Αφηρημένο

Η αυξημένη έκφραση και τη δραστηριότητα του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) /πρωτεϊνική κινάση Β (Akt) σηματοδοτικό μονοπάτι συνδέεται με την ανάπτυξη, την εξέλιξη και την αντίσταση θεραπεία του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου (HNC). Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι microRNA-7 (MIR-7) ρυθμίζει την έκφραση EGFR και δραστικότητα Akt σε μία κλίμακα τύπων καρκινικών κυττάρων μέσω ειδικής αλληλεπίδρασης του με το EGFR mRNA 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR). Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι miR-7 ρυθμισμένη έκφραση EGFR και δραστικότητα Akt σε κυτταρικές γραμμές HNC, και ότι αυτό σχετίζεται με μειωμένη ανάπτυξη

in vitro

και

in vivo

των κυττάρων ( ΗΝ5) που ήταν ευαίσθητος στους αναστολείς τυροσίνης κινάσης του EGFR (ΤΚΙ) erlotinib (Tarceva). miR-7 ενήργησε συνεργικά με erlotinib να αναστείλει την ανάπτυξη της erlotinib-ανθεκτικών κυττάρων FaDu, μια επίδραση που σχετίζεται με αυξημένη αναστολή της Akt δραστηριότητας. ανάλυσης μικροσυστοιχιών των γραμμών ΗΝ5 και FaDu κυττάρων επιμολυσμένων με miR-7 εντόπισε μια κοινή δέσμη μειωτικά miR-7 γονίδια-στόχους, παρέχοντας στοιχεία για τη λειτουργία ογκοκατασταλτικό του miR-7. Επιπλέον, έχουμε προσδιορίσει διάφορους στόχους miR-7 mRNAs με ένα υποθετικό ρόλο στην ευαισθητοποίηση των κυττάρων FaDu να erlotinib. Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν τη ρύθμιση συντεταγμένων της Akt σηματοδότησης από miR-7 στα κύτταρα ΕΘΕΓ και να προτείνει τις θεραπευτικές δυνατότητες του miR-7 μόνο του ή σε συνδυασμό με EGFR TKIs σε αυτή την ασθένεια

Παράθεση:. Kalinowski FC, Giles KM, Candy PA, Αλί Α, Γκάντα ​​C, Epis MR, et al. (2012) Ο κανονισμός του υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα Σηματοδοσίας και Erlotinib Ευαισθησία στο κεφάλι και τα κύτταρα του τραχήλου από miR-7. PLoS ONE 7 (10): e47067. doi: 10.1371 /journal.pone.0047067

Επιμέλεια: Hidayatullah Γ Munshi, του Πανεπιστημίου Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 30, 2012? Δεκτές: 7 Σεπτεμβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 24 Οκτωβρίου, 2012

Copyright: © 2012 Kalinowski et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Σύστημα Υγείας και Ιατρικής Έρευνας του Συμβουλίου της Αυστραλίας και της Ιατρικής Έρευνας Εμπορευματοποίηση Ταμείο της Αυστραλίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος κεφαλής και τραχήλου (ΕΘΕΓ) είναι η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου, με περίπου 600.000 νέες περιπτώσεις σε παγκόσμιο επίπεδο ετησίως [1]. Παρά τις προόδους στη τρόπους θεραπείας, η πρόγνωση για πολλούς ασθενείς ΕΘΕΓ που παρουσιάζουν με προχωρημένη ή μεταστατική νόσο παραμένει φτωχή [2]. Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), ένα μέλος της οικογένειας ErbB υποδοχέα κινάσης τυροσίνης (RTK), υπερεκφράζεται σε περισσότερο από το 80% όλων των HNCs και είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης της κακής έκβασης [3]. σηματοδότηση EGFR ενεργοποιεί ένα δίκτυο κατάντη οδών, συμπεριλαμβανομένου του φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /Akt [4], [5] και Ras /Raf /ERK1 /2 [6], [7] οδούς, οι οποίες προάγουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, εισβολή, μετάσταση, αγγειογένεση και αντίσταση απόπτωση. Κατά συνέπεια, η EGFR έχει αναδειχθεί ως ένα σημαντικό θεραπευτικό στόχο σε HNC.

cetuximab είναι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα (mAb) που κατευθύνεται κατά του EGFR που βελτίωσε την επιβίωση των ασθενών που έλαβαν HNC σε συνδυασμό με ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία [8], [ ,,,0],9]. Μικρό μόριο TKIs, όπως gefitinib και erlotinib, έχουν επίσης αξιολογηθεί σε προχωρημένη HNC και είχαν κάποια κλινική επίδραση κατά του όγκου σε ένα μικρό υποσύνολο των ασθενών [10], [11]. Κλινικές δοκιμές σε HNC αξιολόγηση του συνδυασμού των αναστολέων EGFR με άλλες θεραπευτικές προσεγγίσεις έχουν επίσης κινηθεί, καθώς και μελέτες που διερευνούν αντι-ΕΟΡΚ νέα γενιά παράγοντες, όπως το panitumumab αντι-ΕΟΡΚ mAb και το διπλό EGFR /HER2 ΤΚΙ lapatinib [12] . Η φτωχή κλινική ανταπόκριση της HNC σε αντι-EGFR θεραπείες οφείλεται στην εγγενή και επίκτητη αντίσταση των κυττάρων HNC σε αυτούς τους παράγοντες, η οποία πιστεύεται ότι συμβαίνει μέσω διαφόρων μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης μεταλλάξεις εντός EGFR και κατάντη επενεργητές του που ενεργοποιούν σηματοδότηση (π.χ.. Απώλεια του ΡΤΕΝ, ΡΙ3Κ μετάλλαξη ή υπερέκφραση), αντισταθμιστικές σηματοδότηση μέσω άλλων RTKs (π.χ.. άλλα μέλη της οικογένειας ErbB, ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα 1 υποδοχέα (IGF1R), ή c-Met), και η μετάβαση από ένα επιθηλιακό προς έναν φαινότυπο μεσεγχυματικά ( EMT) [12], [13], [14]. Ως εκ τούτου, οι νέες προσεγγίσεις που απαιτείται για να αναστείλει αποτελεσματικά τα κατάντη οδούς ογκογόνο σηματοδότηση που ενεργοποιούνται σε EGFR-ανεξάρτητο τρόπο με τον EGFR αναστολέας ανθεκτικό ΕΘΕΓ.

