Αφηρημένο

Ιστορικό

Είναι αμφιλεγόμενο αν microRNA-126 είναι ένα κατασταλτικό του όγκου ή ογκογόνο miRNA. Τα περισσότερα πειράματα που απαιτούνται για να διαπιστωθεί αν microRNA-126 συνδέεται με μη μικροκυτταρικό τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του πνεύμονα και την πρόγνωση.

Μέθοδοι

Η υπερέκφραση του microRNA-126 διεξήχθη για να αξιολογήσει την εισβολή των κυττάρων και την ανάπτυξη του όγκου σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές (NSCLC) και το μοντέλο ξενομοσχεύματος γυμνού ποντικού. Gain-of-λειτουργίας πειράματα και δοκιμασίες λουσιφεράσης έγιναν για να αποκαλύψει τη σχέση μεταξύ microRNA-126 και ΡΙ3Κ-Akt μονοπάτι σήματος σε κύτταρα Α549. Αναλύσαμε τις ενώσεις της έκφρασης microRNA-126 μεταξύ των γενετικών παραλλαγών μέσα microRNA-126 και κλινικές πληροφορίες συμπεριλαμβανομένου του καθεστώτος του καπνίσματος, το φύλο, την ηλικία, και ιστολογικό τύπο και το στάδιο του όγκου.

Αποτελέσματα

Κατά τη διάρκεια -έκφραση microRNA-126 σε κυτταρικές γραμμές NSCLC μειωμένο πολλαπλασιασμό κυττάρων in vitro και την ανάπτυξη όγκου σε γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Και microRNA-126 καταπιεσμένη τη δραστικότητα της ΡΙ3Κ-Akt μονοπατιού με τη στόχευση θέσεις πρόσδεσης στην 3′-αμετάφραστη περιοχή του mRNA PI3KR2. Το επίπεδο έκφρασης του microRNA-126 μειώθηκε στις γραμμές NSCLC και ιστούς όγκων. Οι ασθενείς με χαμηλή έκφραση microRNA-126 είχαν σημαντικά φτωχότερη χρόνο επιβίωσης από ό, τι τα άτομα με υψηλή έκφραση microRNA-126 (μέσο χρόνο επιβίωσης (μήνες): 24.392 ± 1.055 έναντι 29.282 ± 1.140,

P

= 0,005). Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική διαφορά στις γονότυπος και αλληλόμορφο συχνότητες της παραλλαγής microRNA-126 (G & gt? Α, rs4636297) μεταξύ ασθενών και μαρτύρων (

P

= 0,366). Επιπλέον, δεν υπήρχε σχέση μεταξύ του rs4636297 SNP και του χρόνου επιβίωσης σε ασθενείς με NSCLC (

P

= 0,992). Και microRNA-126 έκφρασης δεν είχε καμία σημαντική διαφορά μεταξύ των τριών ομάδων γονότυπο (

P

= 0,972).

Συμπεράσματα

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι microRNA-126 είναι ένα από όγκο κατασταλτικού γονιδίου στον NSCLC και χαμηλή έκφραση microRNA-126 είναι μια δυσμενής προγνωστικός παράγοντας σε ασθενείς με NSCLC. Ωστόσο, ο ρυθμιστικός μηχανισμός του microRNA-126 παραμένει να διευκρινιστεί σε διαφορετικές κανονικών και κακοηθών ιστών. Ως εκ τούτου, απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να διερευνήσει τις λειτουργίες καταστολής όγκων των microRNA-126 σε NSCLC

Παράθεση:. Yang J, Lan H, Huang Χ, Liu Β, Tong Υ (2012) microRNA-126 Αναστέλλει Όγκων Κυττάρων την ανάπτυξη και την έκφραση της επίπεδο συσχετίζεται με κακή επιβίωση στο μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ασθενείς. PLoS ONE 7 (8): e42978. doi: 10.1371 /journal.pone.0042978

Συντάκτης: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, το Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 7, Φεβ, 2012? Αποδεκτές: 16, Ιουλίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 10 Αυγούστου 2012

Copyright: © Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αριθμός επιχορήγηση 30.800.633) και επαρχία Σιτσουάν Ίδρυμα Επιστήμης και Τεχνολογίας για Νέους (αριθμός επιχορήγηση 09ZQ026-034). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) παραμένει η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με τον κόσμο, καθώς και στην Κίνα [1]. Πολλά γονίδια που συμμετέχουν στον NSCLC ογκογένεση, όπως

p53

,

Rb

, και

Ras

[2]. Μια μελέτη δείχνει ότι 98 από 186 microRNAs είναι σε περιοχές του γονιδιώματος που συνδέεται με καρκίνο ή σε ευάλωτες περιοχές [3]. Για παράδειγμα, miR-99Α, ας-7, miR-125b-2 βρίσκονται σε ομόζυγη διαγραφή περιοχές χωρίς γνωστά γονίδια καταστολέα όγκου στον καρκίνο του πνεύμονα [3]. Αρκετές microRNAs βρίσκονται κοντά breakpoint περιοχές, συμπεριλαμβανομένων miR-142 στα 50 νουκλεοτίδια από το t (8, 17) που περιλαμβάνουν διακοπή χρωμόσωμα 17 και MYC [3]. Αυτό δείχνει ότι οι microRNAs μπορεί να παίξει καθοριστικό ρόλο στην ογκογένεση και τον καρκίνο πρόοδο [3]. Επιπλέον, προφίλ έκφρασης microRNA αποκαλύπτει χαρακτηριστικούς υπογραφές για πολλούς τύπους όγκων και είναι ένας βιοδείκτης της ταξινόμησης των όγκων, την πρόγνωση και τη θεραπευτική έκβαση [4] – [8].

