Αφηρημένο

Παρά το γεγονός ότι ένα αυξημένο επίπεδο έκφρασης των ΧΙΑΡ συνδέεται με τον καρκίνο των κυττάρων μετάσταση , οι υποκείμενες μοριακοί μηχανισμοί παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητες. Για να επαληθεύσετε τη συγκεκριμένη δομική βάση της ΧΙΑΡ για τη ρύθμιση της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων, εισαγάγαμε διαφορετικούς τομείς ΧΙΑΡ σε ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα HCT116, και διαπίστωσε ότι reconstitutive έκφραση της πλήρους μήκους HA-ΧΙΑΡ και ΗΑ-ΧΙΑΡ ΔBIR, τόσο της τα οποία έχουν άθικτα περιοχή RING, αποκαταστάθηκε η έκφραση β-ακτίνης, ο πολυμερισμός της ακτίνης και του καρκίνου κυτταρική κινητικότητα. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η εισαγωγή του ΗΑ-ΧΙΑΡ ΔRING ή μεταλλαγμένο H467A, η οποία κατάργησε τη λειτουργία του λιγάση Ε3, δεν έδειξε εμφανή αποκατάσταση, αποδεικνύοντας ότι Ε3 δραστηριότητα λιγάσης του τομέα ΧΙΑΡ RING έπαιξε κρίσιμο ρόλο των ΧΙΑΡ στη ρύθμιση των καρκινικών κυττάρων κινητικότητα. Επιπλέον, ο τομέας RING αντί περιοχή BIR ήταν απαραίτητη για την αλληλεπίδραση με RhoGDI ανεξάρτητη σχετικά με τη δραστηριότητα της λιγάση Ε3. Για να συνοψίσω, το παρόν μελέτες μας διαπίστωσε ότι ο ρόλος των ΧΙΑΡ στη ρύθμιση της κυτταρικής κινητικότητας ήταν αποσυνδεδεμένο από κασπάσης-ανασταλτικές ιδιότητες, αλλά σχετίζονται με τη φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ RhoGDI και τον τομέα RING του. Αν και Ε3 δραστηριότητα λιγάσης του τομέα RING συνέβαλαν στην κυτταρική μετανάστευση, δεν συμμετείχε στην RhoGDI δεσμευτική ούτε ubiquitinational τροποποίηση του

Παράθεση:. Liu J, Zhang D, Luo W, Yu J, Li J, Yu Υ, et al. (2012) Ε3 λιγκάσης Δραστηριότητα του ΧΙΑΡ RING Τομέα απαιτείται για ΧΙΑΡ διαμεσολαβείται από τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, αλλά όχι για RhoGDI Δραστηριότητα σύνδεσης αυτού. PLoS ONE 7 (4): e35682. doi: 10.1371 /journal.pone.0035682

Επεξεργαστής: Ο Carl G. Μάκη, του Πανεπιστημίου Rush Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 Δεκεμβρίου 2011? Αποδεκτές: 20 Μάρτη 2012? Δημοσιεύθηκε: 19 Απρίλη 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήταν που παρέχονται από Ηνωμένες Πολιτείες Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας /NCI CA112557 και CA119028-05S110, ΝΙΗ /NIEHS ES012451 και ES010344. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο αναστολέας φυλοσύνδετη πρωτεΐνης απόπτωσης (ΧΙΑΡ) είναι ένα μέλος των αναστολέων της οικογένειας πρωτεϊνών απόπτωσης (ΙΑΡ) [1]. ΧΙΑΡ αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά από ισχυρές ιδιότητες στην ρύθμιση κυτταρικής απόπτωσης [2], [3]. Αργότερα έρευνες διαπιστώθηκε ότι ΧΙΑΡ μπορούν να ρυθμίζουν άλλες κυτταρικές οδούς αποσυνδεθεί από κασπάσης-ανασταλτική δράση του [4], [5], majorly εμπνευσμένη από τα ευρήματα από ΧΙΑΡ-ανεπαρκή ποντίκια που εμφανίζεται καμία εμφανή αποπτωτικό φαινότυπο [6]. Πρόσφατα, μια μεγάλη ποικιλία από στοιχεία αποδεικνύουν ότι οι συμμετοχές των ΧΙΑΡ στο μεταβολισμό χαλκού [7], κυτταρική κινητικότητα [8], [9] και ενεργοποίηση των οδών JNK και ΝΡκΒ [10], [11] δεν είχαν σχέση με την ανασταλτική δράση της επί κασπασών.

Οι πολλαπλές λειτουργίες της ρίζας ΧΙΑΡ από δομική βάση της. ΧΙΑΡ αποτελείται από τρία βακουλοϊού ΙΑΡ επανάληψης (BIR) περιοχές στο αμινο-άκρο και έναν τομέα RING καρβοξυτελικές [12]. Κάθε τομέας BIR αποτελείται από περίπου 70 αμινοξέα που συντονίζουν ένα ιόν ψευδαργύρου μέσω ιστιδίνης και υπολειμμάτων κυστεΐνης [13]. ισχυρός αντι-αποπτωτικό ιδιότητές του εξαρτώνται κυρίως από τις λειτουργίες ενός αυλακιού στον τομέα BIR3 και δύο επιφανειών του τομέα BIR2 τα οποία έχουν αναφερθεί να δεσμεύονται και να αναστέλλουν τη κασπάση-9 και κασπάσης-3/7 αντίστοιχα [14]. περιοχή RING ορίζεται από την παρουσία επτά κυστεϊνών και ένα ιστιδίνη που σχηματίζουν σταυρό αρχιτεκτονική στήριγμα και να συντονίσει δύο ιόντα ψευδαργύρου [15]. πεδία RING συχνά λειτουργούν ως διαμορφώνει τα οποία προσδίδουν λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης (Ε3) δραστηριότητα [13]. Μεταλλάσσοντας το κλειδί κατάλοιπο ιστιδίνης στο αμινοξύ 467 προς αλανίνη του ανθρωπίνου ΧΙΑΡ, Lewis et al βρήκαν ότι Ε3 ουμπικουιτίνης λιγάση λειτουργία του δακτυλίου που απαιτείται για την ενεργοποίηση του ΝΡκΒ, ενώ όχι για Smad-εξαρτώμενης μεταγραφής [16], υποδεικνύοντας ότι δομή- με βάση τις λειτουργίες του ΧΙΑΡ είναι επίσης κυψελοειδές πλαίσιο εξαρτώμενη.

η αυξημένη έκφραση του ΧΙΑΡ βρίσκεται σε πολλούς ιστούς του καρκίνου και συνδέονται με χημειοαντίσταση, την εξέλιξη της νόσου και κακή πρόγνωση [9], [17], [18], [19 ], [20], [21], [22]. Τα πρόσφατα ευρήματα από το εργαστήριο μας και τους άλλους », έδειξε ότι ΧΙΑΡ θα μπορούσε να ρυθμίσει τη μετάσταση όγκου [8], [23], [24]. μετάσταση όγκου είναι μια σημαντική αιτία θανάτου για τους περισσότερους ασθενείς με καρκίνο [25]. Πολλά μόρια που εμπλέκονται στην μεταστατική καταρράκτη ελέγχεται από τα μέλη της Ras-υπεροικογένειας των μικρών πρωτεϊνών που προσδένουν GTP, τα οποία είναι ικανά να δεσμεύουν το ΑΕΠ /GTP και την υδρόλυση του GTP που οδηγούν στην ενεργοποίηση των κατάντη πρωτεϊνών τελεστών [26]. Ανθρώπινη Rho-ΟΤΡάσης υποοικογένεια περιλαμβάνει 23 μόρια σηματοδότησης, μεταξύ των οποίων RhoA, RhoB, Rac1 και Cdc42 έχουν πιο εκτεταμένα διερευνηθεί και να αναφερθεί για τον έλεγχο διαφόρων πτυχών της κυτταρικής κινητικότητας και εισβολή, δηλαδή, κυτταρική πολικότητα, ctyoskeletal οργάνωση, και την μεταγωγή σήματος [27], [28].

Rho-ΘΤΡάσης δραστηριότητα ελέγχεται αυστηρά από τέσσερα βασικά συστατικά που εμπλέκονται στην /κύκλο ΘΤΡάσης GTP-δεσμεύεται ΑΕΠ, συμπεριλαμβανομένων των ΟΤΡάσης-ενεργοποίηση πρωτεϊνών (διάκενα), αναστολείς ΑΕΠ-διάστασης (GDIs), GDI διάστασης παράγοντες (GDFs), και παράγοντες ανταλλαγής νουκλεοτιδίου γουανίνης (GEFs) [29]. RhoGDI διαδραματίζει βασικό ρόλο στην εξισορρόπηση ολόκληρο τον κύκλο ΘΤΡάσης με την πρόληψη διαστάσεως του ΑΕΠ και τη διατήρηση της σύνδεσης GTP μέσω της αλληλεπίδρασης με την ομάδα πρενυλίωση ΟΤΡάσης. Έτσι, απομονώνει ΟΤΡάσης στο κυτταρόπλασμα ενώ εντοπισμού στην εσωτερική μεμβράνη του πλάσματος είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση ΟΤΡάσης. Τα ανασταλτικά αποτελέσματα της RhoGDI στην δραστικότητα ΟΤΡάσης υποστηρίζεται από διάφορες αποδείξεις [30], [31], [32]. Για παράδειγμα, Leffers

et al

. έχουν βρει ότι η υπερέκφραση του RhoGDI σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα που προκαλείται διαταραχή της κυτταροσκελετού της ακτίνης και την αναστολή της κινητικότητας [32]. Ως εκ τούτου, RhoGDI θεωρείται ως ένα ελκυστικό υποψήφιο για τη ρύθμιση της δραστηριότητας των Rho ΟΤΡάσης στη θεραπεία του καρκίνου [26].

πρόσφατες μελέτες μας έχουν αποδείξει ότι ΧΙΑΡ μεσολάβηση motilities καρκινικών κυττάρων μέσω RhoGDI-εξαρτώμενο τρόπο στη ρύθμιση του κυτταρικού σκελετού [ ,,,0],23]. Στην παρούσα μελέτη, θα διευκρινιστεί περαιτέρω των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης ΧΙΑΡ-RhoGDI και εφόσον η δομική βάση της ΧΙΑΡ για τη συμβολή στη διαμεσολάβηση των καρκινικών κυττάρων κινητικότητας.

Αποτελέσματα

τομέα δαχτυλίδι ήταν που απαιτείται για ΧΙΑΡ μεσολάβηση β-ακτίνης έκφραση

έκφραση ΧΙΑΡ είναι αυξημένη σε πολλές καρκινικές κυτταρικές σειρές και συνδέεται στενά με την εξέλιξη και την επιθετικότητα του καρκίνου του κακοήθους [33], [34]. πρόσφατη εργασία μας έδειξε ότι ΧΙΑΡ θα μπορούσε να ρυθμίσει β-ακτίνης έκφρασης [23]. Ως αποτέλεσμα, η εξάντληση του ΧΙΑΡ έκφραση εξασθενημένο ρυθμό μετανάστευσης των κυττάρων και επεμβατική ικανότητα, όπως φαίνεται στο επούλωσης πληγών δοκιμασία προσδιορισμού και trans-καλά, αντίστοιχα (Σχ. 1Α-1Ε). Να σημειωθεί, υπήρχε μόνο οριακή διαφορά στο ρυθμό πολλαπλασιασμού μεταξύ WT και ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα όταν καλλιεργούνται σε μέσο κανονική καλλιέργεια κυττάρων (10% FBS) για έως και 5 ημέρες, η οποία περιελάμβανε το χρονικό εύρος για την δοκιμασία επούλωσης πληγών ( Εικ. 1F), υποδεικνύοντας ότι ο μειωμένος συντελεστής μετανάστευση των κυττάρων παρατηρήθηκε σε ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα δεν οφειλόταν σε πολλαπλασιασμό ελαττωματικών κυττάρων. Επιπλέον, η δυναμική διέγερση του πολυμερισμού της ακτίνης, δηλαδή σχηματισμός F-ακτίνη, με EGF επίσης δραματικά μειωμένη σε ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα ανιχνεύεται με φασματοφωτόμετρο (Εικ. 1 G). Με συνέπεια, μια σαφής αλλαγή της μορφολογίας των κυττάρων σκελετό και πιο περιφερειακές βολάν /βολάν μεμβράνης παρατηρήθηκαν σε EGF-επεξεργασμένα κύτταρα HCT116 WT αλλά όχι σε ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα (Σχήματα 1 & amp?. 1Ι). Τα φαινόμενα αυτά ήταν αναπαραγώγιμα με χτυπήσει κάτω ΧΙΑΡ σε κύτταρα HCT116 (Εικ. 2). Ως εκ τούτου, ανέφερε ότι ΧΙΑΡ έπαιξε καθοριστικό ρόλο στη διαμεσολάβηση της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων και την εισβολή.

(Α), νοκ-άουτ του ΧΙΑΡ στα κύτταρα HCT116 επιβεβαιώθηκε με Western ανάλυση Western. (Β και Γ), η συμπεριφορά της μετανάστευσης των κυττάρων εκτιμήθηκε κατά την εκτέλεση ενός προσδιορισμού επούλωση της πληγής, και οι εικόνες λήφθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία. μπαρ κλίμακα ήταν 300 μm. Η περιοχή του τραύματος ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης Κυττάρων Η μετανάστευση, και τα ποσοτικά δεδομένα έδειξαν όπως υποδεικνύεται (bar σφάλματος αντιπροσωπεύουν Τ.Α, η = 3). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει μία σημαντική διαφορά στο ποσοστό των πληγών περιοχή μεταξύ της ενδεικνυόμενης κυτταρικές σειρές (

σ

& lt? 0,05). (Δ και Ε), Εισβολή της WT (Vector), ΧΙΑΡ

– /- (Vector), και ΧΙΑΡ

– /- (ΗΑ-ΧΙΑΡ) κύτταρα HCT116 προσδιορίστηκε, ποσοτικά και εκφράζεται ως ποσοστό της εισβολής. Τα αποτελέσματα που αντιπροσωπεύεται από τη μέση τιμή ± S.D. των δεδομένων από τρία ανεξάρτητα πειράματα με φρεάτια εις διπλούν για κάθε πείραμα. Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει μια σημαντική μείωση στο ποσοστό εισβολή σε σύγκριση με εκείνη των WT (vector) και ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα (ΗΑ-ΧΙΑΡ) (

σ

& lt? 0,01). (F), τα ποσοστά πολλαπλασιάζονται από τα υποδεικνυόμενα κυτταρικές σειρές αξιολογήθηκαν από μια CellTiter-Glo® φθορισμού κυττάρων Βιωσιμότητα κιτ δοκιμασίας. Τα αποτελέσματα που αντιπροσωπεύεται από τη μέση τιμή ± S.D. των εις τριπλούν φρεατίων. (G-I), Τα αναφερόμενα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς EGF και επαγωγή F-ακτίνης αναλύθηκε με φασματοφωτόμετρο (G), ή παρατηρείται υπό μικροσκόπιο συνεστιακό (H), αντίστοιχα. Ο φθορισμός των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με το λογισμικό του ImageJ (Ι). Η ποσοτικά δεδομένα δείχθηκε όπως υποδεικνύεται (bar σφάλματος αντιπροσωπεύουν Τ.Α, η = 3). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει μια σημαντική μείωση σε σύγκριση με εκείνη στα κύτταρα WT (

σ

& lt? 0,01).

Η

(Α), Νοκ ντάουν των ΧΙΑΡ στα κύτταρα HCT116 ελέγχθηκαν από Κηλίδωση Western δοκιμασίας. (Β και Γ), η συμπεριφορά της μετανάστευσης των κυττάρων εκτιμήθηκε κατά την εκτέλεση ενός προσδιορισμού επούλωση της πληγής, και οι εικόνες λήφθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία. μπαρ κλίμακα ήταν 300 μm. Η περιοχή του τραύματος ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης Κυττάρων Η μετανάστευση, και τα ποσοτικά δεδομένα έδειξαν όπως υποδεικνύεται (bar σφάλματος αντιπροσωπεύουν Τ.Α, η = 3). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει μία σημαντική διαφορά στο ποσοστό των πληγών περιοχή μεταξύ της ενδεικνυόμενης κυτταρικές σειρές (

σ

& lt? 0,05)

Η

ΧΙΑΡ πρωτεΐνη περιέχει τέσσερις λειτουργικές περιοχές, μεταξύ των οποίων τρεις Birs. και μια περιοχή RING (Σχ. 3Α). Το αντι-αποπτωτική λειτουργία του ΧΙΑΡ Birs αναφέρθηκε ότι οφείλεται σε δεσμευτικές και απομείωση ενεργοποίηση της κασπάσης [1] τους. Ο τομέας RING του ΧΙΑΡ ανήκει στην Ε3 λιγάση και μεσολαβεί πρωτεΐνης ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση [1]. Για να επαληθεύσετε τη συγκεκριμένη δομική βάση της ΧΙΑΡ για τη ρύθμιση της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων, επιμολύναμε διαφορετικές ΗΑ-tagged ΧΙΑΡ cDNA κατασκευάζει, συμπεριλαμβανομένης της πλήρους μήκους (ΗΑ-ΧΙΑΡ), RING domain-διαγραφή (ΗΑ-XIAPΔRING), συνολικής BIR διαγραφή (ΗΑ -XIAPΔBIR), και ένα H467A σημειακή μετάλλαξη, η οποία οδηγεί σε απώλεια της Ε3 ουμπικουιτίνης δραστηριότητα λιγάσης, σε ΧΙΑΡ

– /-. κύτταρα αντίστοιχα, και οι σταθεροί μορφομετατροπείς ταυτοποιήθηκαν (Εικόνα 3Β). Re-συνταγματική έκφραση του ΗΑ-ΧΙΑΡ ή ΗΑ-ΧΙΑΡ ΔBIR που περιέχει περιοχή RING σε ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα μια αύξηση στην έκφραση β-ακτίνης σε σύγκριση με εκείνη σε ΧΙΑΡ

– /- (Vector) κύτταρα, ενώ η έκφραση του ΗΑ-ΧΙΑΡ ΔRING που περιέχει BIR τομείς, ή ΗΑ-ΧΙΑΡ H467A που καθιστά κατάργηση της δραστηριότητας λιγάση Ε3, δεν παρέχουν συγκρίσιμα αποκατάστασης (Εικ. 3C). Ως εκ τούτου, αποδεικνύεται ότι ΧΙΑΡ RING τομέα και δραστηριότητα του λιγάση Ε3 έπαιξε ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης της β-ακτίνης.

(Α), Σχηματική αναπαράσταση της πρωτεΐνης ΧΙΑΡ και προσδιόρισε τη λειτουργία του κάθε τομέα. (Β και Γ), Προσδιορισμός των σταθερών επιμολύνσεων υπόθαλψη ΧΙΑΡ και διάφορα πλασμίδια διαγραφή της στην ΧΙΑΡ

– κύτταρα HCT116 – /. Οι αριθμοί κάτω από τις ζώνες έδειξε την πυκνομετρική ανάλυση των σχετικών αναλογιών των β-ακτίνης επίπεδα με τους μάρτυρες φόρτωσης (GAPDH) αξιολογήθηκαν με το λογισμικό του ImageQuant Έκδοση 5.2 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Τα αποτελέσματα ήταν αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Ε3 δραστηριότητα λιγάσης του τομέα ΧΙΑΡ RING συμμετείχε στη μεσολάβηση της κυτταρικής μετανάστευσης και του πολυμερισμού της ακτίνης

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η βιολογική σημασία της β β-ακτίνης αλλαγή έκφραση ρυθμίζεται κατά τομέα ΧΙΑΡ RING, επούλωση δοκιμασία επούλωσης εκτελέστηκε για σύγκριση των ποσοστών μετανάστευσης μεταξύ των διαφόρων επιμολυντών που μεταφέρουν διάφορα πεδία των ΧΙΑΡ, όπως προσδιορίζονται στο Σχ. 3Β. Σύμφωνα με ελαττώματα σε β-ακτίνη έκφρασης, εισαγωγή του ούτε HA-ΧΙΑΡ ΔRING ούτε HA-ΧΙΑΡ H467A θα μπορούσε να αντιστραφεί η βλάβη στο κελί μετανάστευση των ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα, ενώ η έκφραση της πλήρους μήκους ΗΑ-ΧΙΑΡ ή ΗΑ- XIAPΔBIR, δύο εκ των οποίων κατέχουν ανέπαφη περιοχή RING, αποκατέστησε την μείωση της ικανότητας μετανάστευσης των κυττάρων που προκαλείται από την εξάντληση ΧΙΑΡ (Σχ. 4Α). Ενώ λόγω της σχετικής χαμηλή έκφραση του ΗΑ-XIAPΔBIR σε σύγκριση με εκείνη του ΗΑ-ΧΙΑΡ στις επιμέρους προϊόντα μετεμβολιασμού (Εικ. 3Β), το ποσοστό επούλωσης πληγών που παρατηρείται σε ΗΑ-XIAPΔBIR εκφράζουν επιμολύνσεις ήταν βραδύτερη από ότι σε ΗΑ-XIAP- που εκφράζουν κύτταρα (Σχ. 4Α). Το ποσοστό της περιοχής του τραύματος αριστερά un-κλειστή στις 4

ης ημέρας σε σύγκριση με εκείνη σε 0 ημέρα ήταν ποσοτικά με τη χρήση κυττάρων Μετανάστευση λογισμικό ανάλυσης, η οποία έδειξε ότι οι περιοχές της πληγής σε ΧΙΑΡ

– /- (vector), ΗΑ- ΧΙΑΡ ΔRING και ΗΑ-ΧΙΑΡ H467A επιμολύνσεις ήταν σημαντικά υψηλότερα από ότι στην WT κύτταρα HCT116 (Εικ. 4Β). Ως εκ τούτου, προτείνεται ότι Ε3 δραστηριότητα λιγάσης του τομέα RING έπαιξε σημαντικό ρόλο στην ΧΙΑΡ μεσολάβηση κυτταρική κινητικότητα.

(Α), η συμπεριφορά της μετανάστευσης των κυττάρων εκτιμήθηκε με μία δοκιμασία επούλωση της πληγής, και οι εικόνες λήφθηκαν σε διαφορετικές χρονικά σημεία. μπαρ κλίμακα ήταν 300 μm. (Β), Η περιοχή του τραύματος άφησε un-κλειστή στις 4

ης ημέρας ποσοτικά με τη χρήση λογισμικού ανάλυσης κυττάρων μετανάστευση, και η ποσοτική δεδομένα παρουσιάζονται ως υποδεικνύεται (bar σφάλματος αντιπροσωπεύουν Τ.Α, n = 2). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει μία σημαντική διαφορά στο ποσοστό της περιοχής του τραύματος σε σύγκριση με εκείνη στα κύτταρα WT (Vector) (

σ

& lt? 0,05).

Η

Η ακτίνη νημάτων διαδραματίσει κεντρικό ρόλο σε πολυάριθμες κυτταρικές λειτουργίες, όπως η μετανάστευση των κυττάρων και μορφολογικές ρύθμιση [35]. Για να προσδιοριστεί πιθανή εμπλοκή των διαφόρων τομέων του ΧΙΑΡ στη ρύθμιση του πολυμερισμού της ακτίνης, υποβάλλαμε σε αγωγή κυττάρων με EGF, και στη συνέχεια εκχυλίζεται κύτταρα για τον προσδιορισμό των επιπέδων F-ακτίνης με κυτταρομετρία ροής, χρησιμοποιώντας τα σταθερά προϊόντα επιμόλυνσης που αναφέρθηκαν παραπάνω. Και πάλι, F-ακτίνη σχηματισμούς που επάγεται από αγωγή με EGF ήταν προφανώς ελήφθησαν σε κύτταρα HCT116 WT, ΧΙΑΡ

– /- (ΗΑ-ΧΙΑΡ) και ΧΙΑΡ

– /- (ΗΑ-ΧΙΑΡ ΔBIR) μεταγωγικά, ενώ δεν υπήρχε παρατηρήσιμα επαγωγή F-ακτίνης σε ΧΙΑΡ

– /- (vector), ΧΙΑΡ

– /- (ΗΑ-ΧΙΑΡ ΔRING) ή ΧΙΑΡ

– /- (ΗΑ-ΧΙΑΡ H467A) επιμολύνσεων (Εικ. 5Α) . Το αποτέλεσμα ποσοτικοποίηση φαίνεται στο Σχ. 5Β. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας απέδειξαν ότι η λειτουργία του τομέα ΧΙΑΡ RING στη ρύθμιση της ακτίνης πολυμερισμού και κυτταρική κινητικότητα επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση της δραστηριότητα λιγάση Ε3.

(Α), Τα αναφερόμενα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς EGF και F- επαγωγή ακτίνη αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. (Β), τα ποσοτικά στοιχεία που φάνηκε όπως υποδεικνύεται (bar σφάλματος αντιπροσωπεύουν Τ.Α, n = 2). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει μια σημαντική διαφορά στην επαγωγή F-ακτίνης σε σύγκριση με εκείνη στα κύτταρα WT (Vector) (

σ

& lt? 0,05).

Η

ΧΙΑΡ ΔΑΧΤΥΛΙΔΙ τομέα συναλλαγές με RhoGDI, ανεξάρτητα με τη δραστηριότητά του λιγάση Ε3

πρόσφατη εργασία μας έδειξε ότι RhoGDI είχε εμπλακεί σε ακτίνη πολυμερισμού ρυθμίζεται από ΧΙΑΡ [23]. Ως εκ τούτου, ανιχνεύσαμε τη φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των δύο μορίων με συν-ανοσοκαταβύθιση χρησιμοποιώντας ειδικό αντίσωμα αντι-ΧΙΑΡ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι RhoGDI ανιχνεύθηκε στο συν-ανοσοκαταβυθίστηκε συγκρότημα στο ΧΙΑΡ

+ /+, αλλά όχι ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα HCT116 (Εικ. 6Α), προτείνοντας ότι RhoGDI μπορεί να αλληλεπιδρά με ενδογενή ΧΙΑΡ. Η αλληλεπίδραση μεταξύ ΧΙΑΡ και RhoGDI περαιτέρω επαληθεύεται αμοιβαίως με ανίχνευση ΧΙΑΡ σε πολύπλοκες συνανοσοκαθίζησης τράβηξε κάτω από αντι-ΟΡΡ αντίσωμα χρησιμοποιώντας μορφομετατροπείς του ΧΙΑΡ

– /- (ΗΑ-ΧΙΑΡ /GFP-RhoGDI), ενώ υπήρχε αριθ ανιχνεύσιμο επίπεδο ΧΙΑΡ σε πολύπλοκες Co-IP σε επιμολυντές του ΧΙΑΡ

– /- (ΗΑ-ΧΙΑΡ /GFP-vector) (σχήμα 6Β).. Στη συνέχεια, γκρέμισε RhoGDI στο WT και ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα για να επιβεβαιώσουν την συμμετοχή των RhoGDI στην κυτταρική κινητικότητα. Επούλωση των πληγών αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι η εξουδετέρωση της RhoGDI σε WT κύτταρα δεν προκαλούν εμφανή αλλαγή στην πληγή ποσοστό κλεισίματος, ωστόσο, μια εξαιρετικά αυξημένη μετανάστευση των κυττάρων παρατηρήθηκε σε ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα (shRNA-RhoGDI) σε σύγκριση με εκείνη του μη φίμωση του ελέγχου, ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα (μη-αποσιώπησης) (Εικ. 6C). Με συνέπεια, νοκ ντάουν της έκφρασης RhoGDI επίσης αυξήθηκε F-ακτίνης περιεχόμενο ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα (Si-RhoGDI) εκτίθενται σε EGF (Σχήμα 6D, σ & lt? 0.05.). Οι αλληλουχίες του γονιδίου RhoGDI (401-419), που ήταν συμπληρωματικό προς siRNA ολιγονουκλεοτιδίου σε ρΕΟΡΡ-C3 /RhoGDI-re κατασκεύασμα, μεταλλάχθηκαν για την πρόληψη της καταστροφής των εξωγενών mRNA με siRNA RhoGDI [36]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Ε, η υπερέκφραση του ρΕΟΡΡ-C3 /RhoGDI-re εντοπίστηκε σε ΧΙΑΡ

– /- (Si-RhoGDI + RhoGDI-re). Αυτό reconstitutive έκφραση RhoGDI σε ΧΙΑΡ

– /- (Si-RhoGDI + RhoGDI-re) δραματικά εξασθενημένη πολυμερισμό της ακτίνης που προκαλείται από αγωγή με EGF σε σύγκριση με εκείνη του ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα (Si-RhoGDI) (2 % έναντι 14%, ρ & lt? 0,01, Σχήμα 6F).. Επιπλέον, reconstitutive έκφραση RhoGDI σε ΧΙΑΡ

– /- (Si-RhoGDI + RhoGDI-RE) κύτταρα που αποκαθίστανται ανασταλτικό ρόλο των RhoGDI στο σχηματισμό νηματοειδή ακτίνη (Σχήμα 6G.), Γεγονός που υποδηλώνει ότι η επαναφορά των RhoGDI-re ενεργοποιήσετε την αποζημίωση για την απώλεια της ενδογενούς λειτουργίας RhoGDI για τον πολυμερισμό της ακτίνης στην ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας προσκόμισε αποδείξεις ότι RhoGDI μπορεί να εμπλέκεται στην ΧΙΑΡ RING τομέα με τη μεσολάβηση ρύθμιση του πολυμερισμού της ακτίνης και της μετανάστευσης των κυττάρων

(Α), λύματα από WT και ΧΙΑΡ

-. /- κύτταρα HCT116 ήταν Co-άνοσο με αντι-ΧΙΑΡ αντισώματος (ποντικού) ή κανονικό IgG ποντικού, και ανοσοϊζήματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με (κουνέλι) αντισωμάτων-ΧΙΑΡ αντι αντι-RhoGDI (κουνέλι) ή. Πέντε τοις εκατό των προϊόντων λύσης χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδος. (Β), ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα (ΗΑ-ΧΙΑΡ) διαμολύνθηκαν παροδικά με την GFP-RhoGDI ή κενό φορέα, gFTP-φορέα. Συν-ανοσοκατακρήμνιση εκτελέστηκε με σφαιρίδια αγαρόζης αντι-ΟΡΡ αντίσωμα συζευγμένο με. Τα ανοσοϊζήματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανοσοστύπωση χρησιμοποιώντας αντισώματα όπως υποδεικνύεται. (ΝΤΟ). Σταθερά επιμολυσμένα της shRNA-RhoGDI στο WT και ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα εντοπίστηκαν. Η κυτταρική μετανάστευση προσδιορίστηκε με δοκιμασίες επούλωσης πληγών στους υποδεικνυόμενους χρόνους μεταξύ μη σίγηση και μορφομετατροπείς shRNA-RhoGDI σε WT και ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα, αντίστοιχα. Η περιοχή του τραύματος ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης Κυττάρων Η μετανάστευση και ο ποσοτικά δεδομένα φάνηκε όπως υποδεικνύεται (bar σφάλματος αντιπροσωπεύουν Τ.Α, η = 3). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει μία σημαντική διαφορά μεταξύ της ένδειξης κυτταρικές γραμμές (

ρ

& lt? 0,05). μπαρ κλίμακα ήταν 300 μm. (D), Τα αναφερόμενα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EGF για 1 λεπτό για τον προσδιορισμό της Ρ-ακτίνης επαγωγή με κυτταρομετρία ροής. (Ε), Συστατική έκφραση της GFP-RhoGDI-Re στο ΧΙΑΡ

– /- (Si-RhoGDI) πιστοποιήθηκε με κηλίδωση Western. (F και G), σε σχέση επαγωγή F-ακτίνης με την παρουσία EGF προσδιορίστηκε με φασματοφωτόμετρο (F), και παρατηρήθηκαν τα επίπεδα των νηματοειδών Actin υπό συνεστιακή μικροσκοπία (G) στις υποδεικνυόμενες μορφομετατροπείς. Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει μια σημαντική αύξηση σε σύγκριση με εκείνες στις ΧΙΑΡ

– /- (Si-Control) (

ρ

& lt? 0,05), και το (♣) δείχνει σημαντική μείωση σε σύγκριση σε εκείνους που ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα (Si-RhoGDI) (

σ

& lt? 0.001, n = 3)

Η

για τον προσδιορισμό συγκεκριμένων τομέων ΧΙΑΡ εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση. με RhoGDI πρωτεΐνη, που συν-επιμολυσμένα GFP-RhoGDI κατασκευή με HA-ΧΙΑΡ, ΗΑ-ΧΙΑΡ H467A, ΗΑ-ΧΙΑΡ ΔRING και ΗΑ-ΧΙΑΡ ΔBIR αντίστοιχα, σε ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Α, ΗΑ-tag ανιχνεύθηκε στο συν-ανοσοσύμπλοκο τραβιέται κάτω από αντι-ΟΡΡ αντίσωμα σε επιμολυντές φιλοξενούν ΗΑ-ΧΙΑΡ και ΗΑ-ΧΙΑΡ ΔBIR. Επιπλέον, παρόμοια συγγένεια προς GFP-RhoGDI παρατηρήθηκε σε επιμολυντές ΗΑ-ΧΙΑΡ H467A, μία μετάλλαξη με απώλεια της δραστικότητας λιγάσης Ε3 στον τομέα RING. Ενώ παρατηρήθηκε μόνο μια περιθωριακή ζώνη του ΗΑ στο ανοσοσύμπλοκο από ΗΑ-ΧΙΑΡ επιμολύνσεις ΔRING, αποκαλύπτοντας ότι ΧΙΑΡ ΔΑΧΤΥΛΙΔΙ περιοχή έπαιξε σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση με RhoGDI ανεξάρτητη σχετικά με τη δραστηριότητα της λιγάση Ε3. Επιπλέον, αν και περιοχή RING του ΧΙΑΡ μπορούσε να συνδεθεί με RhoGDI, η αλληλεπίδρασή τους δεν έχει ως αποτέλεσμα ουβικιτινίωση RhoGDI (Σχ. 7Β και 7C). Σύζευξη ουβικιτίνης να RhoGDI είχε μόλις ανιχνεύθηκε ακόμη και παρουσία του εξωγενούς άγριου τύπου ουμπικουϊτίνης στο ανοσοσύμπλοκο τραβιέται κάτω από GFP που έχει επισημανθεί με ετικέτα να RhoGDI (Εικ. 7Β). Ούτε εκφράζουν μεταλλαγμένες ουβικιτίνης καθιστούν εμφανή μειώσεις ουβικιτινίωση RhoGDI (Εικ. 7Β). Επίσης, δεν υπήρχε παρατηρήσιμη διαφορά σε RhoGDI ουμπικουιτίνωση μεταξύ WT κύτταρα και ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα (Εικ. 7Β). Τα παρόμοια ευρήματα αναπαράχθηκαν σε κύτταρα 293Τ όπως φαίνεται στο Σχ. 7C. Ως εκ τούτου, προτάθηκε ότι αν και η δραστηριότητά Ε3 λιγκάση που απαιτούνται για ΧΙΑΡ μεσολάβηση κυτταρικής μετανάστευσης, δεν ήταν απαραίτητο για τη σύνδεση RhoGDI, ούτε για ubiquitinational τροποποίηση της

(Α), ΧΙΑΡ

-. /- κύτταρα επιμολύνθηκαν με GFP-RhoGDI, μαζί με HA-ΧΙΑΡ, HA-ΧΙΑΡ H467A, ΗΑ-ΧΙΑΡ ΔRING, ή ΗΑ-ΧΙΑΡ ΔBIR. Συν-ανοσοκατακρήμνιση εκτελέστηκε με σφαιρίδια αγαρόζης αντι-ΟΡΡ αντίσωμα συζευγμένο με. Τα ανοσοϊζήματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση για την ανίχνευση του ΧΙΑΡ χρησιμοποιώντας ΗΑ αντίσωμα. (ΣΙ). WT (Vector), ΧΙΑΡ

– /- (Vector) και ΧΙΑΡ

– /- (ΗΑ-ΧΙΑΡ) κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με κατασκευάσματα της GFP-RhoGDI σε συνδυασμό με Ουμπικουϊτίνη-WT, Ουμπικουϊτίνη-K48R, Ουμπικουϊτίνη -K63R ή ουμπικουϊτίνη-K48R /K63R (KKRR). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν και συν-ανοσοκαταβυθίστηκε με αντι-ΟΡΡ αντίσωμα, και στη συνέχεια ανοσοκηλιδώθηκαν με αντι-Ub και αντισώματα αντι-GFP. (C), κύτταρα 293Τ διαμολύνθηκαν με διάφορα κατασκευάσματα, όπως αναφέρεται για την ανίχνευση των RhoGDI ουβικιτινίωση από αντι-Ub και αντισώματα αντι-GFP. (D), ένα μοντέλο για ΧΙΑΡ ρυθμιζόμενη διαμόρφωση της κινητικότητας των κυττάρων: ΧΙΑΡ δεσμεύεται με RhoGDI μέσω περιοχή RING του και αναστέλλει RhoGDI τροποποίησή της με SUMO το οποίο οδηγεί σε μειορύθμιση της λειτουργίας RhoGDI και προάγει τον πολυμερισμό της ακτίνης και την κυτταρική κινητικότητα. Ή Ε3 δραστηριότητα λιγάσης του τομέα ΧΙΑΡ RING θα μπορούσε να ρυθμίσει κάποια un-επαληθεύεται παράγοντες οι οποίοι στη συνέχεια τον έλεγχο της μετανάστευσης των κυττάρων ανεξάρτητα από RhoGDI δεσμευτική.

Η

Συζήτηση

προηγούμενα ευρήματα μας έχουν δείξει ότι είτε νοκ-άουτ ή knockdown του ΧΙΑΡ μειώθηκε μετανάστευση HCT116 κυττάρων και εισβολή [23]. Στην παρούσα μελέτη, υπό τον όρο ότι διαρθρωτική βάση των ΧΙΑΡ για ρυθμιστικές λειτουργίες του στη μετάσταση του καρκίνου. Με την εισαγωγή διαφορετικών τομέων ΧΙΑΡ σε ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα, το έργο μας έδειξε ότι το δαχτυλίδι τομέα αντί του τομέα BIR απαιτήθηκε για την β-ακτίνη έκφρασης, τη μετανάστευση των κυττάρων καθώς και την αλληλεπίδραση RhoGDI. Ε3 δραστηριότητα λιγάσης του τομέα RING συνέβαλαν στα δύο πρώτα αποτελέσματα, αλλά δεν συμμετείχε στην RhoGDI δεσμευτική ούτε ubiquitinational τροποποίηση του, αναφέροντας ότι ο ρόλος των ΧΙΑΡ στη ρύθμιση της κυτταρικής κινητικότητας ήταν αποσυνδέεται από κασπάσης-ανασταλτικές ιδιότητες, αλλά σχετίζονται με τη λειτουργία του δακτυλίου που ήταν εν μέρει οφείλεται σε φυσική αλληλεπίδραση με RhoGDI (Σχ. 7D).

στην επούλωση των πληγών δοκιμασία, βρήκαμε ότι reconstitutive έκφραση της πλήρους μήκους HA-ΧΙΑΡ και ΗΑ-ΧΙΑΡ ΔBIR, δύο εκ των οποίων έχουν περιοχή RING, σε ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα HCT116 αποκατασταθεί κινητικότητα των κυττάρων του καρκίνου, ενώ την εισαγωγή του ΗΑ-ΧΙΑΡ ΔRING ή μεταλλαγμένο H467A, η οποία καταργήθηκε η λειτουργία Ε3 λιγάση του, δεν έδειξε εμφανή αποκατάσταση, αποδεικνύοντας ότι Ε3 δραστηριότητα λιγάσης του τομέα ΧΙΑΡ RING έπαιξε ρόλο στη ρύθμιση ΧΙΑΡ των καρκινικών κυττάρων κινητικότητα. Μεταβολές σε β-ακτίνης επίπεδα προκάλεσε εκφράζοντας διάφορες περιοχές της ΧΙΑΡ ήταν σύμφωνες με τις επιπτώσεις τους στη μετανάστευση των κυττάρων. Ο επικεφαλής ενδοκυτταρικό «κινητήρα» της κυτταρικής μετανάστευσης είναι κυτταροσκελετού της ακτίνης [37]. Προηγούμενες μελέτες πρότειναν ότι EGF προκάλεσε μετανάστευση κυττάρων από την αναδιοργάνωση της ακτίνης του κυτταροσκελετού και μαζική συσσώρευση των F-ακτίνης [38]. Στις μελέτες μας, η δυσλειτουργία του πολυμερισμού ακτίνης σε ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα θα μπορούσαν να διασωθούν από την εκ νέου συνταγματική έκφραση είτε πλήρους μήκους ΗΑ-ΧΙΑΡ ή ΗΑ-ΧΙΑΡ ΔBIR, ενώ η υπερέκφραση του ΗΑ-ΧΙΑΡ ΔRING ή H467A έδειξε κανένα από αυτές οι αποκαταστάσεις. Σε συμφωνία των ευρημάτων μας, αδημοσίευτα δεδομένα Mehrotra της φήμης επίσης ότι Ε3 δραστηριότητα λιγάσης του ΧΙΑΡ ήταν κρίσιμη για το ρυθμιστικό ρόλο της στην κυτταρική μετάσταση βασίζεται στην παρατήρηση ότι H467A ΧΙΑΡ μεταλλαγμένο απέτυχε να συνεργούν με survivin σε διέγερση ΝΡκΒ-εξαρτώμενο μονοπάτι [24]. Ως εκ τούτου, ήταν σαφές ότι η λειτουργία των ΧΙΑΡ στη ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης εξαρτάται από τη δραστηριότητά της Ε3 λιγκάσης της περιοχής RING παρά σχετικές με αντι-αποπτωτική δυνατοτήτων της.

Έχει προταθεί ότι ο ρόλος των ΙΑΡ στο κελί κινητικότητα μπορεί να είναι εξελικτικά συντηρημένη δεδομένου ότι το

Drosophila

IAP ομόλογο DIAP1 έχει εμπλακεί στην κυτταρική μετανάστευση και μορφογένεση ελέγχοντας μη-αποπτωτική δραστηριότητα κασπάσης [13]. DIAP1 έχει αποδειχθεί για να προωθήσει τα κύτταρα θυλακίου της μετανάστευσης μέσα στο θάλαμο των αυγών κατά τη διάρκεια του

Drosophila

ωογένεση μέσω ρύθμιση της δραστηριότητας των μικρών ΟΤΡάσης, Rac. Μεταλλάξεις σε DIAP1 παρουσίασαν ελαττώματα μετανάστευσης κυττάρων πιθανώς λόγω μεταβολών στη κυτταρική οργάνωση ακτίνης εξαρτώμενη [13], η οποία ήταν αρκετά παρόμοια με αυτά που παρατηρήθηκαν σε ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα στις τρέχουσες μελέτες. Μικρές GTPases παίζουν σημαντικές λειτουργίες σε μια πληθώρα κυτταρικών γεγονότων, όπως η ρύθμιση των συστημάτων νηματοειδή ακτίνη [39]. Rho οικογένεια ΘΤΡάσες ενεργούν διακόπτες ποδηλάτου ως μοριακή μεταξύ ανενεργό μορφή ΑΕΠ-δεσμεύεται στο κυτταρόπλασμα και ενεργή GTP-δεσμευμένη κατάσταση στο κυτταρόπλασμα μεμβράνης [40]. RhoGDI χαρακτηρίστηκε ως μια κάτω-ρυθμιστής της Rho GTPases με εκχύλιση από τους μεμβράνες και διαλυτοποίηση τους στο κυτταρόπλασμα. RhoGDI επίσης να αλληλεπιδρούν με τις περιοχές διακόπτη της GTPases και περιορίζουν τη δυνατότητα πρόσβασης σε GEFs και GAPs έτσι ώστε να κρατήσει ΘΤΡάσης των ανενεργών μελών [39]. Όπως έχουμε αναφερθεί εδώ, ΧΙΑΡ ήταν σε θέση να αλληλεπιδρούν φυσικά με RhoGDI και αναστέλλουν τη δραστηριότητά της στη ρύθμιση ακτίνης συναρμολόγηση κυτταροσκελετού. Έτσι, όταν ΧΙΑΡ ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται, δραστηριότητα RhoGDI κατεστάλη η οποία παρείχε μια εξήγηση για τις παρατηρήσεις που να χτυπήσει κάτω RhoGDI στα κύτταρα HCT116 WT δεν επηρέασε την πληγή ποσοστό κλεισίματος από την δραστηριότητα RhoGDI έχει ήδη ανασταλεί από ΧΙΑΡ, ενώ στην ΧΙΑΡ

– /-. κύτταρα όπου η κατασταλτική επίδραση στη δραστηριότητα RhoGDI ήταν ακυρώνει, RhoGDI χτυπήσει κάτω εκτίθενται πολύ πιο εμφανής βιολογικές επιδράσεις

Επιπλέον, οι μελέτες μας έχουν δείξει ότι η περιοχή RING (ΧΙΑΡ ΔBIR), αλλά δεν BIR τομείς (ΧΙΑΡ ΔRING ), θα μπορούσε να συν-ανοσοκαταβυθίζεται στο άνοσο σύμπλοκο χρησιμοποιώντας το αντίσωμα ειδικό έναντι GFP-RhoGDI. Αν και δραστηριότητα λιγάση Ε3 του τομέα RING φάνηκε να απαιτούνται για τη μετανάστευση των κυττάρων, διαταραχή της λειτουργίας του από μετάλλαξη H467A δεν επηρέασε την αλληλεπίδραση με RhoGDI. Έτσι, έγινε η υπόθεση ότι εκτός RhoGDI, μπορεί να υπάρχουν και άλλοι μεταγενέστεροι στόχοι της δραστηριότητας της Ε3 λιγκάσης της ΧΙΑΡ υπεύθυνες για τον έλεγχο των κυττάρων κινητικότητα, όπως NFκB [24] ή κάποια un-προσδιορίζονται παράγοντες. Αν και Ε3 δραστηριότητα λιγάσης του ΧΙΑΡ συνέβαλαν στην autoubiquitination της ίδιας και ουμπικουιτίνωση των συνεργατών σύνδεσης αυτής, όπως Smac και ΟΕΕ ΧΙΑΡ, RhoGDI δεν υποβλήθηκε σε σύζευξης ουβικιτίνης ακόμα και όταν ΧΙΑΡ ήταν υπερεκφράζεται.

Βάλτε μαζί, οι τρέχουσες μελέτες μας αποκάλυψαν ότι Ε3 δραστηριότητα λιγάσης του τομέα ΧΙΑΡ RING συνέβαλαν στην ακτίνη πολυμερισμού, ο σχηματισμός του κυτταροσκελετού και η μετανάστευση των κυττάρων. Παρόλο τομέα RING ήταν απαραίτητη για RhoGDI αλληλεπίδραση που μεσολαβεί motilities κυττάρων, τη δραστηριότητα της λιγάση Ε3 δεν συμμετείχε στη RhoGDI δεσμευτική ή ubiqutination. Η εναλλακτική μοριακή βάση για τη δράση του λιγάση Ε3 παραμένει να χαρακτηριστεί πλήρως.

Υλικά και Μέθοδοι

πλασμίδια

Τα πλασμίδια που εκφράζουν ΗΑ-tagged ΧΙΑΡ, ΗΑ-ΧΙΑΡ ΔRING, HA-ΧΙΑΡ ΔBIR, ΗΑ-ΧΙΑΡ H467A, και pEBB-HA έκφραση κενό φορέα, ήταν δώρα από τον Δρ Colin S Duckett (Πανεπιστήμιο του Τέξας στο Ώστιν, Ώστιν, Τέξας) [16]. φορέα pEGFP-C3 /RhoGDI εκφράζουν πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) ταμπέλα σήμα RhoGDI και Rac1 παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Mark R. Philips (New York University School of Medicine, New York, NY, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). pRNA-U6 /siRhoGDI και pEGFP-C3 /mRhoGDI (RhoGDI γονίδιο μεταλλάχθηκε από 403-AAA GGC GTC ΑΑΟ ΑΤΤ GAC-420-403-ΑΑΟ GGA GTA ΑΑΑ ATC GAT-420 για την πρόληψη της καταστροφής των εξωγενών mRNA από το αντίστοιχο siRNA) ήταν παρασχέθηκε από τον Dr. BL Zhang όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36]. Ανθρώπινα ΧΙΑΡ και RhoGDI shRNA πλασμιδίων αγοράστηκαν από την Open Biosystems (Pittsburgh, PA)

Cell Culture και διαμόλυνση

Άγρια τύπου και ΧΙΑΡ

-. /- Κύτταρα HCT116 (ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές) ήταν ευγενικό δώρο από τον Dr. Bert Vogelstein (Ιατρικό Ινστιτούτο Howard Hughes και Sidney Kimmel Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου, The Johns Hopkins Ιατρικών Ιδρυμάτων, Βαλτιμόρη, MD) [37]. WT και ΧΙΑΡ

– /- κύτταρα HCT116 καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Nova-Tech, Grand Island, ΝΕ) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Life Technologies , Grand Island, Νέα Υόρκη). επιμολύνσεις κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με αντιδραστήριο Lipofectamine (Invitrogen) ή αντιδραστήριο επιμόλυνσης Fugene * HD (Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ). Για σταθερή διαμόλυνση, οι καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε υγρομυκίνη Β ή G418 ή πουρομυκίνη (Life Technologies) επιλογής φαρμάκου, και τα κύτταρα που επιβίωσαν από το αντιβιοτικό επιλογής συνενώθηκαν ως σταθερά προϊόντα επιμόλυνσης μάζα. Αυτά τα σταθερά προϊόντα επιμόλυνσης κατόπιν καλλιεργήθηκαν στο επιλεγμένο αντιβιοτικό μέσο ελεύθερο για τουλάχιστον δύο διόδους πριν από τη χρήση σε πειράματα.

Επούλωση Δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν μέχρι 80% συρροή. Τραύματα έγιναν με αποστειρωμένα ρύγχη πιπετών. Τα κύτταρα πλύθηκαν με άνευ ορού PBS και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο για τα διάφορα χρονικά σημεία. Φωτογραφίες λήφθηκαν κάθε 24 ώρες μέχρις ότου η πληγή επουλώθηκε στα γονικά κύτταρα [41]. Η περιοχή της πληγής προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το κινητό λογισμικό ανάλυσης Μετανάστευσης (Muscale LLC, Scottsdale, AZ).

Κυττάρου εισβολή Δοκιμασία

Ένα BD BioCoatTM MatrigelTM Εισβολή Επιμελητηρίου (BD Biosciences, San Diego, CA) χρησιμοποιήθηκε για δοκιμασία εισβολή. Τα κύτταρα (2.5 × 10

4) σπάρθηκαν ανά ένθετο εις τριπλούν σε μέσο 5Α 500 μl ελεύθερο ορού του McCoy. Ένθετα τοποθετήθηκαν σε φρεάτια που περιείχαν 500 μΙ μέσου με 5% FBS και ΤΡΑ (20 ng /ml). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες σε ένα επωαστή με 5% CO

2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επί της άνω επιφανείας των φίλτρων για πρώτη φορά απεικονίζεται και στη συνέχεια απομακρύνεται πλήρως από το σκούπισμα με ένα βαμβάκι. Η μεμβράνη κόπηκε με αιχμηρή νυστέρι και τοποθετήθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων.