Αφηρημένο

Ιστορικό

μετάσταση του καρκίνου είναι η κύρια αιτία που οδηγεί σε υποτροπή της νόσου και την υψηλή θνησιμότητα σε ασθενείς με καρκίνο. Ως εκ τούτου, αναστολή διαδικασία της μετάστασης ή τη θανάτωση μεταστατικών καρκινικών κυττάρων με διέγερση απόπτωσης έχει κλινική σημασία για τη βελτίωση του καρκίνου επιβίωση του ασθενούς. Προηγούμενες μελέτες αποκάλυψαν ότι φουκοϊδάνη, ένα φουκόζη πλούσια πολυσακχαρίτη που απομονώνονται από το θαλάσσιο φαιοφύκους, είναι μια πολλά υποσχόμενη φυσικό προϊόν με σημαντική αντικαρκινική δράση. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για το ρόλο του ενδοπλασματικού δικτύου (ER) στρες σε fucoidan επαγόμενη απόπτωση κυττάρων.

Principal Εκτίμηση

ανέφεραν ότι fucoidan θεραπεία αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων και επάγει την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα . θεραπείες Fucoidan οδήγησε σε ρύθμιση προς τα κάτω της γλυκόζης ρυθμίζεται πρωτεΐνη 78 (GRP78) στις μεταστατικό MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού, και της πρωτεΐνης ER 29 (ERp29) στις μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου HCT116 κύτταρα. Ωστόσο, fucoidan θεραπεία προωθείται ER Ca

2 + -εξαρτώμενη καλμοδουλίνη κινάσης (CaMKII) φωσφορυλίωση II, πρωτεΐνη Bcl-σχετίζεται X (Bax) και κασπάσης 12 έκφραση σε MDA-MB-231 κύτταρα, αλλά όχι σε HCT116 κύτταρα. Σε αμφότερους τους τύπους καρκινικών κυττάρων, fucoidan ενεργοποιημένα τη φωσφορυλίωση του παράγοντα έναρξης ευκαρυωτικών 2 άλφα (ρ-eIF2α) \\ CCAAT /ενισχυτή δεσμευτική πρωτεΐνη ομόλογη πρωτεΐνη (CHOP) προ-αποπτωτικών καταρράκτη και ανέστειλε την φωσφορυλίωση της κινάσης ινοσιτόλη-απαιτώντας 1 (ρ- IRE-1) \\ δεσμευτικές πρωτεΐνες 1 μάτισμα (XBP-1s) καταρράκτη προ-επιβίωσης X-box. Επιπλέον, CHOP νοκ ντάουν προληφθούν βλάβες στο DNA και τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από fucoidan.

Συμπέρασμα /Σημασία

Fucoidan ασκεί τη λειτουργία αντι-όγκου του διαμορφώνοντας καταρράκτες ER στρες. Συμβολή της ER στρες με την fucoidan επαγόμενη κυτταρική απόπτωση αυξάνει την κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν δράση κατά των όγκων του και παρέχει αποδεικτικά στοιχεία για την θεραπευτική εφαρμογή των fucoidan στον καρκίνο

Παράθεση:. Τσεν S, Zhao Υ, Zhang Υ, Zhang D (2014) Fucoidan Προκαλεί Cancer Cell απόπτωση διαμορφώνοντας το ενδοπλασματικό δίκτυο άγχος Cascades. PLoS ONE 9 (9): e108157. doi: 10.1371 /journal.pone.0108157

Επιμέλεια: Yu-Jia Chang, Ταϊπέι Ιατρικής του Πανεπιστημίου, την Ταϊβάν

Ελήφθη: 18η Απριλίου του 2014? Αποδεκτές: 17 Αυγούστου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 18η Σεπτεμβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81370524). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια χρόνια νόσος με υψηλή θνησιμότητα λόγω του υψηλού μεταστατικού ικανότητα και την αντοχή του στην χημειοθεραπείας και της ραδιοθεραπείας. Παρά τις καλλιεργημένους του θεραπευτική στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου, καμία αγωγή είναι 100% αποτελεσματικό ενάντια διαδίδονται /μεταστατικό καρκίνο. Μέχρι πρόσφατα, οι περισσότερες από τις θεραπευτικά φάρμακα στοχεύουν στις πολλαπλασιαστικές καρκινικά κύτταρα για τη θεραπεία πρωτογενών όγκων. Δεδομένου ότι οι περισσότερες θάνατοι από καρκίνο είναι αποτέλεσμα της μεταστατικής νόσου, την κατανόηση των μηχανισμών της μετάστασης του καρκίνου και την ανάπτυξη φαρμάκων για τον καρκίνο μεταστατικό πράγματι αναδυόμενες περιοχές στον καρκίνο κυτταρική βιολογία και τη θεραπεία του καρκίνου.

Ανάπτυξη φυσικών προϊόντων για τη θεραπεία του καρκίνου είναι μια υποσχόμενη στρατηγική για τη θεραπεία και την πρόληψη του καρκίνου. Για παράδειγμα, φουκοϊδάνη, μία φουκόζη πλούσια πολυσακχαρίτη, απομονώνεται από καφέ φύκια, όπως

Cladosiphon okamuranus

και

Fucus evanescens

[1], [2]. Fucoidan είναι δομικά παρόμοια με την ηπαρίνη, με ένα σημαντικό ποσοστό του L-φουκόζη [3], [4]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει διάφορες βιολογικές δράσεις, περιλαμβανομένης της αντι-φλεγμονώδη, αντι-πηκτική [5], αντι-Ηΐν και αντικαρκινικά [6] – [9] δραστηριότητες. Σημαντικά, fucoidan δείχνει μια υψηλή αποτελεσματικότητα στην θεραπεία μιας ποικιλίας καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, ο καρκίνος του προστάτη, καρκίνος του πνεύμονα, ηπάτωμα και λευχαιμία [7], [8], [10] – [12]. αντικαρκινική δραστικότητα του εξασκείται με ρύθμιση πολλαπλές οδούς σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα. Διαπιστώθηκε ότι fucoidan μπορεί να επάγει την απόπτωση των κυττάρων