microRNA-126 χαρτογραφηθεί στο χρωμόσωμα 9q34.3 στο γονίδιο που κωδικοποιεί υποδοχής του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα όπως-7 (

EGFL-7

). MicroRNA-126 εκφράζεται έντονα στον πνεύμονα και την καρδιά ιστούς αλλά εκφράζεται επίσης σε χαμηλότερα επίπεδα στον εγκέφαλο, το ήπαρ, τους νεφρούς και [9]. Υψηλά επίπεδα έκφρασης της έκφρασης microRNA-126 εντοπίζεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα, η οποία έχει έναν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της αγγειογένεσης και των αιμοφόρων αγγείων ακεραιότητα αναστέλλοντας την οδό VEGF. Knockdown του microRNA-126 είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια της αγγειακής ακεραιότητας και της αιμορραγίας κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης του ψαριού zebra [10] – [13]. Επιπλέον, ορισμένες μελέτες αποκάλυψαν ότι microRNA-126 καταπιεσμένη απόπτωση των κυττάρων οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας και ενίσχυσε την ικανότητα σχηματισμού αποικιών των οστών ποντικού προγονικών κυττάρων του μυελού των μέσω στόχευσης Πόλο-όπως κινάση 2 (

PLK2

) [14]. Αντιθέτως, άλλες μελέτες έδειξαν ότι microRNA-126 αναφέρεται συχνά ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε διάφορους καρκίνους [15] – [21]. Στον καρκίνο του στομάχου, του υπερ-έκφραση του microRNA-126 ενισχύεται σημαντικά την ανάπτυξη εξαρτάται από την αγκύρωση και ανεξάρτητη από προσκόλληση κυττάρου με στόχευση

SOX2

[16]. Στον καρκίνο του παχέος εντέρου, microRNA-126 καταστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με τη στόχευση φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση βήτα ρυθμιστική υπομονάδα (ρ85β) [19]. Ορισμένες μελέτες δείχνουν επίσης ότι το microRNA-126 μπορεί να αναστέλλουν την εισβολή και τον πολλαπλασιασμό με τη ρύθμιση

Crk

,

VEGF

, και

EGFL7

στον NSCLC [15], [21], [ ,,,0],22]. Έτσι, οι τρέχουσες ενδείξεις φαίνεται να υποστηρίζουν μια στενή σχέση μεταξύ microRNA-126 και την ανάπτυξη του όγκου. Επιπλέον, σε σύγκριση με τους ασθενείς που δεν ανταποκρίνονται στην θεραπεία πρώτης γραμμής με καπεσιταβίνη και οξαλιπλατίνη, επίπεδο έκφρασης microRNA-126 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ασθενείς που ανταποκρίνονται στη θεραπεία με καπεσιταβίνη και οξαλιπλατίνη [23]. Επιπλέον, ο λόγος των microRNA-126 /microRNA-152 επέτρεψε την ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης ουροθηλιακά (BCA) από ούρα σε ειδικότητα 82% και ευαισθησία 72% [24]. Με βάση τις παραπάνω αναφορές, microRNA-126 θα μπορούσε να έχει δυνατή προγνωστική και διαγνωστική αξία για τους καρκίνους.

Είναι αμφιλεγόμενο αν microRNA-126 είναι ένα κατασταλτικό του όγκου ή ογκογόνο miRNA. Και ο ρυθμιστικός μηχανισμός του microRNA-126 παραμένει να διευκρινιστεί σε διαφορετικές κανονικών και κακοηθών ιστών [25]. Επί του παρόντος, οι περισσότερες πειράματα για να προσδιοριστεί αν microRNA-126 σχετίζεται με μη μικροκυτταρικό κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα και την πρόγνωση. Σε αυτή τη μελέτη, θα διερευνήσει το ρόλο του microRNA-126 στον NSCLC και να αποδείξει ότι είναι ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο και το επίπεδο έκφρασης του συσχετίζεται με κακή επιβίωση σε ασθενείς με NSCLC.

Αποτελέσματα

MicroRNA- 126 αναστέλλει τον κυτταρικό εισβολή δοκιμασία και όγκου Ανάπτυξης

Πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία κυττάρων εισβολή στο Α549 και SK-MES-1 κύτταρα με τον φορέα ΡΕ-Mir126 ή ΡΕ-CMV φορέα επιμόλυνσης. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η υπερ-έκφραση του microRNA-126 εξασθενημένη κυτταρική εισβολή, η οποία αποτελείται με προηγούμενες αναφορές (Σχήμα 1Α). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μειώθηκε κατά 47,91% (

P

= 0,0006) και 36.36% (

P

= 0.0018), όταν αντίστοιχα Α549 και SK-MES-1 κύτταρα αντίστοιχα αγωγή με microRNA-126 υπερ-έκφραση για 72 ώρες (Εικόνα 1Β). Για να διερευνήσουν περαιτέρω το αποτέλεσμα του microRNA-126 στην ανάπτυξη του όγκου, μελετήσαμε την ικανότητα των microRNA-126 για να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

από ενδοογκική ένεση του φορέα PE-Mir126 σε Α549 και SK-MES-1 ξενομοσχευμάτων μοντέλα γυμνών ποντικών. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1Γ, η ανάπτυξη των όγκων παρατηρήθηκε από 1 έως 25 ημέρες μετά την τελευταία ένεση. Το μέσο βάρος των όγκων στα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με τον φορέα ΡΕ-Mir126 κατά την ημέρα 25 μετά την τελευταία ένεση ήταν μόνο περίπου ένα ήμισυ του βάρους του όγκου στα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με PBS μόνο ή φορέα ΡΕ-CMV μόνο (Σχήμα 1 D). Όλοι οι όγκοι αύξηση στους ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με τον φορέα ΡΕ-Mir126 ήταν σημαντικά κατέστειλε σε σύγκριση με εκείνες σε αγωγή με PBS και φορέα ΡΕ-Mir126 ποντίκια με αγωγή.

