένων για αυτήν την ομάδα.

PCR-based

δοκιμασία μικροδορυφόρων

Μια σειρά από δείκτες μικροδορυφόρων που αποτελείται από δύο δείκτες μονονουκλεοτιδίου επανάληψης ( BAT25 και BAT26) και τρεις δείκτες δινουκλεοτίδιο επανάληψη (D2S123, D5S346, και D17S250), όπως συνιστάται από το National Cancer Institute Ομάδα Συναίνεσης, χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό του όγκου η αστάθεια μικροδορυφορικού (MSI) κατάσταση. Δείγματα που περιείχαν 50 ng DNA ενισχύθηκαν σε μίγματα αντίδρασης 20-μΙ που περιέχει 2 μι 10 χ ρυθμιστικού διαλύματος (Roche, Mannheim, Germany), 1.7 – 2.5 mmol /L MgCl

2, 0,3 μΜ από κάθε ζεύγος εκκινητή, 250 μΜ τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια , και 2,5 υ DNA πολυμεράση (Roche, Mannheim, Germany). Διεξήχθη PCR με αρχικό στάδιο μετουσίωσης στους 94 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 30 κύκλους του 1 min στους 94 ° C, 1 λεπτό στους 55 ° C, και 1 λεπτό στους 72 ° C και ένα τελικό στάδιο επέκτασης 10 λεπτών στους 72 ° C. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε έναν ΑΒΙ Prism 3100 Genetic Analyzer χρησιμοποιώντας 0,7 μL ενισχυμένου δείγματος σε συνδυασμό με 0.3 μι GeneScan 500 Μέγεθος Standard and 9 μί HiDi φορμαμίδιο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ΑΒΙ Prism 3100 Συλλογής Δεδομένων (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

εκχύλιση του DNA, προετοιμασία βιβλιοθήκη και στοχευμένες exome αλληλουχίας

DNA εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας ένα DNeasy Blood & amp? Ιστού Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA). ποιότητα του DNA ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1%, και η συγκέντρωση του DNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια Δοκιμασία PicoGreen dsDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). βιβλιοθήκες αλληλούχιση SureSelect παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Agilent SureSelect Όλα εξόνιο Kit 38 Mb? Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο Bravo χειριστή υγρού. Η ποιότητα των ενισχυμένων βιβλιοθηκών επαληθεύθηκε με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση (Bioanalyzer? Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), μετά από την οποία συνδυάζεται-άκρο αλληλουχίες DNA που ελήφθησαν από τις βιβλιοθήκες χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Illumina HiSeq (Illumina, San Diego, CA, ΗΠΑ).

Βιοπληροφορική ανάλυση

τα δεδομένα αλληλουχίας ήταν ευθυγραμμισμένες με το γονιδίωμα αναφοράς ανθρώπινη GRCh37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/assembly/grc/ανθρώπινης /index.shtml) χρησιμοποιώντας το Burrows-Wheeler Aligner [43] με τις προεπιλεγμένες παραμέτρους. Εμείς αλληλουχία στο μέσο βάθος της 52.44X για στοχευμένες περιοχές. Οι PCR αντίγραφα απομακρύνθηκαν χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Picard (https://picard.sourceforge.net). Πραγματοποιήσαμε επανευθυγράμμιση και την ποιότητα επαναβαθμονόμηση για τα αλληλουχία δεδομένων με τη χρήση του Γονιδιώματος Analysis Toolkit (GATK) [44]. Μετά την ευθυγράμμιση, χρησιμοποιήσαμε Varscan [45], Strelka [46], και Mutect [47] για να καλέσει μεταλλάξεις, συμπεριλαμβανομένων εισαγωγές και διαγραφές (indels), για κάθε χρωμοσωμική θέση και επίσης χρησιμοποιείται GATK [44] για την ανίχνευση Indel με 15 δείγματα τρίπολο που αποτελείται από φυσιολογικό ορθοκολικό ιστό, πρωτογενή CRC, και συμφωνημένα και γενικώτερα. Εμείς σχολιασμένη τις μεταλλάξεις χρησιμοποιώντας ANNOVAR [48] με τη βάση δεδομένων σχολιασμό Ensembl γονίδιο για τον ανθρώπινο γονιδίωμα χτίσει 37 (https://www.ensembl.org/) και έψαξε για τους αγώνες στην dbSNP137 (http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/projects/genome/assembly/grc/human/index.shtml), 1000 γονιδιώματα των δεδομένων [49], και κοσμικές βάση δεδομένων [50]. Εμείς φιλτράρεται τις μεταλλάξεις από τις στοχευμένες περιοχές και επιλεγμένες μη συνώνυμες, συνώνυμο, κέρδος ή ζημία του κωδικονίου λήξης, πλαισίου indels, μη-πλαισίου indels και μεταλλάξεις ιστοσελίδα μάτισμα.

ανάλυση SCNA

Το μόνο νουκλεοτιδίου πολυμορφισμός (SNP) σειρά CytoScan ™ HD (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε. SCNA ανάλυση της Array CytoScan ™ HD πραγματοποιήθηκε με τη χρήση BioDiscovery Nexus Αριθμός αντιγραφής λογισμικού 6.1 (https://www.biodiscovery.com/software/nexus-copy-number/). Το SNP-Fast Adaptive μελών Τμηματοποίηση Τεχνική 2 αλγόριθμο κατάτμησης χρησιμοποιήθηκε με τις προεπιλεγμένες παραμέτρους.

Ομαδοποίηση

Πλήρης σύνδεση ιεραρχική ομαδοποίηση διεξήχθη για να αξιολογήσει τη συμφωνία μεταξύ των πρωτογενών δειγμάτων CRC και CLM. Μέσο όρο και μόνο σύνδεση ιεραρχική ομαδοποίηση επίσης εφαρμόζονται? Ωστόσο, όλες οι μέθοδοι ομαδοποίησης έδωσε παρόμοια αποτελέσματα. Αξιόπιστες

t-test

και δύο δειγμάτων

t-test

χρησιμοποιήθηκαν για στατιστικές αναλύσεις, και

P

& lt?. 0,05 θεωρήθηκε για να δείξει στατιστική σημαντικότητα

Data Link

στοιχεία Σύνολο αλληλουχίας exome: Ακολουθία Ανάκτηση Αρχείο (SRA) αριθμός ένταξης είναι SRP034161

Cytoscan δεδομένων πίνακα:.. GEO αριθμό προσχώρησης είναι GSE53799

Υποστήριξη πληροφορίες

Εικόνα S1.

Workflow για μεταβολή αριθμού αντιγράφων ανάλυση (CNV)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090459.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

SCNA πρότυπα ζεύγη CRC-CLM. Τα κέρδη εκπροσωπούνται σε μπλε, απώλειες σε κόκκινο και ΑΕ σε καφέ. 8/15 CRC-CLM ομαδοποιημένα ζεύγη έδειξαν υψηλή ομοιότητα στα πρότυπα SCNA σε σύγκριση με τα υπόλοιπα 7/15 CRC-CLM ομαδοποίηση ζεύγη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090459.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Μέση SCNA συχνότητες ομαδοποιούνται και ομαδοποίηση ζεύγη CRC-CLM. (Α) κέρδη Υψηλή αντίγραφο, ομόζυγο απώλειες και ΑΕ είναι εξαιρετικά μεταβλητή στην ομαδοποίηση ζεύγη CRC-CLM. Υψηλά κέρδη αντίγραφο ομαδοποιούνται CRC-CLM έδειξε επίσης μεταβλητότητα. (Β) απώλειες Ένα αντίγραφο στην ομαδοποίηση ζεύγη CRC-CLM έδειξε μεταβλητότητα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090459.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

Workflow για ανάλυση ολόκληρη αλληλουχίας exome

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090459.s004

(ΔΕΘ)

Εικόνα S5.

Μετάλλαξη φάσματα του ΚΕΣ και γενικώτερα. (Α) Μετάλλαξη του φάσματος του ΚΕΣ και να συνδυαστούν και γενικώτερα τους, εκτός από υπερμεταλλαχθούν δείγματα. (Β) Μετάλλαξη φάσμα των τεσσάρων υπερμεταλλαχθούν δείγματα CLM

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090459.s005

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1. .

Αριθμός των σωματικών μεταλλάξεων σε CRCs και γενικώτερα

doi: 10.1371 /journal.pone.0090459.s006

(DOCX)

Πίνακας S2. .

Συνολικός αριθμός των μεταλλάξεων σε κάθε ζεύγη CRC-CLM

doi: 10.1371 /journal.pone.0090459.s007

(DOCX)

Πίνακα S3.

κατάστασης μεταλλάξεων του DNA αναντιστοιχία γονίδια οδού επισκευή και γονίδια DNA πολυμεράσης CRCs και γενικώτερα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090459.s008

(DOCX)

Πίνακας S4.

μεταλλάξεων συμφωνία μεταξύ CRC και CLM ζεύγη. Όλα τα σχετίζεται στενά με τα ζεύγη CRC-CLM στην ιεραρχική ομαδοποίηση κοινόχρηστο μεταλλάξεις σε βασικούς CRC που σχετίζονται με γονίδια

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090459.s009

(DOCX)

Πίνακας S5.

Μεταλλάξεις και μεταλλαγμένα γονίδια στα CRCs και γενικώτερα (ο πίνακας παρέχεται ως αρχεία excel)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090459.s010

(XLSX)