μέσω

η ενεργοποίηση της κασπάσης-καταρράκτες, εξωκυτταρικό σήμα κινάση ρυθμιζόμενη ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάση (ERK1 /2 ΜΑΡΚ) και η απενεργοποίηση του p38MAPK και φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης ( ΡΙ3 K) /πρωτεϊνική κινάση Β (Akt) [7], [11], [13]. Επιπλέον, fucoidan αναστέλλει επίσης Wnt μονοπάτι /β-κατενίνης για να μειωθεί η έκφραση της κυκλίνης D1, που οδηγεί σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου

in vitro

και

in vivo

[7], [14]. Οι

in vivo

μελέτες έδειξαν ότι fucoidan κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου και σημαντικά μειωμένη πνευμονική μετάσταση 4Τ1 κυττάρων καρκίνου του μαστού [14] – [16]. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το δυναμικό ανάπτυξης της fucoidan ως αντικαρκινικό φάρμακο. Αν και αυτό, οι μηχανισμοί δράσης που fucoidan ασκεί στο απόπτωση των κυττάρων του καρκίνου δεν έχουν κατανοηθεί πλήρως. Ειδικότερα, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τη συμμετοχή του ενδοπλασματικού δικτύου (ER) άγχος, μια κεντρική σηματοδότηση που καθορίζει τη μοίρα κυττάρου, στη δραστηριότητα κατά του όγκου fucoidan μεσολάβηση.

ER διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην Ca

2+ ομοιόσταση και κυττάρων παθοφυσιολογία. Συσσώρευση ξεδιπλωμένη ή misfolded πρωτεΐνες εντός του ER ή Ca

εξάντληση κατάστημα 2+ επάγει ER στρες και ενεργοποιεί την ξεδιπλωμένη απόκριση πρωτεΐνη να διατηρεί την ομοιοστασία ER [17]. Υπό συνθήκες ηρεμίας, η πρωτεΐνη συνοδός ER, η γλυκόζη ρυθμίζεται πρωτεΐνη 78 (GRP78), σφραγίζει την πόρου της translocon στο ER και έτσι, μειώνει ER Ca

2+ διαρρεύσει [18]. Σύμφωνα με το ER στρες, GRP78 απελευθερώνεται από την translocon και ενεργοποιεί ER Ca

2 + εξάντληση [19]. Κυτοσολίου Ca

2+ δεσμεύεται με καλμοδουλίνη να ενεργοποιήσει Ca

2+ \\ καλμοδουλίνη κινάσης II (CaMKII) σηματοδότησης, οδηγώντας σε ER στρες που προκαλείται από την κυτταρική απόπτωση μέσω ενεργοποίησης του μιτοχονδριακής απόπτωσης μονοπάτι [20].

ER στρες οδηγεί επίσης σε διάσπαση του GRP78 από τα σύμπλοκα που σχηματίζονται με το τμήμα του αυλού του ER πρωτεϊνών μεμβράνης, πρωτεϊνική κινάση RNA (PKR) -όπως κινάσης ER (PERK), ινοσιτόλη-απαιτώντας κινάση 1 (IRE1) και ενεργοποίηση παράγοντα μεταγραφής 6 (ATF6), με αποτέλεσμα αυτοφωσφορυλίωση του PERK και IRE-1 και μετατόπιση του ATF6 στο Golgi για διάσπαση [21]. Αυτές οι αλλαγές προκαλούν ενεργοποίηση των κατάντη μονοπατιών σηματοδότησης τους. Για παράδειγμα, το ενεργοποιημένο PERK φωσφορυλιώνει ευκαρυωτικό παράγοντα έναρξης 2 άλφα (eIF2α) για να μετριάσει την μετάφραση πρωτεΐνης και τη μείωση της υπερφόρτωσης πρωτεΐνη ER [22]. Παρατεταμένη στρες ER επάγει επίσης ATF4 και CCAAT /δεσμευτική πρωτεΐνη ομόλογη πρωτεΐνη (CHOP) έκφραση ενισχυτή, οδηγώντας σε απόπτωση [17]. Για να αντιμετωπίσει ER στρες, ενεργοποιημένα IRE-1 δρα ως ενδονουκλεάση για να αυξηθεί η πρωτεΐνη σύνδεσης 1 (XBP-1) μάτισμα X-box, οδηγώντας έτσι σε προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων σημαντικών για την επιβίωση των κυττάρων κατά τη διάρκεια της ER στρες [23]. ενεργοποίηση ATF6 εμφανίζεται μετά πρωτεολυτική διάσπαση στο Golgi, που ακολουθείται από πυρηνική μετατόπιση της για την προσαρμοστική απόκριση στρες [24]. Σε κάποιο βαθμό, ER στρες παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση αυτών των υπολοίπων σηματοδότηση για να χειραγωγήσουν τη μοίρα του κυττάρου [17].

