Αφηρημένο

Ιστορικό

Απελευθέρωση των κανονικών Wnt /CTNNB1 (β-κατενίνης) οδός είναι μία από τις πρώτες εκδηλώσεις στην παθογένεια του καρκίνου του παχέος εντέρου. Μεταλλάξεις σε

APC

ή

CTNNB1

είναι ιδιαίτερα συχνές σε καρκίνο του παχέος εντέρου και προκαλούν παρεκκλίνουσα σταθεροποίηση του CTNNB1, το οποίο ενεργοποιεί τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων Wnt δια συνδέσεως με χρωματίνη μέσω των παραγόντων μεταγραφής TCF /LEF. Εδώ αναφέρουμε μια ενοποιητική ανάλυση του γονιδιώματος σε επίπεδο χρωματίνης πληρότητας CTNNB1 με ανοσοκαταβύθιση χρωματίνης σε συνδυασμό με αλληλούχιση υψηλής απόδοσης (τσιπ seq) και γονίδιο προφίλ έκφρασης με ανάλυση μικροσυστοιχιών κατόπιν μεσολάβηση RNAi knockdown του CTNNB1 σε καρκινικά κύτταρα κόλου.

Αποτελέσματα

Παρατηρήσαμε 3629 CTNNB1 κορυφές δεσμευτικές σε όλη την γονιδίωμα και μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ CTNNB1 δεσμευτική και νοκ ντάουν που προκαλείται από την αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης. ενοποιητική ανάλυσή μας οδήγησε στην ανακάλυψη μιας άμεσης Wnt υπογραφή στόχος αποτελείται από 162 γονίδια. Gene ανάλυση οντολογία του παρόντος υπογραφή αποκάλυψε σημαντική εμπλουτισμό των γονιδίων οδού Wnt, προτείνοντας πολλαπλές ρυθμίσεις ανατροφοδότηση του μονοπατιού. Παρέχουμε αποδείξεις ότι αυτό το γονίδιο υπογραφή επικαλύπτει μερικώς το Lgr5

+ εντερική βλαστικών υπογραφή κυττάρων, και είναι σημαντικά εμπλουτισμένο σε φυσιολογική εντερική βλαστικών κυττάρων καθώς επίσης και σε κλινικά δείγματα ορθοκολικού καρκίνου. Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ η έκφραση του συνόλου του γονιδίου-στόχου CTNNB1 δεν συσχετίζεται με την επιβίωση, αυξημένη έκφραση των αρνητικών ρυθμιστών ανάδρασης εντός της υπογραφής προβλέπει καλύτερη πρόγνωση.

Συμπέρασμα

στοιχεία μας παρέχουν ένα γονιδίωμα-ευρεία Λόγω της χρωματίνης πληρότητας και γονιδιακή ρύθμιση της Wnt /CTNNB1 σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Watanabe Κ, Biesinger J, Salmans ML, Roberts BS, Arthur WT, Cleary M, et al. (2014) Ολοκληρωμένη τσιπ επόμενα /Microarray ανάλυση εντοπίζει μια Υπογραφή CTNNB1 Target Εμπλουτισμένο σε εντερικά βλαστικά κύτταρα και τον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (3): e92317. doi: 10.1371 /journal.pone.0092317

Επιμέλεια: Ted S. Acott, Casey Ινστιτούτο Eye, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Οκτωβρίου 2013? Αποδεκτές: 20 Φλεβάρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 20 του Μάρτη του 2014

Copyright: © 2014 Watanabe et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση από Susan G. Komen χορηγήσει KG110897 (XD), ένα Υπουργείο άμυνας BCRP μεταδιδακτορικής έρευνας (KW W81XWH-10-1-0383) των ΗΠΑ, και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγούν R01HG006870 (ΧΧ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Brian S. Roberts και William T. Arthur είναι πρώην υπάλληλοι της Rosetta Inpharmatics, LLC , Merck & amp? Co Inc. Michele Cleary είναι σήμερα ένας υπάλληλος της Merck & amp? Co., Inc. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Ιστορικό

Wnt /CTNNB1 σηματοδότηση είναι ένα συντηρημένο μονοπάτι ότι διαδραματίζει θεμελιώδη ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, ομοιόσταση του ιστού και τη συντήρηση των βλαστικών κυττάρων. Στην κανονική έντερο, αυτή η οδός είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη και τη συντήρηση των εντερικών βλαστοκυττάρων [1], [2]. Η ενεργοποίηση των κανονικών σηματοδότηση Wnt περιλαμβάνει σταθεροποίηση των κυτταροπλασματικών CTNNB1, η οποία αλλιώς αποικοδομείται από το πρωτεάσωμα μέσω μιας πολύπλοκης αποικοδόμησης απαρτίζεται από ογκοκατασταλτικών APC πρωτεΐνης, κινάση σερίνης /θρεονίνης GSK-3, και Axin. Σταθεροποιημένο CTNNB1 μετατοπίζεται στον πυρήνα όπου δεσμεύεται με παράγοντες μεταγραφής TCF /LEF και ενεργοποιεί την έκφραση του γονιδίου-στόχου [2]. Μια βασική εκδήλωση για την έναρξη του παχέος εντέρου (CRCs) είναι CTNNB1 σταθεροποίηση μέσω της απώλειας του

APC

γονίδιο ή ενεργοποίηση μεταλλάξεων στο

CTNNB1

γονίδιο [3]. Αυτή η γενετική συμβάν λαμβάνει χώρα κυρίως στον πληθυσμό εντερική βλαστικών κυττάρων [4] – [6] και οδηγεί σε ανώμαλο πολλαπλασιασμό των μεταλλαγμένων κυττάρων μέσω της ενεργοποίησης των γονιδίων στόχων όπως

MYC

και

CCND1

[7 ]. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη τις διαφορές κυτταρική ρόλοι των σηματοδότηση Wnt /CTNNB1, άλλα γονίδια-στόχους μπορεί επίσης να συμβάλει στην παθογένεση του ΚΕΣ.

Έτσι, την ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισμό των γονιδίων στόχων CTNNB1 γονιδίωμα-ευρεία έχουν μια σημαντική άσκηση στο CRC σπουδές. Μεταγραφική προφίλ χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση γονιδίων-στόχων Wnt /CTNNB1 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [8]. Ωστόσο, η ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου και μόνο είναι περιορισμένη λόγω της αδυναμίας να γίνει διάκριση μεταξύ πρωτογενούς και δευτερογενούς αποτελέσματα της ενεργοποίησης μονοπατιού Wnt. Πιο πρόσφατα, χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) που ακολουθείται από ανάλυση του DNA μεγάλης κλίμακας όπως το DNA-chip (τσιπ chip) ή αλληλούχιση υψηλής απόδοσης (τσιπ seq) [9], [10] χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του γενωμικού loci να η οποία CTNNB1 ή TCF παράγοντες δεσμεύονται άμεσα [11] – [14]. Ωστόσο, τσιπ με βάση τις μελέτες των διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων δείχνουν ότι δεν είναι όλοι οι δεσμευτικές εκδηλώσεις προσδιορίζονται συσχετίζεται με μεταγραφική ρύθμιση σε λειτουργικό επίπεδο [15]. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να εκτελέσει μια ενοποιητική ανάλυση ενσωματώνοντας τόσο γονιδιώματος σε επίπεδο χαρτογράφησης χρωματίνης πληρότητα και την γονιδιακή έκφραση προφίλ στον ίδιο τύπο του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων, ώστε να προσδιοριστούν οι άμεσες και λειτουργικά γονίδια στόχου Wnt /CTNNB1, η οποία δεν έχει ακόμη γίνει η βιβλιογραφία.

στην παρούσα μελέτη, συνδυάζουμε τσιπ seq με ανάλυση μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας την κυτταρική γραμμή SW480 ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου, όπου απορυθμισμένη δραστηριότητα σηματοδότηση Wnt έχει τεκμηριωθεί καλά. Αναφέρουμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της πρόσδεσης CTNNB1 και ρύθμιση της έκφρασης, καθώς και τον εντοπισμό ενός πυρήνα σύνολο 162 γονιδίων ως «Wnt γονίδια άμεσο στόχο» που δεσμεύονται και ενεργοποιούνται από CTNNB1. Το γονίδιο στόχος υπογραφή Wnt εμπλουτίστηκε σε φυσιολογική εντερική βλαστικών κυττάρων και CRCs αλλά απέτυχε να προβλέψει πρόγνωση των ασθενών CRC. Η μελέτη μας παρέχει μια σημαντική πηγή για την κατανόηση της βιολογίας του Wnt σηματοδότησης.

Αποτελέσματα

τσιπ επόμενα ανάλυση CTNNB1 χρωματίνης πληρότητας σε SW480 κύτταρα

SW480 κύτταρα περιέχουν μια μετάλλαξη αδρανοποίησης στο

APC

γονίδιο που οδηγεί σε ένα υψηλό επίπεδο συστατικώς σταθεροποιημένης πρωτεΐνης CTNNB1 στους πυρήνες [16], [17]. Για να συλλάβει την προφανώς δυναμική αλληλεπίδραση των CTNNB1 με χρωματίνης [18], [19], θα βελτιστοποιημένο πρωτόκολλο ChIP χρησιμοποιώντας ειδικό για την αμίνη πρωτεϊνών δια-συνδέτες πριν από την φορμαλδεΰδη cross-linking σε συνδυασμό με την πυρηνική εξαγωγή [20] (βλέπε μεθόδους) . Η ειδική δέσμευση της CTNNB1 πρώτα επικυρωθεί από ChIP-PCR για γνωστούς στόχους συμπεριλαμβανομένων των

MYC

και

Ι.ΕΡ1

(Εικόνα 1Α). DNA από πολλαπλά πειράματα ChIP χρησιμοποιώντας έλεγχο IgG αντισώματος ή ισοτυπικού ελέγχου αντι-CTNNB1 συνενώθηκαν για αλληλούχιση Solexa /Illumina, η οποία έδωσε περίπου 26 εκατομμύρια ατομικές ακολουθία 36 νουκλεοτιδίων διαβάζει σε κάθε εκτέλεση. Μόνο διαβάζει μοναδικά χαρτογραφηθεί στο ανθρώπινο γονιδίωμα (15,776,628 για την IgG ελέγχου και 17112552 για αντι-CTNNB1) χρησιμοποιήθηκαν για την επακόλουθη ανάλυση (Πίνακας 1). Model-Based Ανάλυση των τσιπ Seq (MACS) [21] εντοπίζονται 3629 CTNNB1 δεσμευτική κορυφή περιοχές (

σ

αξία ≤ 1Ε-5, FDR ≤ 5%) σε ολόκληρο το γονιδίωμα (Πίνακας 1). Περίπου το 60% των κορυφών βρίσκονται σε στενή εγγύτητα από τις περιοχές του γονιδίου που κωδικοποιεί συμπεριλαμβανομένων προαγωγό (2-kb 5 ‘πλευρική περιοχή, 21,5%), 5′-UTR (6,9%), το εξόνιο (5,5%), ιντρόνιο (21,6 %), 3’-UTR (3,2%) και κατάντη (2-kb 3 ‘πλευρική περιοχή, 0,5%) περιοχές (Σχήμα 1Β). Εμπλουτισμός CTNNB1 δέσμευσης στους προαγωγούς (21,5%) ήταν στατιστικώς σημαντική (

ρ

& lt? 0.001) σε σύγκριση με την κατανομή των τυχαία κορυφές παρόμοια μεγέθη (3.5 ± 0.2%). Συνεπής με μια προηγούμενη αναφορά [12], η μέγιστη διανομή συσχετίζεται σημαντικά με την εγγύτητα των μεταγραφικών θέσεων εκκίνησης (TSS) (Σχήμα 1 C). Δεδομένου ότι ένα CTNNB1 /TCF δεσμευμένο ενισχυτής μπορεί να δράσει εξ αποστάσεως από τη TSS [18], επιδιώξαμε για TSSs που βρίσκονται εντός 20 kb από τις παρατηρούμενες κορυφές, και εντόπισε 2.794 γονίδια που χρησιμοποιήθηκαν στη μετέπειτα ανάλυση για τον προσδιορισμό των άμεσων γονιδίων στόχων .

Α. βελτιστοποίησης

chip. Τσιπ PCR διεξήχθη για γνωστά στοιχεία CTNNB1 δέσμευσης σε MYC και LEF1 γονίδιο ρυθμιστικών περιοχών. * Αντι-PYGO2 αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος, καθώς PYGO2 πρωτεΐνη συνδέεται με την πρωτεΐνη CTNNB1-TCF /LEF συγκρότημα [51].

Β.

Διανομή CTNNB1 δεσμευτικών περιοχών στο γονιδίωμα σε σχέση με REFSEQ ανθρώπινα γονίδια. Ένα «προαγωγός» ορίζεται ως το 2-kb περιοχή ανάντη του TSS, ενώ ένα «κατάντη» περιοχή ορίζεται ως η 2-kb περιοχή κατάντι της θέσεως τερματισμού μεταγραφής. Διαγονιδιακή περιοχή αναφέρεται σε όλες τις θέσεις εκτός των «υποκινητής», 5′-UTR, ‘εξόνιο’, ‘ιντρόνιο »,« 3’-UTR », ή« προς τα κάτω ».

Γ.

Απόσταση από το κέντρο της κάθε κορυφής δεσμευτική CTNNB1 στην TSS του πλησιέστερου γονιδίου. Η κόκκινη γραμμή αντιπροσωπεύει μια τυχαία κατανεμημένες μοτίβο που δημιουργείται από τη λήψη 1,000 τυχαία μεταθέσεις των κορυφών.

Δ.

Πρόγραμμα MEME προσδιορίζει μια συναίνεση TCF /LEF-μοτίβο σύνδεσης εντός των τσιπ επόμενα κορυφές.

Η

Χρησιμοποιώντας Πολλαπλές EM για Motif εκμαίευση (MEME), ένα de novo πρόγραμμα μοτίβο ανακάλυψη [22], αναλύσαμε τις μοναδικές κορυφές CTNNB1 για την παρουσία του κάθε δυνατή συναίνεση μοτίβο. Μια εκτεταμένη σειρά TCF /LEF συναίνεση [12], [13] στην επιφάνεια ως κορυφαία μοτίβο (Ε value = 7.9e-1135) (Σχήμα 1D). Αρκετές άλλες υποψήφιες αλληλουχίες ταυτοποιήθηκαν επίσης? ωστόσο, φάνηκαν να αντιπροσωπεύουν επαναληπτικές αλληλουχίες, οι οποίες είναι κοινές αντικείμενα αυτής της ανάλυσης (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα επιβεβαιώνουν ότι CTNNB1 προσδένεται στο χρωματίνης κυρίως μέσω /LEF δέσμευσης DNA πρωτεΐνες TCF [11]. Αυτό είπε, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε τα πιθανά μοτίβα δέσμευσης που δεν έχουν εντοπιστεί από MEME, καθώς και την ύπαρξη άλλων συναφών μοτίβα που βρίσκονται εκτός των περιοχών κορυφής ChIP [12], [14]. Πράγματι, ένας k-μερές αναζήτησης [23] αποκάλυψε ότι η συναινετική αλληλουχία AP-1 (TGAYTCA) είναι σημαντικά εμπλουτισμένη σε σύγκριση με παρομοίου μεγέθους τυχαία γονιδιακών θραυσμάτων (

σ

= 1.78e-50), σύμφωνα με προηγούμενες εργασίες αναφοράς τον εμπλουτισμό του AP-1 μοτίβα σε στοιχεία CTNNB1 δεσμευτική [12].

Χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα περιήγησης UCSC γονιδίωμα (NCBI36 /hg18) [24], θα απεικονιστεί CTNNB1 σύνδεση με γνωστά γονίδια-στόχους Wnt /CTNNB1.

Axin2

είναι ένα κλασσικό στόχο και περιέχει πολλαπλά TCF /LEF δεσμευτικές περιοχές του υποκινητή και το πρώτο ιντρόνιο [25]. Τσιπ seq ανάλυσή μας πράγματι προσδιορίζονται πολλαπλές κορυφές σε

AXIN2

, με τις θέσεις τους αντιστοιχούν καλά με τις αναφερόμενες θέσεις πρόσδεσης (Σχήμα 2Α). Διαπιστώσαμε επίσης αιχμές κατά τα αναφερόμενα περιοχές άλλων γονιδίων γνωστών στόχων συμπεριλαμβανομένων των

MYC

[12] και

Ι.ΕΡ1

[26] (Σχήμα 2Β και C).

Ορατή είναι αποτελέσματα για CTNNB1 και IgG διανομές σε Ref-επόμενα γένος. Κόκκινα κουτιά δείχνουν τις θέσεις της συναίνεσης TCF /LEF-δεσμευτική μοτίβα. H3K4me1 και H3K4me3 τομείς από πολλαπλές Εγκυκλοπαίδεια του DNA Elements (ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ) Οι κυτταρικές σειρές εμφανίζονται ως αναφορές για τις περιοχές ενισχυτή /υποκινητή και υποστηρικτής, αντίστοιχα.

Η

Συνδυαστική ανάλυση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης δεσμευτική χρωματίνης και προσδιορίζει μια άμεση CTNNB1 γονίδιο στόχο την υπογραφή περιέχουν ρυθμιστές ανάδρασης του Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι

Για να προσδιοριστούν οι άμεσες και λειτουργικά γονίδια στόχους CTNNB1, αναλύσαμε το chip-επόμενα σύνολο δεδομένων κατά μεταγραφική δεδομένα προφίλ του ελέγχου και της CTNNB1 εξαντλημένο SW480 κύτταρα [27] . Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27], knockdown του CTNNB1 επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά CTNNB1 ειδικά siRNAs, που όταν δοκιμάζεται σε μία λειτουργική δοκιμασία χρησιμοποιώντας μια βήτα-κατενίνης Activated Reporter (BAR) [28] ήταν σε θέση να καταστείλει δραστηριότητα BAR από -99 % και 97% περίπου, αντίστοιχα. Πραγματοποιήσαμε Gene που εμπλουτισμό ανάλυση (GSEA) χρησιμοποιώντας την τροποποιημένη Kolmogorov-Smirnov test (KS) [29] για την αξιολόγηση των CTNNB1-δεσμεύεται γονίδια για την κατανομή τους στο σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχιών όπου τα γονίδια rank-διέταξε για διαφορική έκφραση τους μεταξύ ελέγχου και CTNNB1 εξαντλημένα κύτταρα. Η δοκιμή KS αποκάλυψε εξαιρετικά σημαντική συσχέτιση (

σ

= 0) ανάμεσα δεσμευτικός CTNNB1 και μεταβολές έκφρασης γονιδίου μετά CTNNB1 knockdown, και αυτό ήταν αλήθεια και με τα δύο siRNAs (Σχήμα 3Α και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η πλειοψηφία των CTNNB1 δεσμευμένα γονίδια συσχετίζεται θετικά, ενώ ένας μικρός αριθμός των γονιδίων συσχετίζεται αρνητικά, με την έκφραση CTNNB1 (Σχήμα 3Β). Αυτό είναι σύμφωνο με CTNNB1 δρουν κυρίως ως ένας μεταγραφικός ενεργοποιητής αλλά επίσης είναι ικανή καταστολή της έκφρασης ορισμένων γονιδίων [30].

Α-Β

. οικόπεδα KS που δείχνουν συσχέτιση μεταξύ δέσμευσης CTNNB1 και ρύθμιση της έκφρασης. Οι 2794 γονίδια CTNNB1-δεσμεύεται συγκρίθηκαν για την αντιστοιχία τους με τις αλλαγές έκφρασης κατά siRNA νοκ ντάουν της CTNNB1. Γονίδια στην μικροσυστοιχία ήταν ανάλογα με τη

σ

αξίας (

Μια

,

σ

= 4.4e-16) ή να πάει πάσο αύξηση (

Β

,

σ

= 0) σε κάθε GSEA

Η

Χρησιμοποιώντας μια συνδυαστική κριτήρια, δηλαδή, ρύθμιση προς τα κάτω στην ανάλυση μικροσυστοιχιών με

σ

& lt?. 0.01 και συνδεθείτε αναλογία & lt ? -0.2 μετά τη θεραπεία και των δύο siRNAs και εμφανίζει κορυφές δεσμευτική CTNNB1 εντός ± 20 kb από το TSS, εντοπίσαμε 162 γονίδια ως άμεσο και λειτουργικό Wnt στόχους (Πίνακας S1). Που περιλαμβάνονται σε αυτό το υπογραφής στόχος είναι γνωστοί οι στόχοι, όπως

AXIN2, CDX2, ID 2, Ι.ΕΡ1, LGR6, MSX1, NKD1, NKD2, SP5, TDGF1,

και

TNFRSF19

, που δείχνει την ισχύ του υπογραφή. Εμείς δειγματοληψία και 10 γονίδια από τη λίστα, και να χρησιμοποιηθεί τσιπ PCR για την επιβεβαίωση δέσμευσης στις αναμενόμενες θέσεις (Εικόνα 4Α) CTNNB1. Χρησιμοποιώντας ένα shRNA έναντι CTNNB1 που είναι διαφορετική από τις δύο siRNAs που χρησιμοποιούνται στην ανάλυση μικροσυστοιχιών, μπορούμε επικυρωμένη ότι knockdown του CTNNB1 οδήγησε σε μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω των περισσότερων από τις εξετασθείσες γονιδίων που περιλαμβάνουν

FASLG, IL10, LMO2, MPZL2, NOTUM , PPP1R2,

και

TREM2

(Εικόνα 4Β).

Μια

. ανάλυση τσιπ PCR των υποδεικνυόμενων γονιδίων χρησιμοποιώντας ένα ανεξάρτητα παρασκευάζεται δείγμα χρωματίνης.

Ι.ΕΡ1

και

GAPDH

χρησιμεύουν ως θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι, αντίστοιχα.

Β

. Ποσοτική RT-PCR των υποδεικνυόμενων γονιδίων. Μέση ± τυπική απόκλιση των 4 ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζονται.

Οι σ

τιμές υπολογίζονται με δίπλευρη πρότυπο

t-

δοκιμή. NS: μη σημαντική, *:

σ

& lt? 0,05 και **:

σ

& lt? 0,01

Η

Γονιδιακή Οντολογία (GO) όρος εμπλουτισμός με. Βάση δεδομένων για το σχολιασμό, Οπτικοποίηση, και Ολοκληρωμένη Discovery (David) [31] του 162-στόχο υπογραφή πρότεινε σημαντικές αναπτυξιακές λειτουργίες του μονοπατιού Wnt, συμπεριλαμβανομένων των εμβρυϊκών μορφογένεση απόφυση, την καρδιά, ή την ανάπτυξη των μυών (Πίνακας S2). GO ανάλυση αποκάλυψε επίσης γονίδια που εμπλέκονται σε αρκετές οδούς σηματοδότησης, που υποδηλώνουν τη δυνητική διασταυρούμενη συνομιλίες μεταξύ Wnt σηματοδότησης και αυτών των οδών. Συγκεκριμένα, σημαντικά ανιχνεύεται οδός GO όροι περιλαμβάνουν κυτοκίνη σηματοδότησης (

FASL, BMP7, CXCL4, CXCL6, CXCL14, EDAR, IL10RA, IL10, TNFRSF1B, TNFRSF11B, TNFRSF19

), μονοπάτια στον καρκίνο (

FASL, GLI3 , AXIN2, FGF3, FGF9, FGF19, Ι.ΕΡ1, WNT6, WNT11

), ή μονοπάτι σηματοδότησης Hedgehog (

GLI3, BMP7, WNT6, WNT11

) (Πίνακας 2).

Η

GO ανάλυση προσδιόρισε επίσης γονίδια που κωδικοποιούν συστατικά της σηματοδότησης Wnt ως στόχοι CTNNB1 και δημιουργείται μια εκτεταμένη λίστα των πιθανών ρυθμιστικών αρχών ανάδρασης (Πίνακας 3).

AXIN2, Ι.ΕΡ1, NKD1

και

NKD2

έχουν περιγραφεί ως αρνητικές ή θετικές ρυθμιστές ανάδρασης του μονοπατιού [25], [32], [33].

WNT6

και

WNT11

κωδικοποιούν συνδέτες Wnt που έχουν δυναμικό ρόλο ογκοπροάγουσες ακόμη και σε CRCs με

APC

μεταλλάξεις [34] και ότι έχουν την ικανότητα να σηματοδοτήσει την στρωματική εξαρτήματα για να διαμορφώνει το μικροπεριβάλλον του όγκου [35]. Άλλες ρυθμιστικές αρχές να τροφοδοτούν περιλαμβάνουν

APCDD1

,

NOTUM, PPP1R2

, και

ZNRF3

.

APCDD1

φέρεται να ρυθμίζει αρνητικά την πορεία στο στάδιο της αλληλεπίδρασης συνδέτη-υποδοχέα και η μετάλλαξη του είναι υπεύθυνη για αυτοσωματικό κυρίαρχο ασθένεια απώλεια μαλλιών, κληρονομική υποτρίχωση απλού [36].

NOTUM

κωδικοποιεί μια εκκρινόμενη α /β-υδρολάση, η οποία είναι γνωστό ότι ανταγωνίζεται Wnts απελευθερώνοντας glypicans από την κυτταρική επιφάνεια [37].

PPP1R2

γονιδιακό προϊόν αναστέλλει την πολύπλοκη πρωτεΐνη φωσφατάση 1, που ρυθμίζει το καθεστώς phospholyration της GSK3 [38] και, κατά συνέπεια, την υποβάθμιση CTNNB1 [39].

ZNRF3

κωδικοποιεί μία Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης που προωθεί ειδικά ουμπικουιτίνωση και την υποβάθμιση των Frizzled υποδοχέων [40], [41]. Όπως φαίνεται από τα παραπάνω, έχουμε επιβεβαιώσει

NOTUM

και

PPP1R2

να είναι καλόπιστη στόχους της CTNNB1. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η σηματοδότηση Wnt υπόκειται σε σύνθετη κανονισμούς ανατροφοδότηση.

Η

Η υπογραφή στόχος CTNNB1 είναι εμπλουτισμένο σε εντερικά βλαστοκύτταρα και ΚΕΣ αλλά δεν συσχετίζεται με την επιβίωση των ασθενών CRC

Lgr5

+ εντερικά κύτταρα ενεργώς ποδηλασία βλαστικά κύτταρα και το μονοπάτι σηματοδότησης Wnt /CTNNB1 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην αυτο-ανανέωσή τους [2]. Ως εκ τούτου, σε σύγκριση με την υπογραφή στόχο CTNNB1 που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη με αναφέρθηκε πρόσφατα γονίδιο υπογραφή (ένα σύνολο 510 γονιδίων που ταυτοποιήθηκαν από μικροσυστοιχιών με βάση το μεταγραφικό προφίλ και πρωτεϊνική μάζα φασματομετρίας προφίλ) που είναι εμπλουτισμένο σε Lgr5

+ εντερικά βλαστοκύτταρα [42 ]. Μια στατιστικά σημαντική επικάλυψη (

σ

& lt? 8.9e-07, παράγοντα εκπροσώπηση & gt? 4.1? Σύγκριση με τυχαία πιθανότητα) βρέθηκε: 17 γονίδια (~ 10%) στο γονίδιο-στόχο υπογραφή CTNNB1 ήταν επίσης μέρος της ο Lgr5

+ εντερική βλαστικών κυττάρων υπογραφή (Σχήμα 5Α, Πίνακας 4). GSEA σε μια δεδομένα μικροσυστοιχιών που από EphB2 εμπλουτισμένο εντερικό πληθυσμό βλαστικών κυττάρων από ανθρώπινα κύτταρα του επιθηλίου του παχέος εντέρου (GSE31257) [43] αποκάλυψε επίσης τον εμπλουτισμό των 162-στόχος-υπογραφή μας σε αυτά τα κύτταρα [Κανονικοποιημένο Εμπλουτισμός Βαθμολογία (NES) = 1.81, FDR

q

-τιμή = 0.0? Εικόνα 5Β]. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι άμεσες γονιδίων στόχων CTNNB1 στα κύτταρα SW480 επίσης δραστηριοποιείται στην φυσιολογική εντερική βλαστικών κυττάρων.

Μια

. Επικάλυψη μεταξύ του συνόλου του γονιδίου-στόχου CTNNB1 και την Lgr5

+ εντερική σύνολο γονιδίων βλαστικών κυττάρων.

σ

αξία και παράγοντα εκπροσώπηση highlight στατιστική σημασία σε σύγκριση με τυχαία πιθανότητα. Υπολογισμός αυτός βασίζεται στην υπόθεση ότι ο αριθμός του συνόλου των γονιδίων είναι 20000.

Β-Γ

. GSEA για τα 162 γονίδια με τη χρήση συγκριτικών δεδομένων μεταξύ EphB2

υψηλή ανθρώπινη εντερική βλαστικών EphB2

πληθυσμούς χαμηλού nonstem κυττάρων (

Β

) κυττάρων και, ή μεταξύ του καρκίνου του παχέος εντέρου και φυσιολογικά δείγματα ιστού (

C

).

η

για να διερευνήσουν το ενδιαφέρον του 162-στόχο υπογραφή σε κλινικά δείγματα, πραγματοποιήσαμε GSEA σε δεδομένα γονιδιακής έκφρασης από δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου (GSE41328) [44] . Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε μια εντυπωσιακή εμπλουτισμό της υπογραφής στόχο CTNNB1 σε δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου (NES = 2,01, FDR

q

-τιμή = 0.0? Σχήμα 5C). Χρησιμοποιήσαμε επίσης στη διάθεση του κοινού συνόλου δεδομένων γονιδιακής έκφρασης για να ελέγξετε εάν το 162-στόχο υπογραφή μπορεί να προβλέψει την έκβαση των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου [45]. Παρά τον εμπλουτισμό της υπογραφής σε δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου, δεν παρατηρήσαμε κάποια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της συνολικής έκφραση της υπογραφής και απαλλαγμένη από την ασθένεια μετά τη χειρουργική επέμβαση επιβίωση των ασθενών με καρκίνο παχέος εντέρου (Σχήμα 6Α). Αυτό είπε, η έκφραση αρκετών αρνητικών ρυθμιστών σχόλια που προσδιορίζονται στην παρούσα εργασία σχετίζεται με ένα καλύτερο ποσοστό επιβίωσης ελεύθερης νόσου. Για παράδειγμα, οι ασθενείς με υψηλό μέσο έκφρασης των

AXIN2, APCDD1, NKD1, NKD2

, και

NOTUM

έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερη ελεύθερη νόσου επιβίωση σε σύγκριση με την ομάδα χαμηλής εκφραστής (Εικόνα 6Β). Μαζί, τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν έναν εμπλουτισμό των γονιδίων στόχων άμεση CTNNB1 στα εντερικά βλαστοκύτταρα και κλινικά δείγματα CRC. Ωστόσο, μια σημαντική συσχέτιση με την πρόγνωση των ασθενών με CRC είναι περιορισμένη σε μια επίλεκτη υποσύνολο των γονιδίων στόχων CTNNB1, ήτοι των αρνητικών παραγόντων ανάδραση, και όχι ολόκληρο υπογραφή στόχο.

Ένα σύνολο 232 ασθενών κατηγοριοποιήθηκαν σε υψηλά ( κόκκινο) ή χαμηλή εκφραστές (μπλε) με βάση την έκφραση των γονιδίων 162 (

Α

) ή πέντε αρνητικά γονίδια ανάδρασης (

AXIN2, APCDD1, NKD1, NKD2, NOTUM)

(

Β

).

σ τιμές

υπολογίστηκαν με ανάλυση log rank.

Η

Συζήτηση

αμερόληπτη διαλογή γονιδιώματος κλίμακας μας για CTNNB1 γονιδίων-στόχων συνδυάζοντας τσιπ επόμενα και μικροσυστοιχιών αναλύσεις παρέχει μια σημαντικός πόρος για την έρευνα για τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Παρά τη σημαντική συσχέτιση μεταξύ της δέσμευσης της χρωματίνης και ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, η δουλειά μας αποκαλύπτει ένα μικρό αριθμό (162) των γονιδίων ως άμεση, λειτουργική στόχους CTNNB1 στο SW480 καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα. Αυτός ο αριθμός είναι σημαντικά μικρότερη από εκείνη του CTNNB1 δεσμευμένου loci ή του CTNNB1 αποκρίνονται γονιδίων, γεγονός που υποδηλώνει ότι δεν είναι όλα τα δεσμεύονται loci λειτουργικά χρησιμοποιούνται σε κύτταρα SW480 για μεταγραφική ρύθμιση, και ότι πολλές από τις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση εμφανίζεται ως έμμεσα αποτελέσματα της CTNNB1 εξάντληση. Θα μπορούσαμε να έχουμε χάσει μερικά συγκρατημένα ρυθμίζονται στόχους απαιτώντας την αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης για να εμφανιστούν κατά τη θεραπεία με δύο διαφορετικά siRNAs και χρησιμοποιώντας αυστηρές τιμές cut-off. Μερικά από τα CTNNB1 δεσμευμένου τόποι μπορούν να ρυθμίζονται σε ένα πλαίσιο-ειδικό τρόπο? για παράδειγμα, γονίδια που έχουν επιπλέον ρυθμίσεων, όπως αυτές σιγήσει DNA μεθυλίωση ή κατά κύριο λόγο ελέγχεται από άλλα /μεταφράσεως ρυθμιστές της μεταγραφής σε SW480 κύτταρα μπορεί να μην δείχνουν σημαντική μείωση στην μεταγραφή την εξάντληση CTNNB1. Παραμένει πιθανό ότι οι εν λόγω τόποι ρυθμίζονται από CTNNB1 σε άλλα κυτταρικά περιβάλλοντα.

πειράματα επικύρωσης μας προτείνουν ένα ποσοστό επιτυχίας 80% στην αναγνώριση των καλόπιστων στόχων CTNNB1 χρησιμοποιώντας τη γονιδιωματική προσέγγιση. Μια διαφορά στην απόδοση μεταξύ νοκ ντάουν si /Τα siRNAs ή εκτός στόχου επιπτώσεις της si /Τα siRNAs μπορεί να ευθύνεται για τα «ψευδή θετικά». Η υπογραφή στόχος CTNNB1 των 162 γονιδίων παρουσιάζει ορισμένα ενδιαφέροντα χαρακτηριστικά. Ακόμη πιο εντυπωσιακό είναι η παρουσία των ρυθμιστικών αρχών ανάδρασης του μονοπατιού. ρύθμισης της ανάδρασης του μονοπατιού Wnt /CTNNB1 έχει εδραιωμένη βάση τις μελέτες των μεμονωμένων γονιδίων [25]. Χρησιμοποιώντας σειριακή ανάλυση της χρωματίνης πληρότητας (SACO), CTNNB1 πληρότητα των στοιχείων του κανονικού μονοπατιού σηματοδότησης Wnt έχει ανακαλυφθεί [11]. διαπίστωσή μας ότι τα συστατικά Wnt μονοπάτι υπερεκπροσωπούνται στην υπογραφή στόχο CTNNB1 προσθέτει επιπλέον στοιχεία που να υποστηρίζουν αυτή τη σημαντική λειτουργία της ρύθμισης. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η μελέτη μας και τη μελέτη SACO [11] αποκαλύψει σε μεγάλο βαθμό διακριτά Wnt γονίδια οδού ως στόχοι CTNNB1: από τα 15 γονίδια που εντοπίστηκαν στη μελέτη SACO, μόνο 2 γονίδια (

AXIN2

και

WNT11

) βρέθηκαν στην λίστα μας από 10 γονίδια Wnt μονοπατιού (Πίνακας 2). Επιπλέον, σε σύγκριση με ένα άλλο CTTNB1 τσιπ seq μελέτη που χρησιμοποίησε κύτταρα HCT116 [12], μια επικάλυψη από 161 CTNNB1 δεσμευμένου γονιδίων βρέθηκε μεταξύ των 988 γονιδίων που προσδιορίζονται σε αυτή τη μελέτη και τα 2794 γονίδια που ταυτοποιήθηκαν στην τρέχουσα μελέτη. Ακόμα κι αν η επικάλυψη είναι στατιστικά σημαντική (

σ

& lt? 4.8e-07), ένας σημαντικός αριθμός γονιδίων στόχων ήταν ειδική για κάθε μελέτη. Αυτό μπορεί εν μέρει να οφείλεται σε διαφορά στην ρύθμιση των παραμέτρων ή των δυνητικών θορύβους στην ανάλυση, αλλά θα μπορούσε επίσης να αντικατοπτρίζει μια πραγματική διαφορά στη λειτουργία CTNNB1 μεταξύ των CRC κυτταρικές σειρές (HCT116 εναντίον SW480) που χρησιμοποιούνται στις δύο μελέτες. Πράγματι, μια διαφορά στα πρότυπα μεθυλίωσης του DNA των γονιδίων στόχων Wnt μεταξύ HCT116 και SW620, ένας λεμφαδένας μεταστατική παραλλαγή SW480, έχει αναφερθεί [46]. Ως εκ τούτου, το έργο μας αποκαλύπτει νέες πτυχές της ρύθμισης της ανάδρασης της Wnt /CTNNB1 σηματοδότηση. Εξομάλυνσης των βραχυχρόνιων διακυμάνσεων της εξόδου σηματοδότησης Wnt από πολλαπλούς μηχανισμούς ανάδρασης μπορεί να είναι σημαντική για την ακριβή χωροχρονική ρύθμιση της δραστηριότητας του κατά τη διάρκεια διαμόρφωση και διατήρηση της ομοιόστασης των ιστών ιστού. Επιπλέον, η δυσλειτουργία αυτών των μηχανισμών μπορεί να συνεισφέρουν σε παθολογικές καταστάσεις όπως ο καρκίνος [47].

Ακόμη και για ένα σχετικά μικρό αριθμό γονιδίων στο 162-στόχος-υπογραφή, οι σχετικές λειτουργικές όροι εμφανίζονται απροσδιόριστες και ποικίλα. Αυτό είναι σύμφωνο με τις αποκλίνουσες βιολογικές επιπτώσεις της Wnt /CTNNB1 σηματοδότηση [2]. Η υπογραφή περιλαμβάνει έναν αριθμό μεταγραφικών ρυθμιστών (Πίνακας S1), εμπλέκοντας την ύπαρξη της δευτεροβάθμιας /έμμεση μεταγραφική στόχους. Η αναγνώριση της άμεσης CTNNB1 /στόχοι TCF από άλλους [11] – [14] και το έργο αυτό παρέχει ένα πλαίσιο για να αναλύσουμε τις σχετικές συνεισφορές των άμεσων και έμμεσων γονιδίων-στόχων με τις βιολογικές επιδράσεις της οδού

Είναι. αναγνωρίζεται ευρέως ότι η απορρύθμιση του μονοπατιού Wnt /CTNNB1 είναι ένα βασικό βήμα για την έναρξη της εντερικής ογκογένεση [48]. Αυτή η απορρύθμιση πιστεύεται ότι συμβαίνει στον εντερικό πληθυσμό των βλαστικών κυττάρων ότι η αύξηση του όγκου των καυσίμων [5], [6]. Σύμφωνα με αυτή την έννοια, βρήκαμε η υπογραφή στόχος CTNNB1 να εμπλουτιστεί σημαντικά σε απομονωμένα εντερικά βλαστοκύτταρα, καθώς και σε κλινικά δείγματα CRC. Ωστόσο, δεν παρατηρήσαμε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της υπογραφής στόχου και την πρόγνωση των ασθενών CRC. Αυτό είναι ενδιαφέρον δεδομένου ότι η αυξημένη έκφραση του εντερικού βλαστοκυττάρων υπογραφή προβλέπει κακή πρόγνωση των ασθενών με CRC [46], [49] και ότι η απορρύθμιση του Wnt οδού έχει γίνει γνωστό ως σήμα κατατεθέν της CRC [50]. Το γεγονός ότι η CTNNB1 στοχεύουν υπογραφή περιλαμβάνει έναν αριθμό παραγόντων ανάδρασης μπορεί να περιπλέξει το σενάριο. Για παράδειγμα, η καταστολή των αρνητικών ρυθμιστών ανατροφοδότησης μπορεί να μετατραπεί στην ογκογόνο Wnt δραστηριότητα σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα, αλλά δεδομένου ότι αυτά ανάδρασης Παράγοντες οι ίδιοι είναι Wnt στόχοι, η συνολική πρότυπο έκφρασης γονιδίου-στόχου Wnt μπορεί να μην φαίνεται να συσχετίζονται με την πρόγνωση. Πράγματι, αποσιώπηση της Wnt γονίδια-στόχους μέσω μεθυλίωσης υποστηρικτής έχει σημειωθεί σε CRCs με φτωχή πρόγνωση [46]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση επιλεγμένων αρνητικών παραγόντων ανατροφοδότηση από τη λίστα γονίδιο μας συσχετίζεται πράγματι θετικά με την επιβίωση των ασθενών με CRC (Εικόνα 6Β). Σε αυτές τις περιπτώσεις όπου φιμώνονται οι αρνητικοί ρυθμιστές ανάδρασης του μονοπατιού, το μέσο έκφρασης του γονιδίου-στόχου μπορεί να μην αντανακλούν την πραγματική δραστηριότητα σηματοδότησης του μονοπατιού. Έτσι, η παρούσα μελέτη και άλλοι [46] δείχνουν ότι οι προσεκτικές εκτιμήσεις των πολύπλοκων κανονισμών και της εξάρτησης πλαίσιο δικαιολογημένη όσον αφορά την κλινική χρησιμότητα των διαφόρων Wnt συνόλων γονιδίων στόχων που έχουν προκύψει στη βιβλιογραφία. Η μελέτη μας προσθέτει σε μια συνολική θεώρηση της ρύθμισης σηματοδότησης Wnt στα ΚΕΣ που έχει μελετηθεί για δεκαετίες, αλλά ακόμα να γίνουν πλήρως κατανοητές.

Συμπέρασμα

στοιχεία μας παρέχουν ένα γονιδίωμα-ευρεία άποψη του γονιδίου ρύθμιση από Wnt /CTNNB1 σηματοδότησης σε CRCs. Η ανάλυση του γονιδίου στόχου αποκάλυψε πολλαπλά στρώματα της ρύθμισης ανατροφοδότησης του μονοπατιού Wnt /CTNNB1. Το γονίδιο υπογραφή άμεσος στόχος CTNNB1 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε εντερικό βλαστικών κυτταρικών πληθυσμών και τα καρκινικά κύτταρα, αλλά δεν έδειξε σημαντική συσχέτιση με την επιβίωση των ασθενών CRC. Αυτή η μελέτη παρέχει μια σημαντική πηγή για την κατανόηση των πολύπλοκων και αποκλίνουσες λειτουργίες της Wnt /CTNNB1 οδού.

Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

SW480 κύτταρα ελήφθησαν από την ATCC και διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο Eagle μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου.

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) και υψηλής απόδοσης αλληλούχηση

ChIP διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο από την Millipore με κάποιες τροποποιήσεις. κύτταρα SW480 ήταν εγκάρσια συνδεδεμένα πρώτα με ένα κοκτέιλ από παράγοντες σχηματισμού δεσμών πρωτεΐνης-πρωτεΐνης [0.67 mM θειικού διηλεκτριμιδυλίου (DSS), 0.67 mM διηλεκτριμιδυλεστέρα γλουταρικό (DSG), και 0,67 mM glycolbis αιθυλένιο (ηλεκτριμιδυληλεκτρική) (EGS)] [20] για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια σε 0.75% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά στους 37 ° C. Μετά την πλύση, χρωματίνη ήταν ψαλιδισμένα σε ~100-300-bp θραύσματα χρησιμοποιώντας ένα Bioruptor (Diagenode Inc.). Τα λύματα προκαταρκτική διαύγαση με πρωτεΐνη Α Dynabeads (Invitrogen) για μία ώρα στους 4 ° C, και μικρά δείγματα του ανακτημένου υπερκείμενου υποβλήθηκαν σε αντίστροφη εγκάρσιας σύνδεσης και ο καθαρισμός του DNA (ως δείγματα εισόδου). δειγμάτων εισόδου χρησιμοποιήθηκαν για να μετρηθεί η συγκέντρωση της χρωματίνης DNA και ανοσοκαθίζηση εκτελέστηκε με 25 μg χρωματίνη περιέχει DNA στους 4 ° C όλη τη νύχτα με IgG ελέγχου (Santa Cruz Biotechnology, sc-2027) ή αντι-CTNNB1 αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, sc-7199). Ανοσο-σύμπλοκα στη συνέχεια καθαρίστηκαν με Dynabeads πρωτεΐνη Α και αντίστροφα διασυνδεδεμένο με επώαση με 200 mM NaCl στους 65 ° C για 5 ώρες. Μετά την επεξεργασία με πρωτεϊνάση Κ επί 1 ώρα, Chip DNA ανακτήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού QIAquick PCR (Qiagen, 28104). Βιβλιοθήκη γενιά έγινε χρησιμοποιώντας ομαδοποιημένα δείγματα DNA τσιπ από τέσσερις ανεξάρτητες προετοιμασίες ChIP χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο Illumina. Εν συντομία, τα άκρα θραύσματος DNA τσιπ επισκευάζονται και φωσφορυλιώθηκαν χρησιμοποιώντας Klenow, Τ4 DNA πολυμεράση και Τ4 πολυνουκλεοτιδική κινάση (Illumina συστατικά του κιτ). Μετά τη σύνδεση του Illumina προσαρμογείς, ΟΝΑ επιλεγμένο μέγεθος καθαρισμός με γέλη και στην συνέχεια ενισχύονται με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές Illumina. Αλληλουχίας διεξήχθη σε Ambry Genetics σε Illumina Γονιδιώματος Analyzer IIx, μία λωρίδα ανά δείγμα, 36-bp αλληλουχίας μονήρεις.

Το πείραμα επικύρωσης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση τσιπ PCR με εκκινητές παρατίθενται στον Πίνακα S3.

μικροσυστοιχιών ανάλυση

Η ανάλυση αυτή δημοσιεύθηκε στο παρελθόν [27], καθώς και πειραματικές λεπτομέρειες έχουν ως εξής. Δύο-χρώμα μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε εις διπλούν για SW480 κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο (siRNA εναντίον γονίδιο της λουσιφεράσης) και δύο ανεξάρτητες siRNAs κατά CTNNB1 (CTNNB1 # 1 προς τα εμπρός? CUAUCUGUCUGCUCUAGUATT, αντίστροφη? UACUAGAGCAGACAGAUAGTT, CTNNB1 # 2 προς τα εμπρός? CUGUUGGAUUGAUUCGAAATT, αντίστροφη? UUUCGAAUCAAUCCAACAGTT), αντίστοιχα. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). cDNA συντέθηκε με Cy3 (έλεγχος) και Cy5 (CTNNB1 siRNA) επισήμανση, χρησιμοποιώντας μια προσαρμοσμένη αυτοματοποιημένη έκδοση του αμινοαλλυλο κιτ MessageAmp II (Life Technologies). Τα επισημασμένα δείγματα υβριδοποιήθηκαν με Rosetta /Merck Ανθρώπινα 44K 1,1 μικροσυστοιχία (GPL4372) με επώαση στους 40 ° C για 48 ώρες σε ένα περιστρεφόμενο καρουσέλ. Μετά την πλύση για την απομάκρυνση μη ειδικών υβριδοποιήθηκαν δείγματα, μικροσυστοιχίες ξηράνθηκαν σε θάλαμο άζωτο όζον. Μικροσυστοιχίες σαρώθηκαν με τη χρήση του σαρωτή λέιζερ Agilent LP2. Η έξοδος scanner είναι ένα αρχείο TIFF, η οποία περιέχει ποσοτικά στοιχεία υβριδισμού από κάθε μικροσυστοιχιών. Τα αρχεία TIFF στη συνέχεια σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας Rosetta λογισμικό εξόρυξης έθιμο χαρακτηριστικό, το οποίο εκτελεί μοντελοποίηση σφάλμα. Τα δεδομένα στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το σύστημα Rosetta Resolver®, το οποίο εκτελεί μια λειτουργία συμπίεσης που συνδυάζει τις επαναλήψεις της ίδιας αλληλουχίας σε μια συστοιχία ενώ εφαρμόζεται διορθωτικός συντελεστής σφάλματος. Η στάθμιση σφάλμα αποτελούνταν από προσαρμογή για το συμπλήρωμα και πολλαπλασιαστική θόρυβο.