microRNAs (miRNAs) είναι σύντομες, ενδογενή, μη-κωδικοποίησης RNA που δεσμεύονται με το 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR) συγκεκριμένων mRNAs στόχου να καταστείλει την έκφραση του γονιδίου, είτε μέσω επαγωγής μεταγραφική καταστολή ή μεταγραφής αποδόμησης [15]. miRNAs μπορούν να ρυθμίζουν πολλοί στόχοι γονίδιο, συχνά με συντονισμένο τρόπο μέσα σε ένα κυτταρικό μονοπάτι ή το δίκτυο [16], και με αυτόν τον τρόπο ελέγχουν ποικίλες κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης, της απόπτωσης και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [17]. Η ανώμαλη έκφραση miRNA είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα πολλών καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων HNC, και αυτά τα miRNAs μπορούν να ενεργούν ως καταστολείς όγκων ή ογκογονίδια [18]. Για παράδειγμα, ας-7η έκφραση είναι μειωμένη σε πολλές HNCs, προκαλώντας αυξημένη έκφραση RAS, αυξημένη ανάπτυξη όγκου και μειωμένη επιβίωση των ασθενών [19]. Σε αντίθεση, miR-184 έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά σε καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων της γλώσσας, που οδηγεί σε αυξημένη έκφραση του

c-Myc

ογκογονίδιο, αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την ανάπτυξη του όγκου [20]. Πρόσφατες εκθέσεις δείχνουν ότι miRNAs μπορεί να έχει χρησιμότητα ως νέα θεραπευτικά μέσα καρκίνου ή διαγνωστική /προγνωστική βιολογικών δεικτών [18], [21], [22].

Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι το miR-7 αναστέλλει την έκφραση EGFR και κατάντη Akt και ERK1 /2 δραστικότητα στον πνεύμονα, του μαστού, του καρκίνου του προστάτη και γλοιοβλάστωμα [23], [24], που οδηγεί σε μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση. Η ρύθμιση της έκφρασης EGFR περιλαμβάνει την άμεση, ειδική αλληλεπίδραση του miR-7 με δύο θέσεις στόχους miR-7 εντός της EGFR mRNA 3′-UTR. Επιπλέον, miR-7 ρυθμίζει την έκφραση άλλων μορίων κατάντη του EGFR σε μια μόδα συντεταγμένων, περιλαμβανομένων RAF1, IRS1, IRS2, ΡΑΚ1 [23], [24], [25], υποστηρίζοντας μια λειτουργία καταστολής όγκου για miR-7 σε αυτές και άλλων καρκίνων. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η λειτουργία των miR-7 για σηματοδότηση EGFR και την ανάπτυξη στην ΕΘΕΓ

in vitro

και

in vivo

, εστιάζοντας σε κυτταρικές σειρές που είναι ευαίσθητα ή ανθεκτικά στο EGFR ΤΚΙ erlotinib. Υποθέσαμε ότι το miR-7 θα αναστέλλουν την έκφραση EGFR και κατάντη σηματοδότησης, και αξιολόγησε τη συνέργεια μεταξύ erlotinib και miR-7 στα κύτταρα ΕΘΕΓ erlotinib ανθεκτικά. Τέλος, πραγματοποιήσαμε μικροσυστοιχιών αναλύσεις των δύο κυτταρικές σειρές ΕΘΕΓ για την ταυτοποίηση νέων miR-7 στόχους που θα διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν όγκου δράση καταστολέα του στην ΕΘΕΓ. Τα ευρήματά μας έχουν ευρείες συνέπειες για τη θεραπεία του ΕΘΕΓ με θεραπείες που στοχεύουν EGFR και τη χρήση του miR-7 ως νέα αντι-ΕΘΕΓ θεραπευτική.

Αποτελέσματα

διαφορετικής ευαισθησίας της ΕΘΕΓ κυτταρικών σειρών ο EGFR αναστολέας η erlotinib

για τον καθορισμό της σχετικής ευαισθησίας του ΗΝ5, FaDu, και SCC-25 κύτταρα HNC στην erlotinib αναστολέα EGFR, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς τίτλος κυττάρων των κυττάρων σε επεξεργασία με ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων (Σχ. 1 ). Ενώ τα κύτταρα ΗΝ5 ήταν ιδιαίτερα ευαίσθητα σε erlotinib (ΕΚ

50 = 0,6 μΜ), τα κύτταρα FaDu ήταν ανθεκτικά στο φάρμακο (ΕΚ

50 = 8.3 μΜ). SCC-25 κύτταρα εμφάνισαν ενδιάμεσες ευαισθησία σε erlotinib (ΕΚ

50 = 3,8 μΜ) τα κύτταρα ΗΝ5 αναφερθεί ότι υπερεκφράζουν EGFR μέσω γονιδιακής ενίσχυσης [26], και να είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στην αναστολή του EGFR

in vitro

και

in vivo

[27]. FaDu και SCC-25 κύτταρα εμφανίζουν μέτρια έκφραση EGFR και έχουν δειχθεί ότι δεικνύουν αντίσταση στον αναστολέα gefitinib EGFR [28]. Τα αποτελέσματά μας είναι συνεπή με τις εκθέσεις αυτές, σύμφωνα με την οποία τα κύτταρα FaDu είναι περίπου 10 φορές πιο ανθεκτικά στην erlotinib από τα κύτταρα ΗΝ5. Στο σύνολό τους, τα κύτταρα ΗΝ5 είναι αντιπροσωπευτικά του EGFR αναστολέα ευαίσθητης HNC, κύτταρα FaDu αντιπροσωπεύουν HNC η οποία είναι ανθεκτική στην αναστολή EGFR, και SCC-25 κύτταρα αντιπροσωπεύουν HNC με ενδιάμεση αντίσταση EGFR-αναστολέα. Έτσι, μπορούμε να ερευνήσουμε τη δραστηριότητα καταστολέα όγκου του miR-7 σε κάθε μία από αυτές τις ρυθμίσεις.

