Αφηρημένο

πολυφαινόλες Plant-με βάση (δηλαδή, φυτοχημικά) έχουν χρησιμοποιηθεί ως θεραπεία για ανθρώπινες ασθένειες για αιώνες. Οι μηχανισμοί δράσης αυτών των φυτικής προέλευσης ενώσεις είναι πλέον ένα σημαντικό τομέα της έρευνας. Χιλιάδες φυτοχημικά έχουν απομονωθεί, και ένας μεγάλος αριθμός από αυτούς έχουν δείξει προστατευτική δραστηριότητες ή επιδράσεις σε διάφορα μοντέλα ασθένειας. Χρησιμοποιώντας συμβατικές προσεγγίσεις για να επιλέξετε το καλύτερο ενιαίο ή την ομάδα των καλύτερων χημικών ουσιών για τη μελέτη της αποτελεσματικότητας στη θεραπεία ή την πρόληψη της ασθένειας είναι εξαιρετικά δύσκολο. Έχουμε αναπτύξει και να χρησιμοποιούνται υπολογιστικές-based μεθοδολογίες που παρέχουν αποτελεσματική και ανέξοδη εργαλεία για να αποκτήσουν περαιτέρω κατανόηση της αντικαρκινικές και θεραπευτικές επιδράσεις που ασκούνται από τα φυτοχημικά. Οι μέθοδοι που περιλαμβάνουν Υπολογιστική εικονικής διαλογής, το σχήμα και την ανάλυση φαρμακοφόρου και μοριακή βάση σύνδεσης έχουν χρησιμοποιηθεί για την επιλογή των χημικών ουσιών που στοχεύουν μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη ή ένζυμο και για τον προσδιορισμό πιθανών στόχων πρωτεΐνης για καλά χαρακτηρισμένο, καθώς και για τα νέα φυτοχημικών.

Citation : Τσεν H, Yao Κ, Nadas J, Bode AM, Malakhova Μ, Oi Ν, et al. (2012) Πρόβλεψη των μοριακών στόχων του Καρκίνου Πρόληψη φλαβονοειδή Χρησιμοποιώντας Υπολογιστικές Μέθοδοι. PLoS ONE 7 (5): e38261. doi: 10.1371 /journal.pone.0038261

Συντάκτης: Niall James Haslam, University College Dublin, Ιρλανδία

Ελήφθη: 13, Ιανουαρίου, 2012? Αποδεκτές: 4 Μάη, 2012? Δημοσιεύθηκε: May 31, 2012 |

Copyright: © 2012 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα και το Εθνικό Hormel Ινστιτούτα Υγείας χορηγεί R37 CA081064, CA120388, ES016548, CA0227501 και το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου Σύμβαση αρ HHSN-261200533001C-NO1-CN-53301. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η κατανάλωση φρούτων και λαχανικών έχει από καιρό πιστεύεται ότι μειώνουν τον κίνδυνο ανάπτυξης διαφόρων τύπων καρκίνων του ανθρώπου [1]. Μια σημαντική κατηγορία ενώσεων μέσα σε τρόφιμα που έχουν αυτές τις δραστηριότητες είναι οι πολυφαινόλες [2]. Οι φαινυλπροπανοειδούς μεταβολικές οδούς των φυτών παράγουν αυτά τα πολυφαινολικών ενώσεων από χιλιάδες δευτερογενών μεταβολιτών των φυτών [3]. Τα φλαβονοειδή είναι η πιο κοινή οικογένεια των πολυφαινολικών ενώσεων με έως 8000 μεμονωμένες ενώσεις που ταυτοποιούνται [4]. Τα φλαβονοειδή που βρέθηκαν στα λαχανικά, τα δημητριακά, τα όσπρια, τα φρούτα και τα ποτά όπως το κρασί, τσάι και καφέ μπορεί να υποδιαιρεθεί σε 14 διαφορετικές κατηγορίες με βάση την χημική δομή. Οι κατηγορίες αυτές περιλαμβάνουν τις χαλκόνες, διυδροχαλκόνες, aurones, φλαβόνες, φλαβονόλες, dihydroflavonols, flavanones, φλαβανόλες, flavandiols, ανθοκυανιδίνες, ισοφλαβονοειδή, biflavonoids και προανθοκυανιδίνες [5].

Η αντικαρκινική δυναμικό της μια ποικιλία από καλά χαρακτηρίζεται φλαβονοειδή έχει τεκμηριωθεί καλά [1]. Ισοφλαβονοειδή, όπως ανθρακινόνες, χαλκόνες, και prenylflavonoids, είναι όλες ικανές να προωθήσουν οιστρογονική δραστικότητα στα θηλαστικά [6]. Έχουν επίσης δειχθεί ότι έχουν αντικαρκινικές ιδιότητες [7]. Genistein, για παράδειγμα, μια σημαντική μέλος της οικογένειας ισοφλαβονοειδές προέρχεται από σόγια [7], ειδικώς αναστέλλει τη δράση της κινάσης τυροσίνης υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), ο οποίος παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και μετασχηματισμού [8]. Νέα ευρήματα συνεχίζουν να αναφερθεί συνδέονται με αυτές τις ενώσεις. Η ρεσβερατρόλη, μια πολυφαινόλη που βρέθηκαν στο κόκκινο κρασί, είναι γνωστό ότι έχουν αντιοξειδωτικές δραστηριότητες καθώς και αντικαρκινικές δραστηριότητες εξηγείται από την αναστολή της κυκλοοξυγενάσης των πρωτεϊνών [9]. Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι η ρεσβερατρόλη μπορεί να καταστείλει λευκοτριενίου Α

4 υδρολάση (LTA

4Η) δραστηριότητα [10], η οποία είναι υπερ-εκφράζεται σε πνεύμονα και καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα [11].