(Α) Overe-xPression του microRNA-126 αναστέλλει την εισβολή των κυττάρων σε Α549 και SK-MES-1 κύτταρα. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η υπερ-έκφραση του microRNA-126 εισβολή αποδυναμωνόταν κύτταρο. (Β) microRNA-126 παρεμποδίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε Α549 και SK-MES-1 κύτταρα. Το κυτταρικό πολλαπλασιασμό μειώθηκε δραματικά μετά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με microRNA-126 υπερ-έκφραση για 72 ώρες. (Γ) Η καμπύλη ανάπτυξης όγκου

in vivo από

ενδοογκική ένεση με microRNA-126. Η ανάπτυξη των όγκων παρατηρήθηκε από 1 έως 25 ημέρες μετά την τελευταία ένεση. (D) microRNA-126 αναστέλλει την αύξηση των κυττάρων Α549 και SK-MES-1 κύτταρα in vivo. Ο μέσος όγκος μόνο περίπου μια μισο του βάρους όγκων στους ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με PBS ή φορέα ΡΕ-CMV μόνο. ​​

Η

microRNA-126 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων όγκου αν και ΡΙ3Κ-Ακί Pathway σε NSCLC

για να εξερευνήσετε το μοριακό μηχανισμό του microRNA-126 αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση στο NSCLC, χρησιμοποιήσαμε δύο προγράμματα ανοικτής πρόσβασης (TargetScan και miRBase) για την πρόβλεψη των στόχων του microRNA-126. Οι προβλεπόμενες θέσεις σύνδεσης στην 3’UTR του

PIK3R2

για microRNA-126 που φαίνεται στο Σχήμα 2Α. Η δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης έδειξαν ότι η δραστηριότητα του ρεπόρτερ που περιέχει το 3’UTR του

PIK3R2

γονίδιο μειώθηκε μετά την συν-επιμόλυνση με ΡΕ-Mir126 φορέα (100.67 ± 4.51 vs.31.33 ± 5.86,

P & lt ?

0,0001), ενώ η δραστηριότητα της τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση του ρεπόρτερ που περιέχει το 3’UTR του

PIK3R2

γονίδιο δεν ήταν προφανώς μεταβληθεί (104.00 ± 8.54 έναντι 98.33 ± 10.12,

P

= 0,484) (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, η ανάλυση στυπώματος western αποκάλυψε ότι η έκφραση του PIK3R2 ήταν μειωμένη με κατεργασία με φορέα ΡΕ-Mir126 σε Α549 (0.97 ± 0.14 vs.0.31 ± 0.07, Ρ = 0,002) και SK-MES-1 κύτταρα (0,94 ± 0,13 vs. 0.45 ± 0.08,

P

= 0,005) (Σχήμα 2C). Επιπλέον, η επιμόλυνση του φορέα ΡΕ-Mir126 αντί φορέα ΡΕ-CMV καταστέλλονται σημαντικά φωσφορυλίωσης Akt χωρίς αλλαγή των επιπέδων έκφρασης του συνολικού Akt πρωτεΐνης (κύτταρα Α549, 0,89 ± 0,10 vs.0.41 ± 0.04, Ρ = 0,002. SK-MES-1 κύτταρα 0,88 ± 0,08 vs.0.47 ± 0,05

P

= 0,002) (Εικόνα 2C).

(Α) Υποθετικά microRNA-126 τόπου στόχευση στην 3’UTR του PIK3R2. Μετάλλαξη παρήχθη στην αλληλουχία 3’UTR του PIK3R2 στο συμπληρωματικό χώρο για την περιοχή του σπόρου microRNA-126 όπως υποδεικνύεται. (Β) microRNA-126 θέση πρόσδεσης στην 3’UTR της PIK3R2 εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ανιχνεύθηκε με ένα φωτόμετρο μετά συν-επιμόλυνσης για 48 ώρες. Η δραστικότητα της λουσιφεράσης από κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκε στη δραστηριότητα λουσιφεράσης Renilla. (C) microRNA-126 καταστέλλει έκφραση PIK3R2 και φωσφορυλίωση της Akt σε Α549 και SK-MES-1 κύτταρα. Η συνολική πρωτεΐνη απομονώθηκε από κύτταρα επεξεργασμένα με φορέα ΡΕ-Mir126 ή φορέα ΡΕ-CMV για 48 ώρες. έκφραση PIK3R2 και φωσφορυλίωσης Akt αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας το αντίσωμα να ρ85β και φωσφο-Akt (Ser473). (D) Τα επίπεδα έκφρασης PIK3R2 και φωσφορυλίωση της Akt σε ιστούς NSCLC. μπαρ κλίμακα, 10 μm. ένα. Ανοσοϊστοχημική χρώση αρνητικό έλεγχο των PIK3R2 σε NSCLC ιστό. σι. Ανοσοϊστοχημική χρώση αρνητικού ελέγχου του ρ-Akt (Ser473) σε NSCLC ιστό. ντο. Ανοσοϊστοχημική χρώση των PIK3R2 σε NSCLC ιστού με χαμηλά επίπεδα έκφρασης microRNA-126. ρε. Η ανοσοϊστοχημική χρώση του ρ-Akt (Ser473) σε NSCLC ιστού με χαμηλά επίπεδα έκφρασης microRNA-126. μι. Ανοσοϊστοχημική χρώση PIK3R2 σε NSCLC ιστού με υψηλά επίπεδα έκφρασης microRNA-126. φά. Η ανοσοϊστοχημική χρώση του ρ-Akt (Ser473) σε NSCLC ιστού με υψηλά επίπεδα έκφρασης microRNA-126. (Ε) Τα επίπεδα έκφρασης των PIK3R2 και φωσφορυλίωσης της Akt σε ιστούς NSCLC αντιστρόφως ανάλογη με τα επίπεδα έκφρασης microRNA-126 (PIK3R2, Spearman r = -0,276,

P & lt?

0,0001, Akt, Spearman r = -0,164,

P

= 0,0013). (F) Η θεραπεία με Akt-myr οδήγησε σε στατιστικά σημαντική διάσωση του Α549 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SK-MES-1 με επιμόλυνση με τον φορέα ΡΕ-Mir126. Η συνολική πρωτεΐνη απομονώθηκε από κύτταρα επεξεργασμένα με Akt-MYR, τον φορέα ΡΕ-Mir126 ή των αντίστοιχων ελέγχων για 48 ώρες. Akt φωσφορυλίωση αναλύθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας το αντίσωμα προς φωσφο-Ακί (Ser473). Αφού τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με Akt-MYR, τον φορέα ΡΕ-Mir126 ή των αντίστοιχων ελέγχων για 72 ώρες σε πλάκα 96 φρεατίων, τα ποσοστά πολλαπλασιασμού των κυττάρων προσδιορίστηκαν με την δοκιμασία ΜΤΤ.

Η

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ microRNA-126 και

PIK3R2

σε NSCLC, ανιχνεύσαμε τα επίπεδα έκφρασης του microRNA-126, φωσφορυλίωση PIK3R2 και Akt σε 381 κλινικά δείγματα με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR) και ανοσοκυτταροχημεία (IHC) αντιστοίχως. Τα επίπεδα έκφρασης της φωσφορυλίωσης Akt και PIK3R2 σε ιστούς όγκων αντιστρόφως ανάλογη με τα επίπεδα έκφρασης microRNA-126 (PIK3R2, Spearman r = -0.276,

P

& lt? 0,0001, Akt, Spearman r = -0.164,

P

= 0,0013, Σχήμα 2D & amp? Ε και Πίνακας 1). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 2F έδειξαν ότι η θεραπεία με την ανάκτηση Akt δραστηριότητα είχε ως αποτέλεσμα τη στατιστικά σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού σε κύτταρα Α549 και SK-MES-1 κύτταρα με επιμόλυνση με ΡΕ-Mir126 φορέα (

P

& lt? 0,0001) .

η

επίπεδα microRNA-126 έκφρασης συσχετίζονται με κακή επιβίωση στο μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ασθενείς

σε σύγκριση με την απαθανάτισε βρογχικά επιθηλιακά NL20, 126 microRNA-επίπεδα έκφρασης, προφανώς μειώθηκαν σε κυτταρικές γραμμές NSCLC, όπως Α549, Η358, H1703, Η460 και SK-MES-1 (Σχήμα 3Α). Το επίπεδο έκφρασης του microRNA-126 εξετάστηκε επίσης σε μία ομάδα που αποτελείται από 168 ζεύγη καρκινικών ιστών NSCLC και συμφωνημένα παρακείμενων noncancerous ιστούς (Σχήμα 3Β). επίπεδο έκφρασης του ήταν πολύ χαμηλότερη στους ιστούς όγκων από ότι σε μη καρκινικούς ιστούς (0,905 ± 0.171vs.0.683 ± 0.308,

P & lt?

0,0001).

Τα επίπεδα έκφρασης (Α) του microRNA -126 μειώνονται σε κυτταρικές σειρές NSCLC. Η έκφραση του microRNA-126 εξετάστηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR σε κυτταρικές σειρές NL20 και κυτταρικές σειρές NSCLC. (Β) Τα επίπεδα έκφρασης των microRNA-126 μειώνονται σε δείγματα ανθρώπινου NSCLC. Η έκφραση του microRNA-126 προσδιορίστηκε με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου σε ιστούς όγκων και ιστών παρακείμενων πνευμόνων ταιριαστού ασθενούς. Σε σύγκριση με τις αντίστοιχες παρακείμενους ιστούς των πνευμόνων, microRNA-126 έκφραση ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω σε ιστούς όγκου (

P

& lt? 0,0001). (C) έκφραση Χαμηλή microRNA-126 συσχετίζεται με κακή επιβίωση των ασθενών με NSCLC. Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε δύο ομάδες με βάση τα επίπεδα έκφρασης τους microRNA-126: άτομα με λιγότερο από διάμεση τιμή των microRNA-126 επίπεδα έκφρασης και εκείνοι με μεγαλύτερη ή ίση προς το διάμεσο του microRNA-126 επίπεδα έκφρασης (διάμεσος: 0,654). Οι ασθενείς με χαμηλή έκφραση microRNA-126 είχαν σημαντικά κακή χρόνο επιβίωσης σε σύγκριση με εκείνους με υψηλή έκφραση microRNA-126 (σημαίνει για τον χρόνο επιβίωσης (μήνες): 24.392 ± 1.055 έναντι 29.282 ± 1.140,

P

= 0,005) .