ΗΝ5 (κόκκινο), FaDu (μπλε) και SCC-25 (πράσινο) κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και αγωγή με την erlotinib με αναστολείς του EGFR (τελική συγκέντρωση 0-100 μΜ). Το ήμισυ της μέγιστης αποτελεσματικής συγκέντρωσης (ΕΚ

50) της erlotinib προσδιορίστηκε για κάθε κυτταρική γραμμή μετά την μέτρηση του σχετικού αριθμού των βιώσιμων κυττάρων με τη δοκιμασία κύτταρο τίτλος 3 δ μετά την προσθήκη της erlotinib. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται με την χαμηλότερη συγκέντρωση της erlotinib. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

miR-7 ρυθμίζει την έκφραση EGFR και Akt Δραστηριότητα στην ΕΘΕΓ Γραμμές κυττάρων

Προηγουμένως, εμείς και οι άλλοι προσδιόρισε το EGFR mRNA 3′-UTR ως ένας ειδικός στόχος του miR-7 σε πολλαπλές διαφορετικές καρκινικές κυτταρικές σειρές, και απέδειξαν ότι miR-7 είναι ένας ισχυρός αναστολέας της σηματοδότησης EGFR και η κυτταρική βιωσιμότητα [23], [24]. Είναι ενδιαφέρον ότι, miR-7 εξασθενημένη σηματοδότηση EGFR σε EGFR αναστολέας ανθεκτικά U87MG (γλοιοβλαστώματος) και τα κύτταρα [23], [24] Α549 (μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα). Δεδομένου του σημαντικού ρόλου του EGFR σηματοδότησης σε HNC ογκογένεση και τη θεραπεία, ερευνήσαμε την ικανότητα των miR-7 για την αναστολή της έκφρασης EGFR και κατάντη σηματοδότησης σε κυτταρικές γραμμές HNC. Εμείς επιμολυσμένα ΗΝ5, FaDu και κυτταρικές σειρές SCC-25 με miR-7 ή αρνητικός μάρτυρας miRNA, miR-NC, και πραγματοποιήθηκε κηλίδωση Western για να προσδιοριστεί η επίδραση του miR-7 στην έκφραση EGFR και τη δραστηριότητα Akt. miR-7 ανέστειλε έκφραση EGFR και δραστικότητα (Ρ-EGFR), καθώς και δράση του Akt (Ρ-Akt), ένα βασικό κατάντη τελεστή του EGFR (Εικ. 2Α). Η μείωση της Akt δραστηριότητα που προκαλείται από miR-7 συνδέθηκε με μια αύξηση των σχετικών επιπέδων της ολικής Akt (Εικ. 2Α), μια επίδραση που αντανακλά ενδεχομένως, ένα μηχανισμό ανάδρασης που ελέγχει Akt έκφραση σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα. Δεν παρατηρήσαμε αναστολή της ERK1 2 σηματοδότησης /σε καρκινικές κυτταρικές σειρές κεφαλής και λαιμού με miR-7 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αντίστροφα ανάλυση μεταγραφάσης αλυσιδωτής αντίδρασης ποσοτικής πολυμεράσης (RT-qPCR) κυττάρων HNC επιμολυσμένα με miR-7, έδειξαν μειωμένη έκφραση EGFR mRNA (κύτταρα ΗΝ5, Σχήμα 2Β?. Κύτταρα FaDu, τα δεδομένα δεν φαίνονται), ένα σταθερό εύρημα με προηγούμενες μελέτες μας με miR -7 σε γλοιοβλάστωμα, πνεύμονα, μαστού και του προστάτη καρκινικών κυττάρων [24]. Η μείωση του EGFR mRNA από miR-7 είναι επίσης υποστηρίζεται από μια πρόσφατη έκθεση που υποδηλώνει ότι τα περισσότερα miRNAs καταστέλλουν την έκφραση του γονιδίου, με την προώθηση του mRNA φθορά [29]. Τέλος, επιβεβαίωσε την άμεση αναστολή της έκφρασης του EGFR με miR-7, μέσω της δράσης της κατά του EGFR 3′-UTR χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς γονιδίου αναφοράς στα κύτταρα ΕΘΕΓ. Η συν-επιμόλυνση της HNC κυττάρων με miR-7 και ένα πυγολαμπίδας κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης που περιέχει την πλήρους μήκους EGFR mRNA 3′-UTR απέδωσε σημαντικά χαμηλότερη δραστικότητα ανταποκριτή από ότι με miR-NC (κύτταρα FaDu, Σχήμα 2C?. Κύτταρα ΗΝ5, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται ), επιβεβαιώνοντας ότι miR-7 αλληλεπιδρά με ειδικούς EGFR 3′-UTR θέσεις στόχους [24] σε κύτταρα HNC. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι miR-7 αναστέλλει EGFR mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης και κατάντη σηματοδότησης τουλάχιστον εν μέρει μέσω απευθείας στόχευση του EGFR mRNA 3′-UTR.

(Α) Κηλίδωση Western ανάλυση του EGFR, P-EGFR, Akt και Ρ-Akt επίπεδα ΗΝ5 (αριστερό πάνελ) και FaDu (κέντρο του πίνακα) και SCC-25 (δεξιά πλευρά) κύτταρα 3 δ μετά την επιμόλυνση με miR-7 ή miR-NC πρόδρομα μόρια ή όχημα (LF2000) μόνο. β-ακτίνη περιλαμβάνεται ως μάρτυρας φόρτωσης. (Β) RT-qPCR ανάλυση της έκφρασης EGFR mRNA σε ΗΝ5 κύτταρα 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με miR-7 ή miR-NC πρόδρομα μόρια. Δεδομένα κανονικοποιήθηκε προς GAPDH έκφραση mRNA και εκφράζεται σε σχέση με miR-NC-επιμολυσμένα κύτταρα. (C) Δοκιμασία αναφοράς λουσιφεράσης με κύτταρα FaDu συν-επιμολυσμένα με miR-7 ή miR-NC πρόδρομα μόρια, ένα λουσιφεράση πυγολαμπίδας πλήρους μήκους EGFR mRNA 3′-UTR πλασμίδιο ανταποκριτή, και

Renilla

πλασμίδιο αναφοράς λουσιφεράσης . δραστικότητα λουσιφεράσης Firefly αξιολογήθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, κανονικοποιημένη σε

Renilla

μετρήσεις λουσιφεράσης, και τα δεδομένα εκφράστηκαν ως προς το όχημα (LF2000) μόνο επιμολυσμένα κύτταρα. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *, P & lt?. 0.001, miR-7 vs miR-NC

Η

miR-7 αναστέλλει την ανάπτυξη της erlotinib ευαίσθητων ΗΝ5 κύτταρα

in vitro

και

in vivo

κύτταρα ΗΝ5 ΕΘΕΓ είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στην erlotinib και συνεπώς αποτελεί ένα εξαιρετικό μοντέλο για να εκτιμηθεί η λειτουργική σημασία της αναστολής του EGFR με miR-7

in vitro

και

in vivo

. Ερευνήσαμε την επίδραση του miR-7 στα κύτταρα ΗΝ5 erlotinib ευαίσθητα από μέτρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας με προσδιορισμούς κυτταρικής τίτλο 5 d μετά από παροδική επιμόλυνση του miR-7. Σε σύγκριση με το όχημα (LF2000) και miR-NC, miR-7 μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων ΗΝ5 (Εικ. 3Α και Εικ. 3Β).

