κυττάρων

Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) που υποβάλλονται σε διαφοροποίηση νευροενδοκρινείς (NED) είναι κλινικά σημαντική για την ανάπτυξη της υποτροπιάζον ευνουχισμό ανθεκτικά ΣΕΣΣ. Αύξηση αποδείξεις δείχνουν ότι αυτοφαγία εμπλέκει στην ανάπτυξη των νευροενδοκρινικών (ΝΕ) όγκους, συμπεριλαμβανομένων PCa. Για να διευκρινιστεί η επίδραση της αυτοφαγία για NED, εξετάστηκαν ανδρογόνων-ευαίσθητα κύτταρα του προστάτη LNCaP. Κατεργασία LNCaP κυττάρων με IL-6 είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή της αυτοφαγία. Εν απουσία ανδρογόνων, IL-6 προκάλεσε μια ακόμη ισχυρότερη ενεργοποίηση αυτοφαγία. Παρόμοιο αποτέλεσμα που προσδιορίζονται στην επαγωγή NED. Αναστολή της αυτοφαγία με χλωροκίνη (CQ) μειώθηκε αισθητά NED. Αυτή η παρατήρηση επιβεβαιώθηκε από beclin1 και Atg5 πειράματα αποσιώπησης. Περαιτέρω στήριξη του ρόλου των αυτοφαγία σε NED, βρήκαμε ότι LC3 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε PCa ιστού που είχαν υποτροπιάσει μετά τη θεραπεία στέρηση ανδρογόνου σε σύγκριση με την πρωτογενή ομόλογό του όγκου τους. χρώση LC3 σε υποτροπιάζον προστάτη ιστών έδειξε μοτίβο στικτή παρόμοια με την χρώση των χρωμογρανίνης Α (CGA), ένα δείκτη για τα κύτταρα NED. Επιπλέον, η αναστολή που προκαλείται από αυτοφαγία την απόπτωση των IL-6 που επάγεται ΝΕ διαφοροποιημένα κύτταρα PCa. Συνέπεια, η αναστολή της αυτοφαγία με νοκ ντάουν της beclin1 ή Atg5 ευαισθητοποιημένων ΝΕ διαφοροποιούνται LNCaP κύτταρα σε ετοποσίδη, ένα φάρμακο χημειοθεραπείας. Για τον προσδιορισμό των μηχανισμών, η φωσφορυλίωση της IL-6 στα κατάντη στόχοι αναλύθηκε. Μία αύξηση σε φωσφο-ΑΜΡΚ και μια μείωση της φωσφο-mTOR βρέθηκαν, πράγμα το οποίο σημαίνει ότι η IL-6 ρυθμίζει autophagy μέσω της οδού /mTOR ΑΜΡΚ. Το πιο σημαντικό σε αυτή τη μελέτη είναι η ανακάλυψη της REST, μια νευρωνική ειδική γονιδιακή μεταγραφικός καταστολέας που εμπλέκεται στην ενεργοποίηση αυτοφαγία. Υπόλοιπο κάτω-ρυθμίζονται σε IL-6 θεραπεία. Νοκ ντάουν πειράματα δείχνουν ότι ΥΠΟΛΟΙΠΟ είναι κρίσιμη για NED και ενεργοποίηση αυτοφαγία από την IL-6. Μαζί, οι μελέτες μας υποδηλώνουν ότι η αυτοφαγία εμπλέκεται στην εξέλιξη του προστάτη και παίζει κυτταροπροστατευτική ρόλο όταν NED επάγεται στα κύτταρα του προστάτη από την IL-6 θεραπεία. Τα αποτελέσματα αυτά αποκαλύπτουν τη δυνατότητα στόχευσης αυτοφαγία, ως μέρος μιας συνδυασμένης θεραπευτικής αγωγής για όγκους NE

Παράθεση:. Chang P-C, Wang Τ-Υ, Chang Υ-Τ, Chu C-Y, Lee C-L, Hsu Η-W, et al. (2014) Autophagy Pathway απαιτείται για την IL-6 Induced Νευροενδοκρινής Διαφοροποίηση και χημειοαντίσταση του καρκίνου του προστάτη LNCaP κύτταρα. PLoS ONE 9 (2): e88556. doi: 10.1371 /journal.pone.0088556

Επιμέλεια: Antimo Migliaccio, ΙΙ Università di Napoli, Ιταλία

Ελήφθη: 18 του Νοέμβρη του 2013? Δεκτές: 7 Γενάρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 14 Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Chang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από NSC επιχορηγήσεις (NSC 101 έως 2.320-B-010-047-my3) και από επιχορηγήσεις MMH (MMH10194). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στις δυτικές χώρες και η συχνότητά του αυξάνεται με ταχείς ρυθμούς στην Ασία [1]. θεραπεία αποστέρησης ανδρογόνων (ADT) χρησιμοποιείται για την πρωτογενή και μεταστατικό ανδρογόνο-εξαρτώμενη προστάτη [2]. Ωστόσο, το 80% έως 90% των ασθενών αναπτύσσουν προστάτη ευνουχισμός ανθεκτικά όγκους εντός 3 ετών μετά την επιτυχή ADT. Θεραπευτική αγωγή του προστάτη εμποδίζεται από τέτοια ανάπτυξη ενός ορμονοάντοχο κατάσταση, οπότε ορμονοθεραπεία αποτυγχάνει, με αποτέλεσμα την ασθένεια που εισέρχεται σε μια πιο επιθετική και τελικά μοιραία στάδιο [3]. Ένα συναρπαστικό αλλά μελετημένο χαρακτηριστικό ορμονοάντοχο προστάτη είναι η σύνδεσή της με νευροενδοκρινείς διαφοροποίηση (NED) [4]. NED είναι μια διαδικασία που παρατηρείται κατά τη διάρκεια της ADT [5], [6]. Συνήθως, τα κύτταρα σε έναν όγκο που υποβάλλονται σε NED χαρακτηριστικά δείχνουν ότι είναι παρόμοια με NE κύτταρα και τα κύτταρα αυτά ονομάζονται κύτταρα νευροενδοκρινικού-σαν (NE-παρόμοια). NE-όπως τα κύτταρα είναι μη-πολλαπλασιαστικές, τελικά διαφοροποιημένα, και τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR) -αρνητικοί. Είναι πολύ δύσκολο να σκοτώσουν επειδή είναι ανθεκτικοί σε ορμονοθεραπεία λόγω της έλλειψης του AR? Επιπλέον, είναι ανθεκτικά στην συμβατική χημειοθεραπεία, επειδή αυτοί δεν διαιρούνται [7]. Επιπλέον, απελευθερώνουν ένα μεγάλο αριθμό neurokines, χημειοκίνες, κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες? αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του πολλαπλασιασμού των οποιωνδήποτε γειτονικών κυττάρων μη-ΝΕ PCa? Αυτό συμβαίνει σε ένα παρακρινή τρόπο κατά τη διάρκεια της ADT. NE-όπως τα κύτταρα είναι πιθανό να είναι οι βασικές αιτίες της ορμόνες και χημειοθεραπεία αντίσταση του ευνουχισμού ανθεκτικά προστάτη και η παρουσία της ΒΑ-όπως κυττάρων συσχετίζεται με κακή πρόγνωση [7] – [9]. Η ικανότητα να εντοπίσει τα νέα μηχανισμών που διέπουν το NED των κυττάρων του προστάτη και της θεραπευτικής αντίσταση της ΝΕ-όπως τα κύτταρα θα προσφέρει νέες στρατηγικές που μπορεί να ισχύουν για την πρόληψη του υποτροπίασε ευνουχισμού ανθεκτικά προστάτη ή, εναλλακτικά, με την ανάπτυξη των συνδυασμένων θεραπευτικών καθεστώτων για υποτροπή ευνουχισμό ανθεκτικά ΣΕΣΣ.