Τα φλαβονοειδή είναι promiscuous σε ότι μπορούν να καταστέλλουν την ανάπτυξη πολλών διαφορετικών τύπων καρκινικών κυττάρων μέσω μιας ποικιλίας μηχανισμών. Αυτή η μη ειδικότητα επιδεινώνεται από το γεγονός ότι χιλιάδες φλαβονοειδή υπάρχουν και ως εκ τούτου η μελέτη τους έχει δώσει μια πολύ πλούσια περιοχή της έρευνας. Μόνο μερικές περιπτώσεις υπολογιστική εργασία εστιάζοντας σε φλαβονοειδή υπάρχουν [12], [13], [14]. Χρησιμοποιώντας συμβατικές μεθόδους για να επιλέξει την καλύτερη μονή ή ομάδα των βέλτιστων χημικών ουσιών για την αναγνώριση ενώσεων που είναι αποτελεσματικές σε σχετικά θεραπεία ή την πρόληψη μιας ασθένειας όπως ο καρκίνος είναι δύσκολη. Υπολογιστική στρατηγικές για τον καθορισμό των στόχων της πρωτεΐνης των φλαβονοειδών δεν έχουν ακόμη λάβει μεγάλη προσοχή. Κατά τα τελευταία 3 χρόνια, το εργαστήριο μας έχει χρησιμοποιήσει υπολογιστικές στρατηγικές που περιλαμβάνουν εικονικό έλεγχο, το σχήμα ομοιότητα-διαλογής, και μοριακή βάση για να εντοπίσει πιθανούς στόχους πρωτεΐνη των φλαβονοειδών και άλλων φυτοχημικών [15]. Αυτές οι υπολογιστικές-based μεθοδολογίες έχουν παράσχει αποτελεσματική και ανέξοδη εργαλεία για να αποκτήσουν περαιτέρω κατανόηση της αντικαρκινικές και θεραπευτικές επιδράσεις που ασκούνται από πολυφαινόλες. Εδώ σας παρουσιάζουμε τη διαδικασία μας για το συνδυασμό αυτών των υπολογιστικών στρατηγικές με τις πειραματικές μεθοδολογίες για την επικύρωση συγκεκριμένων φλαβονοειδών και τους αντίστοιχους στόχους τους σε πρωτεΐνες.

Υλικά και Μέθοδοι

Εικονική Διαλογή

Virtual προσυμπτωματικού ελέγχου είναι η υπολογιστική τεχνική που χρησιμοποιείται στην έρευνα ανακάλυψη φαρμάκων τα τελευταία χρόνια και έχει γίνει ένα σημαντικό βήμα στη διαδικασία ανακάλυψης φαρμάκων. Η προβολή περιλαμβάνει τον εντοπισμό και τη συλλογή των σχετικών χημικών δομών από μεγάλες χημικές βιβλιοθήκες. Οι χημικές ουσίες που εντοπίστηκαν είναι αυτοί που είναι πιθανότερο να δεσμεύονται σε έναν στόχο πρωτεΐνη, τυπικά ένας υποδοχέας πρωτεΐνης που επιλέγεται, χρησιμοποιώντας διάφορα προγράμματα ηλεκτρονικών υπολογιστών ή να προσδιορισθούν πειραματικά. Εικονική προβολή από το μοριακό docking είναι η κύρια υπολογιστική μέθοδο που χρησιμοποιήθηκε στην ανακάλυψη φαρμάκων για την αναγνώριση «χτύπησε» [16]. Η κύρια μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε είναι η δομή που βασίζεται εικονική εξέταση, η οποία περιλαμβάνει βάση σύνδεσης χιλιάδων υποψήφιων συνδετήρων σε ένα στόχο πρωτείνη που ακολουθείται από τη σημείωση της αλληλεπίδρασης δέσμευσης πρωτεΐνης-συνδετήρα για να εκτιμηθεί η ενέργεια δέσμευσης του συνδέτη [17]. Δομή-based εικονική διαλογής απαιτεί την 3D δομή των προσδεμάτων. Ο ψευδάργυρος (δηλαδή, ένα αρκτικόλεξο για «ZINC δεν είναι εμπορική») βάση δεδομένων περιέχει πάνω από 13 εκατομμύρια purchasable ενώσεις σε μορφή σύνδεσης 3D που είναι ελεύθερα διαθέσιμα για την εικονική έλεγχο [18]. Από αυτή την τεράστια βάση δεδομένων, μικρότερες και πιο συγκεκριμένες βιβλιοθήκες υψηλής ποιότητας μπορεί να κατασκευαστεί για στοχευμένη εικονικό έλεγχο [19]. Μια άλλη διαθέσιμη βάση δεδομένων που περιέχει 2D μορφές των μορίων είναι το Εθνικό Ινστιτούτο online βάση δεδομένων PubChem Υγείας περιλαμβάνει πάνω από 27 εκατομμύρια μοναδικούς δομές (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Στο εργαστήριό μας, έχουμε δημιουργήσει μια μικρότερη φλαβονοειδών ένωση βάσης δεδομένων των 2.620 ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων aurones, χαλκόνες, φλαβόνες, flavanones, ισοφλαβόνες, biflavonoids, ανθοκυανιδίνες, διϋδροχαλκόνες και προανθοκυανιδίνες. Αυτά τα φλαβονοειδή ενώσεις συλλέγονται και καταρτίζονται από τη βάση δεδομένων του NCI PubChem χρησιμοποιώντας δομής αναζήτηση βάση. Αυτή η βάση δεδομένων χρησιμοποιήθηκε στην διαλογή πιθανών αναστολέων στόχευση ενός αριθμού σχετίζονται με τον καρκίνο πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένης της ρ90 ριβοσωμική S6 κινάση 2 (RSK2), εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση (Cdk), που ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση κινάση 1 (ΜΕΚ1), του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα υποδοχέα (EGFR) και φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση /πρωτεϊνική κινάση Β (ΡΙ3-Κ /PKB)