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε αν ER στρες περιλαμβάνει την fucoidan επαγόμενη κυτταρική απόπτωση στην ιδιαίτερα επεμβατική και μεταστατικό MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού [25] και του καρκίνου του παχέος εντέρου HCT116 κύτταρα [26]. Δείξαμε ότι η θεραπεία fucoidan ρυθμίζει το ER Ca

2 + -modulated φωσφορυλίωση CaMKII σε έναν τύπο-εξαρτώμενο τρόπο κυττάρων. Ωστόσο, η θεραπεία fucoidan στους δύο τύπους καρκινικών κυττάρων ενεργοποιημένων το ρ-eIF2 \\ CHOP προ-αποπτωτικών καταρράκτη και ανέστειλε την ρ-IRE-1 /XBP-1s καταρράκτη προ-επιβίωσης. Ως εκ τούτου, ER στρες συμβάλλει, τουλάχιστον εν μέρει, στην fucoidan επαγόμενη απόπτωση κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού και τα καρκινικά κύτταρα HCT116 του κόλου αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS, Invitrogen, Eugene, OR). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή

Αντισώματα και αντιδραστήρια

Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη:. Κουνελιού αντι-GRP78 και κουνέλι αντι-ERp29 από Novus Biologicals (Littleton, CO)? αντι-eIF2a, αντι-φωσφο-eIF2a (S51), αντι-Ρ58 κουνελιού

ΙΡΚ, PARP κουνελιού αντι-διασπώνται, κουνελιού αντι-ματισμένα XBP-1 (XBP-1s), κουνελιού αντι-διασπασμένη κασπάση ποντικό 3και κουνέλι ποντίκι αντι-GADD153 /CHOP από κινητό σηματοδότηση Technology (Beverly, ΜΑ)? ποντικού αντι-β-ακτίνης από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ)? αντι-CaMKII κουνελιού, κουνέλι αντι-Βαχ, κουνελιού αντι-κασπάση 12 και κουνελιού αντι-φωσφο-CaMKII (T286) από Abcam (Cambridge, ΜΑ).

Fucoidan απομονώθηκε από

Fucus vesiculosus

αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (Saint Louis, ΜΟ). Οι πλήρεις, άνευ ΕϋΤΑ αναστολέα πρωτεάσης δισκία κοκτέιλ ελήφθησαν από την Roche Diagnostics (Indianapolis, ΙΝ). αναστολείς φωσφατάσης κοκτέιλ Ι και II και θαψιγαργίνη (TG) ήταν από την Sigma-Aldrich (Steinheim, Γερμανία). αντιδραστήρια επιμόλυνσης Lipofectamine 2000 παρασχέθηκαν από την Invitrogen (Eugene, OR). Salubrinal αγοράστηκε από Tocris Bioscence (Ellisville, ΜΟ).

Η κυτταρική ανάπτυξη και η βιωσιμότητα

Η ανάπτυξη των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη χρήση του One Λύση CellTiter96 υδατικό κυττάρων Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (Promega, Madison, WI). Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε τριπλούν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5000 κυττάρων ανά φρεάτιο σε 100 μΙ του αντίστοιχου μέσου. Την επόμενη ημέρα, τα μέσα αναρροφήθηκαν και αντικαταστάθηκαν με φρέσκα μέσα που περιέχουν τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις fucoidan (0, 10, 50, και 100 μg /ml). Τα κύτταρα επωάστηκαν υπό πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας για μέχρι 4 ημέρες, και αξιολογήθηκαν τα βιώσιμα κύτταρα. Η απορρόφηση στα 492 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν άπειρο αναγνώστη F200 μικροπλάκας (TECAN Austria GmbH, Γκρόντιγκ, Αυστρία). Τριπλά πειράματα πραγματοποιήθηκαν για κάθε επεξεργασία. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εξετάσθηκε επίσης χρησιμοποιώντας το μπλε της τρυπάνης δοκιμασία αποκλεισμού.

κυτταρικής απόπτωσης

κυτταρικής απόπτωσης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τερματική δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης μεσολάβηση dUTP nick τέλος επισήμανση (TUNEL) δοκιμασίας [27]. Εν συντομία, κύτταρα (2.5 × 10

4 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 6 φρεατίων με καλυπτρίδα και 24 ώρες αργότερα, 2 ml φρέσκου μέσου με fucoidan (τελική συγκ. 100 μg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο . Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή για 3 ημέρες που ακολουθείται από χρώση TUNEL χρησιμοποιώντας το κιτ συστήματος αδιέξοδο Φθορομετρικής TUNEL (Promega, Madison, WI) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι πλάκες τοποθετούνται χρησιμοποιώντας αντιξεθωριάσματος ρευστό στήριξης που περιέχει DAPI. Πράσινο (αποπτωτικό κυτταρικό πυρήνα) και το μπλε (DAPI, συνολικής κύτταρα) φθορίζοντα σήματα συνελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα Olympus Fluoview FV1000 ομοεστιακό λέιζερ μικροσκόπιο σάρωσης (Όλυμπος, Ιαπωνία). Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων εκφράστηκε ως μέσος όρος των πέντε τυχαία επιλεγμένα πεδία (300 κύτταρα ανά πεδίο). Επιπλέον, η κυτταρική απόπτωση εξετάστηκε επίσης με ανοσοκηλίδωση την έκφραση διασπασμένης κασπάσης 3 και διασπάται Πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP).

παρεμβολή RNA

μικρά παρεμβαλλόμενα RNAs (siRNAs) που στοχεύουν CHOP (CHOP siGENOME SMARTpool, Dharmacon, Lafayette, CO) και siGENOME siRNA μη στόχευση χρησιμοποιήθηκαν για CHOP νοκ ντάουν και ελέγχου, αντίστοιχα. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επιμολύνθηκαν παροδικά σε 60-80% συμβολή με siRNA σε μία τελική συγκέντρωση 25 ηΜ χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Invitrogen, Eugene, OR) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επωάστηκαν με φρέσκο ​​μέσο μόνο ή με μέσο με 100 μg /ml του fucoidan. Μετά από 3 ημέρες μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για την ανάλυση βιωσιμότητας χρησιμοποιώντας trypan blue δοκιμασία αποκλεισμού και την αξιολόγηση των επιπέδων CHOP και διασπασμένη PARP με ανοσοστύπωμα.

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

Τα κύτταρα σε 70-80% συρροή υποβλήθηκαν σε θεραπεία με fucoidan σε διάφορες συγκεντρώσεις (0, 1,0, 5,0, 10, 50 και 100 μg /ml, αντίστοιχα) για 3 ημέρες. Τόσο οι συνημμένες και αιωρούμενα κύτταρα συλλέχθηκαν για εκχύλιση πρωτεΐνης. Τα κυτταρολύματα εκχυλίστηκαν με ρυθμιστικό RIPA (1% Igepal, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 0.15 Μ χλωριούχο νάτριο, 0.01 Μ θειικό νάτριο, ρΗ 7.2 και 2 mM EDTA), συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης (Roche Diagnostics) και αναστολείς κοκτέιλ φωσφατάσης Ι και II (1:100, Sigma-Aldrich). Κηλίδωση Western διεξήχθη όπως περιγράφεται [28]. Εν συντομία, το σύνολο των πρωτεϊνών (30 μg /λωρίδα) διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε ρυθμισμένο με Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα με 0.1% Tween 20 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και ανιχνεύθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα. Goat υπεροξειδάσης αντι-ποντικού (HRP? Upstate Biotechnology, Lake Placid, ΝΥ) ή HRP δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύοντα αντισώματα. Το σήμα χημειοφωταύγειας αναπτύχθηκε με SuperSignal West Pico χημειοφωταύγειας υπόστρωμα (Pierce, Rockford, IL). Η ένταση σήματος αναλύθηκε χρησιμοποιώντας GeneTools λογισμικού (Syngene, Frederick, MD). Το επίπεδο της β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Στατιστικές αναλύσεις

Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) και του Student

t

χρησιμοποιήθηκαν δοκιμές για να αναλυθούν η σημασία των διαφορών. p & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως σημαντική. Όλα τα πειράματα καλλιέργειας κυττάρων έγιναν εις τριπλούν. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD) και παρέχονται στον Πίνακα S1.

Αποτελέσματα

θεραπεία Fucoidan επάγει κυτταρική απόπτωση

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν μια σημαντική αναστολή της fucidan για μετάσταση ογκογένεση και καρκινικών κυττάρων [14] – [16]. Για να κατανοήσουμε την επίδραση της fucoidan στην κυτταρική ανάπτυξη και την απόπτωση, τόσο τα μεταστατικά MDA-MB-231 κύτταρα και τα κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με fucoidan στην ενδεικνυόμενη συγκέντρωση για μέχρι 4 ημέρες και η ανάπτυξη των κυττάρων αναλύθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, η κυτταρική ανάπτυξη αναστάλθηκε σημαντικά όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με & gt? 50 μg /ml fucoidan την ημέρα 3 για MDA-MB-231 κύτταρα και την ημέρα 2 για κύτταρα HCT116, σε σύγκριση με αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου. Επιπλέον, για να προσδιοριστεί αν κυτταρικής απόπτωσης αποδίδει στην αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, και οι δύο τύποι κυττάρων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με fucoidan (100 μg /ml) για 3 ημέρες και η κυτταρική απόπτωση αξιολογείται με εξέταση της έκφρασης της διασπασμένης κασπάσης 3 και TUNEL. Όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 1Β, η αγωγή των fucoidan σε υψηλές δόσεις (

π.χ.

., 100 μg /ml) προκάλεσε υψηλή έκφραση διασπασμένη κασπάση 3 και στους δύο τύπους κυττάρων. ανάλυση TUNEL έδειξε επίσης μια κατά προσέγγιση & gt? 25% κύτταρα που υφίστανται βλάβη του DNA σε fucoidan επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ 1Γ.). Ως εκ τούτου, fucoidan θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα αξιοσημείωτη βλάβη του DNA στα κύτταρα αυτά.

(Α) Η ανάπτυξη των κυττάρων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με fucoidan στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση και τα βιώσιμα κύτταρα εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας το One Solution CellTiter96 υδατικό Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού. (Β) κασπάσης 3 ενεργοποίηση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με fucoidan για 3 ημέρες και η έκφραση του διασπασμένη κασπάση 3 εξετάστηκε με στύπωση Western. (Γ) TUNEL. Για την ανάλυση TUNEL, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με fucoidan στα 100 μg /ml επί 3 ημέρες και η κυτταρική απόπτωση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία TUNEL. Τα αποπτωτικά κύτταρα (πράσινο) μετρήθηκαν σε πέντε τυχαία επιλεγμένα πεδία (300 κύτταρα ανά πεδίο) και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± μια SD του ποσοστού των αποπτωτικών κυττάρων επί του συνόλου των κυττάρων (ϋΑΡΙ, μπλε). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± SD σε πειράματα εις τριπλούν. * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

θεραπεία Fucoidan οδηγεί σε διαφορετική απάντηση ER στο MDA-MB-231 και τα κύτταρα HCT116

Για να διερευνηθεί κατά πόσο ER στρες εμπλέκεται σε fucoidan επαγόμενη κυτταρική απόπτωση , εξετάσαμε αρχικά την έκφραση των δεικτών στρες ER συμπεριλαμβανομένων GRP78 και ERp29. Είναι ενδιαφέρον ότι, αντίθετα με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με επαγωγέα ER στρες TG ,, η έκφραση του GRP78 μειώθηκε στα fucoidan επεξεργασμένο MDA-MB-231 κύτταρα με καμία επίδραση στην έκφραση ERp29 σε αυτά τα κύτταρα, σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (καμία επεξεργασία fucoidan ) (Σχ. 2Α). Αντ ‘αυτού, η έκφραση του ERp29 ήταν σημαντικά μειωμένη στα fucoidan κατεργασμένα κύτταρα HCT116, ενώ η έκφραση του GRP78 αυξήθηκε ελαφρώς όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μg /ml, ακολουθούμενη από αναγωγή με υψηλές δόσεις των θεραπειών (Εικ. 2Β). GRP78 έχει πολλαπλές λειτουργίες σε καρκινικά κύτταρα, όπως είναι υπεύθυνη για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, προστατεύοντας τα κύτταρα από την απόπτωση και την επιτάχυνση ER-πρωτεΐνης που συνδέεται με την υποβάθμιση του misfolded πρωτεϊνών [29]. Πρόσφατες μελέτες έχουν ασχοληθεί, επίσης, το ρόλο των ERp29 στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων ενάντια χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία [27], [30]. Η μείωση των GRP78 ή ERp29 στα κύτταρα fucoidan κατεργασμένα υποδηλώνει ότι fucoidan επάγει κυτταρικό θάνατο καταστέλλοντας την έκφραση αυτών των πρωτεϊνών επιβίωσης σε MDA-MB-231 και HCT116 κύτταρα.

