Αφηρημένο

Ιστορικό

Στοιχεία της πρόβλεψης βιοδεικτών είναι απαραίτητη για την η επιτυχής ανάπτυξη της στοχευμένης θεραπείας. Η ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα 1 υποδοχέα (IGF1R) έχει εξεταστεί ως δυνητικό θεραπευτικό στόχο για διάφορους καρκίνους. Ωστόσο, πρόσφατες κλινικές μελέτες έδειξαν ότι τα αντι-IGF1R αντισώματος και χημειοθεραπείας δεν είναι αποτελεσματικές για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

Μεθοδολογία Κύρια Ευρήματα /

Για να ορίσετε βιοδείκτες για την πρόβλεψη επιτυχούς IGF1R στοχευμένη θεραπεία, έχουμε αξιολόγησε την επίδραση αντι-πολλαπλασιασμό των figitumumab (CP-751,871), ένα εξανθρωπισμένο αντι-IGF1R αντίσωμα, έναντι εννέα γαστρικό και οκτώ ηπατοκυτταρικού καρκινικές κυτταρικές σειρές. Από 17 κυτταρικές γραμμές καρκίνου, figitumumab ανέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη των τριών κυτταρικών σειρών (SNU719, HepG2, και SNU368), μειωμένα επίπεδα ρ-ΑΚΤ και π-STAT3 και επάγεται G 1 συλλήψεως με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτά τα κύτταρα έδειξαν συν-υπερέκφραση και μεταβάλλεται κινητικότητα του υποδοχέα IGF1R και ινσουλίνης (IR). Immunoprecipitaion (ΙΡ) δοκιμασίες και ELISA επιβεβαίωσε την παρουσία του IGF1R /IR ετεροδιμερικών υποδοχέων σε figitumumab-ευαίσθητα κύτταρα. Η θεραπεία με figitumumab οδήγησε στην διάσπαση του ετεροδιμερικών υποδοχέων IGF1-εξαρτώμενη και ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου με μειωμένα επίπεδα ετεροδιμερικών υποδοχέων σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Είμαστε δίπλα διαπίστωσε ότι τόσο IGF1R και IR ήταν Ν-συνδεδεμένες glyosylated στο figitumumab-ευαίσθητα κύτταρα. Ειδικότερα, φασματομετρία μάζας έδειξε ότι IGF1R είχε Ν-συνδεδεμένες γλυκάνες στο N913 σε τρεις κυτταρικές γραμμές figitumumab ευαίσθητη. Παρατηρήσαμε ότι η απουσία της Ν-γλυκοζυλίωση σε N913 οδήγησε σε έλλειψη μεμβρανώδη εντοπισμό των IGF1R και figitumumab αναισθησία.

Συμπέρασμα και τη σημασία

Τα στοιχεία δείχνουν ότι το επίπεδο των Ν-συνδεδεμένων ετεροδιμερικός υποδοχέας γλυκοζυλιωμένη IGF1R /IR είναι πολύ συνδέεται με ευαισθησία στο αντι-IGF1R αντισωμάτων σε καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Kim JG, Kang MJ, Yoon YK, Kim HP, το Park J, Τραγούδι SH, et al. (2012) Ο ετεροδιμερισμός της γλυκοζυλιωμένης Insulin-Like Growth Factor-1 υποδοχείς και υποδοχείς της ινσουλίνης σε καρκινικά κύτταρα ευαίσθητα σε αντι-IGF1R αντίσωμα. PLoS ONE 7 (3): e33322. doi: 10.1371 /journal.pone.0033322

Επιμέλεια: Frank T. Kolligs, Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 29, Οκτ, 2011? Δεκτές: 7 Φεβ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 Μαρτίου, 2012

Copyright: © 2012 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από την κορεατική υγειονομικής 21 και τεχνολογίας R & amp? έργου D, Υπουργείο Υγείας, Πρόνοιας & amp? Οικογενειακών Υποθέσεων, Δημοκρατία της Κορέας (A091081), και υποστηρίζεται από την επιχορήγηση Νο R31-2008-000-10103-0 από το πρόγραμμα World Class Πανεπιστήμιο του ΜΕΣΤ και την NRF. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Με εκκρίνεται συνδέτες του, IGF1 και IGF2, ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας 1 υποδοχέα (IGF1R) εκφράζεται έντονα σε πολλά ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των γαστρικών (GC) και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) [1] – [ ,,,0],5]. Ως αποτέλεσμα, έχουν αναπτυχθεί μία ποικιλία στρατηγικών αναστολής της οδού σηματοδότησης IGF1R κατά τη διάρκεια των δύο τελευταίων δεκαετιών [6]. Μεταξύ αυτών, ένα αντικαρκινικό θεραπευτική στρατηγική που χρησιμοποιούν πλήρως ανθρωποποιημένα αντισώματα έχει γίνει μια σημαντική εστίαση της έρευνας [7], γιατί έχει μεγάλες δυνατότητες για να γίνει επιτυχής θεραπευτική αντι-καρκίνου που θα μπορούσε να αναστείλει αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων με χαμηλή τοξικότητα και να παρέχει κλινικά οφέλη όταν χορηγείται σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία [8] – [14]. Ένα πλήρως ανθρωποποιημένο αντι-IGF1R μονοκλωνικό αντίσωμα (figitumumab) έχει δοκιμαστεί σε κλινικές μελέτες φάσης ΙΙΙ? Ωστόσο, καμία στατιστικώς σημαντική βελτίωση δείχθηκε με χορήγηση figitumumab μαζί με την κλασική χημειοθεραπεία σε ασθενείς με προχωρημένο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [15].

Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η Α ισομορφή του υποδοχέα της ινσουλίνης ( IR) είναι αφύσικα υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου και μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου [16] – [19]. Αυτή IR μερίδια μια υψηλή ομολογία αλληλουχίας με IGF1R, ιδίως στο ενδοκυτταρική περιοχή κινάσης [7], [20]. IR προ-υποδοχείς μπορεί να σχηματίσει ετεροδιμερείς υποδοχείς (HR) με IGF1R προ-υποδοχείς μετα-μεταφραστικά, πριν από την διάσπαση για να παράγουν δύο εξωκυτταρικό υπομονάδες άλφα και δύο υπομονάδες βήτα που περιέχουν εξωκυτταρικές, διαμεμβρανικές, και περιοχών κινάσης τυροσίνης [21]. Ως εκ τούτου, όταν τα κύτταρα συν-express IGF1R και IR, οι φιλο-υποδοχείς μπορεί να ετεροδιμερίσει να δημιουργήσει IGF1R /IR HRs [22] – [24]. Αυτές HRs μπορούν επίσης να υπερεκφράζεται σε διάφορα κύτταρα όγκου και τα δείγματα, ως αποτέλεσμα τόσο της IGF1R και IR υπερέκφραση [2], [25], [26]. Κατά συνέπεια, η σχετική αφθονία των IRs επηρεάζει ενεργοποίησης του συστήματος IGF μέσω ώρες, η οποία ανταποκρίνεται σε τόσο ινσουλίνη και IGFs [27] – [29]. Στα καρκινικά κύτταρα με υψηλά επίπεδα IGF1R /IR ώρες, IGF1 και IGF2 ενεργοποιούν διάφορα μονοπάτια προς τα κάτω σηματοδότηση μέσω ετεροδιμερείς υποδοχείς και όχι μέσω ομοδιμερική IGF1Rs [30].

Μια σειρά από μελέτες έχουν προσπαθήσει να προσδιορίσουν την έξυπνη βιοδείκτες με προκλινικές και κλινική σημασία [15], [31], [32]. Ταυτοποίηση πρόβλεψης βιοδείκτες για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της IGF1R στοχευμένη θεραπεία για την κατάλληλη ασθενείς, ωστόσο, εξακολουθεί να είναι αναγκαία. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι figitumumab κατέχει μια υψηλή συγγένεια για IGF1R /IR ετεροδιμερικών υποδοχέων όπως επίσης και υποδοχείς ομοδιμερές IGF1 και αναστέλλει την IGF /IGF1R άξονα σηματοδότησης σε γαστρικό καρκίνο και τα κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Επιπλέον, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι λειτουργική δεσμευμένη σε μεμβράνη IGF1R /IR ετεροδιμερείς υποδοχείς παίζουν σημαντικό ρόλο στη σηματοδότηση IGF1 [26], [33] και ως εκ τούτου μπορεί να χρησιμεύσει ως βιοδείκτες για την πρόβλεψη της ευαισθησίας σε αντι-IGF1R αντίσωμα.

Αποτελέσματα

αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του figitumumab

Ως πρώτο βήμα, αξιολογήσαμε την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του figitumumab, ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που εμποδίζει συνδέτες από δέσμευση σε IGF1R [12], για 17 καρκινικές κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Α). Μερικά κύτταρα θεωρείται ότι είναι ευαίσθητα σε figitumumab, όπως SNU719, HepG2, και SNU368, έδειξε μια δοσοεξαρτώμενη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων? IC

30 τιμή του figitumumab (αναστολές αύξηση του ~ 30%) για κάθε κυτταρική γραμμή ήταν 0.063 μg /ml, 0.062 μg /ml, και 0,047 μg /ml, αντίστοιχα (Πίνακας 1).

Α ) Ανάλυση της αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του figitumumab στη γαστρική και ηπατοκυτταρικού καρκινώματος κύτταρα. Δύο ομάδες των καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων εννέα κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και οκτώ ηπατοκυτταρικού κυτταρικές γραμμές καρκινώματος, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις figitumumab (0, 0.1, 1, και 10 μg /mL) για 120 ώρες για να αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων ελέγχου κατά 30%. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με μία δοκιμασία ΜΤΤ. Έξι αναπαράγουν φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε ανάλυση, και τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν. Τα δεδομένα από πανομοιότυπα φρεάτια παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος των υπόλοιπων κυττάρων. Μπαρ = ± SE. Β) Επίδραση της figitumumab στο σηματοδοτικό μονοπάτι IGF1R. ανάλυση Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη για να παρατηρηθεί το αποτέλεσμα δόσης-απόκρισης figitumumab (0,1-10 μg /mL) για σηματοδότηση IGF1R. SNU638, SNU719, SNU354, HepG2, και SNU368 κύτταρα εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις figitumumab για 72 ώρες. Τα επίπεδα των πρωτεϊνών που σχετίζονται με το μονοπάτι IGF1R και τις ενεργοποιημένες μορφές τους αναλύθηκαν. Οι διαφορές σε σχέση με τον έλεγχο που φαίνεται. Σε κάθε πίνακα, οι αντιπροσωπευτικές κηλίδες από τρία ανεξάρτητα πειράματα που δείχνονται. C) Επίδραση της figitumumab σχετικά με την κατανομή του κυτταρικού κύκλου. Figitumumab-ευαίσθητα κύτταρα (SNU719, HepG2, και SNU368) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του φαρμάκου [0 μg /mL (μαύρο στερεό bar), 0,1 μg /mL (γκρι στερεό bar), 1 μg /mL (λευκή ράβδος), και 10 μg /mL (σκούρο γκρι διαγραμμισμένη ράβδος)] για 48 ώρες και στη συνέχεια βάφονται με ιωδιούχο προπίδιο, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό των κυττάρων στην G

0 /G

1, S και G

2 /M φάσεις απεικονίζονται. Στήλες αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? Μπαρ = ± SE. *

P-

τιμές & lt? 0,05, **

P-

τιμές & lt? 0,01. D) Επίδραση figitumumab στην ανάπτυξη του όγκου σε ποντικούς που φέρουν ξενομοσχεύματα HepG2. κύτταρα HepG2 (1 × 10

