Abstract

μορφογενετικές πρωτεΐνες

Bone (ΒΜΡ) είναι εξαιρετικά διατηρημένες μορφογόνα που είναι απαραίτητες για τη φυσιολογική ανάπτυξη. ΒΜΡ-2 εκφράζεται έντονα στην πλειοψηφία των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), αλλά όχι σε φυσιολογικό ιστό πνεύμονα ή καλοήθεις όγκους του πνεύμονα. Τα αποτελέσματα του καταρράκτη σηματοδότησης BMP στην αύξηση και επιβίωση των καρκινικών κυττάρων είναι ελάχιστα κατανοητή. Δείχνουμε ότι η ΒΜΡ σηματοδότηση είναι basally ενεργός στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, τα οποία μπορούν να ανασταλούν αποτελεσματικά με εκλεκτικούς ανταγωνιστές των υποδοχέων Ι ΒΜΡ τύπου. καρκινικές κυτταρικές σειρές πνεύμονα εκφράζουν alk2, Alk3 και Alk6 και αναστολή ενός μοναδικού υποδοχέα ΒΜΡ δεν ήταν επαρκής για να μειωθεί σηματοδότηση. Αναστολή περισσοτέρων του ενός υποδοχέα τύπου Ι που απαιτείται για να μειωθεί BMP σηματοδότηση σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα. Οι ανταγωνιστές των υποδοχέων ΒΜΡ και σίγηση του τύπου ΒΜΡ υποδοχέων Ι με siRNA θάνατο που επάγεται κυττάρου, αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη, και προκάλεσε σημαντική μείωση στην έκφραση του αναστολέα της διαφοροποίησης (ID 1, ID2, και ID3) τα μέλη της οικογένειας, τα οποία είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν την κυτταρική ανάπτυξη και την επιβίωση σε πολλούς τύπους καρκίνων. Οι ανταγωνιστές των υποδοχέων ΒΜΡ μειώθηκε επίσης κλωνογονικού κυτταρική ανάπτυξη. Knockdown του ID3 μειώθηκαν σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων και κυτταρικό θάνατο που επάγεται από καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων. κύτταρα Η1299 που υπερεκφράζουν σταθερά Ιδ3 ήταν ανθεκτικά στην καταστολή της ανάπτυξης και επαγωγή του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από το ΒΜΡ ανταγωνιστή DMH2. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι BMP σηματοδότηση προάγει την κυτταρική ανάπτυξη και επιβίωση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, η οποία διαμεσολαβείται μέσω της ρύθμισης του των μελών της οικογένειας Id. Εκλεκτικοί ανταγωνιστές των υποδοχέων Ι του ΒΜΡ τύπο αντιπροσωπεύει ένα δυναμικό μέσο για την αντιμετώπιση φαρμακολογικά NSCLC και άλλα καρκινώματα με ενεργοποιημένο ΒΜΡ καταρράκτη σηματοδότησης

Παράθεση:. Langenfeld Ε, το Χονγκ CC, Lanke G, Langenfeld J (2013) Μορφογενετικής Οστών πρωτεΐνη τύπου Ι Ανταγωνιστές των Υποδοχέων της ανάπτυξης Μείωση και προκαλεί κυτταρικό θάνατο του καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών γραμμών. PLoS ONE 8 (4): e61256. doi: 10.1371 /journal.pone.0061256

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 Γενάρη 2012? Αποδεκτές: 11, Μαρ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 12η Απριλίου, 2013

Copyright: © 2013 Langenfeld et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν την ακόλουθη ενδιαφέρον. Τα μικρά μόρια που χρησιμοποιούνται στο πείραμα αντιπροσωπεύουν πιθανά φάρμακα για τη θεραπεία ασθενών με καρκίνο. Μια previsionary αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας έχει υποβληθεί για την πιθανή χρήση αυτών των μορίων στον καρκίνο. Δεν υπάρχουν άλλα διπλώματα ευρεσιτεχνίας, προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Η Οστεομορφογενετικές Πρωτεΐνες (ΒΜΡ) είναι μέλη της υπεροικογένειας αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης (TGF). BMPs είναι phytogenetically συντηρημένες πρωτεΐνες που απαιτούνται για την εμβρυϊκή ανάπτυξη από τα έντομα στον άνθρωπο. Περίπου 20 ΒΜΡ συνδέτες έχουν ταυτοποιηθεί και κατηγοριοποιούνται σε διάφορες υποκατηγορίες. ΒΜΡ-2 και ΒΜΡ-4 μερίδιο 92% ομολογία και έχουν εναλλάξιμα βιολογική δραστικότητα. BMPs εκκρίνονται πρωτεΐνες που σηματοδοτούν μέσω διαμεμβρανικές κινάσες σερίνης /θρεονίνης που ονομάζεται τύπου Ι και τύπου II υποδοχείς [1]. Ο τύπος Ι υποδοχείς είναι alk1, alk2 (ACTR-1), Alk3 (BMPR-ΙΑ), και Alk6 (BMPR-ΙΒ) [1]. Οι υποδοχείς τύπου II είναι BMPR-ΙΙ και τύπου ΙΙ ακτιβίνης υποδοχείς ACTR-ΙΙ και ACR-IIB [1]. BMP υποδοχείς είναι promiscuous, και μπορεί να ενεργοποιηθεί από διάφορους συνδέτες BMP [1], [2]. Κάθε συνδέτης BMP είναι επίσης ικανή να ενεργοποιεί διαφορετικούς υποδοχείς [1], [2]. Η δέσμευση του ΒΜΡ συνδετήρων με τον τύπο Ι υποδοχέα οδηγεί σε φωσφορυλίωση από την ιδιοσυστατικά ενεργό υποδοχέα τύπου II. Το σύμπλοκο υποδοχέα φωσφορυλιώνει Smad-1/5, η οποία στη συνέχεια ενεργοποιεί τη μεταγραφή των κατάντη γονιδίων στόχων [3].

Κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, BMPs ρυθμίζει αποφάσεις κύτταρο μοίρα, κυτταρική επιβίωση, και αγγειογένεσης [4], [5 ], [6], [7], διαδικασίες που είναι επίσης κοινά στην καρκινογένεση. Στην πραγματικότητα, ΒΜΡ-2 υπερ-εκφράζεται στο 98% των NSCLC και άλλα καρκινώματα [8], [9]. Η έκφραση ΒΜΡ συσχετίζεται αντιστρόφως με την επιβίωση [10] και την υψηλή έκφραση συσχετίζεται με μεταστατικό εξάπλωση [11], [12]. ΒΜΡ-2 ενισχύει την αγγειογένεση όγκου [13], [14], [15] και διεγείρει προσβολή όγκου [8]. Η έκτοπη έκφραση της ΒΜΡ-2 σε Α549 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα ενισχυθεί σημαντικά μεταστατική ανάπτυξη σε ένα μοντέλο ποντικού για καρκίνο του πνεύμονα μετά από ένεση στην φλέβα της ουράς [16]. Μελέτες που χρησιμοποιούν ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ΒΜΡ ή knockdown ενός ενιαίου υποδοχέα ΒΜΡ έχουν προτείνει ότι η ΒΜΡ σηματοδότηση σε καρκινικά κύτταρα δεν προάγει την ανάπτυξη των κυττάρων και μπορεί ακόμη και να ενεργήσει ως καταστολέας όγκου (16-19). Οι επιδράσεις της αναστολής πολλαπλών υποδοχέων ΒΜΡ στην κυτταρική ανάπτυξη και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων δεν έχει εξεταστεί. Ως εκ τούτου, η βιολογική σημασία ενός basally δραστικού καταρράκτη σηματοδότησης BMP σε καρκινικά κύτταρα δεν είναι γνωστός.

Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, οι αναστολείς της δέσμευσης DNA /διαφοροποίησης (Id) είναι απευθείας μεσολαβητές της ΒΜΡ σηματοδότησης. Υπάρχουν 4 μέλη της οικογένειας Id (ID 1, ID2, Ιδ3, και ID4). Τα στοιχεία απόκρισης BMP (BRE) σχετικά με τους αναδόχους ID 1, ID2 και Ιδ3 ενεργοποιείται από Smad 1/5/8 (20-23). Οι πρωτεΐνες Id αναστέλλουν τη δέσμευση της γενεαλογίας με τη δέσμευση και απομόνωσης βασικούς παράγοντες μεταγραφής HLH [17]. τα μέλη της οικογένειας Id ενοχοποιηθεί στην ογκογόνο μετασχηματισμό σε διάφορους τύπους καρκίνων [18] [19], [20]. ID1 έχει αναφερθεί να ρυθμίσει εισβολή, τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και την μεταστατική εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων [18], [21], [22]. τα μέλη της οικογένειας Id εκφράζονται συχνά σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [23], [24] και η υπερέκφραση συνδέεται με βραχύτερη επιβίωση χωρίς ασθένεια [25]. Αυτές οι μελέτες υποδεικνύουν ότι η στόχευση μονοπάτια σηματοδότησης, οι οποίες ρυθμίζουν την έκφραση των μελών της οικογένειας Id μπορεί να έχει σημαντικές θεραπευτικές συνέπειες. Αν και ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ΒΜΡ2 επάγει μία παροδική αύξηση στην έκφραση του ID1 στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων [8], ο ρόλος του καταρράκτη σηματοδότησης BMP στη ρύθμιση των βασικών επιπέδων έκφρασης των μελών της οικογένειας Id σε καρκινικά κύτταρα δεν έχει διευκρινιστεί.

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να καθοριστεί σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, τα οποία δεν έχουν διεγερθεί με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη BMP, εάν τα κύτταρα έχουν μια basally ενεργή σηματοδότηση BMP και προσδιοριστεί η επίπτωσή του στην κυτταρική ανάπτυξη, την επιβίωση και την έκφραση του Id μέλη της οικογένειας. Επιλεκτική τύπου ΒΜΡ Ι υποδοχέα ανταγωνιστές και siRNA που στοχεύει τον τύπο ΒΜΡ Ι υποδοχείς αποκαλύπτει ότι basally ενεργός BMP σηματοδότησης σε καρκινικές κυτταρικές σειρές πνεύμονα είναι προώθηση της ανάπτυξης και ένας σημαντικός ρυθμιστής της έκφρασης των μελών της οικογένειας Id. ΒΜΡ σηματοδότηση διαμεσολαβείται από περισσότερους από έναν τύπο υποδοχέα Ι BMP. DMH2 προκάλεσαν τη μεγαλύτερη αναστολή της BMP σηματοδότησης και προκάλεσε τη μεγαλύτερη μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης και της έκφρασης των μελών της οικογένειας Id.

Αποτελέσματα

BMP τύπου Ι Ανταγωνιστές των Υποδοχέων Μείωση Smad 1/5/8 σηματοδότησης

Χρησιμοποιώντας μια ΒΜΡ-απόκρισης λουσιφεράσης (BRE-Luc), εξετάσαμε τις επιδράσεις των διαφόρων ανταγωνιστών του υποδοχέα τύπου BMP σχετικά με τη δραστηριότητα Smad 1/5/8 σε Η1299 κύτταρα. Dorsomorphin, DMH1, DMH2, και LDN όλα προκάλεσε σημαντική μείωση στην έκφραση του ανταποκριτή BRE-Luc σε Η1299 κύτταρα, υποδεικνύοντας μία μείωση στην Smad 1/5/8 δραστηριότητα (Σχήμα 1Α). Η ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως απεκάλυψε ότι τα επιλεκτικά τύπου ΒΜΡ Ι υποδοχέα ανταγωνιστές μειώνουν φωσφορυλίωση της Smad 1/5/8 σε Η1299 και κυττάρων Α549 (Σχήμα 1 Β και σχήμα S1). Η φωσφορυλίωση της Smad 1/5/8 μειώθηκε μέσα σε 24 ώρες της θεραπείας και παρέμεινε για τουλάχιστον 48 ώρες μετά.

(Α) Η1299 κύτταρα επιμολύνθηκαν με BRE-luciferace ρεπόρτερ. Μετά από 48 ώρες τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO, 10 μΜ Dorsomorphin, ή 1 μΜ DMH1, 1 μΜ DMH2, ή 1 μΜ LDN για 48 ώρες. δραστηριότητα BRE-luciferace αναφέρεται ως η επί τοις εκατό των DMSO ελέγχου επεξεργασμένα κύτταρα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν την μέση 3 πειραμάτων εις τριπλούν. Ο μέσος όρος των κυττάρων ελέγχου συγκρίθηκε με τη μέση τιμή των κατεργασμένων κυττάρων. * P & lt? 0,05. (Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης για φωσφορυλιωμένη Smad 1/5/8 του Η1299 κύτταρα που κατεργάζονται με 1 μΜ DMSO, DMH1, ή DMH2 για 12, 24, και 48 ώρες.

Η

ΒΜΡ Τύπου Ι Ανταγωνιστές των Υποδοχέων Μείωση έκφραση της Id μέλη της οικογένειας

Ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί αν η καταρράκτη σηματοδότησης ΒΜΡ ρυθμίζει την έκφραση των μελών της οικογένειας Id σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Dorsomorphin, DMH1, και DMH2 μειώθηκαν σημαντικά έκφραση ID1, ID2, και Ιδ3 σε Α549 και κυτταρικές γραμμές Η1299 (Σχήμα 2Α-Β). Οι ανταγωνιστές BMP προκάλεσε μεγαλύτερη μείωση των μελών της οικογένειας Id στα κύτταρα Η1299 σε σύγκριση με τα κύτταρα Α549. Με ανάλυση κηλίδος Western, Dorsomorphin, DMH1, DMH2 και LDN προκάλεσε μία μείωση σε επίπεδα πρωτεΐνης του ID1 και Ιδ3 σε Α549 και Η1299 κύτταρα (Σχήμα 2C-D και σχήμα S2). Οι ανταγωνιστές της ΒΜΡ μείωσε την έκφραση των μελών της οικογένειας Id μέσα σε 12 έως 24 ώρες, που παρέμεινε για τουλάχιστον 48 ώρες. DMH1 και DMH2 προκάλεσε μεγαλύτερη μείωση των ID1 σε Η1299 κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα Α549. DMH2 προκάλεσε σταθερά μια μεγαλύτερη μείωση της πρωτεϊνικής έκφρασης ID1 από DMH1.

(Α-Β) Ποσοτική RT-PCR για ID1, ID2, και Ιδ3 στο (Α) Α549 και (Β) Η1299 κύτταρα επεξεργασμένα με DMSO, 10 μΜ Dorsomorphin, 1 μΜ DMH1, ή 1 μΜ DMH2 για 48 ώρες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή τουλάχιστον 3 πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν και παρουσιάζονται ως το ποσοστό των κυττάρων σε επεξεργασία ελέγχου. Ο μέσος όρος των κυττάρων ελέγχου συγκρίθηκε με τη μέση τιμή των κατεργασμένων κυττάρων. * P & lt? 0,05. (C-D) Ανάλυση Western blot για ID 1 και Ιδ3 στο (C) Α549 και Η1299 κύτταρα επεξεργασμένα με 1 μΜ DMSO ή 1 μΜ επιλεκτικού τύπου ΒΜΡ Ι υποδοχέα ανταγωνιστή για 12, 24, και 48 ώρες (D). Αυτές οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον 3 φορές.

Η

Πολλαπλές BMP τύπου Ι υποδοχείς προκαλούν Σηματοδοσίας

Στη συνέχεια, θα εκτιμηθεί αν ένα συγκεκριμένο υποδοχέα ΒΜΡ τύπου Ι μεσολαβεί basally ενεργό σηματοδότησης BMP στον καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές. Με ποσοτική RT-PCR, εξετάστηκε η έκφραση των υποδοχέων Ι ΒΜΡ τύπου. Alk1 δεν εκφράστηκε είτε σε Α549 ή κύτταρα Η1299 (Σχήμα 3Α). Όπως αναμενόταν, το alk1 εκφράστηκε σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι Alk2, Alk3 και Alk6 mRNA εκφράζεται σε Α549 και κυτταρικές γραμμές Η1299 (Σχήμα 3Α). Χρησιμοποιώντας siRNA, η έκφραση του κάθε υποδοχέα τύπου Ι μειώθηκε κατά περίπου 40% ή μεγαλύτερη (Εικόνα 3Β). Για να ελεγχθεί η ειδικότητα του siRNA, knockdown του κάθε υποδοχέα τύπου Ι διεξήχθη και RT-PCR πραγματοποιήθηκε για alk2, Alk3 και Alk6. Knockdown του Alk2 προκάλεσε σημαντική αύξηση στην έκφραση του Alk6 (σχήμα 3C). Εξόντωση Alk3 και Alk6 προκάλεσε μια μικρή μείωση στην έκφραση των άλλων υποδοχέων τύπου Ι (Σχήμα 3C). Ποσοτική RT-PCR έδειξε ότι σίγηση του alk2 ή Alk3 στα κύτταρα Η1299 προκάλεσε μείωση κατά περίπου 20-25% στην έκφραση του mRNA ID1 (σχήμα 3D), ενώ αποσιώπηση του Alk6 έτεινε να προκαλέσει μία αύξηση στην έκφραση ID1. Σίγαση τόσο Alk2 και Alk3 προκάλεσε μία σημαντικά μεγαλύτερη μείωση στην έκφραση ID1 από knockdown είτε του υποδοχέα μόνο του (Σχήμα 3D). Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι knockdown ενός μόνο υποδοχέα τύπου IA μόνη δεν μειώνουν ID1 έκφρασης (Σχήμα 3Ε). Αποσιώπηση τόσο Alk2 και Alk3 ή αποσιώπηση alk2, Alk3 και Alk6 προκάλεσε μια μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης ID1 (Σχήμα 3Ε). Ποσοτική RT-PCR έδειξε ότι knockdown πολλαπλών υποδοχέων οδήγησε μια μείωση σε όλες τις υποδοχείς τύπου BMP, η οποία ήταν μεγαλύτερη από αυτή που παρατηρήθηκε για τα ενιαία knockdowns υποδοχέα (σχήμα 3F).

(Α) Ποσοτική RT-PCR του Α549 και Η1299 κύτταρα που δείχνουν έκφραση του alk2, Alk3 και Alk6 αλλά όχι alk1 (n = 3). (Β) κύτταρα Η1299 επιμολύνθηκαν με siRNA που στοχεύει κάθε τύπο Ι ΒΜΡ υποδοχέα και ποσοτική RT-PCR εκτελέστηκε για το εν λόγω υποδοχέα ΒΜΡ. (Γ) εξόντωση κάθε τύπου ΒΜΡ Ι υποδοχέα σε Η1299 κυττάρων πραγματοποιήθηκε και ποσοτική RT-PCR πραγματοποιείται για όλους τους υποδοχείς I 3 τύπου. (Β-Γ) Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των 2 πειραμάτων που εκτελούνται εις διπλούν. (D) knockdown στο Η1299 κύτταρα ενός μόνο τύπου ΒΜΡ Ι υποδοχέα ή αμφότερα Alk2 και Alk3. Μετά από 48 ώρες η έκφραση της ID1 εξετάστηκε με ποσοτική RT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή των 3 πειραμάτων που εκτελούνται εις διπλούν. ανάλυση (Ε) Western blot για id1 σε Η1299 κύτταρα με νοκ ντάουν ενός υποδοχέα Ι ΒΜΡ ή ο συνδυασμός νοκ ντάουν της Alk2 και Alk3, ή τα 3 BMP τύπου Ι υποδοχείς ενιαίου τύπου. Μελέτες έγιναν τουλάχιστον 2 φορές. Μελέτες δείχνουν φίμωση περισσότερους από έναν υποδοχέα απαιτείται για να μειώσει την έκφραση id1. (F) Ποσοτική RT-PCR του τύπου Ι ΒΜΡ υποδοχείς μετά knockdown του Alk2 και Alk3, ή κάθε 3 ΒΜΡ τύπου Ι υποδοχείς. Μελέτες που έχουν γίνει 3 φορές εις διπλούν αναφέρονται ως επί τοις εκατό του ελέγχου. (G) Η1299 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με φορέα ένθεμα, ουσιαστικά δραστική Alk3 (γα-Alk3), ή ουσιαστικά δραστική Alk6 φορείς έκφρασης (γα-Alk6) και ο ανταποκριτής BRE-λουσιφεράσης. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ DMSO ή 1 μΜ ανταγωνιστή υποδοχέα ΒΜΡ για 24 ώρες και η δραστικότητα μετρήθηκε luciferace. Δεδομένα καταδεικνύει την μέση τιμή τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα παρουσιάζονται ως η επί τοις εκατό του ελέγχου.

Η

Ένα δεύτερο σύνολο siRNA που στοχεύει κάθε υποδοχέα ΒΜΡ τύπου Ι χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει περαιτέρω BMP σηματοδότησης. Αυτά siRNA προκάλεσε επίσης σημαντική μείωση της έκφρασης του στοχευμένου υποδοχέα στον Α549 και Η1299 κύτταρα (Σχήμα S3). Εξετάζοντας την εξειδίκευση αυτών των siRNA έδειξαν επίσης ότι knockdown ενός ενιαίου υποδοχέα προκάλεσε κάποια αρνητική ρύθμιση του άλλου τύπου Ι ΒΜΡ υποδοχέων (σχήμα S3). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι υπάρχει διασταυρούμενη ρύθμιση μεταξύ των διαφόρων τύπου Ι ΒΜΡ υποδοχείς. Και πάλι, knockdown ενός Ι υποδοχέα ΒΜΡ ενιαίου τύπου δεν ήταν επαρκής για να μειώσει την έκφραση ID1 είτε στο Α549 και κύτταρα Η1299 (σχήμα S3). Για να εξεταστεί περαιτέρω σηματοδότηση υποδοχέα BMP, κάθε υποδοχέας σίγησε και Smad 1/5/8 δραστικότητα προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία BRE-λουσιφεράσης. Σίγαση μόνο μία ΒΜΡ υποδοχέα τύπου Ι δεν προκάλεσε μείωση στην Smad-1/5/8 Δραστηριότητες (σχήμα S3). Με qRT-PCR, knockdown όλων των 3 τύπου Ι BMP υποδοχείς στα κύτταρα Α549 προκάλεσε μια σημαντική μείωση στην έκφραση του ID1 (σχήμα S3). Η knockdown όλων των τύπων Ι ΒΜΡ υποδοχείς (Alk2, Alk3 και Alk6) επιβεβαιώθηκε με qRT-PCR (σχήμα S3). Η ανάλυση στυπώματος Western και πάλι έδειξε ότι knockdown ενός μόνο υποδοχέα στα κύτταρα Η1299 δεν ήταν επαρκής για να μειώσουν την έκφραση των ID1 (σχήμα S3). Συνεπής με άλλη ομάδα μας των siRNA, νοκ ντάουν της alk2 + Alk3 ή alk2, Alk3 και Alk6 προκάλεσε μείωση στην πρωτεΐνη έκφραση id1 (σχήμα S3). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν ότι η ΒΜΡ σηματοδότηση διαμεσολαβείται από περισσότερους από έναν τύπο Ι υποδοχέα ΒΜΡ σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα.

στην κυτταρική γραμμή μυοβλάστη ποντικού C2C12, DMH1 ανέστειλε Alk2 και Alk3 δραστηριότητα, αλλά έχει αναφερθεί να έχουν αμελητέα ανασταλτικές επιδράσεις για Alk6 [26]. DMH2 είναι γνωστό ότι αναστέλλει Alk2 και LDN αναστέλλει αποτελεσματικά alk2, Alk3 και Alk6 [26]. Για να ελεγχθεί η επιλεκτικότητα υποδοχέα του DMH1, DMH2, και LDN σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, ουσιαστικά δραστική Alk3 (γα-Alk3) ή Alk6 (γα-Alk6) συν-επιμολύνθηκε με τον ανταποκριτή BRE-luciferace εντός Η1299 κύτταρα (σχήμα 3G). DMH2 προκάλεσε μεγαλύτερη μείωση των Alk3 δραστηριότητας από DMH1 και LDN στα κύτταρα Η1299. Οι ανταγωνιστές BMP προκάλεσε κάποια αναστολή της Alk6 αλλά μικρότερη από εκείνη που παρατηρείται για Alk3 (σχήμα 3G).

Αναστολή της ΒΜΡ τύπου Ι υποδοχείς Μειώνει την ανάπτυξη των κυττάρων

Στη συνέχεια, τα αποτελέσματα του αποκλεισμού τύπου Ι BMP υποδοχείς στην κυτταρική ανάπτυξη εξετάστηκε εκτελώντας μετρήσεις κυττάρων. τύπου ΒΜΡ Ι υποδοχέα ανταγωνιστές προκάλεσε σημαντική μείωση του αριθμού των κυττάρων μετά από 7 ημέρες τόσο στο Α549 και κυτταρικές γραμμές Η1299 (Σχήμα 4Α). Οι εκλεκτικοί ανταγωνιστές του υποδοχέα BMP προκάλεσε μεγαλύτερη μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων στα κύτταρα Η1299 σύγκριση με τα κύτταρα Α549. DMH2 προκάλεσε σημαντικά περισσότερο από ό, τι η αναστολή της ανάπτυξης DMH1 στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4Α). Για να αφαιρέσετε το δυναμικό προσδέματα BMP στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας, τα κύτταρα Η1299 καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού και κατεργάζεται με DMH2. DMH2 προκάλεσε επίσης σημαντική αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης των Η1299 κυττάρων που καλλιεργούνται σε μέσο άνευ (SFM) (Σχήμα 4Β) του ορού, υποδεικνύοντας ότι ΒΜΡ μπορεί σηματοδότησης εμφανίζεται σε μια αυτο-αυτόνομο τρόπο. Πολλαπλασιασμό εξετάστηκε με προσδιορισμό βρωμοδεοξυουριδίνης (BrdU) ενσωμάτωση. DMH2 προκάλεσε μια εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Η1299 μέσα σε 24 ώρες (σχήμα 4C) και μια πιο βαθιά επίδραση παρατηρήθηκε στις 48 ώρες (Σχήμα 4C). Knockdown όλων των 3 τύπου Ι ΒΜΡ υποδοχείς (Alk2, Alk3 και Alk6) στα κύτταρα Η1299 προκάλεσε επίσης σημαντική μείωση στην ενσωμάτωση BrdU (σχήμα 4D). Εξόντωση Alk2, Alk3 και Alk6 χρησιμοποιώντας το δεύτερο σύνολο siRNA προκάλεσε επίσης σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού στα κύτταρα Η1299 (σχήμα S3). Ποσοτική RT-PCR έδειξε ότι με αυτό το δεύτερο σύνολο siRNA που στοχεύει όλες τις 3 τύπου Ι BMP υποδοχείς στα κύτταρα Η1299 προκάλεσε μειορύθμιση του Alk2 και Alk6 αλλά όχι Alk3 (σχήμα S3). Αυτό υποδηλώνει ότι η αναστολή της Alk2 και Alk6 είναι αρκετές για να μειώνεται BMP σηματοδότηση σε Η1299 κύτταρα.

(Α) και Α549 Η1299 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM 5% FCS υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO, 10 μΜ Dorsomorphin, 1 μΜ DMH1, 1 μΜ DMH2, ή 1 μΜ LDN για 7 ημέρες και μετρήσεις κυττάρων πραγματοποιήθηκαν. (Β) Η1299 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε SFM υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ DMSO ή 1 μΜ DMH2 για 7 ημέρες και μετρήσεις κυττάρων πραγματοποιήθηκαν. ενσωμάτωση (Γ) BrdU του Η1299 κύτταρα κατεργασμένα με DMSO ή 1 μΜ ή 5 μΜ DMH2 για 24 και 48 ώρες. ενσωμάτωση (D) BrdU των Η1299 κυττάρων επιμολυσμένων με siRNA που στοχεύει όλων των υποδοχέων ΒΜΡ ή ελέγχου siRNA τύπου Ι. (C-D) Τα δεδομένα είναι ο μέσος όρος 3 πειραμάτων εις τριπλούν αναφέρεται ως το ποσοστό των κυττάρων σε επεξεργασία ελέγχου. (Ε-G) ανάπτυξη αποικίας Α549 και Η1299 κύτταρα επεξεργασμένα με 1 μΜ DMSO ή 1 μΜ επιλεκτικός ανταγωνιστής υποδοχέων ΒΜΡ. (Ε) Φωτογραφία ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος. (F-G) Τα στοιχεία δείχνουν το μέσο όρο τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα αναφέρονται ως η επί τοις εκατό του ελέγχου. (G) DMH1 μειώνεται αγκύρωση ανεξάρτητη ανάπτυξη κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα. Α549 και Η1299 κύτταρα σε μαλακό άγαρ υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ DMS0 ή 1 μΜ DMH1 για 2 εβδομάδες και ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκαν. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος 3 ανεξάρτητων πειραμάτων αναφέρονται ως η επί τοις εκατό του ελέγχου.

Η

ΒΜΡ Τύπου Ι Ανταγωνιστές των Υποδοχέων ελάττωση της αύξησης Κλωνογόνος

Η επίδραση των ανταγωνιστών των υποδοχέων ΒΜΡ σε κλωνογονική ανάπτυξη των κυττάρων εξετάστηκε. DMH1, DMH2, και LDN όλα προκάλεσε μια σημαντική μείωση των κλωνογόνων ανάπτυξης τόσο στην Α549 και κυτταρικές γραμμές Η1299 (Σχήμα 4Ε-G). Κλωνογονικού ανάπτυξης ανεστάλη περισσότερο από DMH2 και LDN από DMH1 (σχήμα 4Ε-G). Για την περαιτέρω εκτίμηση των επιδράσεων των DMH1 επί κλωνογονική ανάπτυξη, εξετάστηκε αγκυροβόλιο ανεξάρτητη ανάπτυξη. DMH1 μειωθεί σημαντικά αγκυροβόλιο ανεξάρτητη ανάπτυξη τόσο Α549 και κύτταρα Η1299 (Σχήμα 4Η). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι basally ενεργός σηματοδότηση ΒΜΡ διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και ενισχύει την κλωνογόνο αύξηση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα.

Αναστολή της ΒΜΡ τύπου Ι υποδοχείς προκαλεί

Θανάτου Κυττάρου

Η επίδραση της ΒΜΡ σηματοδότησης στην επιβίωση των κυττάρων εξετάστηκε . Ο κυτταρικός θάνατος προσδιορίσθηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία πρόσληψης αιθιδίου βρωμιδίου. Το βρωμιούχο αιθίδιο λαμβάνεται μόνο από τα κύτταρα που έχουν χάσει την ακεραιότητα της μεμβράνης, η οποία συμβαίνει όταν τα κύτταρα πεθαίνουν με νέκρωση ή απόπτωση [27]. BMH2 επάγεται κυτταρικό θάνατο στα κύτταρα Η1299 εντός 12 ωρών, και στις 48 ώρες όλα τα ανταγωνιστές προκάλεσε σημαντική αύξηση στο ποσοστό των νεκρών κυττάρων (σχήμα 5Α). Μέσα σε 48 ώρες, Dorsomorphin, DMH1 και DMH2 προκάλεσε σημαντική αύξηση σε κυτταρικό θάνατο στα κύτταρα Α549 (Εικόνα 5Β). Για να αξιολογηθεί περαιτέρω κυτταρικό θάνατο, τα κύτταρα Η1299 καλλιεργήθηκαν σε DMEM 5% FCS υποβλήθηκαν σε θεραπεία με DMH2 για 4 ημέρες και το ποσοστό των νεκρών κυττάρων προσδιορίσθηκε με βαφή κυανούν τρυπανίου. DMH2 προκάλεσε σημαντική αύξηση σε κυτταρικό θάνατο, η οποία ήταν εξαρτώμενη από τη δόση (σχήμα 5C). Το ποσοστό των νεκρών κυττάρων ήταν ακόμη υψηλότερο σε Η1299 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε SFM (σχήμα 5D). Μία αμίνη αντιδραστική φθορίζουσα χρωστική χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του κυτταρικού θανάτου, η οποία έδειξε επίσης ότι DMH2 επάγεται κυτταρικό θάνατο στα κύτταρα Η1299 (Σχήμα 5Ε). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι BMP ανταγωνιστές προκαλεί κυτταρικό θάνατο με αναστολή των BMP σηματοδότησης, τρίκλινα νοκ ντάουν της alk2, Alk3 και Alk6 υποδοχείς εκτελέστηκε. Εξόντωση Alk2, Alk3 και Alk6 υποδοχείς προκάλεσε σημαντική αύξηση του ποσοστού των νεκρών κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα ελέγχου siRNA (Σχήμα 5F). Ένα δεύτερο σύνολο siRNA που στοχεύει alk2, Alk3 και Alk6 προκάλεσε επίσης σημαντική αύξηση στο ποσοστό των κυττάρων θανάτου (εικόνα S3). Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι ανταγωνίζεται την δραστηριότητα των υποδοχέων Ι ΒΜΡ τύπο επάγει κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

(Α-Β) Η1299 και Α549 καλλιεργήθηκαν σε DMEM 5% FCS υποβλήθηκαν σε αγωγή με DMSO ή έναν ανταγωνιστή υποδοχέα ΒΜΡ (10 μΜ Dorsomorphin ή 1 μΜ επιλεκτικός ανταγωνιστής). Το ποσοστό των κυττάρων τα οποία καταλαμβάνουν βρωμιούχο αιθίδιο προσδιορίστηκε στη συνέχεια. Τα δεδομένα αναφέρονται ως η μέση τιμή τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. (Γ) Η1299 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM 5% FCS υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO, 1 μΜ και μ5 Μ DMH2 για 7 ημέρες, χρωματίστηκαν με Typan μπλε, και μετρήσεις κυττάρων πραγματοποιήθηκαν. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο 4 πειραμάτων αναφέρονται ως τα νεκρά κύτταρα τοις εκατό. (D) Η1299 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε SFM υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 1 μΜ DMH2 για 7 ημέρες, χρωματίστηκαν με Typan μπλε, και μετρήσεις κυττάρων πραγματοποιήθηκαν. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή 5 πειραμάτων αναφέρονται ως νεκρά κύτταρα τοις εκατό. (Ε) θάνατος κυττάρων καθορίστηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής ανίχνευση πρόσληψη μιας αμίνης αντιδραστικό φθορίζουσα χρωστική σε Η1299 κύτταρα κατεργασμένα με DMS0 ή DMH2 για 4 ημέρες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή 3 ανεξαρτήτων πειραμάτων. κύτταρα (F) Η Η1299 είχαν επιμολυνθεί με siRNA ελέγχου και siRNA alk2 στόχευσης, Alk3 και Alk6. Μετά από 2 ημέρες προσδιορίστηκε το ποσοστό των κυττάρων που χρωματίζονται για βρωμιούχο αιθίδιο. Τα δεδομένα αναφέρονται ως η μέση τιμή των 6 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

BMP σηματοδότησης ρυθμίζεται σε ένα Self-αυτόνομα

Η επαγωγή του κυτταρικού θανάτου και της καταστολής της ανάπτυξης που προκαλείται από ανταγωνιστές των υποδοχέων BMP του καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών που αναπτύσσονται σε SFM πρότεινε ότι BMP σηματοδότηση συμβαίνει σε μια αυτο-αυτόνομο τρόπο. Προγενέστερες μελέτες έχουν δείξει ότι ο καρκίνος του πνεύμονα κυτταρικές σειρές παράγουν την ώριμη πρωτεΐνη ΒΜΡ2, το οποίο είναι η δραστική μορφή [8]. Για να εξασφαλιστεί ότι ο καρκίνος του πνεύμονα κύτταρα εκκρίνουν ΒΜΡ2, μία ELISA του μέσου κυτταρικής καλλιέργειας διεξήχθη. ΒΜΡ2 πρωτεΐνη δεν ανιχνεύθηκε σε DMEM με εμβρυϊκό ορό 5% (FCS) ή σε μέσο ελεύθερο ορού (SFM) (Σχήμα 6Α). ΒΜΡ2 ανιχνεύθηκε στο μέσο όταν κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα καλλιεργήθηκαν σε είτε SFM ή ϋΜΕΜ με 5% FCS (Σχήμα 6Α). Από άλλες ΒΜΡ μπορούσε να είναι σε FCS, τα αποτελέσματα των ανταγωνιστών των υποδοχέων ΒΜΡ για τη ρύθμιση της ΒΜΡ σηματοδότηση εξετάσθηκε σε SFM. Η φωσφορυλιωμένη Smad 1/5 και έκφραση ID1 ανιχνεύθηκε σε Η1299 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο (εικόνα 6Β) στον ορό. τύπου ΒΜΡ Ι υποδοχέα ανταγωνιστές μειώθηκε pSmad 1/5 και ID1 έκφραση των Η1299 κυττάρων που καλλιεργούνται σε SFM (Σχήμα 6Β).

(Α) ΒΜΡ2 ELISA πραγματοποιήθηκε στο DMEM 5% FCS και SFM ελλείψει κύτταρα (μέσο). Ένα ΒΜΡ2 ELISA πραγματοποιήθηκε στο DMEM 5% FCS και μέσο SFM κυτταρικής καλλιέργειας που περιέχει Α549 και κύτταρα Η1299 για 48 ώρες. Πειράματα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή τουλάχιστον 5 πειράματα που εκτελέστηκαν εις τριπλούν. (Β) BMP ανταγωνιστές μειώνουν BMP σηματοδότηση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα καλλιεργήθηκαν σε SFM. κύτταρα Η1299 καλλιεργήθηκαν σε SFM υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ DMSO, 1 μΜ DMH2 ή 1 μΜ LDN για 48 ώρες και ανάλυση στυπώματος Western εκτελείται. (Γ) Ποσοτική RT-PCR για την έκφραση ΒΜΡ2 48 ώρες μετά την επιμόλυνση Η1299 κυττάρων με έλεγχο siRNA ή siRNA που στοχεύει ΒΜΡ2. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το ποσοστό ελέγχου του μέσου όρου των 4 ανεξάρτητα πειράματα. (Δ) Ανάλυση Western blot των Η1299 κυττάρων σε SFM 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με τον έλεγχο siRNA ή siRNA που στοχεύει ΒΜΡ2. ΒΜΡ2 knockdown προκαλεί μια μείωση στην έκφραση του pSmad 1/5 και ID1. (Ε) εξόντωση ΒΜΡ2 επάγει κυτταρικό θάνατο. κύτταρα Η1299 σε SFM επιμολύνονται με έλεγχο siRNA ή siRNA που στοχεύει ΒΜΡ2. Μετά από 48 ώρες, το ποσοστό των νεκρών κυττάρων προσδιορίσθηκε με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των 4 ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν.

Η

Για να εξετάσει περαιτέρω αυτο-αυτόνομη σηματοδότηση του καταρράκτη σηματοδότησης BMP, έκφραση ΒΜΡ2 χτυπήθηκε κάτω χρησιμοποιώντας siRNA. Ποσοτική RT-PCR έδειξε ότι το siRNA που στοχεύει ΒΜΡ2 προκάλεσε μείωση μεγαλύτερη από 60% στην έκφραση της ΒΜΡ2 (σχήμα 6C). Knockdown του ΒΜΡ2 των Η1299 κυττάρων που καλλιεργούνται σε SFM προκάλεσε μια μείωση στην έκφραση πρωτεΐνης φωσφορυλιωμένων Smad 1/5 και ID1 (σχήμα 6D). ΒΜΡ2 knockdown προκάλεσε σημαντική αύξηση του ποσοστού των νεκρών κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα αυξάνεται σε SFM (Σχήμα 6Ε). Αυτές οι μελέτες υποδεικνύουν ότι η βασική δραστηριότητα της ΒΜΡ κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα διεγείρεται σε μια αυτο-αυτόνομα, η οποία μπορεί να ανασταλεί με ανταγωνισμό τον τύπο ΒΜΡ υποδοχείς Ι.

εξόντωση ID 1 και Ιδ3 Μειώνει την Ανάπτυξη κυττάρων και επάγει κυτταρικό Θάνατος

Στη συνέχεια, θα εξεταστεί κατά πόσον ID 1 και /ή Ιδ3 ρυθμίζει την κυτταρική επιβίωση και την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα. Εξόντωση ID1 χρησιμοποιώντας siRNA προκάλεσε μείωση στο επίπεδο πρωτεΐνης ID1 αλλά όχι Ιδ3 (σχήμα 7Α). Knockdown του ID3 προκάλεσε μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης Ιδ3 χωρίς να επηρεάζει την έκφραση του ID1 (σχήμα 7Α). Ποσοτική RT-PCR έδειξε επίσης μείωση της ID 1 και Ιδ3 αντιστοίχως (Σχήμα 7Β). Εξόντωση ID1 ή ένδειξη ID3 σε Η1299 κύτταρα προκάλεσε σημαντική αύξηση στο ποσοστό των νεκρών κυττάρων, όπως προσδιορίζεται με χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο (Σχήμα 7C). μετρήσεις κυττάρων με χρήση Trypan μπλε χρώση έδειξαν ότι η εξουδετέρωση της id1 μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων και προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο, αλλά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Σχήμα 7D, F). Knockdown του ID3 προκάλεσε μια πολύ σημαντική θανάτου στην κυτταρική ανάπτυξη και την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Σχήμα 7D, F). Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η μείωση της έκφρασης Id είναι τουλάχιστον εν μέρει ο μηχανισμός με τον οποίο ανταγωνιστές υποδοχέα ΒΜΡ επάγουν κυτταρικό θάνατο και μειώνουν την ανάπτυξη των κυττάρων. Σε Η1299 κύτταρα, Ιδ3 μπορεί να έχουν μεγαλύτερο ρόλο στη ρύθμιση της BMP σηματοδότησης από id1.

(Α) ανάλυση Western blot για το ID 1 και Ιδ3 48 ώρες μετά Η1299 κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA και siRNA που στοχεύει id1 ή ένδειξη ID3. (Β) Ποσοτική RT-PCR για ID 1 και Ιδ3 μετά Η1299 κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA ελέγχου και siRNA που στοχεύει ID1 ή ένδειξη ID3. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το ποσοστό ελέγχου του μέσου όρου των 2 πειραμάτων. (Γ) Η1299 κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA ελέγχου ή siRNA που στοχεύει ID1 ή ένδειξη ID3. Μετά από 48 ώρες προσδιορίστηκε το ποσοστό των κυττάρων που χρωματίζονται για βρωμιούχο αιθίδιο. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος από 4 ανεξάρτητα πειράματα. (D-F) Η1299 κύτταρα επιμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA και siRNA που στοχεύει ID1 ή ένδειξη ID3. Μετά από 7 ημέρες τα κύτταρα βάφτηκαν με κυανούν του τρυπανίου και προσδιορίστηκε ο αριθμός ζωντανών και νεκρών κυττάρων. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν την ποσοστιαία μεταβολή από siRNA ελέγχου του (D) εν ζωή ή (F) τα νεκρά κύτταρα. (Ε) αντιπροσωπεύει το ποσοστό των κυττάρων που ήταν νεκρός. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των 4 ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

κύτταρα που υπερεκφράζουν Ιδ3 είναι ανθεκτικά στην DMH2

Για να καθορίσετε περαιτέρω αν ID 1 και Ιδ3 μεσολαβήσει BMP σηματοδότηση, φορείς έκφρασης ID 1 και Ιδ3 ήταν σταθερά διαμολύνεται σε Η1299 κύτταρα. Εξαναγκασμένη έκφραση ID1 προκάλεσε αύξηση στην πρωτεϊνική έκφραση του ID1 αλλά όχι Ιδ3 (Σχήμα 8Α). Εξαναγκασμένη έκφραση του ID3 προκάλεσε αύξηση της έκφρασης του ID3 αλλά όχι ID1 (Σχήμα 8Β). Υπήρξε μια μικρή αύξηση στην έκφραση ακτίνης στα κύτταρα Η1299 /Ιδ3. Από ακτίνη θα μπορούσε να είναι έως και ρυθμίζεται από Ιδ3 υπερέκφραση, εξετάστηκε η έκφραση του GAPDH. Με ανάλυση κηλίδας Western έδειξαν ότι η έκφραση GAPDH ήταν το ίδιο μεταξύ των κυττάρων ελέγχου φορέα και κύτταρα Η1299 /Ιδ3. DMH2 προκάλεσε μια παρόμοια μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη των κυττάρων Η1299 /ID1 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα (Σχήμα 8C). DMH2 δεν προκάλεσε αναστολή της ανάπτυξης (σχήμα 8C) ή επάγουν κυτταρικό θάνατο (σχήμα 8D) των κυττάρων Η1299 /Ιδ3. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν περαιτέρω ότι οι βιολογικές επιδράσεις που προκαλούνται από ανταγωνιστές του υποδοχέα ΒΜΡ περιλαμβάνει πρωτεΐνες Id.

Η1299 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με φορείς έκφρασης ID 1 και Ιδ3 ή τον φορέα ένθεμα. (Α-Β) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει αυξημένη έκφραση του (Α) ID1 ή (Β) Ιδ3 στην διαμολυσμένη κυτταρική σειρά. (C-D) Η1299 /κυττάρων ID 1 και Η1299 /Ιδ3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ DMSO ή 1 μΜ DMH2 για 7 ημέρες και η ποσοστιαία ζωντανά και τα νεκρά κύτταρα προσδιορίσθηκε. (C) DMH2 προκάλεσε καταστολή της ανάπτυξης του φορέα ελέγχου και κύτταρα Η1299 /id1 αλλά όχι κύτταρα Η1299 /Ιδ3. επαγόμενο κυτταρικό θάνατο (D) DMH2 στα κύτταρα ελέγχου φορέα (H /con), αλλά όχι στα κύτταρα Η1299 /Ιδ3 (H /ID3). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή τουλάχιστον 3 πειράματα που αναφέρονται ως το ποσοστό των κυττάρων σε επεξεργασία ελέγχου. (Ε) DMH2 deceases κυτταρική ανάπτυξη των αθανατοποιημένων φυσιολογικών ανθρώπινων βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων (HBEC), αλλά όχι τα ανθρώπινα αορτικά ενδοθηλιακά κύτταρα (HAEC). Κυτταρικές σειρές που αναπτύσσονται σε SFM υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1 μΜ DMSO ή 1 μΜ DMH2 για 7 ημέρα και μετρήσεις κυττάρων πραγματοποιήθηκαν. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή τουλάχιστον 3 πειράματα που αναφέρονται ως το ποσοστό των κυττάρων σε επεξεργασία ελέγχου. (F) ανάλυση Western blot δείχνουν υψηλότερη έκφραση της pSmad 1/5 και ID1 στο HBEC σε σύγκριση με HAEC. 1 μΜ DMH2 για 48 ώρες μειωμένη έκφραση pSmad 1/5 και ID1 στο HBEC αλλά όχι HAEC.

Η

DMH2 καταστέλλει την ανάπτυξη των Κανονική βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων αλλά όχι ενδοθηλιακών κυττάρων

Η ΒΜΡ2 καταρράκτη σηματοδότησης είναι απαραίτητη για την πρώιμη ανάπτυξη του πνεύμονα με υψηλή έκφραση σε επιθηλιακά και αγγειακά προγονικά [28]. Κατά την ολοκλήρωση της πτώσης σηματοδότησης πνεύμονα μορφογένεση ΒΜΡ με ελάχιστα ανιχνεύσιμη έκφραση σε ενήλικα φυσιολογικό πνευμονικό ιστό [9], [28], [29]. ΒΜΡ σηματοδότηση επανενεργοποιείται σε φυσιολογικά βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα ενήλικα από φλεγμονή και βλάβη ιστού [28], [29]. Για να οριστεί περαιτέρω η ειδικότητα των ανταγωνιστών των υποδοχέων ΒΜΡ, εξετάσαμε αν φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (HBEC) αθανατοποιημένα χωρίς ιικές ογκοπρωτεΐνες [30] και κανονικά ανθρώπινα αορτικά ενδοθηλιακά κύτταρα (HAEC) αποκρίνονται σε DMH2. Όπως αναμενόταν DMH2 προκάλεσε μια σημαντική μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων Η1299 (57%) και παρόμοια μείωση σε HBEC (42%) (σχήμα 8Ε). DMH2 προκάλεσε μόνο μια μείωση κατά 15% στην κυτταρική ανάπτυξη των HAEC (σχήμα 8Ε). HBEC είχαν υψηλότερο επίπεδο έκφρασης pSmad 1/5 και ID1 από HAEC (Σχήμα 8F). DMH2 προκάλεσε μείωση στην έκφραση του pSmad 1/5 και ID1 σε HBEC αλλά όχι στην HAEC. BMP ανταγωνιστές επίσης μειώθηκε έκφραση ID 1 και επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης των κανονικών ανθρώπινων βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων με SV40 αθανατοποιημένα γονίδιο μεγάλο Τ αντιγόνο (κύτταρα BEAS-2Β) [31] (σχήμα S4 και τα δεδομένα δεν εμφανίζονται).