Τα κύτταρα σε 70-80% συρροή ήταν κατεργάζεται με fucoidan στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 3 ημέρες και οι δύο συνδέονται και αιωρούμενα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης. (Α) Η έκφραση της GRP78, αλλά όχι ERp29, αναστάλθηκε από fucoidan σε MDA-MB-231 κύτταρα? (Β) Η έκφραση του ERp29 ήταν σημαντικά εξασθενημένος από fucoidan σε κύτταρα HCT116, ενώ GRP78 ήταν μόνο ελαφρώς μειωμένη (-1.5 φορές) σε κύτταρα κατεργασμένα με fucoidan στο & gt? 50 μg /ml. Ως θετικός μάρτυρας, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον επαγωγέα του ER στρες TG (2,0 μΜ) για 24 ώρες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD σε πειράματα εις τριπλούν. * P & lt? 0,05? ** Ρ & lt?. 0.01

Η

Αποτελέσματα θεραπεία Fucoidan στην ενεργοποίηση του π-ΟΑΜΚΙΙ \\ Βαχ και κασπάσης 12 έκφραση σε ένα κύτταρο-πλαίσιο με τρόπο που εξαρτάται

Επειδή GRP78 μπορούν να δεσμεύονται με την translocon στην μεμβράνη ER να εμποδίσει Ca

απελευθέρωσης 2+ στο κυτοσόλιο [18], από την επόμενη ανέλυσε αν μείωση του GRP78 σε MDA-MB-231 κύτταρα θα μπορούσαν να προκαλέσουν Ca

2 + μεσολάβηση ενεργοποίηση του CaMKII και την έκφραση της απόπτωσης που συνδέονται με πρωτεΐνες Bax. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, η σχετική φωσφορυλίωση των CaMKII (ρ-CaNKII /CaMKII) αυξήθηκε σταδιακά στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με fucoidan σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (καμία επεξεργασία φουκοϊδάνη), υποδεικνύοντας μια ενεργοποίηση του Ca

2+ \\ σηματοδότηση CaMKII. Σύμφωνα με αυτό, η έκφραση Bax επίσης σημαντικά αυξημένη και διατηρήθηκε σε παρόμοιο επίπεδο στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με fucoidan (10-100 μg /ml). Σε αντίθεση, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, η σχετική φωσφορυλίωση των CaMKII (ρ-CaNKII /CaMKII) ήταν μετρίως αυξημένη (-1.5-φορές) σε κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με 10 μg /ml του fucoidan, ακολουθούμενη από αναγωγή σε εκείνα τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 100 μg /ml του fucoidan. Συνολικά, fucoidan θεραπεία σε κύτταρα HCT116 δεν προκάλεσε σημαντική μεταβολή της σχετικής φωσφορυλίωσης CaMKII και την έκφραση Bax (Σχ. 3Β). Βρήκαμε επίσης ότι η έκφραση της κασπάσης 12 ήταν ιδιαίτερα αυξημένη συγκέντρωση με fucoidan σε MDA-MB-231 κύτταρα, αλλά όχι σε κύτταρα HCT116 (Σχ. 3C). Επιπλέον, δεν διάσπαση της κασπάσης 12 παρατηρήθηκε όταν ανίχνευση με αντίσωμα. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι fucoidan ρυθμίζει Ca

2+ \\ CaMKII σηματοδότησης και κασπάσης 12 σε έναν τύπο με τρόπο που εξαρτάται κύτταρο.

(Α) Σχετική φωσφορυλίωση CaMKII και έκφραση Bax προοδευτικά αυξήθηκαν κατά fucoidan σε MDA-MB-231 κύτταρα? (Β) Σχετική φωσφορυλίωση CaMKII ήταν μετρίως διεγείρεται (-1.5 φορές) σε συγκέντρωση 10 μg /ml, που ακολουθείται από την αναστολή (περίπου 1.4 φορές) από fucoidan στα 100 μg /ml. έκφραση Bax δεν επηρεάστηκε από fucoidan στα κύτταρα HCT116. (Γ) Κασπάση 12 έκφραση και διάσπασης. Fucoidan επάγει αποτελεσματικά κασπάσης 12 έκφραση σε MDA-MB-231 κύτταρα, και όχι σε κύτταρα HCT116. Αριθ διάσπαση της κασπάσης 12 βρέθηκε και στους δύο τύπους κυττάρων. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD από πειράματα εις τριπλούν. * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

θεραπεία Fucoidan αναστέλλει p-IRE-1 \\ XBP-1 μάτισμα

Με βάση τις παραπάνω διαπιστώσεις ότι fucoidan μπορούν να διαμορφώσουν ER αντίδραση στο στρες στα καρκινικά κύτταρα , είμαστε δίπλα εξέτασε κατά πόσον fucoidan ρυθμίζει διαφορετικά IRE-1 \\ XBP-1 s, έναν καταρράκτη καθορισμό της αντίδρασης επιβίωση των κυττάρων

μέσω

up-ρυθμίζουν την έκφραση των πρωτεϊνών μεταφοράς για ER αναδίπλωση της ικανότητας [31], και η PERK \\ P -eIF2α \\ CHOP προ-αποπτωτικό καταρράκτη [17]. Σε σύγκριση με τον μάρτυρα, fucoidan ανέστειλε σημαντικά την έκφραση του XBP-1s και στους δύο τύπους κυττάρων (Σχ. 4Α, Β). Αυτό προκλήθηκε από την μειωμένη φωσφορυλίωση του IRE-1 στα κύτταρα fucoidan-αγωγή, επειδή τα ενεργοποιημένα λειτουργίες ρ-IRE-1 ως μία ενδονουκλεάση για να δημιουργήσει συγκολλημένα XBP-1s από μη ματισμένου XBP-1 mRNA υπό ER στρες [32]. Σε αντίθεση με τις TG-κατεργασμένων κυττάρων καταδεικνύοντας βελτιωμένη IRE-1 φωσφορυλίωση και XBP-1s έκφραση (Σχ. 4Α, Β), τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν μια ανασταλτική δράση του fucoidan επί ER σχετίζεται με το στρες καταρράκτης κυτταρικής επιβίωσης. Ωστόσο, εμείς δεν παρατηρούμε μια σημαντική αλλαγή της Ρ58

IPK, ένας από τους μεταγενέστερους στόχους του XBP-1s και ATF6 [23], στα κύτταρα fucoidan φάρμακο.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με fucoidan όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι» και στο σχήμα 2. Η φωσφορυλίωση του IRE-1 (ρ-IRE-1) και XBP-1 μάτισμα παρουσίασαν σημαντική μείωση κατά fucoidan όπως αξιολογείται με ανοσοστύπωμα. κατάντη στόχου της, Ρ58

IPK, δεν μειώθηκε στη συνέχεια. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD σε πειράματα εις τριπλούν. Σημειώστε ότι TG-κατεργασμένων κυττάρων (2,0 μΜ, 24 ώρες), έδειξε αυξημένο π-IRE-1 και XBP-1s και στα δύο κύτταρα. * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

Fucoidan ενεργοποιεί τη φωσφορυλίωση eIF2α και απορυθμίζει την έκφραση CHOP

Η φωσφορυλίωση της eIF2α είναι ένα κλασικό μηχανισμό για την ρύθμιση προς τα κάτω σύνθεσης παγκόσμια πρωτεΐνη για να αντιμετωπίσουν ER στρες [33 ]. Παρ ‘όλα αυτά, η υπερβολική πίεση ER επίσης προωθεί τον κυτταρικό θάνατο

μέσω

υπερυθμίζουν καταρράκτη ATF4 \\ CHOP [17]. Είναι έτσι Πιθανολογείται ότι αυτή η αλληλουχία είναι πιθανόν να ενεργοποιείται για να συμμετάσχουν στο fucoidan επαγόμενη κυτταρική απόπτωση. Πράγματι, σύμφωνα με τις TG-επεξεργασμένα κύτταρα, η φωσφορυλίωση eIF2α και έκφραση του CHOP προοδευτικά επάγεται σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο και στους δύο τύπους κυττάρων (Σχήμα 5Α & amp?. Β). Ως εκ τούτου, μπορεί να προκαλέσει fucoidan ER σχετίζεται με το στρες προ-αποπτωτική καταρράκτη σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με fucoidan όπως περιγράφεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι» και στο Σχήμα 2. Τα σχετική φωσφορυλίωση των eIF2α (p -eIF2α /eIF2α) και ψιλοκόψτε έκφρασης εντυπωσιακά αυξήθηκαν κατά fucoidan όπως αξιολογήθηκε με ανοσοαποτύπωση. θεραπεία TG (2,0 μΜ, 24 ώρες) προκάλεσε ενεργοποίηση της ρ-eIF2α και CHOP έκφρασης. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD σε πειράματα εις τριπλούν. * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

Salubrinal θεραπεία ενισχύει fucoidan ενεργοποιούνται eIF2α φωσφορυλίωση και ψιλοκόψτε έκφραση

Salubrinal είναι ένας εκλεκτικός αναστολέας της eIF2α αποφωσφορυλίωσης και επάγει υπερφωσφορυλίωση της eIF2α αναστέλλοντας GADD34-ΡΡ1ο σύμπλοκο [34], [35]. Για να εκτιμηθεί εάν salubrinal θεραπεία διευκολύνει fucoidan επαγόμενης ER καταρράκτη στρες, MDA-MB-231 και HCT116 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με salubrinal (50 μΜ) μόνη ή σε συνδυασμό με fucoidan (100 μg /ml) για 48 ώρες και η έκφραση του p- eIF2α και ψιλοκόψτε εξετάστηκε. Όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 6, κύτταρα κατεργασμένα με salubrinal και fucoidan έδειξε υψηλότερη έκφραση της φωσφορυλίωσης ρ-eIF2α και CHOP από τα κύτταρα σε επεξεργασία με salubrinal ή fucoidan μόνο. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν μια τονωτική επίδραση της fucoidan για την salubrinal επαγόμενη ρ- eIF2α \\ CHOP καταρράκτη.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με salubrinal (50 μΜ) μόνη ή σε συνδυασμό με fucoidan (100 μg /ml) για 48 ώρες . Τα κυτταρικά λύματα (30 μα) εφαρμόστηκαν για την ανάλυση της έκφρασης του ρ-eIF2α και CHOP με ανοσοστύπωμα. ** P & lt? 0,01? *** P & lt?. 0.001

Η

CHOP σιωπή αναστέλλει fucoidan επαγόμενη έκφραση διασπασμένης ΡΑΚΡ

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον η fucoidan που προκαλείται CHOP και στους δύο τύπους καρκινικών κυττάρων συνδέεται με το παρατηρηθείσα κυτταρική απόπτωση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA CHOP στόχευση να μειώσει τα επίπεδα της ενδογενούς του ή σε επεξεργασία με siRNA σκαρφάλωμα ως έλεγχος. προκαταρκτικές μελέτες μας έδειξαν ότι και οι δύο τύποι κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με 25 nM siRNA για 48 ώρες θα μπορούσε να οδηγήσει σε & gt? 70% καταστολή της έκφρασης CHOP συγκριτικά με εκείνους που έλαβαν ελέγχου siRNA. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια κατεργάστηκαν με fucoidan (σε 0 ή 100 μg /ml) για 2 ημέρες και CHOP έκφρασης και βλάβη του DNA (όπως εκτιμάται από διασπασμένης ΡΑΚΡ) αναλύθηκαν. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Α, το επίπεδο της CHOP μειώθηκε κατά 70-90% των ελέγχων και στους δύο τύπους κυττάρων μετά τη θεραπεία. Στα κύτταρα προεπεξεργασμένα με έλεγχο siRNA, θεραπεία fucoidan αυξήθηκε αισθητά έκφραση CHOP και διάσπαση PARP πάνω από τα κύτταρα χωρίς θεραπεία fucoidan. Σε αντίθεση, fucoidan θεραπεία δεν ήταν σε θέση να επάγει την έκφραση CHOP και διάσπαση PARP στις CHOP-σιγήσει κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι φίμωση CHOP είναι σε θέση να εμποδίσει fucoidan έκφραση που προκαλείται από διασπασμένη PARP. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν αποδείξεις ότι CHOP συμμετέχει σε fucoidan προκαλούμενη βλάβη του DNA.

(Α) CHOP knockdown με siRNA αναστέλλει fucoidan επαγόμενη έκφραση διασπασμένης ΡΑΚΡ. Κύτταρα σε 70-80% συρροή υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CHOP siRNA ή σκαρφάλωμα siRNA για 48 ώρες, ακολουθούμενη από επεξεργασία fucoidan (0 ή 100 μg /ml) για 2 ημέρες. Τα επίπεδα του CHOP και διασπασμένη PARP αξιολογήθηκαν με ανοσοστύπωμα. (Β) Η σίγαση CHOP ανταγωνίζεται fucoidan-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Τα κύτταρα προ-αγωγή με CHOP siRNA ή siRNA ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με fucoidan (0 ή 100 μg /ml) για 2 ημέρες και η κυτταρική βιωσιμότητα εξετάστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία κυανού τρυπανίου αποκλεισμού. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως ποσοστό των κυττάρων ελέγχου siRNA χωρίς θεραπεία fucoidan (στήλη 3 σε MDA-MB-231 κύτταρα? στήλη 7 σε κύτταρα HCT116). Σημειώστε ότι CHOP knockdown μόνη της δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων και στους δύο τύπους κυττάρων (στήλη 1

vs

3?.. Στήλη 5

vs

7). Αντ ‘αυτού, CHOP knockdown αξιοσημείωτα αποτρέπει την απόπτωση κυττάρων που προκαλείται από fucoidan στα 100 μg /ml (στήλη 2

vs

4 σε MDA ΜΒ-231-κύτταρα?. Στήλη 6

vs

8 σε κύτταρα HCT116. ). Τα αποτελέσματα ερμηνεύονται ως μέσος όρος (± SD) των τριπλών πειραμάτων. * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

CHOP καταστολή ανταγωνίζεται fucoidan επαγόμενη κυτταρική απόπτωση

Για να εξεταστεί η επίδραση της CHOP νοκ ντάουν στον fucoidan επαγόμενη κυτταρική απόπτωση, η βιωσιμότητα των κυττάρων αυτών των επεξεργασμένων κυττάρων εξετάστηκε. Σε σχέση με την κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων ελέγχου siRNA χωρίς θεραπεία fucoidan (Σχήμα 7Β, στήλη 3 σε MDA-MB-231 κύτταρα?. Στήλη 7 σε κύτταρα HCT116), η βιωσιμότητα των κυττάρων στα CHOP-σιγήσει κυττάρων ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε σε Αυτά τα κύτταρα ελέγχου (. Εικ. 7Β, στήλη 1

vs

3? στήλη 5

vs

. 7), υποδεικνύοντας ότι φίμωση CHOP μόνη της δεν θα μπορούσε να επηρεάσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Στα κύτταρα προεπεξεργασμένα με έλεγχο siRNA, fucoidan θεραπεία οδήγησε σε μείωση περίπου 50-60% της βιωσιμότητας των κυττάρων σε σύγκριση με εκείνους χωρίς αγωγή fucoidan (Σχήμα 7Β, στήλη 4

vs

3?.. Στήλη 8

vs

7? p & lt? 0,01). Ωστόσο, fucoidan θεραπεία προκάλεσε μόνο περίπου 10-20% μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων στις CHOP-σιγήσει κύτταρα (Σχ 7Β, στήλη 2

vs

1?… Στήλη 6

vs

5) . Αξίζει να σημειωθεί ότι καταστολή CHOP και στους δύο τύπους κυττάρων οδήγησε σε σημαντική αύξηση της βιωσιμότητας των κυττάρων μετά την αγωγή fucoidan σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με έλεγχο siRNA και fucoidan (Σχήμα 7Β, στήλη 2

vs

4?.. Στήλη . 6

vs

8? p & lt? 0,05). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι knockdown του CHOP θα μπορούσε να προστατεύσει τα κύτταρα από fucoidan επαγόμενη απόπτωση κυττάρων.

