Αφηρημένο

Η αγγειογένεση παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου. Χαμηλή έκφραση του υποδοχέα των αλατοκορτικοειδών (MR) σε αρκετές κακοήθεις όγκους συσχετίζεται με την υποτροπή της νόσου και η συνολική επιβίωση. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση MR μειώνεται σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC). Εδώ Υποθέτουμε ότι μειωμένη έκφραση MR μπορεί να συμβάλει στην αγγειογένεση και φτωχή επιβίωση του ασθενούς σε ορθοκολικό κακοήθειες. Σε μια σειρά ασθενών CRC, αναλύσαμε όγκου έκφραση MR, ο συσχετισμός της με την πυκνότητα μικροαγγειακή όγκου και των επιπτώσεών της στην επιβίωση. Στη συνέχεια, μπορούμε ανακρίνει τον ρόλο του MR στην αγγειογένεση σε ένα in vitro μοντέλο, με βάση την κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου HCT116, ingenierized την εκ νέου έκφραση ενός φυσιολογικώς ελεγχόμενη MR. Σε CRC, μειωμένη έκφραση MR συσχετίστηκε με αυξημένη πυκνότητα μικροαγγειακή και κακή επιβίωση του ασθενούς. Σε pchMR επιμολυσμένα HCT116, αλδοστερόνης ή φυσικά στεροειδή ορό σε μεγάλο βαθμό ανέστειλε επίπεδα έκφρασης του mRNA των δύο VEGFA και του υποδοχέα του 2 /ΚΟΚ. Σε CRC, η ενεργοποίηση MR μπορεί να μειώσει σημαντικά την αγγειογένεση με απευθείας αναστολή απορυθμισμένη VEGFA και της έκφρασης VEGFA mRNA που προκαλείται από υποξία. Επιπλέον, η ενεργοποίηση MR εξασθενεί την έκφραση του υποδοχέα VEGF 2 /KDR, πιθανώς ύγρανσης την ενεργοποίηση ενός μονοπατιού σηματοδότησης που εξαρτάται VEGFA /KDR σημαντική για την επιβίωση των κυττάρων του όγκου υπό συνθήκες υποξίας

Παράθεση:. Tiberio L, Nascimbeni R, Villanacci V, Casella C, Fra Α, Vezzoli V, et al. (2013) Η μείωση των ορυκτοκορτικοειδούς Receptor Δίσκοι Αγγειογονικοί Pathways στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (3): e59410. doi: 10.1371 /journal.pone.0059410

Επιμέλεια: Antonio Moschetta, Πανεπιστήμιο του Μπάρι ρΡΙ_-ΤΚ που εκφράζει ο

Renilla

λουσιφεράση υπό τον έλεγχο του απλού έρπητα προαγωγό θυμιδίνης κινάσης του ιού αγοράστηκε από την Promega? pcDNA3 αγοράστηκε από την Invitrogen.

παροδική επιμόλυνση

HCT116 διαμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο επιμόλυνσης FuGENE HD (Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης για pchMR αξιολογήθηκε στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με ανοσοϊστοχημεία και βρέθηκε να είναι 53,5 ± 8%. Για μια εκτενή περιγραφή αυτής της ανάλυσης, ανατρέξτε S1 κείμενο.

Ίδρυση υποξία

φυσιολογική οξυγόνωση διατηρήθηκε από αναπτυσσόμενα κύτταρα στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστήρα που περιέχει 5% CO

2 στον αέρα. Η υποξία ιδρύθηκε διατηρώντας φιάλες καλλιέργειας στους 37 ° C υπό συνεχή ροή ενός αερίου μίγματος υποξικού που αποτελείται από 95% Ν

2 και 5% CO

2 για 90 λεπτά, όπως περιγράφεται. [27] Στη συνέχεια οι φιάλες σφραγίστηκαν και επωάστηκαν στους 37 ° C για τον επιθυμητό χρόνο της υποξίας.

καλλιέργειας και συνθήκες Θεραπεία της pchMR-MR Επιμολυσμένα HCT116 κύτταρα που αναπτύσσονται κάτω από νορμοξία και υποξία

Πέντε ώρες μετά από επιμόλυνση με pchMR, κύτταρα HCT116 επωάστηκαν σε μέσο Mc Coy που περιείχε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα Εμβρυϊκό Βόειο ορό (Invitrogen) σε αέρα για 12 ώρες (τα πειράματα νορμοξία) ή 24 ώρες (τα πειράματα υποξίας ή CoCl

2 θεραπεία 10% χωρίς ορμόνες ). Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 3 ηΜ αλδοστερόνης (Sigma-Aldrich) και /ή σπειρονολακτόνη (1 μΜ, δόθηκε 1 h πριν από την αλδοστερόνη) (Sigma-Aldrich) και επωάστηκαν περαιτέρω για 36 ώρες στον αέρα (νορμοξία), ή εκτεθειμένα επί 20 ώρες είτε να μειώσει το οξυγόνο (υποξία) ή με 100 μΜ CoCl

2 θεραπεία (CoCl

2). Εναλλακτικά, πέντε ώρες μετά την επιμόλυνση με pchMR ή pcDNA3, τα κύτταρα επωάστηκαν σε 10% FCS συμπληρωμένο μέσο για 48 ώρες στον αέρα (νορμοξία) ή επωάζονται για 24 ώρες στον αέρα ακολουθούμενη από έκθεση σε χαμηλού οξυγόνου για 20 h (υποξία).

Ποσοτική RT-PCR

RNA εκχυλίζεται και αναδρομικά μεταγραφομένων όπως περιγράφεται. [28] Τα επίπεδα μεταγραφημάτων αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR σε μια συσκευή iCycler (Bio-Rad, Μιλάνο, Ι) με iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) υπό συνθήκες που συνιστά ο προμηθευτής. Εκκινητές PCR, βλέπε Πίνακα S1, ελήφθησαν από Eurofins MWG Operon. επίπεδα έκφρασης αγγελιοφόρου RNA κανονικοποιήθηκαν προς β-ακτίνης από την εφαρμογή λογισμικού Q-γονιδίου. [29] Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν και τα προϊόντα της PCR και διαχωρίστηκαν σε πηκτή αγαρόζης 2,5% για έλεγχο.

Western Blot Ανάλυση

Για μια εκτενή περιγραφή, δείτε το κείμενο S1. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση: αντι-ανθρώπινο MR (αραίωση 1:300, ευγενική δωρεά από τον Δρ Gomez-Sanchez, GV Sonny Μοντγκόμερι VA Medical Center, Jackson, MS, USA) [30], αντι-ανθρώπινη HIF-1α ( γάδου. 610.658, αραίωση 1:800, BD Transduction Laboratories), αντι-ανθρώπινο GAPDH (SC-32233, αραίωση 1:5.000, Santa Cruz).

Gene Reporter Δοκιμασία

Για μια εκτενή περιγραφή, δείτε το κείμενο S1 σε απευθείας σύνδεση συμπλήρωμα. PchMR- ή pcDNA3- επιμολυσμένα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με πλασμίδιο που περιέχει γονίδια αναφοράς. Για την ανίχνευση της έκφρασης MR-καθοδηγείται λουσιφεράση, pFC31-Luc και ρΡΙ_-ΤΚ υπηρέτησε ως φορέα ρεπόρτερ ή coreporter γονίδιο, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα δίνονται ως κανονικοποιημένη σχετική δραστηριότητα λουσιφεράσης.

ανοσοφθορισμού

Για μια εκτενή περιγραφή, δείτε το κείμενο S1 σε απευθείας σύνδεση συμπλήρωμα. Σταθερή κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-MR (αραίωση 1:100) και με Alexa Fluor 448 αντι-ποντικού κατσίκας IgG, (Invitrogen). Οι κυτταρικοί πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI. Τα κύτταρα απεικονίζεται από το LSM συνεστιακό μικροσκόπιο (Zeiss).