Η

(Α) Χημική δομή της kaempferol.? (Β) Χημική δομή της quercetin. (C) Χημική δομή της μυρικετίνη. (D) Χημική δομή του LY294002. (Ε) Χημική δομή της isorhamnetin.

Η

Η /εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάσης Ras (ΕΚΚ) μονοπατιού ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, την ανάπτυξη και την κινητικότητα και την ογκογένεση [20]. RSK2, ένα μέλος της οικογένειας p90RSK, είναι μια άμεση κινάσης υπόστρωμα των ERKs και αποτελεί σημαντικό άμεση τελεστή για μεταγραφική ενεργοποίηση των κατάντη παραγόντων μεταγραφής στόχου. Επιπλέον, RSK2 φέρεται εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη [21] και

c-fos

ανάπτυξη -εξαρτώμενη οστεοσαρκώματος [22]. RSK2 αφθονία πρωτεΐνη είναι αυξημένη σε πολλές ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές και σε διάφορους ανθρώπινους όγκους του δέρματος, συμπεριλαμβανομένων των μελανωμάτων και καρκινώματα πλακωδών κυττάρων [23]. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός ενός εκλεκτικού αναστολέα RSK2 είναι εξαιρετικά σημαντική για τη χημειοπρόληψη ή την ανάπτυξη θεραπευτικών φαρμάκων. Ως εκ τούτου, στο παρόν χρησιμοποιήσαμε RSK2 ως παράδειγμα για να καταδείξει πώς υπολογιστικές στρατηγικές και πειραματικές μεθοδολογίες μπορούν να συνδυαστούν αποτελεσματικά για τον εντοπισμό εκλεκτικοί αναστολείς φλαβονοειδών. Μέχρι σήμερα, ένας αριθμός δυνητικών αναστολέων RSK2 έχουν αναφερθεί, συμπεριλαμβανομένων εριοδικτυόλης [24] και kaempferol [23], [25], [26], δύο φλαβονοειδών ενώσεων και SL0101, μια ένωση που έχει συντεθεί δεν βρέθηκε σε φυτά [27]. Αυτά τα φλαβονοειδή βρίσκονται παντού σε φρούτα και λαχανικά, καθώς και δημοφιλή ποτά, όπως κρασί, τσάι και καφέ και εμφανίζουν αντιοξειδωτικές, αντικαρκινικές και αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις [28].

(Α) Κερσετίνη δεσμεύει κατά τη τσέπη ΑΤΡ RSK2 πιθανότατα σε μια ΑΤΡ-ανταγωνιστικό τρόπο. (Β) RSK2 συνδέεται με κερκετίνη. Ένα προϊόν λύσης παρασκευάζεται από κύτταρα JB6 C41 ή εμπορικώς διαθέσιμων δραστικών RSK2 επωάστηκε με σφαιρίδια Sepharose 4Β-quercetin ή με σφαιρίδια Sepharose 4Β και μόνο, και οι τραβιέται κάτω πρωτεΐνες αναλύθηκαν με κηλίδα Western. (C) Κερσετίνη συνδέεται είτε με το NTD ή του ΚΤΕ της RSK2. Για τον προσδιορισμό του τομέα RSK2 που δεσμεύεται με πρωτεΐνες quercetin, RSK2, όπως υποδεικνύεται, επωάστηκαν με σφαιρίδια Sepharose 4Β-quercetin ή με σφαιρίδια Sepharose 4Β και μόνο. Οι τράβηξε κάτω πρωτεΐνες αναλύθηκαν με κηλίδα Western. (D) Ενεργός RSK2 (10 ng) συνδυάστηκε με GST-NFAT3-261-365 (2 μg), 10 μΜ μη επισημασμένου ΑΤΡ, 10 μθί [γ-

32Ρ] ΑΤΡ, και διάφορες δόσεις quercetin (0-50 μΜ). Ένα

in vitro δοκιμασία κινάσης

διεξήχθη και η

32Ρ-επισημασμένο φωσφορυλιωμένο NFAT3 έγινε ορατή με αυτοραδιογραφία. πυκνότητα μπάντα ποσοτικά με τη χρήση του προγράμματος λογισμικού J εικόνας (ΝΙΗ) και την ένταση μπάντα των ενεργών RSK2 και GST-NFAT3-261-365 (100%) συγκρίθηκε.

Η

Το εργαστήριο μας έχει λυθεί και αναφέρθηκαν οι κρυσταλλικές δομές των C-τερματικών και Ν-τερματικά πεδία κινάσης RSK2 [29], [30]. Το Ν-τερματικό πεδίο κινάσης συνδέθηκε με ΑΝΡ στην θέση πρόσδεσης ΑΤΡ. Έτσι, η δομή αυτή (ΠΠ ID: 3G51) είχε κατεβάσει από το ΠΣΠ Τράπεζας για τις μελέτες εικονικής διαλογής. Οι κρυσταλλικές δομές ή μοντέλα ομολογίας της πρωτεΐνης-στόχου στην οποία θα βρίσκεται ένα μικρό μόριο κατεβάσει από την Πρωτεΐνη Τράπεζας (ΠΠ). Τα νερά, τα μέταλλα, και συνδέτες στη συνέχεια απογυμνώνεται από τη δομή και τα υδρογόνα και τα τέλη άτομο προστίθενται στις δομές που χρησιμοποιούν τη μονάδα παρασκεύασμα πρωτεΐνης στο Maestro v9.2 GUI του Schrödinger. Μια τσέπη δέσμευσης ΑΤΡ με βάση τον τόπο δημιουργήθηκε μέσα σε ένα πλέγμα 30-A

3. Η βάση δεδομένων δομή 2D των φλαβονοειδών μετατράπηκε σε 3D βάση δεδομένων δομής με τη χρήση της μονάδας LigPrep του Schrödinger σουίτα λογισμικού.

Η

Υψηλή απόδοση εικονικής διαλογής (HTVS) και σύνδεσης εκτελούνται συνήθως πρώτα, επειδή προορίζονται για την ταχεία διαλογή μεγάλων αριθμών συνδετών που ακολουθείται από πρότυπο και επιπλέον ακρίβεια (SP και XP) σύνδεσης. Εδώ, για φλαβονοειδών βάση δεδομένων μας, μόνο SP και XP σύνδεσης εκτελέστηκαν λόγω του μικρότερου αριθμού των συνδετήρων που εμπλέκονται. Όλες οι ενώσεις αγκυροβολημένο ευελιξία και μια λίστα των ενώσεων top-20 δημιουργήθηκε και οργανώθηκε με βάση την βαθμολογία σύνδεσης (δηλαδή, χαμηλότερη βαθμολογία είναι καλύτερο). Μια λίστα με τα top-6 κατετάγη ενώσεις συντάχθηκε (Πίνακας 1) και kaempferol (Εικ. 1Α) και quercetin (Εικ. 1Β) έχουν αγοραστεί για πειραματική επαλήθευση. Καμπφερόλη και κερκετίνη βρίσκονται φυσικά φλαβονοειδή στα μήλα, τα κρεμμύδια και άλλα φυτά.

Η

Shape-Ομοιότητα μέθοδο διαλογής

Η θεωρία του προσυμπτωματικού ελέγχου σχήματος-ομοιότητα προέρχεται από την ιδέα ότι τα μόρια που έχουν παρόμοια σχήματα και ηλεκτροστατική δυνατότητες θα μπορούσαν να εμφανίζουν ανάλογη βιολογική δραστικότητα. Η μέθοδος περιλαμβάνει εξέταση των ατομιστικής και χωρική χαρακτηριστικά του μορίου στόχου. Οι φαρμακοφόρο και φυσικά χαρακτηριστικά του μορίου ποσοτικώς σε σύγκριση με μια βιβλιοθήκη ενώσεων. Κατά την αναζήτηση για πιθανές πρωτεΐνες-στόχους, η βιβλιοθήκη ένωση που χρησιμοποιείται αποτελείται από κρυσταλλώνεται συνδέτες που εξάγεται από την πιο πρόσφατη έκδοση του προσχεδίου του προϋπολογισμού [31]. Η διαμόρφωση συνδετήρα σε κρυσταλλική δομή χρησιμοποιείται επειδή τα άτομα προσανατολίζονται με έναν τρόπο βελτιστοποιείται για σύνδεση με την πρωτεΐνη. Κάθε διαθέσιμη βάση δεδομένων μπορεί να χρησιμοποιηθεί όταν ψάχνουν για παρόμοιες ενώσεις.

(Α) isorhamnetin συνδέεται με ένα ΑΤΡ-noncompetitive τσέπη του ΜΕΚ1. Το πλαίσιο δείχνει μία διευρυμένη άποψη. Οι δεσμοί υδρογόνου που σχηματίζονται μεταξύ isorhamnetin και τη σπονδυλική στήλη του ΜΕΚ1 (Val127 στη θέση ΑΤΡ-noncompetitive πρόσδεσης και Ser212 στο βρόχο ενεργοποίησης). διάγραμμα αλληλεπίδρασης (Β) Ligand του ΜΕΚ1 και isorhamnetin συγκρότημα. Τα υπολείμματα αντιπροσωπεύονται ως χρωματιστές σφαίρες, επισημαίνονται με το όνομα και τον αριθμό του καταλοίπου του. Τα χρώματα δείχνουν τον τύπο καταλοίπου (πράσινο = υδρόφοβο? Μπλε = πολική). Το στερεό ροζ γραμμή δείχνει το δεσμό υδρογόνου μεταξύ του συνδέτη και του υποδοχέα. Οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις που σχηματίζεται με την πλευρική αλυσίδα σε Ile99, Phe129, Ile141, Phe209 και Leu118.

Η

Η ΦΑΣΗ [32] ενότητα του πακέτου μοριακής μοντελοποίησης λογισμικού Schrödinger είναι ένα πρόγραμμα που μπορεί να εκτελέσει αυτό το είδος του σχήματος -similarity αναζήτηση [33]. Οι πληροφορίες τύπος ατόμου περιλαμβάνεται για την εξέταση της όχι μόνο ομοιότητα σχήμα, αλλά και να ευθυγραμμίσει τα πιθανά σημεία φαρμακοφόρο μεταξύ των ερωτημάτων και των στόχων. Η οριακή τιμή που θα χρησιμοποιηθεί για τα αποτελέσματα παίρνει την κορυφή ευθυγραμμισμένη δομή για κάθε μόριο επέστρεψε και όλα τα διαμορφομερή που διαθέτουν συντελεστή ομοιότητας Tanimoto κάτω από 0,7 διαγραφεί [34], [35]. Το μικρότερο φλαβονοειδών ένωση βάσης δεδομένων που δημιουργήσαμε και την τελευταία έκδοση του προσχεδίου του προϋπολογισμού, το οποίο περιέχει περισσότερες από 500.000 πρωτεϊνικές δομές σε σύμπλοκο με συνδετήρες χρησιμοποιήθηκαν για τη διαλογή σχήμα-ομοιότητα. Έχουμε δημιουργήσει επίσης μια ειδική βάση δεδομένων κινάσης περίπου 4.000 δομές σε σύμπλοκο με συνδέτες που συλλέξαμε από το προσχέδιο προϋπολογισμού για τη διαλογή κινάση στόχους ξεχωριστά.

προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι μυρικετίνη (Εικ. 1Γ), ένα φλαβονοειδές που βρίσκεται σε πολλά σταφύλια , μούρα, φρούτα, λαχανικά, βότανα, καθώς και άλλα φυτά, και μία από τις φαινολικές ενώσεις που υπάρχουν στο κόκκινο κρασί, εμφανίζει ισχυρή αντικαρκινική και chemopreventive επιδράσεις, ιδιαίτερα σε UVB επαγόμενη καρκίνο του δέρματος [36], αλλά μοριακοί μηχανισμοί και οι στόχοι της είναι ασαφείς. Έτσι, για τον εντοπισμό εκτός στόχου πρωτεΐνη που επηρεάζονται από διαλογή μυρικετίνη, το σχήμα-ομοιότητα πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων συνδέτη ΠΣΠ και ειδική βάση δεδομένων κινάσης μας.

Επιχειρήσαμε επίσης για την ταυτοποίηση νέων αναστολέων στόχευσης ΡΙ3-Κ, η οποία είναι μια πασίγνωστες κινάσης εμπλέκονται σε κυτταρικές λειτουργίες όπως η ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, την κινητικότητα, την επιβίωση και ενδοκυτταρική διακίνηση, όλα εκ των οποίων σχετίζονται με την ανάπτυξη του καρκίνου. Ουορτμανίνη και LY294002 είναι ευρεία αναστολείς που στοχεύουν σε όλα τα μέλη της οικογένειας PI3-K. LY294002 (Εικ. 1 D) είναι ένα παράγωγο μορφολίνης του quercetin και παρόλο IC

του 50 είναι περίπου 500 φορές υψηλότερη από εκείνη του ουορτμαννίνη, εξακολουθεί να χρησιμοποιείται ευρέως σε κυτταρική βιολογία ως ειδικός αναστολέας ΡΙ3-Κ, λόγω της σταθερότητας του σε διάλυμα [37]. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται η δομή της LY294002 για τη διεξαγωγή της εξέτασης για δυνητικούς αναστολείς ΡΙ3-Κ σε φλαβονοειδή βάση δεδομένων μας χρησιμοποιώντας τη μονάδα φάση του Suite Schrödinger 2011. Για να εκτελέσετε την προβολή, μυρικετίνη και LY294002 πρώτα παρασκευάζονται ξεχωριστά χρησιμοποιώντας τη μονάδα LigPrep του Schrödinger Suite 2011 κάτω από το πεδίο ισχύος OPLS_2005 και καθορίζοντας τιμή του pH 7,0. Στη συνέχεια, διαλογή διαμορφώνουν-ομοιότητα διεξήχθη χρησιμοποιώντας ΦΑΣΗ.

Μοριακής Docking Μέθοδος

Μοριακή βάση σύνδεσης έχει γίνει ένα πρότυπο εργαλείο στην υπολογιστική βιολογία για την πρόβλεψη της δέσμευσης προσανατολισμό των υποψήφιων φαρμάκων μικρού μορίου με τους στόχους τους σε πρωτεΐνες προκειμένου να προβλέψουμε την συγγένεια και δραστικότητα του μικρού μορίου. Έτσι, η μοριακή βάση για διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον ορθολογικό σχεδιασμό των φαρμάκων. GLIDE από το Schrödinger Suite 2011 [38] είναι ένα από τα προγράμματα που χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο μας για να εκτελέσει σύνδεσης.

Τα διαφορετικά πρωτόκολλα για ελλιμενισμό επιχείρησε πριν από τον προσδιορισμό της σωστής σύνολο των παραμέτρων που πρέπει να χρησιμοποιούνται για ελλιμενισμό. Η σωστή εκ νέου σύνδεσης του συνδέτη που κρυσταλλώθηκε με την πρωτεΐνη στόχο τυπικά χρησιμοποιείται ως επικύρωση των επιλεγμένων παραμέτρων. Όταν περισσότερα από ένα κρυσταλλική δομή μιας πρωτεΐνης-στόχου είναι διαθέσιμο, cross-docking εκτελείται για να καθοριστεί ποια κρυσταλλική δομή είναι η πιο κατάλληλη για σύνδεση [39].

Στο εργαστήριο μας, είχαμε βρει ότι isorhamnetin (Σχ. 1Ε), ένα Ξ-μεθυλιωμένο flavonol σε φυτικά φαρμακευτικά φυτά, όπως το κόκκινο γογγύλι, χρυσόβεργα, φύλλα μουστάρδα και το ακαθάριστο

Hippophaer hamnoides L.,

θα μπορούσε να αναστείλει τη δράση της κινάσης της ΜΕΚ1 ή ΡΙ3-Κ και η αναστολή οφειλόταν να isorhamnetin της άμεσης δέσμευσης με αυτές τις κινάσες [40]. Μοριακή βάση σύνδεσης χρησιμοποιήθηκε για να μελετήσει περαιτέρω τη δέσμευση της isorhamnetin με ΜΕΚ1. Πρώτα μια δομή ακτίνων Χ του ανθρώπινου ΜΕΚ1 σε ένα συγκρότημα με συνδετήρα και MgATP (ΠΣΠ 1S9J) με ανάλυση 2.4 Α κατεβάσει από το προσχέδιο προϋπολογισμού. Η πρωτεΐνη παρασκευάστηκε για την προσάρτηση χρησιμοποιώντας την πρωτεΐνη Παρασκευή Wizard. Όλες οι κρυσταλλογραφικές ύδατα διαγράφηκαν και ένα πλέγμα 30-Α

3 δημιουργήθηκε με βάση την ΑΤΡ noncompetitive συνδέτη (ΒΒΜ) θέση σύνδεσης του υποδοχέα της πρωτεΐνης. MacroModel χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή και ενεργειακά ελαχιστοποίηση isorhamnetin για να δημιουργήσει την πιο δραστήρια ευνοϊκή διαμόρφωση που απαιτείται για τις μελέτες σύνδεσης.

Πολλές τυποποιημένες διαδικασίες που περιλαμβάνονται σε πρωτόκολλα GLIDE σύνδεσης του Schrödinger εκτελέστηκαν. Διαδικασίες που περιλαμβάνονται σύνδεσης με το πρότυπο ακριβείας (SP) ή επιπλέον ακριβείας (XP) σε GLIDE, καθώς και ο τρόπος με μεγαλύτερη ένταση CPU Induced-Fit σύνδεσης (IFD) με τις προεπιλεγμένες παραμέτρους διεξήχθησαν με SP και XP σύνδεσης. Όλες αυτές οι διαδικασίες σύνδεσης επιτρέπεται ευελιξία σύνδεσης συνδετήρα και ένα σύνολο 20 κορυφαία δομές αναλύθηκαν με τη μέθοδο της IFD.

Αποτελέσματα

Εικονική Διαλογή

Με βάση τα αποτελέσματά μας εικονικής διαλογής για RSK2, κερκετίνη και kaempferol δεσμευτικά αποτελέσματα από -9,40 kcal /mol και -8,86 kcal /mol, αντίστοιχα, με RSK2 (Πίνακας 1). Αυτά τα αποτελέσματα είναι μια πολύ καλή ένδειξη της δέσμευσης σε σύγκριση με -7,73 kcal /mol για SL0101, ένα πολύ γνωστό αναστολέα RSK2. μοντέλο σύνδεσης μας δείχνει δεσμευτική quercetin σε ΑΤΡ-ανταγωνιστικό τρόπο εντός του χώρου σχηματισμού ζωνών ΑΤΡ του RSK2 (Εικ. 2Α), υποδεικνύοντας ότι η κερκετίνη μπορεί επίσης να είναι ένας πιθανός αναστολέας του RSK2. Να εξετάσει την υπόθεσή μας, έχουμε συζευγμένο quercetin με χάντρες Sepharose 4Β και πραγματοποίησε

in vitro

δοκιμασία pull-down χρησιμοποιώντας ένα ολόκληρο λύμα κυττάρων ή ενεργό πρωτεΐνη RSK2 (200 ng? Εικ. 2Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η πρωτεΐνη RSK2 δεσμεύεται με Sepharose 4Β σφαιρίδια-quercetin, αλλά όχι με σφαιρίδια Sepharose 4Β μόνο (Σχ. 2Β). Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε μια pull-down δοκιμασίας με σφαιρίδια Sepharose 4Β-κερκετίνη και διάφορα βακτηριακά εξέφρασε θραύσματα πρωτεϊνών RSK2 His-tagged, συμπεριλαμβανομένων His-RSK2-1-740, His-RSK2-1-373, His-RSK2-328- 740, και His-RSK2-399-740. υποδεικνύεται αποτελέσματα κηλίδος Western ότι τόσο η NTD και CTD του RSK2 δεσμεύονται με σφαιρίδια Sepharose 4Β-quercetin (Σχ. 2C). Για να επιβεβαιώσετε τα αποτελέσματα της εικονικής διαλογής που προσδιορίζονται κερκετίνη ως δυνητικός αναστολέας RSK2, πραγματοποιήσαμε μια

in vitro

δοκιμασία κινάσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η βαλανοκετόνη ανέστειλαν δραστικότητα RSK2 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 2D). Χρησιμοποιήσαμε προηγουμένως

in vitro

δοκιμασία κινάσης, μια δοκιμασία μετασχηματισμού των κυττάρων αγκύρωση-ανεξάρτητη και μία δοκιμασία pull-down με Sepharose χάντρες 4Β-kaempferol να δείξει ότι kaempferol συνδέεται με το NTD της RSK2 και αναστέλλει τη δράση RSK2

in vitro

και

ex vivo

[23], [26], [31].

Shape-Ομοιότητα Screening.

στη μελέτη μας, το σχήμα -similarity διαλογή πραγματοποιήθηκε με χρήση της ενότητας ΦΑΣΗ Schrödinger για να εξετάσει τη βάση δεδομένων αποτελείται από συμπλέγματα πρωτεϊνών με συνδέτες και την ειδική βάση δεδομένων της κινάσης. Μυρικετίνη, ένα φλαβονοειδές που βρίσκεται στα σταφύλια, τα μούρα, φρούτα, λαχανικά, βότανα, καθώς και άλλα φυτά, και ένα φαινολικό ενώσεις που υπάρχουν στο κόκκινο κρασί, προσδιορίστηκε να στοχεύσει πολλούς πιθανούς κινάσες (Πίνακας 2). Τα δεδομένα δείχνουν έξι διαφορετικές σύμπλοκα κινάσης /συνδετήρα με μέση βαθμολογία του σχήματος ομοιότητα με μυρικετίνη μεγαλύτερη από 0,7. Ο συνδέτης με τη μεγαλύτερη ομοιότητα προς μυρικετίνη είναι QUE ή κερκετίνη (Σχήμα 1Β)., Η οποία είναι βέβαιο με Pim-1 (ΠΠ ID: 2O3P). Το σκορ ομοιότητας είναι 0.90 και η κερκετίνη είναι ένα αναφερόμενη αναστολέας της Pim-1 [41]. Συνολικά 8 Pim-1 δομές «χτύπημα» από μυρικετίνη με σκορ ομοιότητας μεγαλύτερη από 0,7 (μόνο οι 3 πρώτες επιτυχίες φαίνεται στον Πίνακα 2). Σχεδόν όλα τα «χτύπησε» συνδετήρες αναφερθεί αναστολείς των στοχευμένων κινάσης τους και να έχουν ένα σκορ ομοιότητα μεγαλύτερη από 0,7. Έτσι, πιστεύουμε ότι αυτές οι συνδεδεμένες κινάσες μπορεί να είναι πιθανοί στόχοι μυρικετίνη και ότι μυρικετίνη μπορούσε δυνητικά αναστέλλουν τη δράση τους. προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι μυρικετίνη θα μπορούσε να αναστείλει την δραστικότητα του ΡΙ3-Κ, ΜΕΚ1 και Raf [36], [42], [43].

Για να βρείτε δυναμικό φλαβονοειδή αναστολείς της ΡΙ3-Κ, LY294002, ευρεία αναστολέας της ΡΙ3-Κ, επιλέχθηκε να χρησιμοποιηθεί ως η δομή ερώτημα και το σχήμα-ομοιότητα διαλογή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των φλαβονοειδών βάση δεδομένων μας και τη μονάδα φάση. συντελεστές Ομοιότητα παρακάτω 0,75 διαγράφηκαν και 6 από τις κορυφαίες υποψήφιες ενώσεις παρατίθενται (Πίνακας 3). Έχουμε επικυρωθεί προηγουμένως μυρικετίνη [42] και isorhamnetin [40] ως άμεσοι αναστολείς της ΡΙ3-Κ.

Μοριακή Βάση σύνδεσης

Για να εξετάσει το μοριακό μηχανισμό της αναστολής της ΜΕΚ 1 από isorhamnetin και να κατανοήσουν πώς isorhamnetin αλληλεπιδρά με ΜΕΚ1, εμείς αγκυροβολημένο isorhamnetin

in silico

στο ATP-noncompetitive δεσμευτική τσέπη του ΜΕΚ1 χρησιμοποιώντας διάφορα πρωτόκολλα στην Schrödinger σουίτα λογισμικού. Μελετώντας όλα τα μοντέλα επέστρεψε, βρήκαμε ότι isorhamnetin σχηματίζονται κάποιες ευνοϊκές συνδέσεις και ελλιμενίζεται όμορφα μέσα στην περιοχή MEK1 ΑΤΡ-noncompetitive δέσμευσης. Ορισμένες σημαντικές δεσμοί υδρογόνου σχηματίζονται μεταξύ isorhamnetin και τη σπονδυλική στήλη του ΜΕΚ1, συμπεριλαμβανομένης Val127 στη θέση ΑΤΡ-noncompetitive πρόσδεσης και Ser212 στο βρόχο ενεργοποίησης. Isorhamnetin σχηματίζονται επίσης υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με την πλευρική αλυσίδα στο Ile99, Phe129, Ile141, Phe209 και Leu118 (Σχ. 3Α, Β). Αυτά τα αποτελέσματα θα καθιστούσε ΜΕΚ1 καταλυτικά ανενεργό σταθεροποιώντας την ανενεργό διαμόρφωση του βρόχου ενεργοποίησης. Σημειώστε ότι κάποιες εικόνες δημιουργήθηκαν με το πρόγραμμα UCSF Χίμαιρα [44].

Συζήτηση

Χιλιάδες επιμέρους φλαβονοειδή υπάρχουν σε διάφορα λαχανικά, φρούτα και άλλα φυτά. Φλαβονοειδή, όπως οι κατεχίνες βρίσκονται σε φράουλες και πράσινο και μαύρο τσάι, kaempferol από τα λαχανάκια Βρυξελλών και τα μήλα, και quercetin από τα φασόλια, τα κρεμμύδια και τα μήλα, πιστεύεται ότι ασκούν αντιφλεγμονώδη και αντικαρκινική δραστηριότητα. Για παράδειγμα, όλες αυτές οι ενώσεις φέρεται να μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του πνεύμονα [45]. Τα φλαβονοειδή αναστέλλουν πολλούς διαφορετικούς τύπους καρκίνου μέσω μιας ποικιλίας μηχανισμών και χιλιάδες των φλαβονοειδών υπάρχουν, γεγονός που καθιστά την διαλογή πιθανών αντικαρκινικά αποτελέσματα και την ταυτοποίηση των ειδικών στόχων τους πρωτεΐνη εξαιρετικά προκλητική χρησιμοποιώντας συμβατικές προσεγγίσεις τους. Ευτυχώς, η ανάπτυξη των υπολογιστικών τεχνικών προσομοίωσης και άλλες υπολογιστικές στρατηγικές έχει απλουστευθεί και να εκσυγχρονιστεί η συνολική διαδικασία. Εικονική διαλογή μπορεί εύκολα να δημιουργήσει τα αποτελέσματα από όλα τα φλαβονοειδή που μπορούν να δεσμεύονται με και να επηρεάσει τη δραστικότητα ενός συγκεκριμένου στόχου πρωτεΐνης. Shape-διαλογής μπορεί να βοηθήσει στην εξεύρεση πιθανών «εκτός στόχου» πρωτεΐνες ενός συγκεκριμένου φλαβονοειδών ένωση. Μέθοδοι Μοριακής σύνδεσης μπορεί να παρέχει μια καλύτερη ένδειξη για το πόσο μια ένωση αλληλεπιδρά με στόχο πρωτεΐνη και να επηρεάσει τη δραστικότητα του στοχευόμενου πρωτεΐνης. Αυτές οι τρεις διαδικασίες μπορεί να οδηγήσει στην ταχεία ανακάλυψη πιθανών ενώσεων μολύβδου για αντικαρκινική θεραπεία και χημειοπροφύλαξη.

Τα τελευταία χρόνια, με τη βοήθεια του Blue Gene /L [46], [47] υπερυπολογιστής από την IBM, μας εργαστήριο έχει μελετήσει την αποτελεσματικότητα και τους μηχανισμούς των διαφόρων μολύβδου φλαβονοειδών ενώσεων στη χημειοπροφύλαξη και θεραπεία του καρκίνου με τη χρήση υπολογιστικών στρατηγικών προσομοίωσης. Αυτές οι ενώσεις περιλαμβάνουν kaempferol [23], isorhamnetin [40], 6,7,4′-τριυδροξυισοφλαβόνη [48], εριοδικτυόλης [24], 7,3 ‘, 4’-τριυδροξυισοφλαβόνη [49], quercetin [50], EGCG [ ,,,0],51], [6] -gingerol [52], μυρικετίνη [36], φαινολικές καφέ φυτοχημικά [53], το καφεϊκό οξύ [54] και δελφινιδίνης [55]. Όλες αυτές οι ενώσεις ασκούν ανασταλτική δράση τους σε συγκεκριμένες πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων RSK2, PI-3K, ΜΕΚ1, Pin-1 και Fyn, τα οποία είναι άκρως εκφράζονται ή υπερενεργοποιημένος σε ορισμένες μορφές καρκίνου, όπως του δέρματος και του παχέος εντέρου.

Για την αναγνώριση οι πιθανοί στόχοι μιας ποικιλίας φλαβονοειδών ενώσεων και να μελετήσει προσεκτικά το μηχανισμό δράσης τους, δημιουργήσαμε ένα φλαβονοειδές βάση δεδομένων του 2620 ενώσεις. Συνεχίζουμε για μεγέθυνση της βάσης δεδομένων με την προσθήκη όλο και περισσότερα φλαβονοειδή. Με βάση αυτή την βάση δεδομένων, έχουμε λάβει τα αποτελέσματα για κάθε ένωση και εν δυνάμει πρωτεΐνες off-στόχο με τη χρήση διαλογής σχήμα-ομοιότητα. Έχουμε περισσότερα από 4,1 εκατομμύρια αρχεία για όλα τα είδη των πρωτεϊνικών στόχων και 374.000 αρχεία για τους συγκεκριμένους στόχους της κινάσης. Αυτά τα αποτελέσματα μπορούν εύκολα να ερωτηθούν από την ένωση ταυτότητας ή με βάση τον τύπο της πρωτεΐνης. Εχουμε επίσης σε διαλογή για ενώσεις μολύβδου στόχευση αρκετών ειδικών στόχων που σχετίζονται με την κινάση καρκίνο του δέρματος, καρκίνο του παχέος εντέρου και του καρκίνου του πνεύμονα χρήση εικονικών διαλογής και θα χρησιμοποιήσει τα αποτελέσματα αυτά για περαιτέρω μηχανιστικές μελέτες σε χημειοπροφύλαξη και θεραπεία του καρκίνου.