NE-όπως τα κύτταρα μπορούν να ταυτοποιηθούν με βάση μορφολογικές αλλαγές και την έκφραση των νευρωνικών δεικτών. έχουν πολλαπλές οδούς έχει αποδειχθεί ότι προκαλούν NED στα κύτταρα του προστάτη χρησιμοποιώντας το

in vitro

συστήματα καλλιέργειας? αυτά περιλαμβάνουν στέρηση ανδρογόνου [10] και interlerukin-6 (IL-6) θεραπεία [11]. Το τελευταίο είναι ιδιαίτερα σημαντικό, καθώς τα επίπεδα IL-6 αυξήθηκε σημαντικά σε ασθενείς που υποβάλλονται σε ADT και κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα της IL-6 ορού είναι συχνά υψηλότερη σε ασθενείς με ευνουχισμό ανθεκτικά και μεταστατικών προστάτη [12] – [14]. Η IL-6 είναι μια πλειοτροπική κυτοκίνη σημαντικό για διάφορες ανοσολογικές αντιδράσεις, κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και την καρκινογένεση [15], [16]. Κανονικού IL-6 μονοπατιών σηματοδότησης περιλαμβάνουν (i) JAK-STAT3, (ii) PIK3-Ακί και (iii) ΜΕΚ-ΕΚΚ. Μελέτες έχουν δείξει ότι η IL-6 μεσολαβεί διακοπή αύξησης και επάγει NED σε κύτταρα προστάτη μέσω της ενεργοποίησης του διακριτικού οδών σηματοδότησης? αυτές περιλαμβάνουν STAT3 [17] και PIK3-ÈTK /ΒΜΧ [18]. Πρόσφατα, Delk

κ.ά.

έδειξαν ότι η IL-6 που εκκρίνεται από τα στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών που προκαλείται από NED και αυτοφαγία στα οστά μεταστατικά κύτταρα προστάτη μέσω μιας STAT3-ανεξάρτητο μονοπάτι [19]. Έτσι, η IL-6 έχει προταθεί για την πρόκληση NED και διευκόλυνε τα κύτταρα του προστάτη να γίνει πυρίμαχη. Αυτό καθιστά IL-6 ένας ελκυστικός στόχος για θεραπεία. Ωστόσο, λόγω του pleiotropism, στοχεύοντας IL-6 είναι πιθανό να οδηγήσει σε απρόβλεπτες αποκρίσεις. Μια καλύτερη κατανόηση των κυτταρικών γεγονότων που σχετίζονται με την IL-6, η έκθεση μπορεί να βοηθήσει στον εντοπισμό πιθανών αποτελεσματική στόχο (-ους) για την πρόληψη ή /και θεραπεία του προστάτη.

Η αυτοφαγία, που ονομάζεται επίσης μακροαυτοφαγία, είναι μια μεγάλη οργανωμένη υποβάθμιση λυσοσωμικής μονοπάτι που ευκαρυωτικά κύτταρα χρησιμοποιούν για να υποβαθμίσει μακρόβιων πρωτεϊνών και οργανιδίων σε απόκριση προς διατροφή πείνα ή μεταβολικό στρες. Αυτή η οδός αυτο-πέψη είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική ανάπτυξη και για τη διατήρηση της ενδοκυτταρικής μεταβολικής ομοιόστασης του τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα όπως νευρώνες. Είναι επίσης ένα κεντρικό βιολογικό μονοπάτι που λειτουργεί για την προστασία των οργανισμών έναντι διαφόρων παθογόνων και εναντίον του καρκίνου? Με τον τρόπο αυτό είναι σε θέση να προωθήσει την υγεία και τη μακροζωία. Ωστόσο, όταν αυτοφαγία είναι ομηρία από τα καρκινικά κύτταρα, προκύπτει ως ένας τρόπος για την προστασία των κυττάρων του όγκου από το θάνατο, και ως εκ τούτου είναι σε θέση να προσδώσει φάρμακο αντίσταση των καρκινικών κυττάρων. Κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που σχετίζονται με την αυτοφαγία ξεκίνησε το 1993, όταν τα γονίδια που σχετίζονται με την αυτοφαγία (ΑΤΟ) εντοπίστηκαν για πρώτη φορά σε

S. cerevisiae

[20]. Autophagy είναι μια διαδικασία πολλαπλών σταδίων και έτσι μπορεί να χωριστεί σε διάφορα στάδια? (I) επαγωγής, (ii) κυστίδιο πυρήνων, (iii) επιμήκυνση κυστιδίων και ολοκλήρωση για να σχηματίσει το autophagosome, (iv) σύνδεσης και σύντηξη με λυσόσωμα να σχηματίσει autolysosome, (ν) την υποβάθμιση, και (vi) ανάκτηση [21]. Μεταξύ των κύριων ανάντη ρυθμιστές του μονοπατιού αυτοφαγικά, το τάξης Ι ΡΙ3Κ (PI3KI) -Akt [22] και ΜΕΚ1 /Erk [23], [24] τα μόρια συνδέουν κινάσες τυροσίνης υποδοχέα προς mTOR? Αυτές ενεργούν ως βασικοί αρνητικοί ρυθμιστές της αυτοφαγία και έτσι να καταστείλει αυτοφαγία παρουσία σημάτων που μοιάζει με ινσουλίνη και άλλα παράγοντα ανάπτυξης. Είναι ενδιαφέρον ότι, η λειτουργία της τάξης III PI3K (PI3KIII) είναι εντελώς αντίθετη με εκείνη του PI3KI όταν ρυθμίζουν αυτοφαγία. Αλληλεπιδρώντας με το συστατικό πυρήνα beclin1, PI3KIII επιταχύνει αυτοφαγία, με την προώθηση των κυστιδίων φύτρων [25]. Ένα μικρό μηχανισμών περιλαμβάνει μόρια LKB1-ΑΜΡΚ, οι οποίοι συνδέουν την ενδοκυτταρική ενεργειακής κατάστασης των κυττάρων προς την αρνητική ρύθμιση της mTOR? Αυτό το μονοπάτι ενεργεί για την ενεργοποίηση αυτοφαγία με την παρουσία των τάσεων που αυξάνουν την αναλογία AMP /ATP [26]. Άλλες μικρές μηχανισμοί περιλαμβάνουν p53, ER στρες-Ca

2 + σηματοδότησης, και κυτταροπλασματική STAT3. Ο ρόλος του p53 στον αυτοφαγία είναι παράδοξο και εξαρτάται από την υποκυτταρική θέση του [27] – [29]. ER στρες που συνοδεύει Ca

2 + σηματοδότησης εμπλέκεται επίσης στη ρύθμιση της αυτοφαγία και αυτό συμβαίνει με την ενεργοποίηση CaMKKβ εξαρτώμενη ΑΜΡΚ οδού [30], [31]. Τέλος, κυτταροπλασματική STAT3 καταστέλλει την αυτοφαγία μέσω σύνδεσης με πρωτεϊνική κινάση R (PKR) και την αναστολή της φωσφορυλίωσης των eIF2α [32].

ανάπτυξη NE-όπως κυττάρων βασίζεται σε ένα δίκτυο μεταγραφικοί καταστολείς και ενεργοποιητές που ελέγχει την απόκτηση και συντήρηση των νευρωνικών χαρακτηριστικά. Καταστολέα στοιχείο-1 μεταγραφή σίγηση παράγοντας /νευρώνα περιοριστικός παράγοντας σίγηση (ΥΠΟΛΟΙΠΟ /ΕΣΠΑ) ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά ως κύριο μεταγραφικός καταστολέας που είναι υπεύθυνο για τον περιορισμό νευρωνική έκφραση γονιδίων σε μη νευρωνικά κύτταρα [33] – [36]. Ο καταστολέας συνδέεται με ένα 21-bp στοιχείου καταστολέα 1 στοιχείο αποσιώπηση /νευρώνα-περιοριστικές (RE1 /NRSE) και, στη συνέχεια, προσλαμβάνει μια κατασταλτική συγκρότημα αναδιαμόρφωσης χρωματίνης, mSin3 και Co-REST. Αυτό συμβαίνει μέσω δύο τομέα καταστολής του (μία στο αμινοτελικό άκρο και το άλλο στο τερματικό καρβοξύλιο) και το αποτέλεσμα είναι η επιγενετική αποσιώπηση της μεταγραφής του γονιδίου-στόχου [37]. ΥΠΟΛΟΙΠΟ εκφράζεται υψηλά σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (ΟΚΕ), νευρικά προγονικά κύτταρα (NPC) του σώματος και μη νευρωνικών κυττάρων, όπου η πρωτεΐνη καταστέλλει την έκφραση των νευρωνικών ειδικών γονιδίων, διατηρώντας έτσι pluripotency των ΟΚΕ και NPCs με αναστολή νευρωνικής διαφοροποίησης σε μη-νευρωνικά κύτταρα [33]. Είναι ενδιαφέρον ότι, ΥΠΟΛΟΙΠΟ έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει την γονιδιακή μεταγραφή του συναπτοφυσίνη (SYN) [38], [39], ένα από τα κοινά δεικτών NED σε κύτταρα PCa. Μια πολύ πρόσφατη έκθεση Svensson

et al

έδειξε επίσης ότι ΥΠΟΛΟΙΠΟ μεσολαβεί δράσεις AR και διαμορφώνει ανδρογόνων προκαλείται από τη στέρηση NED σε προστάτη [40].

Για να στοχεύσετε τη συμβολή της ΔΝΕ για το εξέλιξης του προστάτη στην ορμόνη-πυρίμαχων κατάσταση, η παρούσα μελέτη έχει ως στόχο να διαπιστωθεί κατά πόσον η IL-6 είναι σε θέση να ρυθμίζουν αυτοφαγία στα κύτταρα του προστάτη, η οποία, με τη σειρά της, προκαλεί κυτταρική NED. Αυτό θα αποτρέψει την απόπτωση των κυττάρων κατά τη διάρκεια της IL-6 που προκαλείται από NED και ως αποτέλεσμα θα επιτρέψει NE-σαν την επιβίωση των κυττάρων σε υποτροπιάζον PCa. Προκειμένου να αντιμετωπιστούν υπόθεση μας, μελετήσαμε την ικανότητα της IL-6 για να επάγει αυτοφαγία και NED σε κύτταρα LNCaP ευαίσθητο σε ανδρογόνο. Βρήκαμε ότι autophagy επάγεται από την IL-6 και παίζει ουσιαστικό ρόλο στην IL-6 που προκαλείται από NED. Συνεπής με την ενεργοποίηση του αυτοφαγία διάρκεια NED, ένα αυξημένο επίπεδο LC3 μπορεί να παρατηρηθεί σε υποτροπιάζον PCa ιστό και τέτοιες ιστός έχει μια παρόμοια μορφή χρώσης εστίες για την CGA, ένας δείκτης για NE-σαν κύτταρα. Ερευνήσαμε autophagy ως πιθανό σήμα που είναι σε θέση να προστατεύουν τα κύτταρα από την απόπτωση PCa και η χημειοθεραπεία φάρμακα όπως ετοποσίδη. Σε συμφωνία με την αύξηση του επιπέδου της αυτοφαγία, την ενεργοποίηση και αναστολή ΑΜΡΚ mTOR αποδείχθηκε να είναι παρόντες κατά τη διάρκεια της IL-6 θεραπεία απουσία ανδρογόνων. Το πιο σημαντικό, η μελέτη μας εντόπισε την προς τα κάτω ρύθμιση των REST, ενός νευρώνα-περιοριστική σιγαστήρα? αυτό βρέθηκε να είναι κρίσιμης σημασίας για την επαγωγή NED και ενεργοποίηση αυτοφαγία από την IL-6.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και πλασμίδια

LNCaP κύτταρα του προστάτη καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco /Invitrogen, 31800-014) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Hyclone, SH30071.03), 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Sigma-Aldrich, P4458) και L-γλουταμίνη (Sigma-Aldrich, G7513). LNCaP κύτταρα που εκφράζουν σταθερά eGFP-LC3, LNCaP-eGFP-LC3, είχαν δημιουργηθεί προηγουμένως [41] και διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε για LNCaP, αλλά συμπληρωμένο με 400 μg /mL του G418 (Amresco, E859). Η επαγώγιμη κασέτα shRNA, το H1 /TO-shRNA-συνδέτη που περιέχει μια θέση κοπής BsmBI, εισήχθη εντός του φορέα pLenti4, προκειμένου να δημιουργήσει έναν επαγώγιμο φορέα λεντοϊού shRNA, δηλαδή plenti4-H1 /TO-shRNA. Το επαγόμενο υποκινητή για έκφραση shRNA είναι ένα υβρίδιο του υποκινητή Η1 και του χειριστή tet (Invitrogen, Η1 /ΤΟ). Η κασέτα shRNA της beclin1 (5′-CACCGGTCTAAGACGTCCAACAACACGAA TGTTGTTGGACGTCTTAGACC-3 ‘), Atg5 (5′-CACCAAGCAACTCTGGATGGG ATTGCGAACAATCCCATCCAGAGTTGCTT-3′) και REST (5’-CACCGTGTAA TCTACAGTATCACCGAAGTGATACTGTAGATTACAC-3 ‘) έχουν ξεχωριστά εισάγεται στην plenti4-H1 /TO- shRNA και αυτά στη συνέχεια εισάγονται σε LNCaP-TR κύτταρα με βραδέος μεταγωγή. Τα κύτταρα επιλέχθηκαν για 14 ημέρες χρησιμοποιώντας 50 μg /ml ζεοσίνη (InvivoGen, μυρμήγκι-Ζη-1). Οι αποδόσεις νοκ ντάουν για beclin1, Atg5 και REST από το Τα siRNAs ελέγχθηκαν με τη θεραπεία με δοξυκυκλίνη (Dox) για 48 ώρες. LNCaP-TR-shBeclin1, LNCaP-TR-shAtg5, LNCaP-TR-shREST διατηρήθηκαν όπως περιγράφεται για LNCaP, αλλά έχει συμπληρωθεί με 5 μg /ml του blasticidin S (InvivoGen, μυρμήγκι-BL-1) και 50 μg /ml του ζεοσίνη .

φθορισμού μικροσκοπία

κύτταρα LNCaP απλώθηκαν σε καλυπτρίδες με πολυ-L-λυσίνη (Marienfeld, 0.111.530) και μετά από επεξεργασία, όπως αναφέρεται, αυτά σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη σε 1 × PBS επί 15 λεπτά. Επόμενη οι καλυπτρίδες στερεώθηκαν σε διάλυμα στερέωσης [20 mM Ν-προπυλεστέρας, 80% γλυκερόλη, 20% 1 χ PBS], και έγινε ορατό με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (Lecia, DMI4000B). Το μήκος των νευριτών στις καλυπτρίδες αναλύθηκε με MetaMorph (Molecular Devices, ανάπτυξης νευριτών). LNCaP κύτταρα δείχνουν χαμηλό βασικό επίπεδο NED υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας (RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS). Το μέσο μήκος νευρίτη των κυττάρων ελέγχου καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% FBS σε καθένα πειράματα χρησιμοποιήθηκε ως 1, και έγινε σύγκριση κατόπιν έγινε για μήκος νευρίτη που λαμβάνεται μετά IL-6 θεραπείες. Τα κύτταρα LNCaP-eGFP-LC3 παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω για τα κύτταρα LNCaP εκτός για χρώση με Hochest 33258 (Invitrogen, H3569) πριν από την τοποθέτηση. Οι εικόνες eGFP-LC3 οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού Lecia DMI4000B με έναν φακό 63 × και αναλύθηκαν με MetaMorph (Molecular Devices, Transflour). LNCaP κύτταρα δείχνουν χαμηλό βασικό επίπεδο αυτοφαγία υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας. Να διακρίνει την επαγωγή αυτοφαγία, κύτταρα που εμφανίζουν περισσότερα από 50 έντονη αδρανών eGFP-LC3 από 5 έως 7,5 μm και 15 έντονη αδρανών eGFP-LC3 7,5 έως 20 μm μετρήθηκαν ως αυτοφαγία-θετικών κυττάρων μετά την επαγωγή.

Δυτική Blot και Αντισώματα

Σύνολο κυτταρολύματα (TCLs) παρασκευάστηκαν από κύτταρα χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό ΝΡ-40 λύσης [0,5% ΝΡ-40 (Amresco, Ε109), 1 × PBS, 1 × αναστολείς πρωτεάσης (Roche, 04693132001) ]. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης του κάθε δείγματος μετρήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας Bio-Rad δοκιμασία πρωτείνης αντιδραστηρίου βαφής και το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Bio-Rad, 500-0006). Για ανοσοστύπωση, ίσες ποσότητες πρωτεΐνης φορτώθηκαν και διαχωρίστηκαν σε μια 6%, 8% ή 15% SDS-πολυακρυλαμιδίου όπως αρμόζει. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν κατόπιν από την πηκτή σε 0,45 μm μέγεθος πόρου μεμβράνες PVDF (GE Healthcare, RPN303F). Επόμενη οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με ρυθμιστικό αποκλεισμού [5% BSA σε 1 χ TBST]. Πρωτογενή αντισώματα για ρ-Akt (Ser473) (Cell Signaling, # 9271), Akt (κυτταρική σηματοδότηση, # 9272), ρ-mTOR (Ser2248) (κυτταρική σηματοδότηση, # 2976), mTOR (κυτταρική σηματοδότηση, # 2983), ρ -STAT3 (Tyr705) (Cell σηματοδότηση, # 9145), STAT3 (κυτταρική σηματοδότηση, # 9139), σ-ΕΚΚ (Thr202 /Tyr204) (κυτταρική σηματοδότηση, # 9101), Erk (Santa Cruz Biotechnology, sc154), p-ΑΜΡΚ (Thr172) (Cell σηματοδότηση, # 2535), ΑΜΡΚ (κυτταρική σηματοδότηση, # 2793), LC3B (κυτταρική σηματοδότηση, # 2775), beclin1 (κυτταρική σηματοδότηση, # 3738), Atg5 (κυτταρική σηματοδότηση, # 2630), τουμπουλίνη III ( Cell Signaling, # 5666), υποδοχέα ανδρογόνου (Millipore, 06-680), ΥΠΟΛΟΙΠΟ (Millipore, 09-019), και GAPDH (GeneTex, GTX100118) αραιώθηκαν σε 5% BSA σε 1 χ TBST. Οι μεμβράνες μετά ανιχνεύθηκαν με τα διάφορα πρωτογενή αντισώματα, στη συνέχεια κατεργάζεται με το κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα. Τέλος, οι μεμβράνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific, 34080) και απεικονίζεται μέσω ενός /Fluorescence Imaging System Φωταύγειας (FUJIFILM, LAS-4000).

Ανοσοϊστοχημεία χρώσης (IHC-χρώση)

παραφίνη-ενσωματωμένες δείγματα από ασθενείς με πρωτοπαθή και υποτροπιάζον ευνουχισμό ανθεκτικά προστάτη που είχαν συλλεχθεί μεταξύ του 1990 και του 2010 στο Memorial Hospital Mackay συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη. Δεοντολογίας εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Ινστιτούτο κριτική Memorial Hospital Mackay. Ενημερωμένη συγκατάθεση γράφτηκε. Τομές ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν μέσω διαβαθμισμένης αιθανόλης (100, 90, 80, 70, 50%), υποβλήθηκαν σε ανάκτηση αντιγόνου με μικροκύματα σε 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.0) για 10 λεπτά, αποκλείστηκαν για ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης με 3 % Η

2O

2 για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια αποκλείστηκαν με αραιωτή αντισώματος που περιέχει φόντο-αναγωγικά συστατικά (ϋΑΚΟ, S302281). Τέλος, τα πλακίδια χρωματίσθηκαν για όλη τη νύχτα στους 4 ° C με beclin1 (GeneTex, GTX61619), LC3 (Novus Biologicals, NB110-57179), ΥΠΟΛΟΙΠΟ (Bethyl, IHC-00141), ή CgA (Abcam, ab15160) ειδικά αντισώματα και οπτικοποιούνται εξής τυπικό πρωτόκολλο με χρήση 3-αμινο-9-αιθυλοκαρβαζόλη (AEC) ως χρωμογόνο (ϋΑΚΟ, K346430) παρουσία του αιματοξυλίνη αντιχρωματισμός. Η ιστολογία και χρώση αξιολογήθηκε από έναν παθολόγο με τυφλό τρόπο χρησιμοποιώντας μια κλίμακα τεσσάρων βαθμίδων που εκπροσωπούν αρνητικό (μηδέν), ασθενές (1), το ενδιάμεσο (2), και ισχυρό (3), τα σήματα.

Ο 3 – (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) Δοκιμασία

LNCaP, LNCaP-TR-shBeclin1 και κύτταρα LNCaP-TR-shAtg5 σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκες, καλλιεργήθηκαν για δύο ημέρες, και στη συνέχεια κατεργάζεται όπως υποδεικνύεται. Στη συνέχεια, η βιωσιμότητα των κυττάρων εξετάσθηκε με ανίχνευση ΜΤΤ (Sigma-Aldrich, M5655). Προστέθηκε ΜΤΤ σε τελική συγκέντρωση 0,5 mg /mL και οι κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν κατά 10% SDS. Η οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο μικροπλάκας σε μήκος κύματος 570 και 660 nm.

κασπάσης-3/7 ELISA Δοκιμασία

κύτταρα LNCaP απλώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων . Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται. Caspase-3/7 επίπεδα δραστικότητας μετρήθηκαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ένα ομοιογενές Caspase-3/7 κιτ προσδιορισμού Αρο-ΕΝΑ (Promega, TB295) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με το μίγμα του υποστρώματος και αντίδρασης ρυθμιστικό. Η κασπάση-3/7 Δραστηριότητα μετρήθηκαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών φθορισμού (Tecan Systems, άπειρη 200).

Αντίστροφη Μεταγραφή (RT) και ποσοτική PCR (qPCR)

Ολικό RNA απομονώθηκε από μη επαγόμενη και Dox-επαγόμενα κύτταρα LNCaP-TR-shREST χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, 15596-018). Ολικό RNA (2 μα) μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας ολιγο-άΤ και SuperScript

III RT (Invitrogen, 18080-085). Τα επίπεδα mRNA των διαφόρων γονιδίων στη συνέχεια καθορίζεται από qPCR και ομαλοποιημένη κατά GAPDH.

Αποτελέσματα

IL-6 και στέρησης ανδρογόνων συνεργιστικά Προκαλέστε Autophagy σε LNCaP κύτταρα

Αύξηση αποδεικτικά στοιχεία πρέπει δείξει ότι autophagy διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην υποστήριξη νευρωνική διαφοροποίηση [42] – [44]. Μια πιο πρόσφατη μελέτη δείχνει επίσης ότι antophagy μπορεί να διαδραματίσει ουσιαστικό ρόλο στην IL-6 που προκαλείται από NED των οστών μεταστατικά κύτταρα του προστάτη [19]. Τα επίπεδα της IL-6 στον ορό έχουν βρεθεί να αυξάνουν σε ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπεία αποστέρησης ανδρογόνων (ADT) [12], [14]. Στέρηση ανδρογόνου [45] και IL-6 [18] έχουν επίσης βρεθεί υπεύθυνη για την ανάπτυξη και NED PCa ανθεκτική στην ADT. Για να μελετηθεί αν autophagy ενεργοποιείται μαζί με NED του προστάτη κατά τη διάρκεια της κυτταρικής ADT, στέρηση ανδρογόνου και IL-6 συνδυασμένης θεραπείας χρησιμοποιήθηκαν εδώ. κυτταρική σειρά LNCaP, ένα ανδρογόνο-ευαίσθητη κυτταρική σειρά ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος προστάτη ταχέως αποκτά χαρακτηριστικά NE, συμπεριλαμβανομένης της παύσης της μίτωσης, επέκταση νευριτών και ενισχυμένη έκφραση των νευρωνικών δεικτών όπως τουμπουλίνης III, όταν διεγείρονται, επιλέχθηκε για τη μελέτη. LNCaP κύτταρα που εκφράζουν σταθερά eGFP-LC3, δηλαδή κύτταρα LNCaP-eGFP-LC3, καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο που περιείχε 10% FBS, 2,5%

ξυλάνθρακα /δεξτράνης

κατεργασμένους FBS (

CDT

) ( η προϋπόθεση στέρηση ανδρογόνου), ή 2,5% CDT συν 100 ng /ml IL-6. Autophagosomic κύτταρα (κύτταρα με punctation GFP-LC3-ΙΙ) ήταν καταμέτρηση χρησιμοποιώντας σταθεροποιημένα κύτταρα LNCaP μετά από 48 ώρες θεραπείας. Στέρηση ανδρογόνου αύξησε τον αριθμό των κυττάρων που υφίστανται αυτοφαγία έως 41% (Εικ. 1). IL-6 μόνη της αύξησε τον αριθμό των κυττάρων σε αυτοφαγικά 17% (Εικ. 1). Είναι ενδιαφέρον ότι, ο αριθμός των κυττάρων που υφίστανται αυτοφαγία που προκαλείται από IL-6 κάτω από τη στέρηση ανδρογόνου ήταν σημαντικά αυξημένη περαιτέρω σε 87% (Εικ. 1). Η επαγωγή της NED από στέρηση ανδρογόνου και IL-6 θεραπεία επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας τα κύτταρα LNCaP. επιμήκυνση νευριτών, ένα τυπικό φαινότυπο των κυττάρων NED, παρατηρήθηκε (Εικ. 2Α και 2Β). Περιέργως, ο βαθμός επαγωγής αυτοφαγία είχε υψηλή συσχέτιση με το βαθμό του NED μεταξύ των κυττάρων LNCaP. Η συσχέτιση αυτή επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ανάλυση στυπώματος Western. IL-6 θεραπεία αύξησε σημαντικά την έκφραση του νευρώνα-ειδικός δείκτης, τουμπουλίνης III και τη μετατροπή της LC3-Ι σε LC3-II (Σχ. 2C). Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι ενδέχεται να απαιτείται η ενεργοποίηση της αυτοφαγία για την IL-6 που προκαλείται από NED υπό συνθήκες στέρησης ανδρογόνων.

(Α) LNCaP κύτταρα-eGFP-LC3 ήταν ο πολιτισμός σε 10% FBS, 2,5% FBS ή 2.5 % CDT συμπληρωμένο RPMI 1640 σε απουσία (έλεγχος) και παρουσία 100 ng /ml IL-6 επί 48 ώρες. Αυτό ακολουθήθηκε από στερέωση, η πυρηνική αντιχρωματισμός με ϋΑΡΙ (μπλε), και ανάλυση με μικροσκοπία φθορισμού (FITC, 63 × μεγέθυνση). (Β) Για κάθε θεραπεία, το ποσοστό των κυττάρων με eGFP-LC3 στικτή υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το μέσο όρο από 15 μικροσκοπικά πεδία?

bars

, SD.

Η

(Α) LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2,5% CDT ή 2,5% CDT συν 100 ng /ml IL-6 επί 48 ώρες. Η επαγόμενη επιμήκυνση νευριτών εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας φωτεινού εικόνες μικροσκοπία (μεγέθυνση 40 φορές). (Β) Η νευριτών επιμήκυνση ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας το μέσο όρο από 3-5 μικροσκοπικά πεδία?

μπαρ

, SD. (Γ) LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο (Α). Σύνολο κυτταρολύματα (TCLs) παρασκευάστηκαν και στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν για την ανίχνευση τουμπουλίνης III, υποδοχέα ανδρογόνων (AR) και LC3. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Autophagy Αναστολή Καταστέλλει NED σε LNCaP κύτταρα