7) εγχύθηκαν στο δεξί πλευρό γυμνών ποντικών (η = 5). Η θεραπεία με figitumumab (125 μg /mL [6.3 mg /kg σωματικού βάρους], μία φορά την εβδομάδα για 3 εβδομάδες) άρχισε μόλις ο όγκος του όγκου έφθασε 200 mm

3. Καμία σημαντική απώλεια σωματικού βάρους παρατηρήθηκε κατά την διάρκεια της μελέτης. Οι όγκοι μετρήθηκαν με παχύμετρο σε τακτά χρονικά διαστήματα. Οι μαύροι κύκλοι = αγωγή με έκδοχο ελέγχου μόνο (έλεγχος), ανοικτά τρίγωνα = αγωγή με figitumumab. Οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων (τα μεγέθη του όγκου των ποντικών ελέγχου και εκείνων των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με figitumumab) συγκρίθηκαν από την ημέρα 17 μέχρι το τέλος της περιόδου αγωγής (ημέρα 21) με τη χρήση

t

δοκιμή διπλής όψης του Student . *

P-

τιμές & lt? 0,05? **

P-

τιμές & lt?. 0,01 έναντι του ελέγχου

Η

Figitumumab διαταράσσει IGF1R σηματοδότησης κυρίως μέσω της ΑΚΤ και STAT3 οδών και προκαλεί G

1 σύλληψης

Για να εξετάσει το μηχανισμό μέσω του οποίου figitumumab αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, εξετάσαμε κατά πόσο υπήρχαν διαφορές στα κατάντη σηματοδότησης μεταξύ των ευαίσθητων και ανθεκτικών κυττάρων παρουσία του ορού μετά από μακροχρόνια θεραπεία με αύξοντα δόσεις figitumumab (Εικόνα 1Β). Σε αυτό το πείραμα, μόνο figitumumab-ευαίσθητα κύτταρα εμφάνισαν μειωμένα σημαντικά επίπεδα ρ-ΑΚΤ και π-STAT3 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο? Ωστόσο, δεν υπήρξαν αλλαγές στα επίπεδα του p-ERK. Παρατηρήσαμε επίσης ότι figitumumab μείωσε το επίπεδο της συνολικής κυτταρικής IGF1R σε SNU719 κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι η ρύθμιση προς τα κάτω αυτού του υποδοχέα μπορεί να αντιπροσωπεύουν μια διαδικασία αποικοδόμησης αντίσωμα διαμεσολαβούμενη [8]. Ερευνήσαμε αν figitumumab επαγόμενη μειορύθμιση της έκφρασης IR καθώς και τα επίπεδα IGF1R σε άλλα κύτταρα σε διάφορα χρονικά σημεία. Είναι ενδιαφέρον, figitumumab προκάλεσε την ταχεία μείωση του συνολικά επίπεδα IGF1R μετά 3 ωρών σε SNU668 και SNU739 κύτταρα (IR-αρνητικά κύτταρα), αλλά δεν το έκανε σημαντικά ρυθμίζουν προς τα κάτω είτε IR ή IGF1R έκφραση στις άλλες κυτταρικές γραμμές (Σχήμα S1). Σε αντίθεση, figitumumab δεν ρυθμίζουν προς τα κάτω ρΑΚΤ, pERK, ή pSTAT3 σε ανθεκτικά κύτταρα.

Για να προσδιοριστεί η εξάρτηση του σήματος IGF1R σε ευαίσθητα κύτταρα, είμαστε δίπλα εκτελούνται πειράματα με siRNA να φιμώσουν την έκφραση IGF1R (Σχήμα S2A). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι IGF1R ειδικής αλληλουχίας siRNAs προκαλούσε βαθιά IGF1R κάτω ρύθμιση χωρίς να επηρεάζουν την έκφραση IR και παρουσίασε σαφή συσχέτιση μεταξύ της ικανότητας των siRNA και figitumumab να αναστέλλουν την φωσφορυλίωση συγκεκριμένων κατάντη σήματα, όπως π-ΑΚΤ και ρ- STAT3, μόνο σε ευαίσθητα κύτταρα. Ερευνήσαμε επίσης τα αποτελέσματα της IGF1R knockdown στον πολλαπλασιασμό των ευαίσθητων κυττάρων και επιβεβαίωσε ότι φίμωσης έκφραση IGF1R είχε ως αποτέλεσμα μια αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση σε ευαίσθητα κύτταρα (Σχήμα S2B). Με λίγα λόγια, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της figitumumab διαμεσολαβείται κυρίως μέσω της προς τα κάτω ρύθμιση της ΑΚΤ και STAT3 οδών σηματοδότησης και όχι μέσω της οδού σηματοδότησης ERK σε ευαίσθητα κύτταρα τα οποία έχουν ισχυρή εξάρτηση σηματοδότησης IGF1R.

Για την περαιτέρω ανάλυση των μηχανισμών μέσω των οποίων figitumumab ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (Σχήμα 1 C). Figitumumab προκάλεσε παρόμοια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στο ποσοστό SNU719, HepG2, και SNU368 κυττάρων στην G1 φάση. Ωστόσο, δεν υπήρξε αυξημένος ρυθμός της απόπτωσης (τοις εκατό των κυττάρων υπο-G1? Δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτή η ανάλυση έδειξε ότι figitumumab μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων μέσω της αναστολής του κυτταρικού κύκλου, χωρίς να επάγει απόπτωση.

Η αντικαρκινική δράση των figitumumab σε ένα μοντέλο όγκου ξένου μοσχεύματος

επόμενο ζήτησε περαιτέρω στοιχεία δραστηριότητας figitumumab

in vivo

χρησιμοποιώντας HepG2 για τη δημιουργία ξενομοσχευμάτων λόγω της ευαισθησίας τους σε figitumumab

in vitro

. Για να αξιολογηθεί η επίδραση της figitumumab στην ανάπτυξη όγκου

in vivo

, ξενομοσχεύματος όγκοι αναπτύχθηκαν σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς. Όπως φαίνεται όπως φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, επαναλαμβανόμενη εβδομαδιαία χορήγηση εφάπαξ δόσης figitumumab (6,3 mg /kg σωματικού βάρους) στα ζώα που φέρουν HepG2 όγκων οδήγησε σε σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου για 21 d του figitumumab δοσολόγησης και αναστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου κατά την ημέρα 17 ( P & lt? 0,01). Επιπλέον, ελέγξαμε την επίδραση της figitumumab επί μορίων IGF1R σχετίζονται μετά από 1 d του figitumumab θεραπείας. Figitumumab μείωσε αποτελεσματικά τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης IGF1R και IRS1 (Σχήμα S3A). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η θεραπεία με μία εφάπαξ δόση των figitumumab ανέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη των όγκων με αναστολή της ενεργοποίησης IGF1R και IRS1.

υπερεκφράζεται IGF1R και IR μορφή IGF1R /IR ετεροδιμερικών υποδοχέων σε figitumumab-ευαίσθητα κύτταρα

για τον εντοπισμό ενός στόχου για την πρόβλεψη της ευαισθησίας σε figitumumab, έκφραση IGF1R σχετίζονται πρωτεΐνες και μεταγενέστερα μόρια σηματοδότησης αναλύθηκαν παράλληλα με κηλίδωση Western. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι figitumumab ευαίσθητα καρκινικά κύτταρα όλων υπερεκφράζεται IGF1R? βασικά επίπεδα έκφρασης του IR ήταν επίσης πολύ υψηλότερη σε σύγκριση με εκείνη σε άλλα ανθεκτικά κύτταρα (Σχήμα 2Α). Με βάση μια πρόσφατη έκθεση [31], περιμέναμε ότι θα figitumumab αναστέλλουν ειδικά την ανάπτυξη των κυττάρων που υπερεκφράζουν IGF1R ή φωσφορυλιωμένη μορφή, αλλά όχι εκείνοι που υπερεκφράζουν IR επειδή figitumumab δεν δεσμεύεται στην IRS [12]. Ωστόσο, τα επίπεδα πρωτεΐνης IR ήταν να ανταποκρίνεται περισσότερο στις figitumumab από οποιαδήποτε άλλη πρωτεΐνη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, ο αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του figitumumab ήταν ασθενέστερη σε κύτταρα που υπερεκφράζουν μόνο IGF1R, όπως SNU668 και SNU739, από ό, τι σε κύτταρα που υπερεκφράζουν τόσο IGF1R και IR. Αυτό το εύρημα πρότεινε ότι διαφορετικά

in vitro

ευαισθησίες των κυττάρων σε figitumumab συνδέεται τόσο με IGF1R και IR επίπεδα που με τη σειρά του μπορεί να επηρεάσει το επίπεδο της IGF1R /IR ετεροδιμερικών υποδοχέων [2].

Α ) Η ανάλυση ανοσοαποτύπωσης της συνολικής IGF1Rβ και τα επίπεδα της πρωτεΐνης IRβ. Δύο τύποι γαστρικού και του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την επίστρωση και ανοσοκηλίδωση με αντι-IGF1Rβ αντίσωμα, αντι-IRβ αντίσωμα, και αντι-α αντίσωμα τουμπουλίνης διεξήχθη. Και για τους δύο τύπους των κυττάρων, οι αντιπροσωπευτικές κηλίδες από τρία ανεξάρτητα πειράματα που δείχνονται. Β) Ανάλυση της παρουσίας IGF1R /IR ετεροδιμερικό υποδοχέα (HR) με τη χρήση ανοσοκατακρημνίσεως. Σύνολο κυτταρικές πρωτεΐνες (1 mg) από κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκαταβύθιση με αντι-αντίσωμα IGF1R, διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε σταθερή τάση (80 V), και Western αποτύπωμα με αντίσωμα αντι-IRβ. Το στύπωμα στη συνέχεια απογυμνώνεται και ξαναϊχνηθετούνται με αντι-αντίσωμα IGF1Rβ C) Ποσοτική ανάλυση του IGF1R ομοδιμερούς, IR ομοδιμερές, και IGF1R /IR επίπεδα ετεροδιμερές χρησιμοποιώντας μία ELISA. Ρυθμιστικού λύσης (100 μL) που περιείχε ίση ποσότητα πρωτεϊνών (50 μg /φρεάτιο) από 11 κυτταρικές γραμμές καρκίνου συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων MCF7 (θετικός έλεγχος) καλλιεργήθηκαν σε φρεάτια αντι-IGF1R επικαλυμμένο με αντίσωμα και ανιχνεύεται με ένα αντίσωμα ανίχνευσης αντι-IR. φρεάτια Anti-IR αντίσωμα-επικάλυψη, πρότυπα πρωτεϊνών IR, και το αντίσωμα Ανίχνευση αντι-IR χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα στην ετεροδιμερικό υποδοχέα ELISA. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM νανογραμμάρια πρωτεΐνης υποδοχέα ανά 50 μα ολικής πρωτεΐνης. Οι κυτταρικές σειρές που παρατίθενται σύμφωνα με την ευαισθησία τους σε figitumumab. Μπαρ = ± SE. Α) Επίδραση της figitumumab για IGF1- μεσολάβηση IGF1R /IR ώρες. Τα κύτταρα τον ορό επί 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με figitumumab, IGF1, ή αφέθηκαν χωρίς επεξεργασία. κύτταρα SNU719 επωάστηκαν με figitumumab (10 μg /mL) για 1 ώρα στους 37 ° C που ακολουθείται από διέγερση με IGF1 (100 ng /mL) για 30 λεπτά. Η ανοσοκαθίζηση εκτελέστηκε με ένα αντι-αντίσωμα IGF1R και στύπωμα Western. Εισόδου = συνολικό προϊόν κυτταρικής λύσης χωρίς IP.

Η

Δεδομένου ότι είναι κοινώς γνωστό ότι IGF1R και IR μπορούν να σχηματίσουν ετεροδιμερή όταν και οι δύο συν-υπερεκφράζεται λόγω της εξαιρετικά ομόλογες δομές τους [2], πραγματοποιήσαμε πειράματα ανοσοκατακρήμνισης σε καθορίσει αν IGF1R αλληλεπιδρά με IR για να σχηματίσουν ετεροδιμερές στο figitumumab-ευαίσθητα κύτταρα. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2Β, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν τόσο IGF1R και IR, όπως SNU719, HepG2, και SNU368, περιείχε IGF1R /ετεροδιμερή IR. Η κυτταρική σειρά SNU601, η οποία έδειξε μέτρια ευαισθησία στην figitumumab, περιείχε επίσης IGF1R /ετεροδιμερή IR. Για να καθοριστεί εάν figitumumab αναγνωρίζει κατά προτίμηση IGF1R /IR ετεροδιμερικών υποδοχέων σε ευαίσθητα κύτταρα [12], εκτελέσαμε πειράματα ανοσοκαθίζησης χρησιμοποιώντας figitumumab ως το αντίσωμα χρησιμοποιείται για ανοσοκαταβύθιση. Σημαντικά επίπεδα τόσο IGF1R και IR σε figitumumab-ευαίσθητα κύτταρα ανιχνεύθηκαν σε ανοσοϊζήματα figitumumab, υποδηλώνοντας ότι αυτό το αντίσωμα έχει μια ανώτερη ικανότητα να αναγνωρίζουν τόσο το ομοδιμερές IGF1R και IGF1R /IR ετεροδιμερές κυρίως σε ευαίσθητα κύτταρα (Σχήμα S4).

Μπορούμε επίσης ποσοτικά μετρήθηκε IGF1R, IR, και IGF1R επίπεδα /IR HR χρησιμοποιώντας ειδικά ELISAs με αντισώματα τα οποία αναγνωρίζουν ειδικά IGF1R ή IR και δεν αντιδρούν εγκάρσια με το άλλο. Συγκρίναμε 11 καρκινικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων MCF7 (Εικόνα S5), η οποία έχει αξιολογηθεί σε προηγούμενη [2] μελέτη. Τα επίπεδα του IR κυμάνθηκε από 0,08 να 2,3 ng /50 μg συνολικού κυτταρικού πρωτεΐνες, και τα επίπεδα IGF1R κυμαίνονταν από 0,50 να 10,6 ng /50 μg συνολικού κυτταρικού πρωτεΐνες (Πίνακας 2). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση του IGF1R και IR ήταν παρόμοιες, και τα περισσότερα αποτελέσματα ELISA συσχετίζονται στενά με τις κηλίδωση Western αποτελέσματα (Σχήμα 2Α). Το κυτταρικό επίπεδο του IGF1R /IR HRs κυμαίνονταν από 0,39 να 0,99 ng /50 μg συνολικού κυτταρικού πρωτεΐνες. Το επίπεδο HRs ήταν υψηλότερο σε ευαίσθητα κύτταρα από ανθεκτικά κύτταρα (Σχήμα 2C), γεγονός που υποδηλώνει ότι το επίπεδο έκφρασης του /ετεροδιμερικού υποδοχέα IR IGF1R συσχετίζεται σημαντικά με την ευαισθησία του φαρμάκου.

Η

Σχηματισμός IGF1 εξαρτώμενη από τον υποκαταστάτη IGF1R /IR ετεροδιμερές αναστέλλεται από αντι-IGF1R αντίσωμα

για να καθορίσει περαιτέρω το μηχανισμό της αντι-πολλαπλασιαστική figitumumab δραστηριότητα που σχετίζεται με την έκφραση ετεροδιμερούς IGF1R /IR, εξετάσαμε επίσης αλλαγές στην έκφραση ετεροδιμερικό υποδοχέα που εξαρτάται από συνδέτη (Εικόνα 2D ). Βρήκαμε ότι τα ετεροδιμερή συνδέονται προς συνδετήρες IGF1, αλλά αυτός ο σχηματισμός εξαρτώμενη από συνδετήρα IGF1 καταστάλθηκε από figitumumab σε ευαίσθητα κύτταρα. Σε SNU368, φάνηκε ότι figitumumab κατέστειλε όχι μόνο IGF1 συνδετήρες σύνδεσης με τις ώρες, αλλά και την έκφραση του IGF1R /IR ώρες σε απουσία συνδέτη IGF1. Η ετεροδιμερής επίπεδα υποδοχέα σε κύτταρα SNU638 και SNU354, ωστόσο, ήταν σχετικά σταθερά παρουσία του figitumumab. Επιπλέον, δεν υπήρχε ανιχνεύσιμη ινσουλινο-εξαρτώμενος σχηματισμό ετεροδιμερούς ή διαστάσεως λόγω figitumumab. Η φωσφορυλίωση σε απόκριση σε 100 ηΜ ινσουλίνης, επίσης, δεν μειώνεται κατά figitumumab (Σχήμα S6). Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματα από αυτό το πείραμα έδειξε ότι IGF1R /IR ετεροδιμερή ανταποκρίθηκαν καλά προς IGF1, και μπλοκάρισμα του IGF1 από figitumumab επάγεται η ρύθμιση προς τα κάτω του IGF1 εξαρτώμενη από συνδετήρα IGF1R /IR σχηματισμό ετεροδιμερούς στις κυτταρικές γραμμές φάρμακο ευαίσθητη.

Επιλεκτική υπερέκφραση IR προκαλεί σχηματισμό ετεροδιμερικού υποδοχέα και ενισχύει την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του figitumumab

για να αξιολογηθεί κατά πόσον η δράση του figitumumab περιορίστηκε σε SNU719, HepG2, ή SNU368 κύτταρα, πραγματοποιήσαμε μελέτες σε κύτταρα με χαμηλά επίπεδα έκφρασης του IR, περιλαμβανομένων SNU739 και SNU886 κύτταρα, επιμολυσμένα με pcDNA3.1-IR που επάγεται υψηλή έκφραση του IR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, τα επίπεδα έκφρασης IR στα επιμολυσμένα κύτταρα αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με το pcDNA3.1 (-) άδειο φορέα. Επιπλέον, IGF1R /IR HRs επίσης σχηματίζονται στις IR-επιμολυσμένα κύτταρα. Για να εξεταστεί εάν ο σχηματισμός IGF1R /IR HR λόγω των αυξημένων επιπέδων της πρωτεΐνης IR θα μπορούσε να ενισχύσει την ευαισθησία του φαρμάκου, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς ΜΤΤ. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι IR-επιμολυσμένα κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα στην αυξημένη αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του figitumumab (Σχήμα 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα αυξημένα επίπεδα του IR και IGF1R επέτρεψε καρκινικά κύτταρα να σχηματίσουν IGF1R /IR ώρες και αυξημένη αντι-πολλαπλασιαστική απόκριση τους σε figitumumab.

Α) Επίδραση της διαμολύνσεως IR στα επίπεδα /IR HR IGF1R σε IR- αρνητικές κυτταρικές γραμμές. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με το pcDNA3.1 (-) φορέα έκφρασης που περιέχει IR cDNA άγριου τύπου. Μία ίση ποσότητα προϊόντων λύσης από κύτταρα επιμολυσμένα με είτε τον κενό φορέα ή pcDNA3.1 (-) που περιέχει IR cDNA υποβλήθηκε σε ανοσοκαταβύθιση με αντι-IGF1R αντίσωμα που ακολουθείται από κηλίδα Western αναλύσεις IRβ και IGF1Rβ. Β) Επίδραση του IR-επιμόλυνσης σε figitumumab ευαισθησία. Τα επιμολυσμένα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων, που έλαβαν θεραπεία με figitumumab για 5 d, και υποβλήθηκε σε προσδιορισμούς ΜΤΤ. Στερεά σύμβολο τρίγωνο με διακεκομμένες γραμμές = κενό φορέα (pcDNA3.1-), στερεά σύμβολα κύκλο με γραμμές = pcDNA3.1 (-) IR. Bar = ± SE. Οι μέσες τιμές ελήφθησαν από έξι αντίγραφα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν εις τριπλούν.

Η

Ν-συνδεδεμένη γλυκοζυλίωση των IGF1R και IR σε ευαίσθητα κύτταρα

Εκτός από τη σύνδεση μεταξύ ωρών και ευαισθησία φαρμάκου, βρήκαμε επίσης ότι η Ν-συνδεδεμένη γλυκοζυλίωση (NLG) είναι ένα επιπλέον σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει την απάντηση στο figitumumab. Blotting για την υπομονάδα αντι-IGF1Rβ αποκάλυψε δύο ισομορφές περίπου 95 και 105 kDa στα περισσότερα κύτταρα? Ωστόσο, τα ευαίσθητα κύτταρα έδειξαν μία ασθενή 105 μπάντα kDa και μια ισχυρότερη ζώνες σε 115 kDa (Σχήμα 4Α). Εν ολίγοις, IGF1Rβ σε figitumumab-ευαίσθητα κύτταρα μετανάστευσαν πιο αργά σε SDS-PAGE από εκείνο στο ανθεκτικά κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον, blotting για την αντι-IRβ υπομονάδας παράγεται το ίδιο μοτίβο μπάντα με εκείνη της IGF1Rβ. Προκειμένου να προσδιοριστεί εάν οι διαφορές στην μοριακή μάζα μεταξύ των ευαίσθητων και ανθεκτικών κυττάρων οφείλονταν σε διαφορές στο Ν-γλυκοζυλίωσης, εμείς ενζυματικώς απογλυκοζυλιωμένη IGF1R και IR με PNGage F, η οποία απομακρύνεται όλους τους τύπους των Ν-συνδεδεμένων γλυκανών. Η θεραπεία με PNGage F αύξησε την ηλεκτροφορητική κινητικότητα και των δύο IGF1Rβ και IRβ σε όλα τα κύτταρα figitumumab ευαίσθητα (Σχήμα 4Β), δεικνύοντας ότι IGF1Rβ και IRβ στα ευαίσθητα κύτταρα ήταν κυρίως Ν-συνδεδεμένη γλυκοζυλιωμένη.

Α) ανάλυση ανοσοκηλίδος διαφορετικό μοντέλο μετανάστευσης IGF1Rβ σε SDS-PAGE. Ηλεκτροφορητική πρότυπα κινητικότητας των IGF1Rβ αναλύθηκαν παράλληλα από τη Δυτική bloting. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Β) Ανάλυση της Ν-γλυκοζυλιωμένη IRβ και IGF1Rβ στις ευαίσθητες κυτταρικές γραμμές με ενζυματική απογλυκοσυλίωση με PNGage F. Όλα τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 ° C για 12 ώρες με πρωτεΐνες PNGage F. IGF1Rβ και IRβ αναλύθηκαν εν παραλλήλω με κηλίδωση Western. Οι κηλίδες που εμφανίζονται είναι οι εκπρόσωποι των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Μια ειδική ιστοσελίδα NLG της IGF1R σε figitumumab-ευαίσθητα κύτταρα

επόμενο προσδιοριστεί κατά πόσον η τροποποίηση του NLG της υπομονάδας IGF1Rβ θα μπορούσε να είναι άλλο υποψήφιο βιοδείκτη για figitumumab ευαισθησία. Για να προσδιορίσετε μια συγκεκριμένη τοποθεσία NLG εντός της υπομονάδας IGF1Rβ, χρησιμοποιήσαμε ένα συνδυασμό της ενζυμικής de-γλυκοζυλίωσης και ανάλυση φασματομετρίας μάζας (MS). Μετά την αξιολόγηση των δειγμάτων τόσο από ευαίσθητα και ανθεκτικά κύτταρα, εντοπίσαμε site-specific γλυκοζυλίωσης στο Asn900 και Asn913 μεταξύ των πέντε πιθανές θέσεις NLG (Asn747, 756, 764, 900 και 913) της υπομονάδας IGF1Rβ. Άλλες τοποθεσίες NLG (Asn747, 756 και 764) ήταν δύσκολο να εντοπιστούν λόγω της παρουσίας των πολλαπλών τόπων NLG και την έλλειψη θέσεων πρωτεολυτικής διάσπασης εντός της περιοχής πεπτιδική αλληλουχία (Σχήμα 5Α). Ως εκ τούτου, εστιάσαμε στα κατάλοιπα Asn900 και Asn913 να αξιολογήσει site-specific NLG διαφορές μεταξύ των figitumumab ευαίσθητα και ανθεκτικά κύτταρα. Μια πλήρης μοτίβα πεπτιδίου κατακερματισμό του τρυπτικού πεπτιδίου (

897NPGNYTAR

904) περιείχαν προηγουμένως Ν-γλυκοζυλιωμένου πεπτιδίου στην Asn900 (προσθήκη 1 Da, N + 1) παρατηρήθηκε τόσο από ευαίσθητο και αντίσταση κύτταρα, τα οποία περιλάμβανε το υπόλειμμα Asn της θέσης γλυκοσυλίωσης σε Asn900 (Σχήμα S7). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι Asn900 είχε γλυκοζυλιωθεί στις δύο φάρμακα ευαίσθητα και ανθεκτικά κύτταρα. Ωστόσο, πεπτίδια με NLG σε Asn913 εντοπίστηκαν μόνο στις ευαίσθητες, αλλά δεν ανθεκτικά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η συγκεκριμένη ιστοσελίδα NLG δεν ήταν γλυκοζυλιωμένη στα ανθεκτικά κύτταρα.

Α) Προσδιορισμός του τόπου κατοχής NLG της IGF1Rβ υπομονάδων . υπομονάδες IGF1Rβ περιέχει Ν-συνδεδεμένες θέσεις γλυκοζυλίωσης (Asn747, Asn756, Asn764, Asn900, και Asn913) απομονώθηκαν από αμφότερα φάρμακο ευαίσθητη (SNU719, HepG2 και SNU368) και αντίσταση κύτταρα (SNU638 και SNU354) και προσδιορίζονται από tandem MS από την αύξηση του 1.0 Da από την αντίστοιχη μάζα του Αδη, ως αποτέλεσμα της μετατροπής από Ν-συνδεδεμένη γλυκοζυλιωμένη Asn προς Asp. Όλα τα NLG σε Asn900 σε δύο ευαίσθητα και την αντίσταση των κυττάρων προσδιορίστηκε να ασχολούνται με Ν-γλυκοζυλίωσης (γεμάτο ορθογώνιο). NLG σε Asn913 των ευαίσθητων κυτταρικών σειρών (HepG2, SNU719 και SNU368) προσδιορίστηκαν να ασχολούνται με Ν-γλυκοζυλίωσης (γεμάτο τετράγωνο), ενώ η Ν-glycosites σε Asn913 των κυτταρικών αντίστασης γραμμές (SNU638 και SNU354) βρέθηκαν να είναι κατειλημμένο με Ν-γλυκοζυλίωση. (Ανοικτό ορθογώνιο). Β) Επίδραση της θέσης μετάλλαξης N913Q στην ηλεκτροφορητική προτύπων κινητικότητας των IGF1Rβ. κύτταρα Huh7 (ένα IGF1R-αρνητική κυτταρική γραμμή) επιμολύνθηκαν με το κενό pcDNA3.1 (-) φορέα έκφρασης (έλεγχος), pcDNA3.1 (-) που περιέχει IGF1R cDNA άγριου τύπου (WT IGF1R) ή pcDNA3.1 (- ) με IGF1R cDNA τύπο μετάλλαξης (IGF1R N913Q). Μία ίση ποσότητα του κυτταρολύματος από τα επιμολυσμένα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδας Western για IGF1Rβ. C) Επίδραση της N913Q θέσης μετάλλαξης για το σχηματισμό IR ετεροδιμερικών υποδοχέων IGF1R /. Μία ίση ποσότητα του κυτταρολύματος από επιμολυσμένα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκε σε ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) με αντι-IGF1R αντίσωμα που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western για IRβ και IGF1Rβ. Εισόδου = συνολικό προϊόν κυτταρικής λύσης χωρίς IP. Α) Επίδραση της N913Q ιστοσελίδα μετάλλαξης σε IGF1R εντοπισμό. Μια δοκιμασία ανοσοφθορισμού διεξήχθη για να παρατηρήσουν τον εντοπισμό των IGF1R. αντιδραστικότητα IGF1R οπτικοποιήθηκε με συνεστιακή μικροσκόπηση σάρωσης με λέιζερ (bar Κλίμακα: 30 μm). Αντιπροσωπευτικά εικόνες. Πράσινο: IGF1R, Μπλε: πυρήνες. Ε) Επίδραση της N913Q ιστοσελίδα μετάλλαξης σε figitumumab ευαισθησία. κύτταρα Huh7 επιμολυσμένα με άδειο pcDNA3.1 – φορέα, άγριου-τύπου φορέα που περιέχει IGF1R cDNA, ή φορέα που περιέχει IGF1R (N913Q) cDNA τύπος μετάλλαξης απλώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις figitumumab για 120 h (αριστερά () ). ποσοστά κυτταρικής βιωσιμότητας με 1 μg /mL figitumumab (δεξιά). Έξι αναπαράγουν φρεάτια συμπεριελήφθησαν σε κάθε ανάλυση, και τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν. Τα δεδομένα από πανομοιότυπα φρεάτια παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος των υπόλοιπων κυττάρων. *

P-

τιμές & lt? 0,05? **

P-

τιμές & lt?. 0.01

Η

Για να επαληθεύσετε περαιτέρω την ιστοσελίδα NLG συναίνεση (N913) και λειτουργική σημασία της, κατευθυνόμενη σε θέση IGF1R μετάλλαξη κατασκευάστηκε. Asn913 αντικαταστάθηκε με ένα κατάλοιπο γλουταμίνης για να αποδώσει ένα μεταλλαγμένο N913Q (Asn913 ln). Για την εκτίμηση των λειτουργικών συνέπειες αυτής της μετάλλαξης, άγριου τύπου IGF1R και η μεταλλαγμένη κατασκεύασμα εκφράστηκαν παροδικά σε κύτταρα Huh7. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, τα επίπεδα έκφρασης του άγριου τύπου και μεταλλαγμένων IGF1R στα επιμολυσμένα κύτταρα αυξήθηκαν σημαντικά σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με τον κενό pcDNA3.1 (-) φορέα. Ωστόσο, η μετάλλαξη N913Q εμφανίστηκε ως μια ταινία 105 kDa που μετανάστευσαν ταχύτερα από την πρωτεΐνη φυσικού τύπου που παρήγαγαν ένα παρόμοιο μοτίβο μετανάστευση της πρωτεΐνης σε ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) σε SNU719 κύτταρα. Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαίωσαν ότι η μπάντα ~115 kDa σε ευαίσθητα κύτταρα αντιστοιχούσε σε IGF1R που ήταν NLG στο N913.

Είναι ενδιαφέρον, φαίνεται ότι η αφαίρεση των Ν-συνδεδεμένων σακχάρων από N913 της IGF1R δεν είχε εμφανή επίδραση στις σχηματισμούς της HRs IGF1R /IR. Μάλλον, η μετάλλαξη αυτή επηρεάζεται μόνο από την κατάσταση NLG του υποδοχέα επειδή τα επίπεδα HR ήταν σημαντικά αυξημένη στα μεταλλαγμένα IGF1R-επιμολυσμένα κύτταρα και το μεταλλαγμένο υποδοχέα έδειξε αυξημένο ρυθμό μετανάστευσης σε SDS-PAGE (Σχήμα 5C). Αυτό το αποτέλεσμα υποδήλωσε ότι η απομάκρυνση της Ν-συνδεδεμένων ζάχαρη από την τοποθεσία N913 μεταβάλλεται το προφίλ banding SDS-PAGE IGF1Rβ αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην ετεροδιμερισμός των IGF1R και IR.

NLG ρυθμίζει IGF1R εντοπισμό στην μεμβράνη πλάσματος και καθορίζει την ευαισθησία στην figitimumab

επόμενο εκτελείται μία δοκιμασία ανοσοφθορισμού για να καθοριστεί αν η μετάλλαξη της θέσης συναινετική N913 αποτρέπεται κυτταρική επιφάνεια έκφραση του IGF1R. Τα κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου IGF1R είχε μια αφθονία IGF1R συνδεδεμένου με μεμβράνη του πλάσματος, ενώ η μεταλλαγμένη μορφή ήταν πρωτίστως διατηρείται μέσα στα κύτταρα με σχετικά μικρή ή καθόλου εντοπισμού μεμβράνης πλάσματος (Σχήμα 5D). Για να αξιολογηθεί η λειτουργικότητα των NLG ελλειμματικών-IGF1Rs σε σύγκριση με τη μορφή άγριου τύπου, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του figitumumab αυξήθηκε κατά υπερεκφράζουν άγριου τύπου IGF1R, ενώ τα κύτταρα επιμολυσμένα με τον μεταλλαγμένο IGF1R δεν εμφανίζει καμία αλλαγή στην ευαισθησία φαρμάκου (Σχήμα 5Ε). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η έλλειψη των Ν-συνδεδεμένων σακχάρων στο N913 στο IGF1R προκαλείται κυρίως κυτταροπλασματική εντόπιση του υποδοχέα ενώ άγριου-τύπου IGF1R φάνηκε να εντοπίζεται στη μεμβράνη πλάσματος με αυξημένη ευαισθησία στο figitumumab. Ως εκ τούτου, NLG στο N913 φαίνεται να είναι απαραίτητη για την λειτουργική IGF1R δεσμευμένη σε μεμβράνη και οδηγεί σε αυξημένη απόκριση σε αντι-IGF1R αντίσωμα σε καρκινικά κύτταρα.

Συζήτηση

Figitumumab (CP-751871) έχει ελεγχθεί ενεργά σε ασθενείς με πολλαπλό μυέλωμα, αλλά ο προσδιορισμός των βιοδεικτών και των μηχανισμών είναι απαραίτητη για την πρόβλεψη αποκρίσεων θεραπεία και έτσι να βοηθήσει με την επιλογή των ασθενών για τη μεγιστοποίηση κλινικά οφέλη. Τα στοιχεία από την παρούσα μελέτη προκύπτει ότι το επίπεδο των HRs IGF1R /IR μπορεί να είναι μια πιθανή διαγνωστική βιοδείκτη για την πρόβλεψη της ευαισθησίας σε αντι-IGF1R αντισώματος, ιδιαίτερα σε GC και τα κύτταρα HCC. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι το επίπεδο της ίδιας της IGF1R μπορεί να έχουν προγνωστική αξία σε μαστού, του πνεύμονα, και του παχέος εντέρου [31], [34]. Στη μελέτη μας, ωστόσο, ούτε έκφραση του IGF1R μόνος ούτε επίπεδα άλλων IGF1R συνδέονται μόρια, περιλαμβανομένων IRS1, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να προβλέψει επαρκώς figitumumab ευαισθησία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αντ ‘αυτού, βρήκαμε ότι ένας σημαντικός παράγοντας για την αντιμετώπιση figitumumab φαινόταν να είναι υψηλά επίπεδα έκφρασης του IR, επειδή μόνο φάρμακο ευαίσθητα κύτταρα έδειξαν υψηλά επίπεδα IR καθώς IGF1R (Σχήμα 2Α). όχι.