Στατιστική Ανάλυση

Συνοπτικά στατιστικά στοιχεία για τις συνεχείς μεταβλητές με μη-κανονική κατανομή (όπως αξιολογήθηκε από Kolmogorov-Smirnov δοκιμές) παρουσιάζονται ως διάμεσοι, ενώ είναι κανονικά κατανεμημένα μεταβλητές συνοψίζονται ως μέσοι ± SEM. διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν με Wilcoxon-Mann-Whitney, t-test ή ANOVA Φοιτητών που ακολουθείται από Bonferroni t-test κατά περίπτωση. Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του MR και CD34 αξιολογήθηκε με την εφαρμογή Κάππα του Cohen και δοκιμές Phi Kramer του. Η μέθοδος Kaplan-Meier και δοκιμασία logrank χρησιμοποιήθηκαν για να εξετασθούν τα αποτελέσματα των διαφορετικών μεταβλητών στη συνολική επιβίωση. Δεν πολυπαραγοντική ανάλυση έγινε λόγω του περιορισμένου μεγέθους του δείγματος και η χαμηλή αναλογία των γεγονότων ανά μεταβλητή. Η στατιστική ανάλυση έχει πραγματοποιηθεί με τη χρήση του ανοικτού κώδικα στατιστικής R. πακέτο Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν αμφίδρομες και εκτελούνται σ 0,05.

Αποτελέσματα

Σε ορθοκολικό καρκίνωμα ασθενείς η έκφραση του υποδοχέα μεταλλοκορτικοειδών συσχετίζεται αντίστροφα με μικροαγγειακή πυκνότητα και φτωχή πρόγνωση

τα κλινικά χαρακτηριστικά βασικής γραμμής και πληροφορίες σχετικά με τους 5-ετών παρακολούθησης της κλάσης ασθενή που περιλαμβάνονται στη μελέτη συνοψίζονται στον πίνακα S2.

μικροαγγείων πυκνότητα, όπως αξιολογήθηκε από την έκφραση του CD34 ενδοθηλιακού δείκτη, και η έκφραση MR εκτιμήθηκαν με IHC. Ένα αντιπροσωπευτικό πρότυπο έκφρασης CD34 και MR σε ένα δείγμα CRC σε σύγκριση με εκείνη μιας κανονικής βλεννογόνο του κόλου φαίνεται στο Σχ. 1Β και 1Α, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα από παρόμοιες αναλύσεις σε δείγματα όγκων από κοόρτη μας ασθενή, βασίζεται στον προσδιορισμό της αναλογίας των δύο CD34 και MR θετικά κύτταρα στις διάφορες μέλη αυτής της ομάδας, δείχνουν ότι η έκφραση CD34 ήταν χαμηλή σε 12 υποκείμενα, ενδιάμεσα σε 2 άτομα, και υψηλή περιεκτικότητα σε 16 υποκείμενα, ενώ η έκφραση MR ήταν χαμηλή σε 17 άτομα, και με υψηλή περιεκτικότητα σε 13 άτομα (Εικ. 1). Υπήρξε μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του όγκου των CD34 και έκφραση του όγκου του MR (συντελεστής Kramer Φι: 0.95, κάπα του Cohen: -0,844, p & lt? 0.001). Οι εκφράσεις των δύο CD34 και MR συνδέθηκαν (απευθείας με p & lt? 0.001, και αντιστρόφως με p & lt? 0.001, αντίστοιχα) με το στάδιο του όγκου κατηγοριοποιούνται σε φάση Ι και ΙΙ, σε αντίθεση με σταδίου ΙΙΙ και IV. Μεταξύ των άλλων μεταβλητών κλινικο-παθολογικές, κανένας ήταν στατιστικά που σχετίζονται με CD34 ή έκφραση του κ.

Διάσπαρτα σκάφη θετικά για CD34 στην lamina propria. (X20) και (Α δεξί πάνελ) Διάχυτη πυρηνική θετικότητα για MR σε κρύπτες του παχέος εντέρου βλεννογόνου. (X40). (Β) Η &? Ε: Αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου, μετρίως διαφοροποιημένες, όπως φαίνεται με χρώση Αιματοξυλίνη-Ηωσίνη. CD34: Focal θετικότητα για το CD34 στα σκάφη που ευρίσκονται στον όγκο. MR: Διάχυτη πυρηνική και κυτταροπλασματική θετικότητα για MR σε καρκινικά κύτταρα. Μεγέθυνση: (α), x10? (Β), x20? (Γ), x40.

Η

Με τη δοκιμή rank καταγραφής, η συνολική επιβίωση βρέθηκε να σχετίζεται με την έκφραση του CD34 (p = 0,006), με την έκφραση του MR (p = 0,021) ( Εικ. 2), και με την πρόθεση της θεραπείας (ρ = 0,002). Κανένα από τα άλλα κλινικο-παθολογικές μεταβλητές βρέθηκε να σχετίζεται με τη συνολική επιβίωση, ωστόσο η επίδραση του σταδίου του όγκου στην επιβίωση ήταν στο όριο του εύρους της σημαντικότητας (p = 0,054).

Η

VEGFA και VEGFR2 /ΚΟΚ έκφραση αναστέλλεται από υποδοχείς αλατοκορτικοειδών ενεργοποίηση σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται

για να αναλύσει το ρόλο που διαδραματίζουν οι MR στην αγγειογένεση στο CRC και υπό το πρίσμα του σημαντικού ρόλου που διαδραματίζουν οι αγγειογενετικών παραγόντων που παράγονται απευθείας από καρκινικά κύτταρα στην ογκογένεση, έχουμε δημιουργήσει ένα in vitro μοντέλο μέσω επιμόλυνσης HCT116, μία καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή στην οποία η ενδογενής MR επίπεδο πρωτεΐνης ήταν μόλις ανιχνεύσιμη (Εικ. 3Α, το ανώτερο τμήμα), με ένα αποτελεσματικό σύστημα έκφρασης γονιδίου MR (pchMR πλασμίδιο) [25].

(Α, άνω πάνελ)

έκφραση MR.

κυτταρολύματα Σύνολο από άγριου τύπου και pchMR επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 αναλύθηκαν με western blot χρησιμοποιώντας αντι-MR αντισώματα. νεφρικά κύτταρα ανθρώπου (ΗΕΚ293) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Ανθρώπινη GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. Αντιπροσωπευτικά fluorograms από δύο ανεξάρτητα πειράματα που δίνει παρόμοια αποτελέσματα εμφανίζονται (Α, κάτω πλαίσιο)

MR μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις.

PchMR-επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με 3 ηΜ αλδοστερόνης ή /και 1 μΜ σπιρονολακτόνης σε μέσον Mc Coy με 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FCS. Λύματα ολόκληρων κυττάρων αναλύθηκαν με κηλίδα Western χρησιμοποιώντας αντι-MR αντισώματα. Οι MR μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που επάγεται με αγωγή αλδοστερόνη υποδεικνύεται από την προς τα άνω μετατόπιση της κινητικότητας του MR. Ένας εκπρόσωπος φθορογραφήματος από τρία ανεξάρτητα πειράματα με επιτιθέμενες αποτελέσματα φαίνεται (Β)

δραστηριότητα λουσιφεράσης εξαρτώνται κ.

PcDNA3-επιμολυσμένα (γκρίζες μπάρες) ή pchMR-επιμολυσμένα (λευκές ράβδοι) κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με pMMTV-Luc να εκφράζουν λουσιφεράση πυγολαμπίδας από έναν προαγωγό που εξαρτάται MR. Κυτταρική καλλιέργεια, αλδοστερόνης ή σπειρονολακτόνη θεραπεία και φυσιολογική οξυγόνωση ή υποξία συνθήκες περιγράφονται λεπτομερώς στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. Οι τιμές του πυγολαμπίδας δραστικότητα λουσιφεράσης της αλδοστερόνης διεγείρεται pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα σε 10% FCS απογυμνωμένο ή 0.1% FCS, και τα δύο σε νορμοξικά ή υποξικές συνθήκες, συγκρίθηκαν με εκείνα των μη διεγερμένα κύτταρα ελέγχου pchMR επιμολυσμένα, καθορίζεται ως 1. Οι τιμές της λουσιφεράσης πυγολαμπίδας δραστικότητα του pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα σε 10% FCS συγκρίθηκαν με εκείνη του pcDNA3-επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου, καθορίζεται ως 1. τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσες ± SEM (n = 4-6). ** Ρ & lt? 0.005 και *** ρ & lt? 0.001, vs κύτταρα ελέγχου,

# ρ & lt? 0,001 vs FCS- ή κύτταρα αλδοστερόνης επεξεργασμένα, ANOVA που ακολουθείται από Bonferroni t-test ή Student t-test, όταν απαιτείται. (C)

MR υποκυτταρικό εντοπισμό

. PchMR-επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με αλδοστερόνης (3 ηΜ) και /ή σπειρονολακτόνη (1 μΜ) για 30 λεπτά και χρωματίστηκαν με αντίσωμα αντι-MR (πράσινο) και DAPI (μπλε). Εικόνες ελήφθησαν με συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ.

Η

Δείξαμε ότι τουλάχιστον το 50% των κυττάρων HCT116 στην καλλιέργεια θα μπορούσε να επιμολυνθούν ρουτίνας (δείτε το

Υλικό και Μέθοδοι

) και εκφράζουν MR πρωτεΐνης σε σημαντικά επίπεδα, όπως φαίνεται από τη σύγκρισή τους με κύτταρα ΗΕΚ293, που λαμβάνονται ως θετικό μάρτυρα (Σχ. 3Α, πάνω μέρος). [31] Επιπλέον, με τη χρήση διαφορετικών προσεγγίσεων, δείξαμε ότι σε pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 MR λειτουργικά ενεργοποιείται από συναγωνιστές. Πράγματι, μετά την προμήθεια της αλδοστερόνης, MR υποβλήθηκαν σε ειδικές μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (Σχ. 3Α, κάτω πλαίσιο), τη μεταγραφή ενός πλασμιδίου MR ανταποκριτή που περιέχει γονίδιο λουσιφεράσης ήταν έντονα ενισχυμένη (Σχ. 3Β), και MR ήταν μετατοπίζεται μέσα στο κύτταρο πυρήνας με τα αναμενόμενα κινητική (Σχ. 3C). Ειδικότερα, αλδοστερόνης δίνεται στα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο που παρέχεται με είτε 0.1% ή 10% απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα εμβρυϊκό βόειο ορό σημαντικά αυξημένη τα επίπεδα της δράσης της λουσιφεράσης (16 πτυχώσεις αλδοστερόνης επεξεργασμένο pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα vs -untreated μάρτυρες). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η δραστικότητα λουσιφεράσης επίσης ενεργοποιήθηκε με ανάπτυξη κυττάρων σε 10% ορό εμβρύου μόσχου το οποίο περιέχει φυσικά αγωνιστές MR, αντιπροσωπεύοντας έτσι μια πιο φυσιολογική κατάσταση (5 πτυχώσεις σε pchMR επιμολυσμένα έναντι pcDNA3-επιμολυσμένα κύτταρα) (Σχ. 3Β). [32] Η επαγωγή της λουσιφεράσης δραστηριότητα με αγωγή της αλδοστερόνης, παρόμοιο με αυτό που βρέθηκε στα επιμολυσμένα κύτταρα κάτω από νορμοξία, βρέθηκε επίσης σε κύτταρα που εκτίθενται σε χαμηλότερες συγκέντρωση οξυγόνου (Σχ. 3Β), που μας επιτρέπει να ελεγχθεί η επίδραση της ενεργοποίησης MR επίσης σε κύτταρα που αναπτύσσονται υπό συνθήκες υποξίας. Δείξαμε επίσης ότι το ανταγωνιστικό ανταγωνιστή σπιρονολακτόνης προκάλεσε την εξαφάνιση του μεγαλύτερου μέρους του αλδοστερόνης που επάγεται μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, ενώ επάγει από μόνη της κάποια άλλα ειδικά αυτοί (Σχ. 3Α κάτω πίνακας) και σε μεγάλο βαθμό, αν και ατελώς, κατάργησε την αύξηση της δραστικότητας λουσιφεράσης που επάγεται από αλδοστερόνης (Σχ. 3Β). Εντυπωσιακά, η πυρηνική μετατόπιση του MR που προκαλείται από την αλδοστερόνη δεν θα μπορούσε να αποκλειστεί, αλλά μάλλον προκλήθηκε από σπιρονολακτόνη μόνη της (Σχ. 3C).

Λειτουργική επικύρωση του μοντέλου των κυττάρων μας, μας επέτρεψε να ερευνήσει την πιθανή αιτιακή σχέση μεταξύ της δραστηριότητας MR και οι αλλαγές έκφρασης του mRNA που κωδικοποιεί για διαφορετικούς αγγειογόνων παραγόντων τόσο σε νορμοξικά και υποξικό περιβάλλον. Δείξαμε ότι, σε pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα καλλιεργούνται υπό HTC116 ορθοξικές συνθήκες, η ενεργοποίηση MR με αλδοστερόνη προκαλεί μια σημαντική μείωση της έκφρασης του VEGF mRNA, ενώ δεν επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των άλλων αγγειογενετικών παραγόντων, δηλαδή bFGF, PGF2 και EGF. Η αλδοστερόνη προκληθείσα μείωση της έκφρασης VEGFA ήταν ειδικά, έστω και μερικώς, αναστέλλεται από την ανταγωνιστικό ανταγωνιστή MR σπειρονολακτόνη (Εικ. 4). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά επισημαίνουν VEGFA ως προ-αγγειογενετική γονίδιο ενδεχομένως ρυθμίζονται από τη δραστηριότητα κ.

Επιδράσεις της αλδοστερόνης στο VEGFA (Α), bFGF (Β), PGF2 (C) και EGF (D) επίπεδα mRNA σε pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 υπό ορθοξικές συνθήκες καλλιέργειας. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 ηΜ αλδοστερόνης σε 10% FCS απογυμνωμένο με την απουσία ή παρουσία 1 μΜ σπιρονολακτόνης και την ανάλυση των επιπέδων mRNA διεξήχθησαν με πραγματικού χρόνου PCR. Για κάθε πίνακα, οι τιμές έκφρασης του mRNA επεξεργασμένων pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με εκείνες των μη διεγερμένα κύτταρα ελέγχου pchMR επιμολυσμένα, καθορίζεται ως 1. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM (n = 3). * Ρ & lt? 0,05 vs pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου, ANOVA που ακολουθείται από Bonferroni t-test

Η

Είναι γνωστό ότι η υποξία, ένα σταθερό χαρακτηριστικό των στερεών μικροπεριβάλλον του όγκου, προκαλεί έντονα έκφραση VEGFA.. Σε αυτές τις βάσεις αναλύσαμε την επίδραση της ενεργοποίησης MR στα επίπεδα έκφρασης VEGFA υπό χαμηλή συγκέντρωση οξυγόνου. Σε αυτό το σκοπό, πρώτα απέδειξε ότι, σε pchMR επιμολυσμένα κύτταρα HCT116, τα επίπεδα του VEGFA mRNA να αυξηθεί μετά την έκθεσή τους σε υποξία παρόμοια με αγρίου τύπου HCT116 κύτταρα και ότι το

2 θεραπεία CoCl, η οποία μιμείται υποξία, αυξάνει έντονα VEGFA έκφραση mRNA σε επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 5Β και 5Α, αντίστοιχα). Στη συνέχεια έδειξε ότι η μείωση της έκφρασης VEGFA που προκαλείται από την αλδοστερόνη στο pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 κατά την διάρκεια νορμοξία (Σχ. 4Α) βρέθηκε επίσης υπό CoCl

2 θεραπεία ή υποξικές συνθήκες καλλιέργειας (Σχ. 6Α). Αυτά τα αποτελέσματα είναι ιδιαίτερα σημαντική δεδομένου ότι δείξαμε ότι τόσο η υποξία και CoCl

2 θεραπεία αυξάνει έντονα την έκφραση VEGFA mRNA (Εικ. 4Β). Επιπλέον, δείχνουν επίσης ότι ο κ ενεργοποίηση των αγωνιστών φυσικά παρούσα στο σύνολό FCS είναι σε θέση να μειώσει την έκφραση VEGFA mRNA τόσο στο πλαίσιο ορθοξικές και συνθήκες υποξίας (Εικ. 6Β).

Σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση της επαγωγής VEGFA mRNA σε κύτταρα άγριου τύπου HCT116 εκτέθηκαν σε χρόνους που υποδεικνύονται από υποξία (Α) και σε pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 εκτέθηκαν σε νορμοξία, υποξία ή CoCl

2 θεραπεία (Β). Στον πίνακα Α, οι τιμές της έκφρασης VEGFA mRNA για κάθε δείγμα σε σύγκριση με εκείνη του χρόνου 0, καθορίζεται ως 1. Στον πίνακα Β, οι τιμές της έκφρασης του VEGF mRNA του pchMR επιμολυσμένα κύτταρα εκτέθηκαν σε υποξία ή CoCl

2 θεραπεία συγκρίθηκαν με εκείνη της pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου που εκτίθενται σε φυσιολογική οξυγόνωση, καθορίζεται ως 1. τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM (n = 3-4). * Ρ & lt?. 0.05 ANOVA που ακολουθήθηκε από Bonferroni t-test

Η

σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση της επαγωγής VEGFA mRNA στο (Α) pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με 3 ηΜ αλδοστερόνης με την παρουσία ή στην απουσία 1 μΜ σπειρονολακτόνη και εκτέθηκαν σε CoCl

2 θεραπεία ή υποξία και (Β) pchMR- ή ροϋΝΑ3-επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 καλλιεργήθηκαν μόνο με 10% FCS κάτω από νορμοξικές και υποξικές συνθήκες καλλιέργειας. Στον πίνακα Α, οι τιμές της έκφρασης VEGFA mRNA για κάθε δείγμα συγκρίθηκαν με εκείνες των μη διεγερμένα κύτταρα ελέγχου pchMR επιμολυσμένα, καθορίζεται ως 1. Στον πίνακα Β, οι τιμές της έκφρασης του VEGF mRNA του pchMR επιμολυσμένα κύτταρα ορού ενεργοποιημένης συγκρίθηκαν με εκείνες του τα κύτταρα ελέγχου pcDNA3-επιμολυσμένα, καθορίζεται ως 1. τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM (n = 3-4). * P & lt? 0.05 vs pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου ή κύτταρα pcDNA3-επιμολυσμένα, ANOVA που ακολουθείται από Bonferroni t-test ή Student t-test κατά περίπτωση

Η

Τέλος, σχετικά με τις βάσεις των πρόσφατων εκθέσεων από Calvani. και συνεργάτες σχετικά με το ρόλο του ΚΟΚ εκφράζεται σε κύτταρα HCT116 στη διατήρηση της κυτταρικής επιβίωσης μετά από έκθεση σε παρατεταμένη υποξία, αναλύσαμε, σε pchMR επιμολυσμένα κύτταρα HCT116, μία πιθανή αιτιολογική σχέση μεταξύ δραστικότητας MR και τις αλλαγές έκφραση ΚΟΚ. Πράγματι, αυτοί οι συγγραφείς απέδειξαν ότι ΚΟΚ μεσολαβεί μια καθυστερημένη VEGF εξαρτώμενη επαγωγή του HIF-1α, οδηγώντας στην αυτοκρινή παραγωγή του VEGFA, δεδομένου ότι θα μπορούσε να αναστείλει τόσο HIF-1α-επαγωγή και την επιβίωση των υποξικών κυττάρων HCT116, είτε με αντι-VEGFA ή αντι-ΚΟΚ αντισώματα. [21] Έτσι, ως ένα προκαταρκτικό πείραμα, αποδείξαμε την παρουσία ενός λειτουργικού VEGF /KDR /HIF1α αυτοκρινής βρόχος στο κελί μας σειρά HCT116, αναπαράγοντας την έλλειψη της όψιμης επαγωγή του HIF-1α με VEGFA αντισωμάτων σε κύτταρα που αναπτύσσονται κάτω από υποξικές συνθήκες (Εικ. S1).

στη συνέχεια αποδεικνύεται ότι στη pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα HCT116, ενεργοποίηση MR προκάλεσε μια σημαντική μείωση των επιπέδων του ΚΟΚ mRNA. έκφραση ΚΟΚ mRNA μειώθηκε σε αλδοστερόνης διεγείρεται pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 έως περίπου 65% σε σχέση προς μη διεγερμένα τους ελέγχους τους (Εικ. 7Α) και ακόμη σε μεγαλύτερο βαθμό στον ορό που διεγείρεται pchMR- επιμολυσμένα HTC116 σύγκριση με pcDNA3-επιμολυσμένα ελέγχους (Σχ. 7Β ). Εντυπωσιακά, αν και η σπειρονολακτόνη δεν μετέβαλε σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης ΚΟΚ, φάνηκε να αντιστραφεί μόνο εν μέρει τις συνέπειες της θεραπείας αλδοστερόνης στο pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα HCT116. Πράγματι, ακόμη και αν μια παρόμοια μείωση στην έκφραση ΚΟΚ παρατηρήθηκε σε aldosterone- και σπιρονολακτόνη-αλδοστερόνης-κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με μάρτυρες, στην τελευταία αυτή περίπτωση, η μείωση αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Σχ. 7Α). Λόγοι που μπορεί να ευθύνεται για διαφορετικές δραστικότητα σπειρονολακτόνη στην αντιστροφή των αποτελεσμάτων που προκαλούνται από ενεργό MR σε διαφορετικούς στόχους ή σε διαφορετικά περιβάλλοντα θα συζητηθεί παρακάτω.

Επιπτώσεις της αλδοστερόνης

(Α)

ή

ορού (Β)

σχετικά επίπεδα KDR mRNA. καλλιέργεια

κυττάρων και θεραπείες συνθήκες ήταν όπως στο σχήμα 4, ή το σχήμα 6 πάνελ Β-νορμοξία, αντίστοιχα. Αναλύσεις επίπεδα ΚϋΡ mRNA διεξήχθησαν με πραγματικού χρόνου PCR και των αποτελεσμάτων (n = 5) δίδονται όπως στο Σχ 5. * ρ & lt? 0,05 vs pchMR-επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου ή κύτταρα pcDNA3-επιμολυσμένα, ANOVA που ακολουθείται από Bonferroni t-test ή Student t-test κατά περίπτωση.

η

Συζήτηση

Επειδή προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση MR ρυθμίζεται προς τα κάτω και στις δύο καρκίνους του παχέος εντέρου και του πνεύμονα, έχει προταθεί ότι ο κ μπορούν να ενεργούν ως ένα ογκοκατασταλτικών γονιδίων [23].

Εδώ έχουμε δημιουργήσει μια σύνδεση μεταξύ υποέκφραση του MR, μειωμένη επιβίωση και την προς τα πάνω ρύθμιση της αγγειογένεσης του όγκου του ασθενούς σε προχωρημένο στάδιο καρκίνου. Χρησιμοποιώντας ένα in vitro μοντέλο που βασίζεται σε μια κυτταρική γραμμή καρκινώματος του παχέος εντέρου, στην οποία ανάγκασε την έκφραση MR, πρέπει επίσης να παρέχουν τα στοιχεία που ενεργοποιείται MR μπορεί να μετριάσει την έκφραση της VEGFA και του υποδοχέα της 2 /ΚΟΚ.

Μια σύνδεση μεταξύ έκφραση MR και την αγγειογένεση σε CRC έχει προηγουμένως προταθεί. [22] Εδώ δείχνουμε ότι η έκταση του MR θετικών κυττάρων συσχετίζεται αντίστροφα να MVD σε δείγματα όγκων, υποστηρίζοντας την υπόθεση ότι η μειωμένη έκφραση MR απελευθερώνει ένα ρόλο κατασταλτική που ασκείται από MR στην αγγειογένεση του όγκου. Να δώσει ιδέες για το ρόλο που διαδραμάτισε ο κ στο CRC αγγειογένεση, δείξαμε ότι η εκ νέου έκφραση των ενεργοποιημένων MR σε μια άνω και κάτω τελεία καρκίνου κυτταρική γραμμή, η οποία χαρακτηρίζεται από ένα επίπεδο αρκετά χαμηλό πρωτεϊνών MR, μιμούμενη έτσι ένα βασικό χαρακτηριστικό που υπάρχουν στο CRC in vivo, οδηγεί σε μία ειδική μείωση στην έκφραση του mRNA του VEGFA μεταξύ άλλων αγγειογόνο παράγοντα που αναλύθηκαν, σε κύτταρα υπό νορμοξικές συνθήκες καλλιέργειας. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν μια άμεση επίδειξη μιας κατασταλτικής ρόλος του MR στην αγγειογένεση του όγκου οδηγείται από την κακοήθη επιθήλιο. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα ευρήματά μας σε κύτταρα του παχέος εντέρου είναι συνεπή με τα αποτελέσματα μιας πρόσφατης μελέτης σε ένα διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού που δείχνουν ότι η μακροχρόνια

in vivo

MR υπερέκφραση, παρουσία φυσιολογικών ποσό της αλδοστερόνης, συγκεκριμένα μειωτικά γονιδιακή έκφραση VEGFA στην καρδιά [33].

Λίγα είναι γνωστά για τη ρύθμιση των αγγειογόνων αυξητικών παραγόντων στον ιστό κάτω από νορμοξικές συνθήκες.