Για να καθοριστεί εάν η επαγωγή αυτοφαγία είναι απαραίτητη για την IL-6 που προκαλείται από NED υπό τις συνθήκες στέρησης ανδρογόνων, εμείς αναστέλλουν autophagy χρησιμοποιώντας χλωροκίνη (CQ), έναν αναστολέα αυτοφαγία που μπλοκάρουν τη λειτουργία του λυσοσώματος. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, CQ (50 μΜ) παρεμπόδισε έντονα την IL-6 που προκαλείται από NED σε κύτταρα LNCaP και μείωσε ελαφρώς την διαφοροποίηση που προκαλείται από στέρηση ανδρογόνου. Ποσοτικοποίηση του μήκους νευρίτη από MetaMorph έδειξε υπήρχε επίσης σημαντική αναστολή αυτού του φαινοτύπου (Σχ. 3Β). CQ μπορεί να έχουν μη-ειδικές επιδράσεις πλην ότι η αναστολή της οδού αυτοφαγία. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω τη σημασία της αυτοφαγία πορεία προς την IL-6 που προκαλείται από NED κάτω από τις ανδρογόνων συνθήκες στέρησης, χρησιμοποιήσαμε μικρά RNAs φουρκέτα (Τα siRNAs), shBeclin1 και shAtg5, να knockdown την έκφραση του beclin1 (Atg6) και Atg5, δύο γονίδια Atg απαραίτητα για την έναρξη αυτοφαγία και το σχηματισμό autophagosome, αντίστοιχα. Πρώτον, έχουμε δημιουργήσει ένα shBeclin1 επαγώγιμων νοκ ντάουν κυτταρική σειρά και shAtg5 επαγώγιμων νοκ ντάουν γραμμή κυττάρων σε κύτταρα LNCaP, δηλαδή LNCaP-TR-shBeclin1 και -shAtg5. Η ανοσοκηλίδωση έδειξε ότι και οι δύο Τα siRNAs ήταν σε θέση να knockdown στόχο τους με επιτυχία (Σχ. 4Α και 5Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, beclin1 knockdown κυττάρων που εμφανίζονται σημαντικά χαμηλότερο βαθμό NED από κύτταρα ελέγχου (Εικ. 4Β και 4C) και ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε Atg5 knockdown κυττάρων (Σχ. 5Β και 5C). δεδομένα Ποσοτικοποίηση έδειξαν ότι τόσο Atg5 και beclin1 knockdown έχει σημαντική αποδοτικότητα αναστολή σε IL-6 που προκαλείται από NED (Σχ. 4C και 5C). Σύμφωνα με την μορφολογία κυττάρων, η αναστολή της NED με χτυπήσει κάτω beclin1 και Atg5 ταυτοποιήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας τουμπουλίνης III αντίσωμα (Σχ. 4D και 5D). Μαζί, αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι η οδός αυτοφαγία είναι απαραίτητη για τα κύτταρα του προστάτη να υφίστανται NED.

(Α) LNCaP κύτταρα-eGFP-LC3 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2,5% CDT ή 2,5% CDT συν 100 ng /ml IL- 6, με την απουσία και παρουσία 50 μΜ χλωροκίνη (CQ) για 48 ώρες. Αυτό ακολουθήθηκε από στερέωση, η πυρηνική αντιχρωματισμός με ϋΑΡΙ (μπλε), και ανάλυση με μικροσκοπία φθορισμού (FITC, μεγέθυνση 40 φορές). (Β) Η νευριτών επιμήκυνση ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας το μέσο όρο από 3-5 μικροσκοπικά πεδία?

μπαρ

, SD.

Η

(Α) LNCaP κύτταρα-TR-shBeclin1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1 μg /ml Dox για 48 ώρες. TCLs προετοιμάστηκαν και ανοσοστυπώθηκαν για την ανίχνευση beclin1 χρησιμοποιώντας GAPDH ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) LNCaP κύτταρα-TR-shBeclin1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 48 ώρες με 1 μg /ml Dox προκειμένου να προκληθεί knockdown του beclin1 και μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή για άλλες 48 ώρες με 2.5% CDT ή 2,5% CDT συν 100 ng /ml IL -6 προκαλεί κυτταρικό NED. Η αναστολή της επιμήκυνσης έκφυσης από beclin1 νοκ ντάουν αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας εικόνες μικροσκοπίας φωτεινού πεδίου (μεγέθυνση 40 φορές). (Γ) Η νευριτών επιμήκυνση ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας το μέσο όρο από 3-5 μικροσκοπικά πεδία?

μπαρ

, SD. (D) TCLs ελήφθησαν από κύτταρα LNCaP-TR-shBeclin1 σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο (Α) και αυτά στη συνέχεια αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

(Α) LNCaP κύτταρα-TR-shAtg5 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μg /ml Dox για 48 ώρες. TCLs προετοιμάστηκαν και ανοσοστυπώθηκαν για την ανίχνευση Atg5 χρησιμοποιώντας GAPDH ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) LNCaP κύτταρα-TR-shAtg5 υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 48 ώρες με 1 μg /ml Dox να επάγει knockdown του Atg5 και στη συνέχεια κατεργάζεται για άλλες 48 ώρες με 2.5% CDT ή 2,5% CDT συν 100 ng /ml IL-6 για να επάγει κυττάρων NED. Η αναστολή της επιμήκυνσης νευρίτη από Atg5 knockdown εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας φωτεινού εικόνες μικροσκοπία (μεγέθυνση 40 φορές). (Γ) Η νευριτών επιμήκυνση ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας το μέσο όρο από 3-5 μικροσκοπικά πεδία?

μπαρ

, SD. (D) TCLs λαμβάνεται από κύτταρα LNCaP-TR-shAtg5 σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο (Α) και αυτά στη συνέχεια αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

Autophagy Gene Expression στην πρωτοβάθμια και Υποτροπή PCa Δείγματα

Τα παραπάνω ευρήματα δείχνουν ότι η αυτοφαγία μπορεί να ενεργοποιηθεί μαζί με NED στα κύτταρα του προστάτη κατά τη διάρκεια της ορμονοάντοχου υποτροπής. Να χαρακτηρίζει τη σχέση μεταξύ αυτοφαγία και NED στα κύτταρα του προστάτη, εξετάσαμε την έκφραση της ΑΧΕ, η οποία είναι ένας δείκτης ΒΑ όγκου, και την έκφραση της LC3, μια που σχετίζονται αυτοφαγία γονίδια, σε δεκατρία ζεύγη υποτροπή δείγματα πρωτοβάθμιας και ορμονοάντοχου ιστό του προστάτη , τα ζεύγη που λαμβάνονται από τον ίδιο ασθενή. Αντιπροσωπευτικά ανοσοϊστοχημεία είναι (IHC) αποτελέσματα για την CGA και LC3 φαίνεται στο Σχήμα 6. Η θετική χρώση CgA δείχνει πρότυπο εστίες (Σχήμα 6, κλειστά βέλη.), Το οποίο είναι ένα τυπικό χαρακτηριστικό των κυττάρων ΝΕ σε υποτροπιάζον δείγματα PCa? Ωστόσο, αυτό το μοτίβο δεν ήταν παρούσα στα πρωτογενή δείγματα του προστάτη. Είναι ενδιαφέρον ότι, μια εστίες χρώση LC3 παρατηρήθηκε επίσης σε υποτροπή δείγματα PCa (Σχ. 6, ανοικτά βέλη). Από τα δεκατρία ζεύγη προστάτη δειγμάτων, 8 (62%) παρουσίασαν σημαντική αύξηση στην έκφραση LC3 (μέσος ανοσοαντιδραστικότητα LC3 (IR) του πρωτογενούς και υποτροπίασαν PCa όγκου ήταν 0,51 και 1,12, αντίστοιχα? Ρ & lt? 0.005) σε υποτροπή PCa ιστό συγκρίνοντας στην πρωτοβάθμια ομόλογό του όγκου τους.

Εκπρόσωπος IHC εικόνες χρώση των δύο ζευγαριών των δειγμάτων ιστού, δηλαδή την πρωτοβάθμια και υποτροπιάζουσα προστάτη δείγματα από το ίδιο άτομο, βάφτηκαν με τη χρήση αντι-LC3, αντι-ΑΧΕ, τα και τα αντισώματα αντι-ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ .

η

Autophagy προκαλείται από την IL-6 Προστατεύει ΒΑ διαφοροποιημένες LNCaP κύτταρα από

κυτταρικού θανάτου

η αυτοφαγία είναι σημαντική για τη διατήρηση της ομοιόστασης του τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα [46]. Η παρατήρηση ότι autophagy είναι νευροπροστατευτική [47] και ότι η autophagy επάγεται από την IL-6 μας ώθησε να υποθέσει ότι η αυτοφαγία μπορεί να χρησιμεύσει ως ένας προστατευτικός μηχανισμός για τη διατήρηση της ομοιόστασης και την αύξηση της επιβίωσης των IL-6 που προκαλείται από τερματικά διαφοροποιημένο NE-κύτταρα που μοιάζουν . Αν αυτή είναι η περίπτωση, θανάτωση κυττάρων πρέπει να ενισχύεται εάν αυτοφαγία αναστέλλεται. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήσαμε μία δοκιμασία ΜΤΤ για τον προσδιορισμό του ρόλου του αυτοφαγικά οδού σε IL-6 που προκαλείται από διακοπή αύξησης και αντοχή σε κυτταρικό θάνατο. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, η IL-6 που προκαλείται από θεραπεία αύξηση σύλληψης σε κύτταρα LNCaP (Εικ. 7Α). Όταν autophagy ανεστάλη με αγωγή με CQ, αυτό προκάλεσε μια σημαντική αύξηση σε κυτταρικό θάνατο μεταξύ των IL-6 κατεργασία LNCaP κύτταρα (Σχ. 7Α). Η αυξημένη θανάτωση κυττάρων βρέθηκε να είναι λόγω της ενισχυμένης απόπτωση σε μεγάλο βαθμό, όπως αποδεικνύεται από την παρουσία μιας σημαντικής αύξησης των κασπάσης 3-/7 δραστηριότητα σε 48 ώρες μετά από την IL-6 συν CQ συνδυασμένη θεραπεία (Εικ. 7Β). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν για πρώτη φορά ότι η αναστολή της αυτοφαγία είναι σε θέση να ξεπεράσει την απόπτωση αντοχή της IL-6-indued ΝΕ διαφοροποιημένα κύτταρα και δεικνύουν ότι αυτοφαγία είναι η βασική αιτία πίσω από την χημειοαντίσταση του ΒΑ-σαν κύτταρα.

(Α) LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 2,5% CDT συμπληρωμένο RPMI 1640 και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 100 ng /ml IL-6 ή όχημα ελέγχου με την παρουσία ή απουσία 50 μΜ CQ. Οι αριθμοί των κυττάρων αναλύθηκαν με τη χρήση μίας ανιχνεύσεως κυτταρικής βιωσιμότητας ΜΤΤ στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία.

σημεία

, σημαίνει?

μπαρ

, SD. (Β) LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο (Α) και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για κασπάση-3/7 Δράση στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Το κάθε σημείο δεδομένων που παρουσιάζεται είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων?

μπαρ

, SD.

Η

Ο προστατευτικός ρόλος της αυτοφαγία στην χημειοαντίσταση της ΒΑ διαφοροποιημένων κυττάρων του προστάτη σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα, όπως η ετοποσίδη στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε από τις ακόλουθες διαπιστώσεις. Όπως ήταν αναμενόμενο, ετοποσίδη δεν ήταν σε θέση να σκοτώσει τα IL-6 που επάγεται ΝΕ διαφοροποιημένα κύτταρα LNCaP. Είναι ενδιαφέρον ότι, η ετοποσίδη προκάλεσε μια στατιστικά σημαντική αύξηση σε κυτταρικό θάνατο μετά knockdown είτε beclin1 ή Atg5 στη Β.Α. κύτταρα διαφοροποιούνται LNCaP που είχαν προκληθεί από την IL-6 υπό συνθήκες στέρησης ανδρογόνων (Εικ. 8). Όταν λαμβάνεται μαζί, τα παραπάνω ευρήματα υποδεικνύουν ότι autophagy επαγόμενη από την IL-6 είναι σε θέση να προστατεύσει την IL-6 που προκαλείται ΝΕ διαφοροποιημένων κυττάρων LNCaP από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο και ότι η αναστολή της αυτοφαγία είναι σε θέση να καταργήσει την αντίσταση απόπτωση καθώς και την χημειοθεραπεία αντοχής που σχετίζονται με NE-κύτταρα που μοιάζουν PCa.

LNCaP-TR-shBeclin1 (Α) και LNCaP-TR-shAtg5 κύτταρα (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Dox για 48 ώρες για να επάγεται είτε beclin1 ή Atg5 knockdown, αντίστοιχα, ή αφεθεί χωρίς θεραπεία.