Συζήτηση

Fucoidan έχει αποδειχθεί ότι είναι μία νέα θεραπευτικό παράγοντα για τη θεραπεία του καρκίνου. Μηχανιστικές μελέτες αποκάλυψαν ότι fucoidan μπορεί να καταστείλει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, ογκογένεση και τη μετάσταση με ρύθμιση πολλαπλές οδούς σηματοδότησης [5], [7], [11] – [14]. Στην παρούσα μελέτη, αποδεικνύει ότι fucoidan διαμορφώνει καταρράκτες στρες ER στα καρκινικά κύτταρα και το ενεργοποιημένο έκφραση CHOP είναι υπεύθυνη για fucoidan επαγόμενη κυτταρική απόπτωση.

ER στρες πυροδοτεί μια σειρά από διαδικασίες που απαιτούνται για την απόπτωση. Ένας από αυτούς είναι η απελευθέρωση του ER Ca

2+ καταστήματα στο κυτταρόπλασμα για να ενεργοποιήσετε το Ca

2 + -signal μετατροπέα CaMKII, οδηγώντας σε απόπτωση μέσω: (

i

) ενεργοποίηση του c-Jun Ν τερματικής κινάσης (JNK) για την επαγωγή του υποδοχέα θανάτου Fas (11)? (

ii

) διέγερση του Ca

2 + πρόσληψη από τα μιτοχόνδρια και την απελευθέρωση των apoptogens [36]. Ως εκ τούτου, η ενεργοποίηση CaMKII από ER Ca

2 + διαρροή διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην απόπτωση. Ωστόσο, παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία fucoidan επαγόμενη ενεργοποίηση του ρ-CaMKII σε MDA-MB-231 κύτταρα και όχι σε κύτταρα HCT116. Σταθερά, η μιτοχονδριακή αποπτωτική πρωτεΐνη Bax και το ER-σχετίζεται κασπάσης 12 ήταν σημαντικά αυξημένα σε fucoidan επεξεργασμένο MDA-MB-231 κύτταρα. Λαμβάνοντας υπόψη ότι GRP78 μπορούν προσδένεται σε ER Ca

2+ και translocon στην μεμβράνη ER να εμποδίσει ER Ca

2+ διαρρεύσει [18], αυτό μπορεί να εξηγηθεί από το γεγονός ότι fucoidan θεραπεία σε MDA-MB-231 , όχι σε κύτταρα HCT116, προκάλεσε μείωση της κυτταροπροστατευτικών GRP78, οδηγώντας έτσι σε ER Ca

2+ διαρρεύσει στο κυτοσόλιο να ενεργοποιήσει φωσφορυλίωση CaMKII. Σε αντίθεση, δεν υπήρχε σημαντική μεταβολή της φωσφορυλίωσης CaMKII και Βαχ και κασπάσης 12 έκφραση σε κύτταρα HCT116 fucoidan-θεραπεία, αν και η φωσφορυλίωση CaMKII ήταν μετρίως ενισχύεται με fucoidan στα 10 μg /ml και αναστέλλεται σε 100 μg /ml. Αυτό είναι πιθανώς συνάδει με την παρατήρηση ότι η έκφραση του GRP78 δεν επηρεάστηκε σημαντικά από fucoidan σε κύτταρα HCT116. Ωστόσο, η επίδραση της fucoidan που προκαλείται αρνητική ρύθμιση της ERp29 για την μέτρια μείωση της φωσφορυλίωσης CaMKII στα κύτταρα HCT116 δεν θα πρέπει να αποκλειστεί. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι ο ER σχετίζεται με, Ca

2 + επαγόμενη κασπάσης 12 ενεργοποίηση εμπλέκεται επίσης στην ER στρες απόπτωση [37], ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε ενεργοποίηση της προ-κασπάσης 12 ( διάσπαση της κασπάσης 12) σε κύτταρα fucoidan-θεραπεία, υποδηλώνοντας ότι αυτό αλληλουχίας κασπάσης δεν μπορεί να ενεργοποιηθεί. Επειδή GRP78 και ERp29 είναι απαραίτητες πρωτεΐνες ER στη διατήρηση της ομοιόστασης ER και λειτουργίες όπως αναδίπλωση και έκκριση πρωτεϊνών και της υποβάθμισης του misfolded πρωτεϊνών [29], [38], είναι εύλογο ότι fucoidan ενισχύει βλάβη λειτουργία ER μέσω εξασθένηση της έκφρασης του GRP78 ή ERp29 σε ένα πλαίσιο κυττάρων εξαρτώμενο τρόπο, όπου θα πρέπει να διερευνηθούν περαιτέρω οι ακριβείς μηχανισμοί

ER στρες με τη μεσολάβηση τα μονοπάτια σηματοδότησης σε συνδυασμό με δύο κύριες καταρράκτες:. κυτταρικού θανάτου που σχετίζονται με PERK \\ P-eIF2α \\ CHOP καταρράκτη και την επιβίωση των κυττάρων που σχετίζονται με AFT6 (IRE-1) \\ XBP-1 μάτισμα καταρράκτη [17]. Για να αντιμετωπίσει με ER στρες, XBP-1 mRNA είναι συγκολλημένα από τα ενεργοποιημένα p-IRE-1 για να δημιουργήσει XBP-1s [32]. XBP-1s είναι μια ιδιαίτερα ενεργός παράγοντας μεταγραφής και είναι ένα από τα βασικά ρυθμιστές της ER αναδίπλωσης ικανότητας [31]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η επιμήκυνση του IRE-1 σηματοδότηση κατά τη διάρκεια της ER στρες μπορεί να προωθήσει την επιβίωση των κυττάρων [39]. Ως εκ τούτου, η εξασθένηση της παρούσας καταρράκτη θα μπορούσε να προκαλέσει κυτταρική απόπτωση. Πράγματι, οι μελέτες μας έδειξαν ότι η θεραπεία fucoidan εμπόδισε σημαντικά XBP-1 μάτισμα μέσω της αναστολής της IRE-1 φωσφορυλίωσης.