η

Όπως απεικονίζεται στον πίνακα 2, διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης του microRNA-126 δεν συσχετίζονται με το φύλο, την ηλικία, ιστολογικό τύπο, ή το στάδιο του όγκου στο κοόρτη 442 περιπτώσεων NSCLC . Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε δύο ομάδες με βάση τα επίπεδα έκφρασης τους microRNA-126: άτομα με λιγότερο από διάμεση τιμή των microRNA-126 επίπεδα έκφρασης και εκείνοι με μεγαλύτερη ή ίση προς το διάμεσο του microRNA-126 επίπεδα έκφρασης (διάμεσος: 0,654). Ωστόσο, η ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε ότι οι ασθενείς με χαμηλά επίπεδα έκφρασης microRNA-126 είχαν σημαντικά φτωχούς φορές την επιβίωση σε σύγκριση με εκείνους με υψηλό επίπεδο έκφρασης microRNA-126 (σημαίνει για τον χρόνο επιβίωσης (μήνες): 24.392 ± 1.055 έναντι 29.282 ± 1.140 ,

P

= 0,005) (Εικόνα 3C). Η πολυπαραγοντική Cox ανάλυση παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου έδειξε επίσης ότι τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης microRNA-126 ήταν σημαντικά δυσμενή προγνωστικό παράγοντα (αναλογία κινδύνου, 0.782? 95% CI, 0.647 0,945). (Πίνακας 3)

Η

γενετική παραλλαγή στο microRNA-126 δεν συνδέεται με τον καρκίνο του κινδύνου και Χρόνος επιβίωσης σε ασθενείς με ΜΜΚΠ

Εμείς αλληλουχία των τμημάτων του γονιδιώματος DNA, συμπεριλαμβανομένης της προ-miR-126 και αντίστοιχες πλευρικές περιοχές του (± 200 bp) σε 442 NSCLC ασθενείς και 543 μάρτυρες. Τρεις SNPs, συμπεριλαμβανομένων rs78242242, rs1140713 rs4636297and, ελέγχθηκαν στα τμήματα. Στην παρούσα μελέτη, rs78242242 και rs1140713 δεν αναλύθηκαν στατιστικά λόγω των πολύ χαμηλών συχνοτήτων (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Η κατανομή γονότυπος του SNP (G & gt? Α, rs4636297) στους μάρτυρες ήταν αναγνωρίζεται σε ισορροπία Hardy-Weinberg (

P

= 0,336), και δεν υπήρξε συνολική διαφορά στις κατανομές γονότυπου μεταξύ των περιπτώσεων και έλεγχοι (Πίνακας 4). εκτιμήσεις επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε ότι δεν υπήρχε σχέση μεταξύ rs4636297 και του χρόνου επιβίωσης σε ασθενείς με ΜΜΚΠ (

P

= 0,992) (Εικόνα 4Α). Η πολυπαραγοντική Cox ανάλυση παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου έδειξε επίσης ότι rs4636297 δεν συνδέθηκε με τη συνολική επιβίωση των ασθενών με NSCLC (αναλογία κινδύνου, 0,995? 95% CI, 0,836 – 1,184) (Πίνακας 3). Αξιολογήσαμε επίσης αν ο πολυμορφισμός rs4636297 συσχετίστηκε με έκφραση microRNA-126 σε NSCLC και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των τριών ομάδων γονότυπο (

P

= 0,972) (Σχήμα 4Β).

(Α) γενετική παραλλαγή στο microRNA-126 δεν σχετίζεται με τους χρόνους επιβίωσης. εκτιμήσεις επιβίωσης Kaplan-Meier δείχνουν ότι δεν υπάρχει καμία συσχέτιση μεταξύ rs4636297 SNP και του χρόνου επιβίωσης σε ασθενείς με NSCLC (

P

= 0,992). (ΣΙ). Τα επίπεδα έκφρασης του microRNA-126 σε NSCLC ιστούς τριών γονοτύπων είναι παρόμοια. έκφραση microRNA-126 προσδιορίστηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των τριών ομάδων γονότυπο (

P

= 0,972).

Η

Συζήτηση

Κατά τα τελευταία λίγα χρόνια, έχει διαπιστωθεί ότι η παρεκκλίνουσα εκφράσεις microRNAs παίζουν σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό και την ανάπτυξη [26] όγκων – [28]. Στην ογκογένεση, τα επίπεδα έκφρασης ορισμένων microRNAs μειώθηκε σε ιστούς του καρκίνου. Αυτοί οι τύποι των microRNAs θεωρούνται ως γονίδια καταστολής όγκου. Tumor καταστολέα microRNAs συνήθως εμποδίζουν ογκογένεση ρυθμίζοντας αρνητικά ογκογονίδια ή γονίδια που ελέγχουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, τη μετανάστευση και την απόπτωση [29], [30]. Επί του παρόντος, microRNA-126 επίπεδο έκφρασης μειώνεται σημαντικά σε διάφορους ιστούς όγκων, συμπεριλαμβανομένων των NSCLC, καρκίνοι του παχέος εντέρου, του καρκίνου του μαστού και καρκίνου του στομάχου [16] – [22], [31]. Ως εκ τούτου, microRNA-126 θεωρείται ως ογκοκατασταλτικά γονίδια.

Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η υπερ-έκφραση του microRNA-126 πολλαπλασιασμός εξασθενημένη NSCLC αύξησης κυττάρων και όγκων στο μοντέλο ξενομοσχευμάτων γυμνών ποντικών. Είναι γενικά αποδεκτό ότι miRNAs ασκούν την λειτουργία τους με προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων κατάντη στόχο τους. Η ενεργοποίηση των αποτελεσμάτων ΡΙ3Κ οδού στην κυτταρική ανάπτυξη και επιβίωση, η οποία συμβάλλει στην ανάπτυξη του όγκου, το μεταστατικό και αντίσταση σε θεραπεία NSCLC [32]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η ΡΙ3Κ-Akt μονοπάτι παίζει έναν κεντρικό ογκογόνο ρόλο στην επαγωγή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την ανάπτυξη όγκων [33], [34]. Αυτή η οδός είναι ως εκ τούτου ένας ελκυστικός στόχος για τους αντικαρκινικούς παράγοντες. Με βάση την βιοπληροφορική ανάλυση για τους στόχους πρόβλεψη microRNA-126, το

επιλέχθηκε PIK3R2

γονίδιο για τους πιθανούς στόχους του microRNA-126. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι

PIK3R2

γονίδιο ήταν ένα άμεσο στόχο του microRNA-126. Επιπλέον, microRNA-126 έκφρασης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές NSCLC και ιστούς όγκου αισθητά μειωμένη σε σύγκριση με μη καρκινικό κύτταρα και τους ιστούς. ASLO δεδομένα μας έδειξαν ότι η υπερ-έκφραση του microRNA-126 πολλαπλασιασμός εξασθενημένη NSCLC κυττάρου και την ανάπτυξη του όγκου σε ξενομοσχεύματα Α549 μοντέλο γυμνών ποντικών αν και ρύθμιση του PI3K-Akt μονοπάτι σηματοδότησης. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η απώλεια της έκφρασης microRNA-126 μπορεί να περιλαμβάνει την ανάπτυξη και την εξέλιξη του NSCLC. Συνεπής με αυτά τα προηγούμενα ευρήματα [22], τα αποτελέσματά μας έδειξαν επίσης ότι τα επίπεδα έκφρασης της έκφρασης microRNA-126 συσχετίζονται με κακή επιβίωση σε μη μικροκυτταρικό ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα.

γενετικές παραλλαγές σε πρόδρομο microRNA (pre-miRNA) ή έχουν miRNA θέσεις στόχοι έχουν δειχθεί ότι σχετίζεται με τον κίνδυνο διαφόρων μορφών καρκίνου. Μερικές μελέτες δείχνουν ότι SNPs σε προ-miRNAs έπαιξε σημαντικό ρόλο στην πρόβλεψη του NSCLC επιβίωση και την επιδεκτικότητα [35], [36]. Για παράδειγμα, miR-196a2 παραλλαγή ομοζυγώτες είχε μια αυξημένη αναλογία κινδύνου 1,76 φορές (HR) για μια δυσμενή συνολική επιβίωση των NSCLC [36]. Ωστόσο, δεν πολυμορφισμοί βρέθηκαν στις προβλεπόμενες θέσεις σύνδεσης στην 3’UTR της PIK3R2 για microRNA-126. Γι ‘αυτό και πραγματοποίησε την ανάλυση της γενετικής σύνδεσης για να μελετήσει πιθανή συσχέτιση των SNPs στο microRNA-126 με την επιβίωση και την ευαισθησία του NSCLC. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι οι γονότυπος και αλληλόμορφο συχνότητες του microRNA-126 (G & gt? Α, rs4636297) SNPs δεν συσχετίστηκαν με τον κίνδυνο και τη συνολική επιβίωση των NSCLC. Στην προηγούμενη έκθεση, η συσχέτιση μεταξύ του rs4636297 και του κινδύνου καρκίνου του μαστού δεν έχει βρεθεί [37]. Πρόσφατη μελέτη καταδεικνύει ότι rs4636297GG γονότυπο σημαντικά μπλοκ η επεξεργασία των PRI-miRNA να προ-miRNA, με αποτέλεσμα την σημαντικά μειωμένη ώριμο microRNA-126 έκφρασης [38]. Ομοίως, σε σύγκριση με τον αγρίου τύπου G αλληλόμορφο, το Μια παραλλαγή του rs4636297 δεν έχει καμία επίδραση στη δευτερογενή δομή της ίδιας της προ-miR-126, αλλά επηρεάζει τη δευτερεύουσα δομή της πλευρικής περιοχής. Εν τω μεταξύ, η ελεύθερη ενέργεια ΔG είναι αυξημένη στην Α αλληλόμορφο παραλλαγής [37]. Ωστόσο, microRNA-126 επίπεδο δεν είχε καμία σημαντική διαφορά μεταξύ των τριών ομάδων γονότυπο στην ομάδα μας των 442 περιπτώσεων NSCLC. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι δαιμόνια παραλλαγές στο microRNA-126 δεν έχουν καμία επίπτωση στο επίπεδο microRNA των ιστών του όγκου σε ασθενείς με NSCLC. Αν και μια μελέτη προσδιόρισε ότι Ets-1 και Ets-2 μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση του microRNA-126 με τη στόχευση ενός στοιχείου πρόσδεσης Ets σε γονιδιωματικές περιοχές ανάντη του microRNA-126 και

EGFL7

γονίδιο σε ενδοθηλιακά κύτταρα [39] , περαιτέρω μελέτες είναι απαραίτητες για να καθοριστεί αν η παραπάνω μηχανισμός περιλαμβάνει στο κάτω ρύθμιση των microRNA-126 σε NSCLC.

Εν περιλήψει, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι microRNA-126 είναι ένα γονίδιο καταστολής όγκων στον NSCLC και χαμηλής έκφραση microRNA-126 είναι μια πολύ δυσμενής προγνωστικός παράγοντας σε ασθενείς με NSCLC. Ωστόσο, οι γενετικές παραλλαγές του microRNA-126 δεν συνδέονται με NSCLC κινδύνου και πρόγνωση. Επιπλέον, το ρυθμιστικό μηχανισμό του microRNA-126 παραμένει να διευκρινιστεί σε διαφορετικές κανονικών και κακοηθών ιστών. Ως εκ τούτου, απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να διερευνήσει τις λειτουργίες καταστολής όγκων των microRNA-126 σε NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture, Πληθυσμός μελέτης και χειρουργικά δείγματα

Α549, Η358, H1703, Η460 και SK-MES-1 ανθρώπινου γραμμές NSCLC, ένα φυσιολογικό ανθρώπινο βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων (NL-20), ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. Ανθρώπινα δείγματα NSCLC ήταν από 442 ασθενείς σε Τσενγκντού Στρατού Γενικό Νοσοκομείο και το Νοσοκομείο Sichuan Provincial Λαϊκής από το 2008 και το 2010. Από 442 δείγματα, 76 ελήφθησαν με βιοψία από 43 περιπτώσεις του σταδίου IV και 33 περιπτώσεις του σταδίου ΙΙΙ, και το υπόλοιπο που λαμβάνεται με χειρουργική. Υπάρχουν 168 παρακείμενα noncancerous ιστούς των πνευμόνων στα 442 δείγματα. Το στάδιο της NSCLC βασίζεται σε (AJCC) Σύστημα TNM την αμερικανική μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο. ελέγχου χωρίς καρκίνο ήταν από μια ομάδα των 543 ατόμων που δεν είχαν ιστορικό καρκίνου και αντιστοιχήθηκαν με τις υποθέσεις που αφορούν την ηλικία και το φύλο. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Σιτσουάν Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών & amp? Sichuan Provincial Λαϊκού Νοσοκομείου, Δυτική Κίνα Δεύτερον Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Sichuan και Chengdu Στρατού Γενικό Νοσοκομείο. Η υπογεγραμμένη ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες ή από τους εκπροσώπους των ασθενών, αν δεν μπορεί να επιτευχθεί άμεσα συναίνεση. Κανένας από τους ασθενείς είχαν λάβει καμία θεραπεία για τον καρκίνο του πνεύμονα πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Οι συμμετέχοντες στη μελέτη υποβλήθηκαν σε προσωπική συνέντευξη για να λάβουν πληροφορίες σχετικά με δημογραφικά χαρακτηριστικά και παράγοντες του τρόπου ζωής, όπως η χρήση καπνού.

Εξαγωγή RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ. Ολικό RNA (100 ng) από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση cDNA χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφή εναύσματα για microRNA-126 και U6 μικρό πυρηνικό RNA. Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο διεξήχθη χρησιμοποιώντας το SYBR® Premix Ex Taq ™ (Takara Biotech Co.). qPCR εναρκτήριων για microRNA-126 (Cat.no.MQP-0101) και U6 μικρό πυρηνικό RNA (Cat.no.MQP-0201) ήταν από Ribobio Co. microRNA-126 και U6 μικρά πυρηνικά RNA ήταν αντίστοιχα ποσοτικά σύμφωνα με την πρότυπη καμπύλη και πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. U6 μικρού πυρηνικού RNA χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση. Η σχετική έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση:. Αντίτυπα (miR-126) /αντίγραφα (U6)

Δοκιμασία Κυττάρων εισβολή

Ένα θάλαμο καλλιέργειας κυττάρων φρεατίων (Millipore, Bedford, MA, USA) επικαλύφθηκε με Matrigel, ξηραίνονται και να ανασυσταθεί με μέσο καλλιέργειας στους 37 ° C. Τα κύτταρα διαιρούνται σε τρεις ομάδες: την ομάδα ελέγχου, η ομάδα ΡΕ-CMV και της ομάδας ΡΕ-Mir126. Κύτταρα μετεμβολιασμένα με ΡΕ-CMV ή ΡΕ-Mir126 στερήθηκαν τροφής εντός μέσου χωρίς ορό και εναιωρούνται σε 1 × 10

6 /ml σε μέσο RMPI1640 για 24 ώρες πριν από την δοκιμασία. 300 μΐ κυτταρικού εναιωρήματος τοποθετήθηκαν στον άνω θάλαμο και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 24 ώρες στους 37 ° C. Τα αιωρούμενα μέσα ενημέρωσης στον κατώτερο θάλαμο απομακρύνθηκαν. Τα κύτταρα που είχαν εισβάλει την κάτω πλευρά του φίλτρου μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με διάλυμα Gimsa. Ο αριθμός των κυττάρων που πέρασαν μέσα από τους πόρους εντός του κατώτερου θαλάμου μετρήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Δοκιμασίες

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων σε RMPI1640 με 10% FBS και 100 μg /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη για 72 ώρες. ρυθμούς πολλαπλασιασμού των κυττάρων προσδιορίστηκαν με την δοκιμασία 3- (4, 5-διμεθυλοθειαζολυλ-2) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ).

Vector Κατασκευάσματα

Το θραύσμα 398 bp σε μήκος που περιέχουν 3’UTR του

PIK3R2

ενισχύθηκε με PCR και κλωνοποιήθηκε σε φορέα PMD-18T (Takara) χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: προς τα εμπρός, 5′-ACTAGTTGCAGATTCAGGGCTTCTCT -3 ‘, και αντίστροφη, 5’-AAGCTTCCTGTATGACCTTGGGCACT -3 ‘. Στη συνέχεια, το θραύσμα υποκλωνοποιήθηκε εντός των θέσεων Spe Ι και Hind III προς τα κάτω του γονιδίου της λουσιφεράσης στο πλασμίδιο pMIR-REPORT (Ambion) για να δημιουργηθεί pMIR- PIK3R2-REPORT WT πλασμίδιο. Χρησιμοποιώντας pMIR- PIK3R2-REPORT πλασμίδιο WT ως μήτρα, pMIR- PIK3R2-REPORT ΜΤ πλασμίδιο, το οποίο μετέφερε το μεταλλαγμένο

PIK3R2

3′-UTR αλληλουχία στο συμπληρωματικό χώρο για την περιοχή του σπόρου microRNA-126, ήταν παράγεται από ένα ΚΩΔ -PLUS-Mutagenesis Kit (Toyobo, Japan) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: προς τα εμπρός, 5′-TGCCATGCTTGTTATTGATATGATATAAAACATC -3 ‘, αντίστροφη, 5′-ACAAAACCTGCCTCCCAGCTCGTGGGGC -3’. Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση.

Luciferase Reporter Assay Gene

Α549 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και συνεπιμολύνονται με pMIR- PIK3R2-REPORT πλασμίδιο WT (ή pMIR- PIK3R2-REPORT ΜΤ πλασμίδιο) και ΡΕ-Mir126 φορέα (GeneSil Biotechnology Co, Ltd, Κίνα) χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000. Firefly και Renilla δραστηριότητες λουσιφεράσης μετρήθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με χρήση του κιτ διπλής Luciferase Reporter Assay (Promega, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις διπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Western Blot

Τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA. Η συνολική πρωτεΐνη (20 μg) έτρεξαν σε 12% SDS-PAGE και εν συνεχεία μεταφέρθηκαν πάνω διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF). Η μεμβράνη αποκλείστηκε σε ρυθμισμένο με tris αλατούχο Tween-20 (ΤΒδ-Τ) με 3% BSA για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια επωάστηκαν με τα πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C και ακολουθεί επώαση με τα συζευγμένα με HRP δεύτερα αντισώματα για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ανοσοαντιδραστικές ζώνες ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας SuperSingal δυτικά pico υπόστρωμα χημειοφωταύγειας και εκτέθηκαν σε ακτίνες Χ φιλμ.

Η ανοσοκυτταροχημεία

Η ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε σε τομές 5-mm από ιστούς παραφίνης NSCLC να προσδιοριστεί η έκφραση φωσφορυλίωσης PIK3R2 και Akt. Εν συντομία, για το μπλοκάρισμα της ενδογενούς υπεροξειδάσης, τα πλακίδια επωάστηκαν για 10 λεπτά με 3% Η

2O

2, πλύθηκαν με PBS για 5 λεπτά, και στη συνέχεια για 30 λεπτά με 3% ορό κατσίκας σε PBS. Οι πλάκες επωάστηκαν σε PIK3R2 και φωσφο-Ακί (Ser473) αντίσωμα (1:250, τεχνολογία σήμα κυψέλης) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα επόμενα στάδια πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση συστημάτων EnVision ™ (ϋΑΚΟ). Οι εντάσεις χρώσης σκόραρε και εκπροσωπήθηκαν ως εξής: Σκορ 0: εντελώς αρνητικά δείγματα? Σκορ 1: δείγματα με μέχρι 10% των θετικών κυττάρων? Σκορ 2: δείγματα με 11-50% των θετικών κυττάρων? Σκορ 3:. Δείγματα με 50% των θετικών κυττάρων

Nude Mouse Μοντέλο Ξενομοσχεύματος

Θηλυκά BALB /c ηυ /ηυ ποντικοί (ηλικίας 4-5 εβδομάδων) αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο των πειραματόζωων Sichuan Provincial Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών (Τσενγκντού, Κίνα). Τα κύτταρα Α549 (1 × 10

6) αιωρήθηκαν σε 100 μΙ PBS και ενέθηκαν υποδορίως στην δεξιά περιοχή πλευρό γυμνών ποντικών. Μετά από 10 ημέρες, οι όγκοι έφθασαν 5-10 mm σε διάμετρο και τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες (5 ποντικοί ανά ομάδα), τα ζώα έλαβαν εντός του όγκου εγχύσεις φορέα ΡΕ-Mir126, τον φορέα ΡΕ-CMV ή PBS, αντίστοιχα, για τέσσερις φορές κατά τις ημέρες 1, 3, 5 και 7, με τη συνολική δόση 3 χ 10 μονάδες

10 plaqueforming (pfu) ανά όγκο. Οι διαστάσεις του όγκου μετρήθηκαν 2 φορές κάθε 5 ημέρες από ένα γραμμικό δαγκάνας. Ο όγκος του όγκου (mm

3) υπολογίστηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: μήκος Χ πλάτος

2/2. Όλα τα ποντίκια θυσιάστηκαν ανώδυνα την τριακοστή ημέρα μετά τη θεραπεία, και οι εκτομή όγκων ζυγίστηκαν.

Γονοτυπικές

rs2297882 παραλλαγή ήταν ο γονότυπος με ανάλυση της αλληλουχίας. MicroRNA-126 συμπεριλαμβανομένων των προ-miRNAs ενισχύθηκαν με PCR, οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχυθεί το προϊόν: προς τα εμπρός, 5′-ATTGCCGTGTGGCTGTTAG-3 ‘? αντιστραφεί, 5’-CATTGCACTGTCCACTCCTG -3 ‘. Τα προϊόντα της PCR υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας και στις δύο κατευθύνσεις σε ABI3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Οι εκκινητές για PCR χρησιμοποιήθηκαν επίσης ως εκκινητές προσδιορισμού αλληλουχίας.

στατιστικά Ανάλυση

Το επίπεδο των microRNA-126 σε διάφορες ομάδες αξιολογήθηκε με δοκιμή Τ. Οι συσχετίσεις μεταξύ NSCLC κινδύνου και γονότυπους SNP υπολογίστηκαν από αναλύσεις πολυπαραγοντική λογιστική παλινδρόμηση. Η επιβίωση υπολογίζεται από την ημερομηνία της αρχικής διάγνωσης από την ημερομηνία είτε το θάνατο ή την τελευταία παρακολούθηση. Επιβιώσεις αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier, και οι διαφορές στην κατανομή αξιολογήθηκαν με τη βοήθεια του τεστ log-rank.