(Α) Χρωματομετρική δοκιμασία κυττάρων τίτλος των κυττάρων ΗΝ5 5 ημέρες μετά την επιμόλυνση σε πλάκες 96 φρεατίων με miR-7 ή miR-NC πρόδρομα μόρια, ή όχημα (LF2000) μόνο. (Β) Γραφική απεικόνιση της δοκιμασίας κυττάρου τίτλου από το (Α). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τον σχετικό αριθμό των βιώσιμων κυττάρων ΗΝ5 κανονικοποιημένη να LF2000 επεξεργασμένα ΗΝ5 κύτταρα. ανάλυση (C) TaqMan RT-qPCR του miR-7 έκφραση σε ΗΝ5 κλώνων με σταθερή έκφραση του miR-7 (κλώνος 39) ή miR-NC (κλώνος 2). Δεδομένα κανονικοποιήθηκε προς έκφραση U44 snRNA και εκφράζεται σε σχέση με ΗΝ5 miR-NC κλώνος 2. (D) κηλίδωση Western ανάλυση του EGFR, Akt και Ρ-Akt επίπεδα σε ΗΝ5 κλώνων με σταθερή έκφραση του miR-7 (κλώνος 39) ή ΜΙΚ NC (κλώνος 2). β-ακτίνη περιλαμβάνεται ως μάρτυρας φόρτωσης. (Ε) Εγχειρίδιο καταμέτρηση των κυττάρων των κυττάρων ΗΝ5 με σταθερή έκφραση του miR-7 (κλώνος 39) ή miR-NC (κλώνος 2). Τα δεδομένα εκφράζονται σε σχέση με το miR-NC. (F) κλωνογονικότητας δοκιμασία των κυττάρων ΗΝ5 με σταθερή έκφραση του miR-7 (κλώνος 39) ή miR-NC (κλώνος 2) 10 d μετά τα κύτταρα σπάρθηκαν σε δίσκους 10 cm. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *, P & lt? 0,01, miR-7 vs miR-NC? **, P & lt? 0.005, miR-7 vs miR-NC

Η

Για να εκτιμηθεί η επίδραση του miR-7 στην ανάπτυξη του όγκου ΗΝ5

in vivo

, χρησιμοποιήσαμε λεντοϊού παράδοση. παράγουν κύτταρα ΗΝ5 με σταθερή υπερέκφραση του miR-7 ή miR-NC. Χρησιμοποιώντας TaqMan miRNA RT-qPCR παρατηρήσαμε ~ 80 φορές προς τα πάνω ρύθμιση του miR-7 σε κύτταρα ΗΝ5 με σταθερό miR-7 έκφραση (ΗΝ5 σταθερός κλώνος 39), σε σύγκριση με κύτταρα ΗΝ5 με σταθερή έκφραση miR-NC (ΗΝ5 σταθερός κλώνος 2) (Εικ . 3C). Ανάλυση της έκφρασης EGFR και σηματοδότησης από κηλίδωση Western αποκάλυψε μια μικρή μείωση (-15%?

δείτε Μέθοδοι 2.7

) στα επίπεδα της πρωτεΐνης EGFR σε ΕΘΕΓ με miR-7 σταθερή έκφραση (Σχήμα 3D.), Αλλά ένα μεγαλύτερο ( -25%) μείωση των επιπέδων της Akt φωσφορυλιώνεται στη σερίνη-473 (Ρ-Akt). Εμείς διαλογή πολλαπλές ΗΝ5 /miR-7 κλώνους και παρατηρήθηκαν miR-7 υπερέκφραση και παρόμοια επίπεδα EGFR και P-Akt σε κάθε κλώνο (Εικ. S1). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η μείωση της Akt δραστικότητας που επιτελείται από miR-7 δεν είναι απλώς οφείλεται στην αναστολή της έκφρασης EGFR και αντ ‘αυτού είναι πιθανό να προκύψουν από μια συντεταγμένη μείωση στην έκφραση και δράση των πολλαπλών μορίων υπεύθυνος για δραστικότητα Akt.

Για να καθοριστεί εάν σταθερό miR-7 έκφραση αναστέλλει την ανάπτυξη ΗΝ5

in vitro

, πραγματοποιήσαμε χειροκίνητη καταμέτρηση των κυττάρων του miR-NC ΗΝ5 σταθερός κλώνος 2 κύτταρα και miR-7 ΗΝ5 σταθερός κλώνος 39 κύτταρα. Αυτά τα πειράματα αποκάλυψαν μία σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού του miR-7 σταθερά κύτταρα ΗΝ5 σύγκριση με miR-NC σταθερά κύτταρα ΗΝ5 (Σχ. 3Ε). Για να επιβεβαιώσετε αυτό το εύρημα, εκτιμήσαμε την κλωνογενοποιήσεως της ΗΝ5 σταθερών κυτταρικών σειρών μας. Σταθερή έκφραση του miR-7 μείωσε σημαντικά τον αριθμό και το μέγεθος των αποικιών που σχηματίστηκαν μετά από 10 d σε σύγκριση με ΗΝ5 κύτταρα με σταθερούς έκφραση miR-NC (Σχ. 3F). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή με εκείνα που λαμβάνονται με εμείς παροδική miR-7 διαμόλυνση και δείχνουν ότι η ~ 80 φορές αύξηση στην miR-7 έκφραση σε ΗΝ5 miR-7 σταθερός κλώνος 39 οδηγεί σε μειωμένη δραστικότητα Akt και μειώνει σημαντικά το

σε vitro

ανάπτυξη των κυττάρων του ΕΘΕΓ ΗΝ5.

Είμαστε δίπλα προσπάθησε να διερευνήσει την επίδραση της σταθερής έκφρασης miR-7 στο

in vivo

αύξηση ξενομοσχευμάτων όγκου ΗΝ5 σε άτριχα ποντίκια. Μετά από την υποδόρια ένεση του miR-7 ΗΝ5 σταθερός κλώνος 39 ή miR-NC ΗΝ5 κύτταρα σταθερός κλώνος 2 στο πλευρό θηλυκών γυμνών ποντικών, οι όγκοι του όγκου παρακολουθούνταν σε μία περίοδο 29 ημέρας. Μια σημαντική μείωση της ανάπτυξης του όγκου παρατηρήθηκε για ΗΝ5 ξενομοσχεύματα με σταθερό miR-7 έκφραση σε σύγκριση με miR-NC σταθερό ξενομοσχεύματα ΗΝ5 (Εικ. 4Α και Εικ. 4Β). Χρησιμοποιήσαμε ανάλυση TaqMan miRNA qRT-PCR του miR-7 επίπεδα για να επιβεβαιώσει ότι το miR-7 υπερέκφραση επέμενε στα ΗΝ5 /miR-7 ξενομοσχευμάτων κατά τη διάρκεια της μελέτης μας (Εικ. 4C), και παρατηρήσαμε επίσης μια μείωση της P- Akt επίπεδα στο ΗΝ5 /miR-7 κλώνος 39 ξενομοσχευμάτων σε σύγκριση με ΗΝ5 /miR-NC κλώνος 2 ξενομοσχεύματα με κηλίδωση Western (Εικ. 4D και Εικ. 4Ε). Αυτή είναι η πρώτη απόδειξη ότι το miR-7 μπορεί να μειώσει την ανάπτυξη του όγκου ΕΘΕΓ

in vivo

, και είναι συνεπής με άλλες πρόσφατες μελέτες που αποδεικνύουν ότι το miR-7 μειώνει την ανάπτυξη του καρκίνου του ήπατος, καρκίνο του πνεύμονα και ξενομοσχευμάτων schwannoma σε ποντίκια [ ,,,0],30], [31], [32]. Για να επιβεβαιωθεί το εύρημα μας και να αποκλειστεί η πιθανότητα ενός κλωνικού αποτέλεσμα, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία σχηματισμού όγκου στην οποία τα κύτταρα ΗΝ5 επιμολύνθηκαν παροδικά σε καλλιέργεια με miR-7 ή miR-NC, και μετά από 24 ώρες με ένεση υποδορίως στο πλευρό θηλυκών γυμνών σχηματισμό ποντίκια και όγκου αξιολογούνται. Ανάλυση των όγκων του όγκου κατά 10 d αποκάλυψε μια σημαντική αναστολή του σχηματισμού όγκου σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα ΗΝ5 παροδικά επιμολυσμένα με miR-7 (ΗΝ5 /miR-7), σε σύγκριση με ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα ΗΝ5 υπό αγωγή με όχημα ή miR-NC-επιμολυσμένα (ΗΝ5 /miR-NC) (Εικ. S2). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την παρατήρηση μας ότι τα σταθερά miR-7 έκφραση αναστέλλει την ανάπτυξη ξενομοσχευμάτων ΗΝ5 όγκου (Σχ. 4Α και το Σχ. 4Β) και στην υπόθεση ότι miR-7 είναι ένας ισχυρός αναστολέας της σηματοδότησης EGFR, Akt δραστηριότητα, και ογκογονικότητα σε HNC.

(Α) η ανάπτυξη ξενομοσχεύματος ΗΝ5 όγκου μετά από υποδόρια ένεση των σταθερών ΗΝ5 miR-NC κλώνος 2 (κόκκινο) ή miR-7 κλώνος 39 (μπλε) κύτταρα σε γυμνούς ποντικούς. Ο μέσος όγκος του όγκου (mm

3) χαράσσεται συναρτήσει του χρόνου (δ). (Β) Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες του ξενομοσχευμάτων όγκου για κύτταρα με σταθερή έκφραση miR-NC (κλώνος 2, αριστερά) και σταθερή έκφραση miR-7 (κλώνος 39, δεξιά). (C) TaqMan RT-qPCR ανάλυση του miR-7 έκφραση σε ΗΝ5 /miR-7 και ΗΝ5 /miR-NC ξενομοσχεύματα σταθερό όγκο σε πειραματικό τελικό σημείο. Τα δεδομένα ήταν ομαλοποιημένη στην έκφραση U44 snRNA και των επιπέδων του miR-7 παρουσιάζονται σε σχέση με ΗΝ5 /miR-NC κλώνος 2 όγκους. (D) κηλίδωση Western ανάλυση της Akt και Ρ-Akt επίπεδα μεταξύ ΗΝ5 /miR-7 και ΗΝ5 /miR-NC ξενομοσχεύματα σταθερό όγκο. β-ακτίνης και Akt περιλαμβάνονται ως μάρτυρες φόρτωσης. (Ε) Ανάλυση πυκνομετρία P-Akt επίπεδα μεταξύ ΗΝ5 /miR-7 (κλώνος 39) και ΗΝ5 /miR-NC (κλώνος 2) ξενομοσχεύματα όγκου με κηλίδωση Western. P-Ακί επίπεδα κανονικοποιήθηκαν για ολική Akt έκφρασης. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. *, P & lt? 8,0 × 10

-5, miR-7 vs miR-NC? **, P & lt? 1,0 × 10

-8, miR-7 vs miR-NC? ***, Ρ = 0.06, miR-7 vs miR-NC.

Η

Syngergistic δράσης του miR-7 και erlotinib σε FaDu και SCC-25 ΕΘΕΓ κύτταρα

in vitro

όπως miR-7 μπορούν να αναστείλουν την έκφραση του EGFR, καθώς και δραστηριότητα της Akt, υποθέσαμε ότι μπορεί να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα των αντι-EGFR θεραπευτικά με κύτταρα HNC? Δηλαδή, ο συνδυασμός του miR-7 και erlotinib ενδέχεται συνεργιστικά αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων HNC. Για να διερευνήσουν αυτή, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα FaDu που είναι ανθεκτικά σε erlotinib (ΕΚ

50 = 8,3 μΜ? ~ 10 φορές υψηλότερη από ό, τι τα κύτταρα ΗΝ5). κύτταρα FaDu επιμολύνθηκαν παροδικά με miR-7, miR-NC, ή όχημα μόνο, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία σε 3 δ μετά την επιμόλυνση με ένα υπο-ΕΚ

50 και κλινικά σχετικές [33] δόση (7,5 μΜ) της erlotinib ( ή όχημα). Μετά περαιτέρω 4 d, η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με προσδιορισμό κυτταρικής τίτλου (Σχ. 5Α). miR-7 μόνο (χωρίς erlotinib) και erlotinib μόνο (μόνο όχημα? LF2000) κάθε παράγεται μια μικρή αλλά στατιστικά σημαντική αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης FaDu. Ωστόσο, ο συνδυασμός του miR-7 και ερλοτινίμπη παρήγαγε μια ακόμη μεγαλύτερη μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων, ένα αποτέλεσμα που καθορίστηκε από το μοντέλο προσθετισμού Bliss [34] να είναι συνεργιστική, όπου Ε

Bliss = Ε

miR-7 + E

erlotinib-Ε

miR-7 × E

erlotinib = 0,15 + 0,18 – 0,15 × 0,18 = 0,30, και η πειραματικά παρατηρηθεί κλασματική αναστολή (Ε

παρατηρήθηκε) με miR-7 συν ερλοτινίμπη ήταν 0,61. Παρατηρήσαμε επίσης συνέργεια μεταξύ miR-7 και erlotinib σε SCC-25 κύτταρα ΕΘΕΓ (Εικ. S3), όπου Ε

Bliss = E

miR-7 + E

erlotinib-Ε

miR-7 × E

erlotinib = 0,61 + 0,35 έως 0,6 × 0,35 = 0,75, και η πειραματικά παρατηρηθεί κλασματική αναστολή (Ε

παρατηρήθηκε) με miR-7 συν erlotinib ήταν 0,84.

(Α) κυττάρων τίτλος ανάλυση των κυττάρων FaDu που επιμολύνθηκαν μόνο με όχημα (LF2000), miR-7, ή miR-NC για 3 d, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με erlotinib (7,5 μΜ) ή φορέα (DMSO) για περαιτέρω 4 ημέρες. Τα δεδομένα εκφράζονται ως προς το όχημα-επιμολυσμένα, υπό αγωγή με όχημα κύτταρα FaDu (LF2000 μείον erlotinib, πρώτη στήλη). (Β) Κηλίδωση Western ανάλυση του EGFR, Ρ-EGFR, Akt και Ρ-Akt επίπεδα σε κύτταρα FaDu που επιμολύνθηκαν μόνο με όχημα (LF2000), ή miR-7 ή miR-NC για 3 ημέρες και στη συνέχεια κατεργάζεται ± erlotinib (7,5 μΜ) για 24 ώρες. β-ακτίνη περιλαμβάνεται ως μάρτυρας φόρτωσης. (C) Ανάλυση πυκνομετρία P-Ακί επίπεδα από κηλίδωση Western μεταξύ κυττάρων FaDu επιμολυσμένα με miR-NC ή miR-7 και στη συνέχεια κατεργάζεται με erlotinib (7,5 μΜ) για 24 ώρες. Τα δεδομένα φαίνεται σε σχέση με το miR-NC-επιμολυσμένα κύτταρα. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *, P & lt? 0,05, miR-7 μείον erlotinib vs miR-NC μείον erlotinib και LF2000 συν ερλοτινίμπη vs LF2000 μείον ερλοτινίμπη? **, P & lt? 0,01, miR-7 συν erlotinib vs miR-NC συν erlotinib. † δείχνει συνέργεια μεταξύ miR-7 και erlotinib, όπως ορίζεται από το πρότυπο προσθετικότητας Bliss [34].

Η

Σε παράλληλες μελέτες, χρησιμοποιήσαμε δυτική αποτύπωση να αξιολογήσει τον αντίκτυπο των miR-7, erlotinib, και η συνδυασμός των miR-7 και ερλοτινίμπη στην έκφραση EGFR /δραστηριότητας και της δραστηριότητας της Akt σε κύτταρα FaDu (Εικ. 5Β). Παρατηρήσαμε αναστολή της φωσφορυλίωσης του EGFR (P-EGFR) τόσο με erlotinib και miR-7, ενώ miR-7 μείωσε επίσης βασική έκφραση EGFR. Σημαντικά, ο συνδυασμός του miR-7 και ερλοτινίμπη παρήγαγε μια μεγαλύτερη μείωση της P-EGFR έκφραση από παρατηρήθηκε είτε με erlotinib ή miR-7 μόνο του, και πυκνομετρία επιβεβαίωσε ότι η Ρ-Ακί επίπεδα ήταν χαμηλότερα με το συνδυασμό του miR-7 και ερλοτινίμπη από ό, τι με miR-NC και erlotinib (

δείτε Μέθοδοι 2.7

? Σχ. 5C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο συνδυασμός του miR-7 και ερλοτινίμπη λειτουργεί συνεργιστικά σε κύτταρα HNC, να αναστέλλουν ταυτόχρονα έκφραση EGFR και δραστικότητα, δραστικότητα Akt, και την ανάπτυξη των κυττάρων.

Microarray Ανάλυση του miR-7-ρυθμιζόμενες γονιδίων σε ΗΝ5 και FaDu ΕΘΕΓ κύτταρα

Για να αποκτήσουν περαιτέρω κατανόηση του μηχανισμού δράσης του miR-7 και στα δύο ΗΝ5 και τα κύτταρα FaDu, πραγματοποιήσαμε μικροσυστοιχιών αναλύει παράλληλα ολικού RNA που απομονώθηκε από ΗΝ5 και τα κύτταρα FaDu που ήταν επιμολυσμένα με miR-7 ή miR-NC. Έχουμε εκλεγεί για να μαζέψουν RNA για ανάλυση μικροσυστοιχιών σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με miRNA, να μεγιστοποιηθεί η ειδικότητα και ευαισθησία, με βάση την προηγούμενη εμπειρία μας με miR-7 επιμόλυνση των κυττάρων Α549 [24], καθώς και μια έκθεση που υποδηλώνει ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των έμμεσων miR-124 στόχος mRNAs σε HepG2 κύτταρα καρκίνου του ήπατος άρχισε στις ~32 ώρες μετά την επιμόλυνση [35]. Μετά την κανονικοποίηση των δεδομένων, εμείς αιτιολογημένη ότι η άμεση miR-7 γονίδια-στόχους σε ΗΝ5 και τα κύτταρα FaDu θα μειωτικά σημαντικά μετά miR-7 επιμόλυνση. Εμείς εξευγενισμένα αυτές τις λίστες γονίδιο εκχωρώντας μία αποκοπή για προς τα κάτω ρύθμιση των τουλάχιστον -1,5 φορές και με σημασία ρ & lt? 0,05 (Εικ. 6Α), και εκτελείται ανάλυση συστάδων των προκυπτόντων γονιδίων που ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω με miR-7 σε σχέση με miR-NC σε ΗΝ5 ή κύτταρα FaDu (Εικ. 6Β). Αυτό αποκάλυψε επικάλυψη στα γονίδια ρυθμίζεται προς τα κάτω από miR-7 μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών. Εκατόν εβδομήντα εννέα mRNAs σημαντικά μειωτικά από miR-7 στα κύτταρα ΗΝ5 (Πίνακας S1), 357 mRNAs ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε κύτταρα FaDu από miR-7 (Πίνακας S2), και 103 mRNAs ήταν συνήθως προς τα κάτω σε τόσο ΗΝ5 και τα κύτταρα FaDu (Πίνακας S3). Ένα διάγραμμα Venn που αποτελείται από τα miR-7 ρυθμίζεται προς τα κάτω γονίδια για κάθε κυτταρική γραμμή (Σχ. 6C) τονίζει την τομή των miR-7 ρυθμίζεται προς τα κάτω mRNAs μεταξύ ΗΝ5 και κυττάρων FaDu, η οποία αντιπροσωπεύει μια υπογραφή στόχο miR-7 στα κύτταρα HNC. ανάλυση οικόπεδο Scatter έδειξε μια ισχυρή συσχέτιση (R

2 = 0.435, ρ & lt? 0.001) μεταξύ της πτυχής-μείωση στην έκφραση των 103 γονιδίων σε απόκριση προς miR-7 μεταξύ ΗΝ5 και κυττάρων FaDu (Σχήμα 6D).. Επίσης χρησιμοποιήσαμε ανάλυση RT-qPCR για να επιβεβαιωθεί η ρύθμιση προς τα κάτω του RAF1 και μετασχηματιστικό παράγοντα ανάπτυξης άλφα (TGFa) mRNA με miR-7 σε μικροσυστοιχιών μας αναλύει τόσο ΗΝ5 και κυττάρων FaDu (Εικ. S4). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν miR-7 έχει την ικανότητα να στοχεύουν την EGFR, προς τα κάτω μονοπάτια του και επίσης ένα συνδέτη EGFR, όπως TGFa.

(Α) οικόπεδα ηφαίστειο που εκπροσωπούν ανιχνευτές σειρά μεταξύ ΗΝ5 (αριστερά) και FaDu (δεξιά ) κύτταρα 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με miR-7 ή miR-NC πρόδρομα μόρια. Αντιστοίχιση αποκοπής του ± 1,5 φορές αλλαγή (miR-7 vs miR-NC) και p & lt? 0,05, σημαντικά μειωτικά ανιχνευτές είναι σε πράσινο και σημαντικά υπερεκφράζεται ανιχνευτές είναι στο κόκκινο. (Β) ανάλυση Σύμπλεγμα miR-7-μειωτικά γονιδίων σε ΗΝ5 και κυττάρων FaDu, όπου πράσινο και κόκκινο σκίαση αντιστοιχεί σε κατιούσα ρύθμιση και ρυθμίζεται αυξητικά γονίδια, αντίστοιχα. (C) Venn διάγραμμα του miR-7-μειωτικά γονιδίων σε ΗΝ5 και τα κύτταρα FaDu. (D) οικόπεδο διασπορά των miR-7-ρυθμίζεται προς τα κάτω γονίδια κοινά σε ΗΝ5 και τα κύτταρα FaDu (R

2 = 0,435, p & lt? 0.001).

Η

Για να επικυρώσετε την προσέγγισή μας συνδυάζει την ΜΙΚ 7 μειωτικά σύνολα γονίδιο για ΗΝ5 και τα κύτταρα FaDu να εντοπίσουν τα κοινά mRNAs στόχο, χρησιμοποιήσαμε Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση (IPA) για να αξιολογήσει το ποσοστό των γονιδίων που ήταν σημαντικά μειωτικά από miR-7 και ήταν μέτρια ή υψηλή εμπιστοσύνη προβλέψει, ή αποδεδειγμένη, miR -7 στόχους. IPA προσδιορίζονται 91/179 (54%) μειωτικά ΗΝ5 mRNAs ως προβλεφθούν ή αποδεδειγμένη miR-7 στόχους, 113/357 (32%) μειωτικά FaDu mRNAs ως προβλεφθούν ή αποδεδειγμένη miR-7 στόχους, και 57/103 (55%) ρυθμίζεται προς τα κάτω mRNAs που είναι κοινές στα δύο κύτταρα ΗΝ5 και FaDu ως υποτιθέμενη ή πραγματική-miR 7 στόχους, τονίζοντας τον εμπλουτισμό της συνδυασμένης μειωτικά γονίδιο miR-7 που με υποθετικό ή επικυρωμένα miR-7 mRNAs στόχο και υποδηλώνει ότι αποτελεί στόχο miR-7 υπογραφής σε κύτταρα ΕΘΕΓ.

Για να προσδιοριστεί η λειτουργική σημασία του γονιδίου-στόχου miR-7 που είναι κοινές στα ΗΝ5 και τα κύτταρα FaDu, χρησιμοποιήσαμε ΙΡΑ να αναθέσει λειτουργίες στα 103 γονίδια που ρυθμίζεται προς τα κάτω από το miR-7 και στα δύο κυτταρικές γραμμές. Ένα υποσύνολο των 103 γονίδια – εκ των οποίων περισσότερα από τα μισά είχαν προβλέψει ή επικυρωμένα miR-7 στόχους – συνδέθηκε με τις λειτουργίες που αντιπροσωπεύουν ένα ευρύ φάσμα των διαδικασιών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου, συμπεριλαμβανομένων των «πολλαπλασιασμό των κυττάρων», «ανάπτυξη κυττάρων», «κυτταρικού κύκλου» «ογκογένεση», «πρωτεϊνική σύνθεση», «αγγειογένεση», «κυτταρικός θάνατος», και «κυτταρική κίνηση» (Εικ. 7). Αυτό το εύρημα τονίζει την ικανότητα του miR-7 να συν συγχρονισμένα ρυθμίζουν πολλαπλές ογκογόνες διαδικασίες σε καρκινικά κύτταρα.

miR-7-ρυθμίζεται προς τα κάτω γονιδίων κοινά σε τόσο ΗΝ5 και τα κύτταρα FaDu (103) έχουν εκχωρηθεί σε σχολιασμένα καρκινο-συναφές διεργασίες που χρησιμοποιούν το λογισμικό IPA. Αυτές περιλάμβαναν «κυτταρικού κύκλου», «κίνηση κύτταρο», «κυτταρικό πολλαπλασιασμό», «ανάπτυξη κύτταρο», «ογκογένεση», «πρωτεϊνική σύνθεση», «αγγειογένεση» και «κυτταρικού θανάτου». Επίσημη σύμβολα γονίδιο χρησιμοποιούνται για κάθε miR-7-μειωτικά γονίδιο και ένα μπλε κύκλο υποδηλώνει ότι ένα γονίδιο είναι μια προβλεπόμενη ή επικυρωμένο στόχο της miR-7 με ανάλυση του ΜΠΒ.

Η

Για να αποκτήσουν περαιτέρω πληροφορίες για το λειτουργία των miR-7 ως ρυθμιστής της σηματοδότησης EGFR και Akt δραστηριότητα – με την ικανότητα να ευαισθητοποιήσει ΕΘΕΓ κύτταρα στην erlotinib – χρησιμοποιήσαμε ΙΡΑ να αναθέσει την ομάδα των γονιδίων ρυθμίζεται προς τα κάτω από το miR-7 στα κύτταρα ΗΝ5 και τα κύτταρα FaDu στην κανονική «PI3K /Akt σηματοδότηση »οδού (Εικ. 8). Ενώ PIK3CD, ΡΑΚ1, ΙΚΚ και NF-κΒ ρυθμίστηκαν προς τα κάτω από τα κύτταρα miR-7 σε ΗΝ5 αλλά όχι FaDu, η πλειοψηφία των miR-7 ρυθμίζεται προς τα κάτω γονιδίων που σχετίζονται με την ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι μειώθηκαν τόσο ΗΝ5 και κυττάρων FaDu, γεγονός που υποδηλώνει ότι αντιπροσωπεύουν μια οριστική miR-7 υπογραφή στόχος που συνδέεται με την PI3K /Akt σηματοδότησης κατάντη του EGFR. Υποθέτουμε ότι η συνέργεια μεταξύ miR-7 και ερλοτινίμπη είναι τουλάχιστον εν μέρει λόγω της miR-7-μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση των πολλαπλών μορίων που συνδέονται με την δραστικότητα Akt σε κύτταρα HNC.

Σχηματική αναπαράσταση των μορίων στο EGFR /Akt σηματοδοτικό μονοπάτι που αναστέλλονται από miR-7 στην ΕΘΕΓ. λογισμικό IPA χρησιμοποιήθηκε για τη χαρτογράφηση κοινή miR-7-μειωτικά γονίδια (εμφανίζεται με πράσινο χρώμα) σε κύτταρα FaDu και ΗΝ5 πάνω στο κανονικό PI3K /Akt μονοπατιού. Η πυκνότητα της σκίασης αντιπροσωπεύει την πολλαπλή μεταβολή προς τα κάτω ρύθμιση ενός γονιδίου από miR-7. Μπλε κύκλοι υποδεικνύουν ότι ένα γονίδιο είναι μια προβλεπόμενη ή επικυρωμένο στόχο της miR-7 με ανάλυση ΙΡΑ. Αρκετά γονίδια που ανήκουν στην PI3K /Akt μονοπατιού που ρυθμίζεται προς τα κάτω από το miR-7 στα κύτταρα ΗΝ5 μόνο είναι σκιασμένα στο γαλάζιο.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι miR-7 ρυθμίζει την έκφραση EGFR και κατάντη σηματοδότησης σε ΗΝ5 και FaDu HNC κυτταρικές σειρές που έχουν διαφορετική ευαισθησία στην erlotinib EGFR ΤΚΙ. Βρήκαμε ότι το miR-7 αναστέλλει την ανάπτυξη της erlotinib-ευαίσθητα κύτταρα ΗΝ5

in vitro

και

in vivo

, και ότι miR-7 μπορεί να ευαισθητοποιήσει erlotinib-ανθεκτικά κύτταρα FaDu στην erlotinib. ανάλυση μικροσυστοιχιών του miR-7-επιμολυσμένα ΗΝ5 και κύτταρα FaDu προσδιορίζονται κοινό γονίδιο υπογραφή στόχο για miR-7, παρέχοντας εικόνα της δραστηριότητα καταστολέα όγκου στο πλαίσιο διαφόρων σχετίζονται με τον καρκίνο λειτουργίες, όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την κίνηση των κυττάρων. Τέλος, η ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών μας πρότειναν ότι miR-7 ευαισθητοποιεί ανθεκτικές EGFR αναστολέας κύτταρα HNC με την erlotinib με συντονισμένη ρύθμιση της έκφρασης πολλαπλών μορίων που συνδέονται με την δραστικότητα της Akt, μια κρίσιμη καθοδικός τελεστής του EGFR και μια αναδυόμενη θεραπευτικός στόχος στον καρκίνο.

ένα σημαντικό εύρημα της μελέτης μας είναι ότι το miR-7 έχει την ικανότητα να ευαισθητοποιήσουν erlotinib ανθεκτικά ΕΘΕΓ κύτταρα να erlotinib, με το συνδυασμό της erlotinib και miR-7 εμφανίζουν συνεργιστική μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με erlotinib ή ΜΙΚ 7 μόνο. Η παρατήρηση αυτή είναι σημαντικό δεδομένου ότι η αντοχή της HNC σε αναστολείς EGFR είναι κοινή και ένα σημαντικό κλινικό πρόβλημα [12]. Τα δεδομένα μας βασιστεί επίσης στην πρόσφατη έκθεση της Rai και τους συναδέλφους στην οποία παράδοση των miR-7 με EGFR αναστολέας ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα κατέστειλε την ανάπτυξη του

in vitro

και

in vivo

, ένα Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις.