Αφηρημένο

Στόχος

Η θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) παραμένει μια κλινική πρόκληση, καθώς πάνω από το 15% των ασθενών που είναι ανθεκτικοί σε 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) -με βάση χημειοθεραπευτικούς σχήματα, και τα ποσοστά υποτροπής του όγκου μπορεί να είναι τόσο υψηλή όσο 50-60%. Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (CSC) είναι ικανά να επιβιώνουν συμβατικών χημειοθεραπειών που επιτρέπει την αναγέννηση του αρχικού όγκων. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε την αποτελεσματικότητα της 5-FU και πολυφαινόλες φυτών (κουρκουμίνη), στο πλαίσιο της επιδιόρθωσης του DNA (MMR) την κατάσταση και τη δραστηριότητα CSC σε 3D καλλιέργειες κυττάρων CRC.

Μέθοδοι

Υψηλή πυκνότητα 3D καλλιέργειες CRC κυτταρικές σειρές HCT116, HCT116 + CH3 (συμπληρώνεται με χρωμόσωμα 3) και τα αντίστοιχα ισογονιδιακό 5-FU-χημειο-ανθεκτικού παράγωγο κλώνους τους (HCT116R, HCT116 + ch3R) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 5-FU είτε χωρίς είτε με κουρκουμίνη σε χρόνου και δοσο-εξαρτώμενη δοκιμασίες.

Αποτελέσματα

προ-θεραπεία με κουρκουμίνη ενίσχυσε σημαντικά την επίδραση της 5-FU σε κύτταρα HCT116R και HCR116 + ch3R, σε αντίθεση με 5-FU μόνη της ως αποδεικνύεται από την αυξημένη αποσύνθεση του colonospheres, η ενισχυμένη απόπτωση και αναστέλλοντας την ανάπτυξή τους. Η κουρκουμίνη και /ή 5-FU επηρεάζεται έντονα MMR-ανεπαρκή κύτταρα CRC σε καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας, ωστόσο MMR-ικανοί κύτταρα CRC ήταν πιο ευαίσθητα. Αυτές οι επιδράσεις της κουρκουμίνης στην ενίσχυση χημειοευαισθησία προς 5-FU υποστηρίχθηκαν περαιτέρω από την ικανότητά της να καταστέλλει αποτελεσματικά CSC πισίνες, όπως αποδεικνύεται από μείωση του αριθμού των δεικτών CSC θετικών κυττάρων, τονίζοντας την καταλληλότητα αυτού του μοντέλου 3D καλλιέργεια για την αξιολόγηση έκφρασης δείκτη CSC σε ένα κοντά στο

vivo

ρύθμιση.

Συμπέρασμα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν νέα και προγενέστερα μη αναγνωρισμένων συνεπειών της κουρκουμίνης στην ενίσχυση χημειοευαισθητοποίηση με 5-FU χημειοθεραπεία με βάση το DNA MMR-ανεπάρκεια και χημειο τους ανθεκτικών ομολόγους με στόχο την CSC υπο-πληθυσμού. (246 λέξεις περίληψη)

Παράθεση:. Shakibaei M, Buhrmann C, Kraehe P, Shayan P, Lueders C, Goel Α (2014) Η κουρκουμίνη Chemosensitizes 5-φθοριοουρακίλη Ανθεκτικό MMR-Ελλιπή τα Ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου κόλου σε Υψηλή καλλιέργειες πυκνότητας. PLoS ONE 9 (1): e85397. doi: 10.1371 /journal.pone.0085397

Επιμέλεια: Gautam Sethi, Yong Loo Lin Ιατρική Σχολή, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σιγκαπούρης, Σιγκαπούρη

Ελήφθη: 25 Οκτώβρη του 2013? Αποδεκτές: 27 Νοέμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 3 Ιανουαρίου του 2014

Copyright: © 2014 Shakibaei et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο συχνή. καρκίνου που επηρεάζει άνδρες και γυναίκες εξίσου σε όλο τον κόσμο [1]. Οι τρέχουσες θεραπείες για την αντιμετώπιση του ορθοκολικού καρκίνου περιλαμβάνουν κυρίως χημειοθεραπείες 5-φθοριοουρακίλη με βάση τα οποία χρησιμοποιούνται μεμονωμένα ή σε συνδυασμό με οξαλιπλατίνη (FOLFOX) ή αντι-αγγειογόνοι παράγοντες, και /ή αντι-επιδερμικού αυξητικού παράγοντα παράγοντες [2]. Αν και τα ποσοστά εμφάνισης καρκίνου του παχέος εντέρου έχουν μειωθεί κάπως, οι τρέχουσες θεραπείες που σχετίζονται με σημαντικές παρενέργειες, υψηλό κόστος και τα ποσοστά υποτροπής άνω του 50%, κυρίως λόγω της ανάπτυξης των κεκτημένων χημειοαντίσταση να συνηθισμένα χημειοθεραπευτικά [3], [4]. Οι περιορισμοί αυτοί υπογραμμίζουν την επιτακτική και επείγουσα ανάγκη για τον εντοπισμό και την ανάπτυξη νέων στρατηγικών και ασφαλής θεραπεία που μπορεί να βοηθήσει να ξεπεραστούν χημειοαντίσταση και την ενίσχυση του όγκου κυτταρική απόκριση στα φάρμακα κατά των όγκων.

Καρκινογένεση πιστεύεται ότι είναι μια διαδικασία πολλαπλών σταδίων που προκύπτει από μια κλιμακωτή συσσώρευση γενετικών αλλοιώσεων σε διάφορα γονίδια (π.χ. τα γονίδια που σχετίζονται μετάστασης, ογκογονίδια, κατασταλτικά όγκου γονίδια) που οδηγεί σε προοδευτική μετατροπή των υγιών κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα [5], [6]. Είναι τώρα περισσότερο αναγνωρίζεται, ότι επιγενετικές μεταβολές, όπως παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA, οι τροποποιήσεις των ιστονών, χρωμόσωμα αναδιαμόρφωση και βλάβες στο σύστημα επιδιόρθωσης αναντιστοιχία (MMR), επίσης να επηρεάσουν σημαντικά την ανάπτυξη CRC, [5], [7]. Βλάβη στο MMR σύστημα προκαλεί γενετική αστάθεια, καθώς είναι σημαντικό για την απόδειξη σφάλματα ανάγνωσης σύνθεση DNA κατά την αντιγραφή, οδηγώντας σε αλλαγμένη φαινοτύπους κυττάρων, ενισχυμένη επιδεκτικότητα για νεοπλασματικό μετασχηματισμό και τη διευκόλυνση της ανάπτυξης των χημειο-ανθεκτικά κύτταρα [8], [9].

κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης και της διάδοσης των όγκων συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου, του καρκίνου κύτταρα απαιτούν ικανότητα αυτο-ανανέωση, παρόμοια με εκείνη που παρουσιάζεται από τα βλαστικά κύτταρα. Είναι πλέον ευρέως αποδεκτό ότι παθογένεση του καρκίνου στους περισσότερους όγκους, συμπεριλαμβανομένων CRC, οδηγείται από ένα υποσύνολο των κυττάρων του όγκου που εμφανίζουν βλαστικά χαρακτηριστικά των κυττάρων είναι παρόμοια με το φυσιολογικό βλαστικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των δυνατοτήτων αυτο-ανανέωση και πλειοδυναμία [10], [11] και ότι Αυτά τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC) έχουν τη δυνατότητα να εισβάλουν και να σχηματίσει μακρινές μεταστάσεις [12], [13], [14]. Στο παχύ έντερο, αυτά του παχέος CSC παρεκκλίνοντα διαφοροποιούν την παραγωγή ενός μεγαλύτερο μέρος των καρκινικών κυττάρων με το μεγαλύτερο κλάσμα αποτελείται από περισσότερα διαφοροποιημένα κύτταρα και ένα μικρό κλάσμα των βλαστικών κυττάρων, τα οποία τελικά θα αντικαταστήσει τα υγιή του παχέος βλαστοκυττάρων και το σύνολο του κόλου κρύπτη αποικίζεται από στέλεχος του καρκίνου κύτταρα και τους απογόνους τους [10]. Μια σειρά ειδικών δεικτών έχουν ταυτοποιηθεί για παχέος CSC, συμπεριλαμβανομένων των CD133

+, CD 44

+, CD166

+ και ΑΙ_ϋΗ1

+ [15], [16]. Υποτροπή των όγκων μετά από φαινομενικά επιτυχημένη χημειοθεραπεία πιστεύεται ότι είναι λόγω της χημειο-ανθεκτικά ΚΕΠ που διαφεύγουν θάνατο από χημειοθεραπευτικά φάρμακα [17]. Ως εκ τούτου, τα νέα θεραπευτικά μέσα που μπορούν να στοχεύσουν επιτυχώς ΚΕΠ, είναι πολύ πιθανόν η πιο πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική στη συνάντηση αυτή η τεράστια κλινική πρόκληση.

Οι αναδυόμενες βιβλιογραφία δείχνει ότι πολλά διαιτητικά συστατικά μπορεί να ρυθμίσει άμεσα ή έμμεσα φλεγμονώδεις αντιδράσεις στο έντερο από ρύθμιση της λειτουργίας του εντερικού φραγμού [18]. Επιπλέον, αρκετές φυσικά διαιτητικές ενώσεις έχουν δειχθεί ως αντικαρκινικών θεραπευτικών παραγόντων [19], [20], [21], [22]. Πράγματι Υπάρχουν ενδείξεις ότι η συμβατική χημειοθεραπεία στο CRC ωφελεί σημαντικά μέσω συνδυαστικών θεραπειών με μερικά από τα εν λόγω φυσικά διαιτητικές πολυφαινόλες [5], [23], [24]. Ένα τέτοιο βοτανική, κουρκουμίνη (diferuloylmethane), ένα κίτρινο μπαχαρικό που προέρχεται από τα ριζώματα του

Curcuma longa

, έχει μια μακρά παράδοση ως αντι-φλεγμονώδη παράγοντα στην παραδοσιακή ινδική Ayurvedic σύστημα της ιατρικής. Επιπλέον, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η κουρκουμίνη δρα ως ισχυρός χημείο- και ραδιοευαισθητοποιητής σε πολλαπλές ανθρώπινους καρκίνους [25], [26] και μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων του συστήματος MMR ελλειμματικά κύτταρα καρκίνου κόλου [27], [28]. Σε προηγούμενη μελέτη, δείξαμε ότι η κουρκουμίνη αύξησε την χημειοευαισθησία του 5-FU σε ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές σειρές με τη στόχευση ΝΡ-κΒ, Src και NF-κΒ-εξαρτώμενο ρυθμιζόμενο γονίδιο προϊόντων [5]. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι η στόχευση του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων με 5-FU και οξαλιπλατίνη (FOLFOX) σε συνδυασμό με κουρκουμίνη εξασθενημένα EGF-R, IGF-1R και Akt μονοπάτι σηματοδότησης και αξιοσημείωτα μειωμένη καρκίνος δείκτη βλαστικών κυττάρων θετικών κυττάρων και προκάλεσε αποσύνθεση του colonospheres [ ,,,0],23], [24].

πρόσφατα δείξαμε ότι η συνδυασμένη θεραπεία της κουρκουμίνης με 5-FU προκαλεί περισσότερο σημαντική κυτταροτοξικότητα σε DNA MMR ανεπάρκεια καλλιέργειες μονοστοιβάδας CRC, σε σύγκριση με κάθε παράγοντα χωριστά [5]. Κατά συνέπεια, ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί κατά πόσο κουρκουμίνη μόνο του ή σε συνδυασμό με 5-FU μπορεί να επηρεάσει DNA MMR-ανεπαρκή κύτταρα καρκίνου κόλου που είναι εγγενώς ανθεκτικά στην 5-FU στην διαμόρφωση colonosphere σχηματισμό και δραστικότητα CSC σε 3D καλλιέργειες.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και κυττάρων Πολιτισμού

Ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου (HCT116? MMR ανεπάρκεια) ελήφθησαν από την Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών κυττάρων (Salisbury, UK). HCT116 + CH3, είναι μια MMR-ικανός κυτταρική γραμμή, η οποία δημιουργήθηκε στο εργαστήριο μας από την σταθερή επιμόλυνση του χρωμοσώματος 3 που φέρουν ένα αντίγραφο αγρίου τύπου του

hMLH1

γονιδίου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Δημιουργήσαμε επίσης 5-FU ανθεκτικά παράγωγα αυτών των κυτταρικών σειρών, που αναφέρονται ως HCT116R και HCT116 + ch3R αντίστοιχα, που δημιουργήθηκαν από επαναλαμβανόμενη θεραπεία των γονικών κυτταρικών σειρών σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις της 5-FU επί μία περίοδο 10-12 μηνών. Τόσο τα γονικά και 5-FU ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνηθεί η αποτελεσματικότητα των επί μέρους και συνδυασμένων 5-FU και θεραπείες κουρκουμίνη. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας ιστών σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM? 4,5 g D-γλυκόζης /L) συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% αντιβιοτικό /αντιμυκητιασικό σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C σε μια ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε τρεις ημέρες, και τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας θρυψίνη /EDTA.

Αντισώματα

Τα μονοκλωνικά αντισώματα προς ΑΙ_ϋΗ1 αγοράστηκαν από Acris Αντισώματα GmbH (Herold, Γερμανία). Τα μονοκλωνικά αντισώματα προς CD133 και CD44 αγοράστηκαν από Abcam PLC (Cambridge, UK). Αντισώματα σε β-ακτίνη (A5316) ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Τα μονοκλωνικά αντι-PARP [πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης] αντισώματος (7D3-6) αγοράστηκε από την Becton Dickinson (Χαϊδελβέργη, Γερμανία). Αλκαλική φωσφατάση αντι-ποντικού προβάτου και αντι-κουνελιού δευτερογενή αντισώματα συνδέονται πρόβατα για ανοσοκηλίδωση αγοράστηκαν από την Millipore (Schwalbach, Γερμανία). Όλα τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε συγκεντρώσεις και αραιώσεις που συνιστώνται από τον κατασκευαστή.

Growth Media, Χημικά, και κυτοκίνες

Μέσο ανάπτυξης (F-12 του Ham /μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (50:50) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 25 μg /ml ασκορβικό οξύ, 50 IU /ml στρεπτομυκίνη, 50 IU /ml πενικιλλίνη, 2.5 μg /ml αμφοτερικίνη Β, απαραίτητα αμινοξέα και L-γλουταμίνη) ελήφθη από Seromed (Μόναχο, Γερμανία). Θρυψίνη /EDTA (ΕΚ 3.4.21.4) αγοράστηκε από Biochrom (Βερολίνο, Γερμανία). Εροη ελήφθη από Plano (Marburg, Γερμανία). 5-FU αγοράστηκε από τη Sigma (Μόναχο, Γερμανία). Η κουρκουμίνη (BCM-95) ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από Dolcas Biotech (Landing, NJ, USA). Η κουρκουμίνη παρασκευάστηκε με διάλυση σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) σε μία συγκέντρωση αποθέματος από 5.000 μΜ και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C. Διαδοχικές αραιώσεις παρασκευάστηκαν σε μέσο καλλιέργειας.

100 mm απόθεμα της 5-FU παρασκευάστηκε σε απόλυτη DMSO και αποθηκεύεται στους -20 ° C. Η συγκέντρωση του DMSO ήταν μικρότερη από 1% της φαρμακευτικής αγωγής. Για τη θεραπεία, 5-FU αραιώθηκε σε ϋΜΕΜ και προστέθηκε σε καλλιέργειες για να δώσει την επιθυμητή τελική συγκέντρωση. Μετά 70-80% συρροή, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-FU ή κουρκουμίνης μεμονωμένα, ή συνδυασμός τους.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με την 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) πρόσληψη μέθοδο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Εν συντομία, HCT116, HCT116 + CH3 κύτταρα και τα χημειο-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές 5-FU σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων (1000 ανά φρεάτιο) και εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις των μεμονωμένων 5-FU ή η κουρκουμίνη εις τριπλούν για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα για να ληφθεί η IC

50 τιμές (κυτταρική αύξηση 50% ανασταλτικές συγκεντρώσεις). Επιπλέον, σε μια άλλη σειρά πειραμάτων, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 5 μΜ κουρκουμίνη για 12 ώρες και στη συνέχεια συν-επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της 5-FU (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 μΜ) για 24 ώρες για να ληφθεί η βέλτιστη δόση για τη θεραπεία συνδυασμού. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και στη συνέχεια, διάλυμα ΜΤΤ (5 mg /mL) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και η πλάκα επωάστηκε για 2 ώρες στους 37 ° C. Το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20% SDS και 50% διμεθυλοφορμαμίδιο) προστέθηκε, και τα κύτταρα επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 37 ° C. Η απορρόφηση του κυτταρικού εναιωρήματος μετρήθηκε στα 570 nm (OD570) χρησιμοποιώντας Αποκάλυψη 96 φρεατίων αναγνώστη πλάκας πολλαπλής σάρωσης (Bio-Rad Laboratories Inc. Μόναχο, Γερμανία). Τα δεδομένα που λαμβάνονται υπολογίστηκαν και αντιπροσωπεύθηκαν ως ποσοστό επιβίωσης σε σχέση με τους μάρτυρες. Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές ανεξάρτητα, και στατιστική ανάλυση έγινε για να ληφθούν οι τελικές τιμές.

Δημιουργία και Αναστολή Colonosphere αποικίες

Για την δοκιμασία σχηματισμού colonosphere όγκου, 10 μl πτώση, περίπου 2 εκατομμύρια κύτταρα, τα αντίστοιχα χημειο-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές παράγωγο 5-FU τους HCT116, HCT116 + CH3 και απλώθηκαν επί ενός φίλτρου κυτταρίνης στην κορυφή μιας γέφυρας πλεγμάτων [31]. μέσο καλλιέργειας κυττάρων έφθασε το περιβάλλον μέσο φίλτρου και κύτταρα καλλιεργηθεί μέσω διάχυσης. Αυτό το μοντέλο επιτρέπει στα κύτταρα να συσσωματώνονται και σχηματίζουν μια διακριτή σφαιρίδιο, η οποία εξετάσθηκε μετά 1-10 ημέρες. Το αντίστοιχο χημειο-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές 5-FU τους HCT116, HCT116 + CH3 και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κουρκουμίνη (20 μΜ), 5-FU (5 μΜ) ή ο συνδυασμός τους (κουρκουμίνη 5 μΜ και 5-FU 0,1 μΜ) για 1, 3, 7 και 10 ημέρες, αντίστοιχα. Εφαρμοσμένη συγκεντρώσεις υπολογίστηκαν και παριστάνεται ως ποσοστό επιβίωσης σε σχέση με μη κατεργασμένους ελέγχους. Το IC

50 ορίστηκε ως η συγκέντρωση του φαρμάκου που απαιτείται για την αναστολή HCT116, HCT116R ή HCT116 + CH3 και HCT116 + ch3R κατά 50% σε σχέση με τους μάρτυρες. IC

50 τιμές υπολογίστηκαν από την καμπύλη απόκρισης δόσης. Τα δεδομένα που προέρχονται από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. σχηματισμός Colonosphere αξιολογήθηκε με οπτική μικροσκοπία, ϋΑΡΙ (4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη, Sigma) και μικροσκοπία ηλεκτρονίου.

μικροσκοπίας μετάδοσης ηλεκτρονίων (ΤΕΜ)

Ηλεκτρονική μικροσκοπία διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Εν συντομία, καλλιέργειες κυττάρων υψηλής πυκνότητας, επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω, σταθεροποιήθηκαν για 1 ώρα σε στερεωτικό Karnovsky που ακολουθείται από μετα-καθήλωση εντός 1% ΟΣΟ

4 λύση. Μετά από αφυδάτωση σε σειρά αλκοόλης αύξουσα, οι καλλιέργειες ενσωματωμένα σε Εροη και αποκοπής υπέρλεπτων με Reichert-Jung Ultracut Ε (Darmstadt, Γερμανία). Οι τομές σε αντίθεση με ένα μίγμα 2% οξικό ουρανύλιο /κιτρικό μόλυβδο και εξετάστηκαν με ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (ΤΕΜ 10, Zeiss, Ινστιτούτο φαρμακολογία Βερολίνο, Γερμανία).

Ποσοτικοποίηση του Μιτοχονδριακή Μεταβολές (MC) και αποπτωτικά

θανάτου Κυττάρου

υπέρλεπτων τμήματα των δειγμάτων παρασκευάστηκαν και αξιολογήθηκαν με ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (ΤΕΜ 10? Zeiss, Ινστιτούτο φαρμακολογία Βερολίνο, Γερμανία). Για να ποσοτικοποιηθεί η MC και αποπτωτικών κυττάρων, ο αριθμός των κυττάρων με μορφολογικά χαρακτηριστικά του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου προσδιορίστηκε με βαθμολόγηση 100 κύτταρα από 25 διαφορετικές μικροσκοπικά πεδία.

DAPI χρώση για αποπτωτικά κύτταρα

συμπύκνωση χρωματίνης και αποπτωτικά κύτταρα εξετάστηκαν με πυρηνική χρώση με ϋΑΡΙ (4 ‘, 6’-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη, Sigma), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Εν συντομία, οι καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας βυθίστηκαν σε O.C.T. ενσωμάτωση μέσου και αμέσως καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο. Οκτώ έως δέκα μm πάχους τομές κόπηκαν. Οι τομές στερεώθηκαν με μεθανόλη για 30 λεπτά στους 4 ° C στο σκοτάδι. Στη συνέχεια, οι καλλιέργειες πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και στη συνέχεια 1 μl διαλύματος ϋΑΡΙ (5 mg /ml) σε πέντε ml PBS απλώθηκε πάνω στις καλλιέργειες που ακολουθείται από επώαση για 20 λεπτά στο σκοτάδι. Τα επισημασμένα κύτταρα πλύθηκαν επανειλημμένα με PBS για να απομακρυνθεί η περίσσεια του λεκέ ϋΑΡΙ, που καλύπτεται με Fluoromount έγκλεισης και αξιολογούνται κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Leica, Germany). Πειράματα και ανάλυση πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Ανάλυση Western Blot

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της κουρκουμίνης, 5-FU ή η κουρκουμίνη /5-FU σε διάσπαση της PARP και την έκφραση των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου (CSC) δείκτες, προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και κλασματοποιείται με SDS-PAGE [33]. Εν συντομία, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν σε PBS, και οι πρωτεΐνες εκχυλίσθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris /HCl (ρΗ 7,2), 150 mM NaCl, 1% (ν /ν) Triton Χ-100, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 50 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 100 mM φθοριούχο νάτριο, 0,01% (ν /ν) απροτινίνη, πεπστατίνη Α (4 μg /ml), λευπεπτίνη (10 μg /ml), και φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο 1 mM (PMSF)) για 30 λεπτά σε πάγο. Μετά τη ρύθμιση της συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης, ίσες ποσότητες (500 μg πρωτεΐνης ανά λωρίδα) του συνόλου των πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (7.5% ή 12% πηκτώματα) υπό αναγωγικές συνθήκες. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης και επωάσθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος (5% (w /v) σκόνη αποβουτυρωμένου γάλακτος σε PBS, 0,1% Tween 20) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες επωάστηκαν για μια νύχτα με το πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο σε ρυθμιστικό αποκλεισμού στους 4 ° C σε έναν αναδευτήρα, πλύθηκαν 3 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού, και στη συνέχεια επωάστηκαν με το δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση για 90 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες πλύθηκαν 3 φορές σε 0.1 Μ Tris (ρΗ 9.5) που περιέχει 0.05 Μ MgCl

2 και 0.1 Μ NaCl. Τέλος, ειδικά σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας nitroblue tetrazolium και 5-βρωμο-4-χλωρο-3-indoylphosphate (

σ

-τολουϊδίνης άλας? Pierce, Rockford, IL, USA) ως υποστρώματα για αλκαλική φωσφατάση. οι

Στατιστική Ανάλυση

αριθμητικά δεδομένα εκφράζονται ως μέσες τιμές (+/- SD) για ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν. Τα μέσα συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

υποθέτοντας ίσες διακυμάνσεις δοκιμασία του Student. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές εάν η

σ

αξία ήταν μικρότερη από 0,05.

Αποτελέσματα

Ανθρώπινο MMR ανεπάρκεια και -proficient κύτταρα CRC (HCT116, HCT116 + CH3 ) και των αντίστοιχων 5-FU χημειο-ανθεκτικού παράγωγο κυτταρικές γραμμές τους (HCT116R, HCT116 + ch3R) χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη μας για να διερευνήσει την επίδραση της κουρκουμίνης και /ή 5-FU στη βιωσιμότητα των κυττάρων, την απόπτωση και τον καρκίνο βλαστικά κύτταρα (CSC) σε καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας.

MMR- Ελλιπή CRC κύτταρα και τις αντίστοιχες 5-FU κύτταρα ανθεκτικά τους είναι ευαίσθητα σε κουρκουμίνη

προσδιορίστηκαν Τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του 5-FU ή κουρκουμίνης σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου τέσσερα χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της 5-FU (0, 1, 5, 10 και 20 μΜ) ή κουρκουμίνη (0, 1, 5, 10 και 20 μΜ) και η βιωσιμότητα των κυττάρων εξετάστηκε με ΜΤΤ δοκιμασία (Εικ. 1Α & amp ? 1Β). Παρατηρήσαμε ότι η 5-FU μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών HCT116, HCT116 + CH3 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με IC

50 τιμή των 5 μΜ, ενώ, αντίστοιχα παράγωγά τους 5-FU ανθεκτικά δεν είχε καμία απάντηση σε 5-FU θεραπεία (Εικ. 1Α). Τα κύτταρα HCT116 + CH3 και τα αντίστοιχα 5-FU χημειο-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές ήταν εξίσου ευαίσθητα σε κουρκουμίνη (IC

50 5 μΜ), ενώ τα DNA MMR με ανεπάρκεια κυτταρικές σειρές HCT116 και HCT116R κύτταρα ήταν λιγότερο ευαίσθητα σε κουρκουμίνη σε σύγκριση με το DNA MMR-καλά κυτταρικές σειρές HCT116 + CH3 και HCT116 + ch3R (IC

50 20 μΜ? Εικ. 1Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η αποκατάσταση της δραστηριότητας hMLH1 στο HCT116 κυτταρική γραμμή, με την εισαγωγή του χρωμοσώματος 3, συσχετίστηκε με αυξημένη ευαισθησία σε 5-FU.

HCT116, HCT116 + CH3, HCT116R και HCT116 + ch3R κύτταρο γραμμές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της 5-FU (0, 1, 5, 10 και 20 μΜ) μόνο του (Α) για 24 ώρες, διαφορετικές συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης (0, 1, 5, 10 και 20 μΜ) μόνο (Β) για 24 ώρες, ή προ-επεξεργασία με κουρκουμίνη 5 μΜ για 4 ώρες, και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις της 5-FU (0, 0,1, 1, 2, 4) για 24 ώρες (C). Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη μέθοδο ΜΤΤ και IC

50 προσδιορίζεται στο 50% αναστολή της ανάπτυξης. Τα αποτελέσματα παρέχονται ως μέσες τιμές με τυπικές αποκλίσεις από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι τιμές συγκρίθηκαν με τον έλεγχο και στατιστικώς σημαντικές τιμές με ρ & lt? 0.05. Οι σημαντικές τιμές που σημειώνονται με (*).

Η

Για την αξιολόγηση της ευαισθησίας των κυττάρων με το συνδυασμό της κουρκουμίνης και θεραπεία 5-FU, εμείς προεπεξεργασμένα HCT116, HCT116 + CH3 και τα αντίστοιχα 5-FU χημειο-ανθεκτικά κύτταρα πρώτα με 5 μΜ κουρκουμίνη που ακολουθείται από κατεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της 5-FU (0, 0,1, 1, 2 και 4 μΜ) για 24 ώρες (Εικ. 1 C). προσδιορισμοί ΜΤΤ πραγματοποιήθηκαν και καθορίστηκαν IC

50 τιμές. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η κουρκουμίνη ενίσχυσε σημαντικά την κυτταροτοξικότητα της 5-FU και για τις δύο κυτταρικές σειρές (HCT116 και HCT116 + CH3) περίπου 0,1 μΜ 5-FU (Σχ. 1 C). Είναι ενδιαφέρον ότι, η προθεραπεία με 5 μΜ κουρκουμίνη ελαττωμένη IC

50 τιμές για 5-FU σε 2 μΜ στην ανθεκτική HCT116R 5-FU και κυτταρικές σειρές HCT116 + ch3R (ρ & lt? 0,05? Εικ. 1 C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το DNA MMR ανεπάρκεια HCT116R και DNA MMR-ικανοί HCT116 + ch3R κύτταρα προκατεργάστηκαν με κουρκουμίνη ήταν πιο ευαίσθητα σε 5-FU από τα κύτταρα που έλαβαν μόνο 5-FU και η εισαγωγή του χρωμοσώματος 3 στα κύτταρα HCT116 παρουσίασαν αυξημένη ευαισθησία του τα κύτταρα στη θεραπεία με 5-FU και /ή κουρκουμίνης σε σύγκριση με τα κύτταρα HCT116.

η κουρκουμίνη και /ή 5-FU καταστολή Colonosphere Ανάπτυξης MMR-ανεπαρκή κύτταρα CRC και τα αντίστοιχα 5-FU κύτταρα ανθεκτικά τους στην οι καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας

για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της 5-FU ή /και η κουρκουμίνη είτε μόνο του είτε σε συνδυασμό με το μέγεθος της colonospheres, ένα σημαντικό χαρακτηριστικό των καρκινικών βλαστικών κυττάρων [34], τρισδιάστατα καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας [31] του HCT116 και τα αντίστοιχα χημειο-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές διεξήχθησαν (Σχ. 2Α-C).

καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας κυττάρων HCT116 (Α) ή HCT116R (Β) είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή ήταν αγωγή με 5-FU (5 μΜ), κουρκουμίνη (20 μΜ), ή 5-FU /κουρκουμίνη σε συνδυασμό (0,1 /5 μΜ). Οι καλλιέργειες αξιολογήθηκαν μετά από 1, 3, 7, και 10 ημέρες, και οι εικόνες των ιθαγενών πολιτισμών που λαμβάνονται. Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων. μέγεθος Colonosphere μετρήθηκε και τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες τιμές με τυπικές αποκλίσεις από τρία ανεξάρτητα πειράματα. C: καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας του HCT116, HCT116 + CH3 και τα αντίστοιχα 5-FU-χημειοθεραπεία κύτταρά τους είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 5-FU (5 μΜ), κουρκουμίνη (20 μΜ), ή 5-FU /κουρκουμίνη σε συνδυασμό (0,1 /5 μΜ). Οι καλλιέργειες αξιολογήθηκαν μετά από 10 ημέρες, colonosphere μέγεθος μετρήθηκε και τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες τιμές με τυπικές αποκλίσεις από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι σημαντικές τιμές που σημειώνονται με (*).

Η

Στις καλλιέργειες ελέγχου χωρίς θεραπεία, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο κύτταρα HCT116 και HCT116R σχηματίζονται σφαιροειδή αποικίες, με χρονο-εξαρτώμενη αύξηση του μεγέθους του κατά τη διάρκεια της colonospheres 10 ημερών (Εικ. 2Α, 2Β). Θεραπεία των καλλιεργειών HCT116 μόνο με 5-FU, σε αντίθεση με αντίστοιχα 5-FU ανθεκτική HCT116R κυτταρική γραμμή τους, μείωσε δραματικά το μέγεθος των colonospheres σύγκριση με τα αντίστοιχα στοιχεία ελέγχου (Σχ. 2Α, 2Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, η επεξεργασία της 5-FU κύτταρα ανθεκτικά με 5-FU μεμονωμένα δεν έχουν αρνητική επίδραση επί του μεγέθους colonosphere (Εικ. 2Β). Αντίθετα, σε καλλιέργειες που κατεργάζονται μόνο με κουρκουμίνη και /ή 5-FU, το μέγεθος colonosphere σημαντικά ήταν μειωμένη σε σύγκριση με τα αντίστοιχα στοιχεία ελέγχου (Σχ. 2Α, 2Β, 2C). Η θεραπεία μόνο με κουρκουμίνη ή η θεραπεία συνδυασμού έχει δειχθεί ότι είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στην αναστολή της σχηματίζει σφαίρα ικανότητα των τεσσάρων κυτταρικών σειρών CRC. Τα μεγέθη των colonospheres με ομάδες που έλαβαν κουρκουμίνη ήταν σημαντικά μικρότερη σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι α) η κουρκουμίνη από την ίδια κατασταλεί μέγεθος colonosphere στο DNA MMR ελλειμματικά κύτταρα HCT 116, και β) η κουρκουμίνη ευαισθητοποιημένα HCT116R και HCT116 + ch3R κυττάρων σε 5- FU επαγόμενη κυτταροτοξικότητα (Σχ. 2Α, 2Β, 2C). Στο τέλος της πειραματικής περιόδου (10 ημέρες), θα μπορούσε να παρατηρηθεί ότι ενώ τα κύτταρα ελέγχου που σχηματίζονται καλά ανεπτυγμένη colonospheres, τα 5-FU ανθεκτικά κύτταρα CRC που εκτίθενται σε μόνη ή σε θεραπεία συνδυασμού κουρκουμίνη έδειξαν σημαντικά μικρότερη σχηματισμός σφαιροειδές (Σχ. 2C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι colonoshere μέγεθος ήταν σημαντικά μειωμένη σε καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας αγωγή είτε μόνο με κουρκουμίνη ή συνδυασμό κουρκουμίνης και 5-FU, υποδεικνύοντας μία ανασταλτική επίδραση της κουρκουμίνης και /ή 5-FUon HCT116, HCT116 + CH3 και τους colonosphere αντίστοιχα παράγωγά ανθεκτικό 5-FU.

Η κουρκουμίνη και /ή 5-FU Αύξηση κυτταροτοξικότητα της Colonospheres της MMR-ανεπαρκή κύτταρα CRC και τις αντίστοιχες 5-FU κύτταρα ανθεκτικά τους σε High Density Πολιτισμών

Για να εξετάσει αν η colonosphere σχηματισμός-ανασταλτική δράση της κουρκουμίνης και 5-FU σε HCT116, HCT116 + CH3, κυτταρικές σειρές HCT116R και HCT116 + ch3R σχετίζεται με την επαγωγή της απόπτωσης, κατεργασμένων κυττάρων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας χρώση ϋΑΡΙ, η οποία έδειξε ότι αποπτωτικά σώματα που περιέχουν πυρηνικό θραύσματα και συμπύκνωση χρωματίνης παρήχθησαν εντός της αποπτωτικής πισίνα των κυττάρων (Σχ. 3Α, 3Β). Πράγματι, η επώαση των HCT116 και HCT116R κυττάρων σε μέσο άνευ ορού οδήγησε στο σχηματισμό του colonosphere κατά τη διάρκεια περιόδου 10 ημερών. Ωστόσο, η επώαση των HCT116 και HCT116R κυττάρων με 5-FU, η κουρκουμίνη, ή κουρκουμίνης μαζί με 5-FU για 10 ημέρες είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αποσύνθεση του colonosphere (ες) σε σύγκριση με τις αντίστοιχες τους ελέγχους τους (Σχ. 3Α, 3Β). Υψηλότερη αποσύνθεση παρατηρήθηκε σε απόκριση στον συνδυασμό κουρκουμίνης και 5-FU σε κυτταρικές σειρές HCT116 + ch3R (Σχ. 3Α, 3Β) HCT116 + CH3 και.

καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας του HCT116, HCT116 + CH3 (Α ), ή HCT116R και HCT116 + ch3R (Β) είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 5-FU (5 μΜ), κουρκουμίνη (20 μΜ), ή 5-FU /κουρκουμίνη σε συνδυασμό (0,1 /5 μΜ). Οι καλλιέργειες αξιολογήθηκαν μετά από 1, 3, 7, και 10 ημέρες, και χρωματίστηκαν με Hoechst 33258 (DAPI) να αποκαλύψει αποπτωτική μεταβολές των κυτταρικών πυρήνων. Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές των τριών ξεχωριστών πειραμάτων.

Η

Η κουρκουμίνη Βελτιώνει 5-FU-απόπτωση των MMR-ανεπαρκή κύτταρα CRC και τις αντίστοιχες 5-FU κύτταρα ανθεκτικά τους σε High Density Πολιτισμών

Για να εξετάσει αν η ανασταλτική της ανάπτυξης δράση της κουρκουμίνης και 5-FU σε σχηματισμό colonosphere σε τρισδιάστατο καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας σχετίζεται με την επαγωγή της απόπτωσης, υπερδομικές αξιολογήσεις εκτελέστηκαν (Εικόνα 4 & amp?. 5) σε HCT116, HCT116 + CH3 , HCT116R και HCT116 + ch3R κύτταρα κατεργασμένα με 5-FU (5 μΜ) και η κουρκουμίνη (20 μΜ) μεμονωμένα, ή 5-FU /κουρκουμίνη σε συνδυασμό (0,1 /5 μΜ) για 1, 3, 7, και 10 ημέρες. Σε καλλιέργειες ελέγχου, κυτταρικές σειρές 5-FU ανθεκτικά ομόλογό τους HCT116, HCT116 + CH3 και παρουσίασαν μεγάλες στρογγυλές βιώσιμα κύτταρα (που περιέχει διακριτές διανομή του ενδοπλασματικού δικτύου, τα μιτοχόνδρια και άλλα κυτταρικά οργανίδια) και αυτά τα κύτταρα γίνονται οικεία κύτταρο-προς-κύτταρο επαφή ( Σχ. 4Α, 5Α). Κατεργασία HCT116 κυττάρων με 5-FU ή η κουρκουμίνη μόνος είχε σαν αποτέλεσμα τον εκφυλισμό του κυττάρου οργανιδίων, μιτοχονδριακή διόγκωση και την εμφάνιση πολλαπλών κενοτόπια, με εξέχοντα σημάδια απόπτωσης ειδικά σε καλλιέργειες κουρκουμίνη επεξεργασμένο υψηλής πυκνότητας περίπου την 10η ημέρα (Σχ. 4Α-Β). Αυτά περιλαμβάνονται περιοχές των συνοπτικών ετεροχρωματίνης εντός των πυρήνων, και πολλαπλές autophagocytic κυτταροπλασματικά κενοτόπια. Παρόμοιες παρατηρήσεις έγιναν για HCT116 + CH3 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αντίθετα, τέτοια αποτελέσματα δεν μπορούσε να παρατηρηθεί σε 5-FU ή θεραπεία κουρκουμίνη HCT116R (Σχ. 5Α-Β) ή HCT116 + ch3R κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, μια συνδυαστική θεραπεία 5-FU και η κουρκουμίνη άνω των 10 ημερών αξιοσημείωτα ενισχυμένη εκφυλισμός όλων των κυττάρων του όγκου. Επισημάνθηκε εκφυλιστικές αλλαγές και αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν γύρω ημέρας 3 σε HCT116 (Εικ. 4Α-Β) και κύτταρα HCT116R (Σχ. 5Α-Β), που ήταν ήδη ορατή γύρω ημέρα 1 σε HCT116 + CH3 κύτταρα (Σχ. 4Α-Β) και τα κύτταρα HCT116 + ch3R (Σχ. 5Α-Β). Ποσοτικοποίηση και στατιστική ανάλυση της υπερδομής δεδομένων υπογραμμίζει τα εξέχοντα αποτελέσματα της συνδυασμένης 5-FU και η κουρκουμίνη μεταχείριση επαγωγή και ενίσχυση της μιτοχονδριακής αλλαγές (MC) και αποπτωτικά αποτελέσματα στα κύτταρα HCT116 (Εικ. 4Β) και τα κύτταρα HCT116R (Εικ. 5Β).

Α: καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας του HCT116 και HCT116 + CH3 είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 5-FU (5 μΜ), κουρκουμίνη (20 μΜ), ή 5-FU /κουρκουμίνη σε συνδυασμό (0,1 /5 μΜ). Οι καλλιέργειες αξιολογήθηκαν μετά από 1, 3, 7, και 10 ημέρες, και αξιολογούνται ultrastructurally με ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης. Το νωρίτερο χρονικό σημείο, όταν εντοπίστηκε για πρώτη φορά απόπτωση (βέλη), οι εικόνες επισημαίνονται με κόκκινο χρώμα κουτιά. Μικρογραφίες που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων. Μεγέθυνση: x5000, bar = 1 μm. Β: Μιτοχονδριακή αλλαγές (MC) και την απόπτωση ποσοτικοποιήθηκαν μετρώντας 100 κύτταρα με μορφολογικά χαρακτηριστικά του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου από 25 διαφορετικά μικροσκοπικά πεδία και τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες τιμές με τυπικές αποκλίσεις από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι σημαντικές τιμές που σημειώνονται με (*)

Η

Α:. πολιτισμούς υψηλής πυκνότητας των HCT116R και HCT116 + ch3R είτε αριστερά χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 5-FU (5 μΜ), κουρκουμίνη (20 μΜ) ή 5-FU /κουρκουμίνη σε συνδυασμό (0,1 /5 μΜ). Οι καλλιέργειες αξιολογήθηκαν μετά από 1, 3, 7, και 10 ημέρες, και αξιολογούνται ultrastructurally με ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Το νωρίτερο χρονικό σημείο κατά την απόπτωση (βέλη) εντοπίστηκε για πρώτη φορά εικόνες επισημαίνονται με κόκκινα κουτιά. Μικρογραφίες που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων. Μεγέθυνση: x5000, bar = 1 μm. Β: Μιτοχονδριακή αλλαγές (MC) και την απόπτωση ποσοτικοποιήθηκαν μετρώντας 100 κύτταρα με μορφολογικά χαρακτηριστικά του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου από 25 διαφορετικά μικροσκοπικά πεδία και τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες τιμές με τυπικές αποκλίσεις από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι σημαντικές τιμές που σημειώνονται με (*).

Η

Η κουρκουμίνη ενισχύει την αντικαρκινική επίδραση της 5-FU μέσω απόπτωση Διαδρομή στην HCT116, HCT116 + CH3 κύτταρα και τα αντίστοιχα 5-FU κύτταρα ανθεκτικά τους σε High Density Πολιτισμών

από υπερδομικές αξιολόγηση με τα αποτελέσματα ηλεκτρονικής μικροσκοπίας έδειξαν ότι η 5-FU +/- κουρκουμίνη επαγόμενη απόπτωση (Σχ. 4-5), και PARP φαίνεται να εμπλέκεται στην επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα όγκου [35], επομένως ερευνήσαμε αν η κουρκουμίνη ενισχύει διάσπαση PARP με 5-FU κατεργασία HCT116, HCT116 + CH3 και αντίστοιχα 5-FU ανθεκτικά αντίστοιχά τους. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6, ανάλυση ανοσοκηλίδος έδειξε ότι η διάσπαση της PARP ενισχύθηκε, όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν σε κουρκουμίνη (20 mM) ή 5-FU (5 mM) μόνο, ή σε συνδυασμό κουρκουμίνης και 5-FU (0,1 /5 μΜ) . Αυτές οι επιδράσεις ήταν εντονότερες σε συνδυασμένη θεραπεία με κουρκουμίνη και 5-FU σε σχέση με το ενιαίο θεραπείες (Εικ. 6).

καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας HCT116 και HCT116 + CH3 (αριστερά Lanel) και των HCT116R και HCT116 + ch3R (δεξί πάνελ) κύτταρα είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 5-FU (5 μΜ), κουρκουμίνη (20 μΜ), ή 5-FU /κουρκουμίνη σε συνδυασμό (0,1 /5 μΜ). Οι καλλιέργειες αξιολογήθηκαν μετά από 3 ημέρες και κυτταρολύματα ολόκληρο παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για διάσπαση της PARP. Western blots που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Η πρωτεΐνη καθαριότητας β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας φόρτωσης σε όλα τα πειράματα.

Η

Η κουρκουμίνη έχει Ισχυροί Χημειοευαισθητοποίηση επίδραση στον καρκίνο του παχέος εντέρου βλαστοκύτταρα στο MMR-Ελλιπή και -proficient κύτταρα CRC σε καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας

για να αποδειχθεί η επίδραση της κουρκουμίνης Χημειοευαισθητοποίηση επί του παχέος εντέρου δείκτες CSC CD133, CD44 και έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 σε καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας, κηλίδωση Western ανάλυση διεξήχθη (Εικ. 7). καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας του HCT116, HCT116 + CH3 και τα αντίστοιχα 5-FU ανθεκτικά ομολόγους είτε αφεθεί χωρίς θεραπεία, ή έλαβαν θεραπεία με 5-FU (5 μΜ) ή κουρκουμίνη (20 μΜ) μόνο, ή 5-FU /κουρκουμίνη σε συνδυασμό (0,1 /5 μΜ) για 12 ώρες.