Αφηρημένο

Αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν εξετάσει τη λειτουργία και την εξέλιξη του ομολόγου Drosophila να το ανθρώπινο γονίδιο ευαισθησίας στον καρκίνο του μαστού

BRCA2

, που ονομάζεται

dmbrca2

. Έχουμε ήδη εντοπιστεί αυτό που φαινόταν να είναι μια πρόσφατη επέκταση στην RAD51-δεσμευτική BRC-επαναλαμβάνω σειρά στην πρόγονο του

Drosophila Yakuba

. Σε αυτή τη μελέτη, εξετάζουμε τα πρότυπα της μεταβολής και εξέλιξης του

dmbrca2

BRC-επαναλαμβάνω σειρά μέσα στο

Δ. Yakuba

και στενούς συγγενείς του. Έχουμε αναπτύξει ένα μοντέλο για το πώς η άνιση πέρασμα μπορεί να παραχθεί η εκτεταμένη μορφή, αλλά παρατηρούμε επίσης σύντομες μορφές επανάληψης, τυπικά άλλων ειδών στο

Δ. melanogaster

ομάδα, διαχωρισμό μέσα στο

Δ. Yakuba

και

Δ. santomea

. Αυτές οι σύντομες μορφές δεν φαίνεται να είναι ταυτόσημη προς την κάθοδο, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ιστορία του

dmbrca2

στο

Δ. melanogaster

υποομάδα περιελάμβανε συσπάσεις μονάδα επανάληψης με αποτέλεσμα homoplasious μορφές. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η εξελικτική ιστορία του

dmbrca2

στο

Δ. Yakuba

και ίσως και σε άλλα είδη Drosophila μπορεί να είναι πιο περίπλοκη από ό, τι μπορεί να συναχθεί από την εξέταση των δημοσιευμένων ακολουθιών ενιαία γονιδιώματος ανά είδος

Παράθεση:. Bennett SM, Mercer JM, Noor MAF (2010) H ολίσθηση συρόμενο Away: Serial Αλλαγές και Homoplasy στο Επαναλάβετε Αριθμός στο

Drosophila Yakuba

ομόλογο του Ανθρώπου Καρκίνου Ευαισθησίας Gene

BRCA2

. PLoS ONE 5 (6): e11006. doi: 10.1371 /journal.pone.0011006

Συντάκτης: William J. Murphy, Texas A Αν είναι πραγματικό, είναι αυτή η υψηλότερη επανάληψη μορφή αριθμού πανταχού παρούσα σε όλες τις

Δ. Yakuba

στελέχη, ή είναι μια μικρότερη μορφή παρούσα σε φυσικούς πληθυσμούς; Μπορούμε να συμπεράνουμε την ιστορική αλλαγή στον αριθμό των επαναλήψεων με την ανάλυση αλληλουχίας νουκλεοτιδίων; Και τέλος, αν υπάρχουν εναλλακτικές μορφές, μπορούμε να εντοπίσει ενδείξεις των συνδεδεμένων φυσική επιλογή στην εξάπλωση του μεγάλου αριθμού μορφή επαναλάβετε; Σε αυτή τη μελέτη, ερευνούμε την ακολουθία και την εξέλιξη του αριθμού των BRC επαναλαμβάνει το ομόλογο Drosophila του

BRCA2

στο

Δ. Yakuba

και είδη αδελφή του

Δ. santomea

και τοποθετήστε το σε ένα εξελικτικό πλαίσιο. Η κατανόηση των μοντέλων που παρατηρούνται σε αυτά τα είδη μπορεί να μας επιτρέψει να γνωρίσουμε καλύτερα τις γενετικές διεργασίες που επηρεάζουν αυτό το γονίδιο που είναι σημαντικό για τη βασική διαδικασία του ανασυνδυασμού και της ανθρώπινης υγείας γενικότερα.

Υλικά και Μέθοδοι

Drosophila

Αποθέματα

Drosophila Yakuba

και

Δ. santomea αποθέματα

που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη λήφθηκαν από τον Δρ Jerry Coyne [20]. Οι μύγες διατηρήθηκαν σε απόλυτη αιθανόλη μέχρις ότου το DNA εκχυλίζεται στο εργαστήριο μας.

Απομόνωση DNA, PCR Ενίσχυση και καθορισμός αλληλουχίας

Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από τους ενήλικες του

D. Yakuba

και

Δ. santomea

με ένα ενιαίο πρωτόκολλο μύγα squish [21]. Εναρκτήρες για PCR ενίσχυση σχεδιάστηκαν από την δημοσιευμένη

D. Yakuba

συνέλευση ακολουθίας του γονιδιώματος [22]. Οι εκκινητές σχεδιάζονται από το

dmbrca2

περιοχή χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν με PCR τμημάτων του γονιδίου σε 25 όγκους αντίδραση μL. Τα μεγέθη των προϊόντων PCR επιβεβαιώθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1%. Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας ExoSAP-It (USB Corp) και αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας ΑΒΙ BigDye στη μονάδα αλληλούχισης Duke University IGSP. Αλληλουχίες κατατέθηκαν στις βάσεις δεδομένων GenBank /EMBL με αύξοντες αριθμούς HM146151-HM146174.

Αναλύσεις δεδομένων

αλληλουχίες DNA που ευθυγραμμίστηκαν υπολογιστικά χρησιμοποιώντας BioEdit 7.0.9 [23], και στη συνέχεια τροποποιήθηκε με χειροκίνητη ευθυγράμμιση . DNAsp [24] χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της πολυμορφίας νουκλεοτιδίων (pi) και D Tajima του [25], για το

dmbrca2

περιοχή. Έχουμε λάβει τις τιμές των D Tajima για παρόμοιες θέσεις στο

Δ. Yakuba

και

Δ. santomea

από Llopart

et. al.

[26] για σύγκριση.

Εμείς εξέτασε τις αλληλουχία περιοχών για κάθε στέλεχος και να τους σε σύγκριση με την πλήρη συναρμολογημένη αλληλουχία αυτής της περιοχής από τη δημοσιευμένη

Δ. Yakuba

γονιδίωμα [22]. Στο δημοσιευμένο περιοχή του γονιδιώματος, θα κατηγοριοποιηθούν οι πέντε διακριτές BRC επαναλαμβάνει τη χρήση διαγνωστικών αμινοξέα και τις διαφορές μεγέθους, με αρίθμησή τους αριθμητικά 1 έως 5 από 5 ‘άκρο [18]. Εμείς μεταφραστεί την ακολουθία DNA των εξονίων αλληλουχιών στελεχών μας και με το χέρι σε σύγκριση κάθε μεμονωμένη επανάληψη στα αριθμημένα επαναλήψεις γονιδίωμα χρησιμοποιώντας το διαγνωστικό αμινοξέα και τις διαφορές μεγέθους.

Η φυλογενετική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με PAUP * 4.0b10 [27 ]. επαναλαμβανόμενα μοτίβα BRCA2 για

Δ. melanogaster

(DME),

Δ. sechellia

(ΔΣΕ),

Δ. simulans

(DSI),

Δ. erecta

(Der), και

Δ. Yakuba

(ΔΥΑ) ελήφθησαν από τα γονιδιώματα αναφοράς FlyBase, και σε συνδυασμό με

Δ. santomea

(DSA) και επιπλέον

Δ. Yakuba

ακολουθίες που συλλέγονται για το έργο αυτό.

Δ. Yakuba

χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για την αρίθμηση επαναλαμβανόμενα μοτίβα: 1-5 από το αμινο-άκρο προς καρβοξυτελικό άκρο του πεπτιδίου.

Δ. persimilis

επανάληψης 2 (Dpe2) χρησιμοποιήθηκε ως εξω. ευθυγραμμίσεις ακολουθία έγιναν στο Seaview έκδοση 4.0 [28] με πρόσθετες προσαρμογές με το μάτι. Τα μοτίβα αλληλουχίας που οριοθετείται από τη μεγάλη Pfam κρυμμένο μοντέλο Markov 35 αμινοξέων (HMM) για επαναλήψεις BRCA2 [29]. Λόγω του μικρού μήκους ακολουθία και μέτρια επίπεδα παραλλαγή ακολουθίας, γείτονα-που ενώνει με μη διορθωμένη p-αποστάσεις επιλέχθηκε για την εκτίμηση δέντρο.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Πριν από φυλογενετική ανάλυση των δημοσιευμένων em

Δ. melanogaster

αλληλουχίες γονιδιώματος υποομάδα για τις επαναλήψεις αποκάλυψαν δύο μεγάλες κλάδους: όλα ζυγές επαναλήψεις και όλα με μονό αριθμό επαναλήψεων [18].

Δ. Yakuba

επαναλάβετε 3 (Dya3) ανήκε στο μονό αριθμό κλάδος, αλλά ήταν ασυνήθιστο να μην ομαδοποίηση είτε με την πρώτη ή την τρίτη επαναλήψεις, αλλά αντ ‘αυτού υπόλοιπα βασικά σε δύο (βλέπε Εικόνα 2). Οπτική εξέταση του αμινοξέος και αλληλουχίες νουκλεοτιδίων αποκάλυψε ότι το 3 ‘άκρο του Dya3 επιβαρύνθηκαν ισχυρή ομοιότητα αλληλουχίας προς Dme1 και Der1, ενώ το 5’ άκρο διέθετε μερικές διαγνωστικές αμινοξέα που έμοιαζε Dme3 και Der3 (Σχήμα 3). Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι έχει συμβεί μια άνιση διάβαση πάνω περίπτωση (Σχήμα 4) μεταξύ της επανάληψης 1 και επαναλάβετε 3 που οδηγεί σε επανάληψη την επέκταση από μια προγονική 3 BRC επαναλαμβάνει σε προέρχεται κατάσταση των 5 επαναλήψεων ιστορικά στο

D . Yakuba

καταγωγή. Αν και η Dya2 και Dya4 επαναλαμβάνει σύμπλεγμα φυλογενετικά, το 17% απόκλιση αλληλουχίας αμινοξέων και κενό 18 αμινοξέων στη δημοσιευμένη αλληλουχία του γονιδιώματος του Dya4 σε σχέση με Dya2, δείχνουν ότι ένα τέτοιο γεγονός, εάν πράγματι συνέβη καθόλου, δεν συμβαίνουν σε πολύ πρόσφατο παρελθόν.

οι αλληλουχίες που περιλαμβάνονται προέρχονται από

Drosophila melanogaster

(DME),

Δ. Yakuba

(ΔΥΑ),

Δ. sechellia

(ΔΣΕ),

Δ. erecta

(Der), και

Δ. simulans

(DSI). Dya3c και Dya3n υποδεικνύουν περιοχές της επανάληψης 3 5 ‘και 3’, αντίστοιχα.

Η

Αυτές οι μεταφράσεις αμινοξέος από τις δημοσιευμένες αλληλουχίες του γονιδιώματος του

Drosophila melanogaster

(DMEL),

ΡΕ. Yakuba

(ΔΥΑ),

Δ. sechellia

(ΔΣΕ),

Δ. erecta

, και

Δ. simulans

(DSI) είναι ευθυγραμμισμένα και χρωματικό κώδικα για να επισημάνετε τις ομοιότητες μεταξύ τους. Δ Yakuba επαναλάβετε 3 (Dya3) χωρίζεται σε δύο μισά που φαίνεται στην ομάδα ως εξής, το 3 ‘άκρο με τα πρώτα επαναλήψεις και το 5’ άκρο με το 3ο επαναλήψεις.

Η

η

Δ. Yakuba

ομόλογο του

dmbrca2

στη δημοσιευμένη αλληλουχία του γονιδιώματος περιέχει 5 BRC επαναλήψεις [18]? Ωστόσο, όταν οπτικοποιείται τα ενισχυμένα προϊόντα PCR του παρόντος επαναληπτική περιοχή σε 43

D. Yakuba

και 18

Δ. santomea

στελέχη, βρήκαμε δύο σαφώς διαφορετικές μεγέθους ζώνες. Το μεγαλύτερο προϊόν, που παρατηρήθηκαν σε 57 από τις 61 στελεχών, αντιστοιχούσε με το αναμενόμενο μέγεθος για 5 BRC επαναλήψεις. Ως εκ τούτου, η μορφή 5-επανάληψη παρατηρήθηκε στη δημοσιευμένη αλληλουχία του γονιδιώματος δεν είναι σταθερό εντός φυσικούς πληθυσμούς. Αυτή η παραλλαγή αριθμός επανάληψης επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση 11 από τις μεγάλες στελέχη και όλα 4 από τις σύντομες μορφές, αποδεικνύοντας ότι οι μεγάλες μορφές κατείχαν τα αναμενόμενα 5 διακριτές επαναλήψεις BRC ενώ τα βραχυπρόθεσμα στελέχη κατείχαν μόνο 3.

Εμείς ευθυγραμμιστεί η προβλεπόμενες αλληλουχίες αμινοξέων, σε σύγκριση με τους μεμονωμένους δημοσιεύθηκε επαναλήψεις γονιδιώματος (και ειδικά αμινοξέα που εμφανίστηκε «διαγνωστικό» σε σχέση με Dya2 και Dya4), και ανακάλυψε τι φαίνεται να είναι πολλαπλές σύντομες μορφές.

Δ. Yakuba

στέλεχος Cascade 21 και

Δ. santomea

στέλεχος LAGO 1482 το καθένα έχει 3 συνολικά επαναλήψεις, οι οποίες περιλαμβάνουν 1

ου και 3

ου επαναλήψεις που μοιάζουν με το πλήρες 1

ου και 5

ου επαναλήψεις το δημοσιευμένο

D . Yakuba

αλληλουχία του γονιδιώματος. Τους 2

nd επανάληψη, ωστόσο, αρχίζει με την μοιάζει με το 2

nd γονιδίωμα επανάληψης που βασίζεται σε ένα διαγνωστικό αμινοξέος και την παρουσία ενός περιοχή 18 αμινοξέων ειδικά για Dya2-βουτ διακόπτες στα μέσα για να μοιάζουν με Dya4 με βάση 4 διαγνωστικά αμινοξέα (βλέπε Σχήμα 5).

Δ. Yakuba

στέλεχος Cascade 24 και

Δ. santomea

στέλεχος STO 7 έχουν επίσης μόνο 3 επαναλήψεις, αλλά πολύ περισσότερο από δευτερόλεπτα επανάληψης τους μοιάζει Dya4, συμπεριλαμβανομένης της κολόβωση 18 αμινοξέων (Εικόνα 5). Η διαφορά αυτή υποδηλώνει ότι τουλάχιστον μία περίπτωση περικοπή οδήγησε στην εμφάνιση μιας νέας μορφής με 3 BRC repeats- και αυτές οι σύντομες μορφές μπορεί να είναι ανεξάρτητη διαγραφές από μια μακρά, 5 επαναλάβετε μορφή.

Αυτές οι μεταφράσεις αμινοξέος είναι από Dya2, Dya4,

Δ. Yakuba

στελέχη Cascade24 και Cascade 21,

Δ. santomea

στελέχη STO7 και LAGO1482, Der και DME. Οι αστερίσκοι πάνω από την ευθυγράμμιση δείχνουν τις περιοχές που έχουν διαφορές μεταξύ των αλληλουχιών του γονιδιώματος που δημοσιεύθηκε Dya2 και Dya4, αλλά δεν είναι σταθερά μεταξύ των στελεχών αλληλουχία 5-επανάληψη του

D. Yakuba

(γεγονός που υποδηλώνει ότι δεν είναι «διαγνωστικό»).

Η

Αυτή η παρατήρηση του homoplasious 3 μορφές επανάληψης αλληλόμορφο θέτει το ερώτημα του κατά πόσον η φαινομενική σταθερότητα αυτής της μορφής στο

Δ. melanogaster

ομάδα διαψεύδει κρυφές επεκτάσεις και συστολές σε αριθμό επανάληψης. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, εξετάσαμε προσεκτικά την δημοσιεύθηκε

dmbrca2

ακολουθία

Δ. erecta

(η οποία, δυστυχώς, δεν έχει άλλα στελέχη διαθέσιμα για άμεση αλληλούχιση). Η

Δ. erecta

2

ου επαναλαμβανόμενη αλληλουχία αμινοξέων BRC έμοιαζε μέρη του

Δ. Yakuba

2

ου και 4

ου BRC επαναλαμβάνει κατά τρόπο σύμφωνο με αυτό που προέρχεται από ένα διαγραφή των πέντε επανάληψη μορφή (βλέπε Εικόνα 5). Συγκεκριμένα, φέρει τα 18 αμινοξέα που υπάρχουν σε Dya2 αλλά όχι Dya4, αλλά έχει τρία αμινοξέα διαγνωστική Dya4 στο 3 ‘άκρο του. Ως εκ τούτου, σε αντίθεση με την φυλογενετική υπόθεση στο Σχήμα 4, το

D. erecta

3-επανάληψης μορφή μπορεί να έχουν προκύψει δευτερευόντως από ένα προγονικό 5-επανάληψης μορφή. Η

dmbrca2

ακολουθία

Δ. melanogaster

δείχνει επίσης μια δυνητικά παρόμοιο μοτίβο (Σχήμα 5), αλλά τα συμπεράσματα είναι πιο δύσκολη λόγω της πολύ μεγαλύτερης απόκλισης αλληλουχίας και δυνατές πολλαπλές εξελικτικές αλλαγές στην αλληλουχία αμινοξέων ανά.

Για να δοκιμαστεί για την υπογραφή των φυσικών επιλογή για την άφθονη 5-επαναλαμβάνω μορφή, υπολογίσαμε D Tajima στο

Δ. Yakuba

(D = -0.68518) και

Δ. santomea

(D = -0.27805). Δεν ήταν σε θέση να υπολογίσει Tajima για την σύντομη φόρμα λόγω των πολύ χαμηλών συχνοτήτων του μεταξύ δειγμάτων μας (και ότι ορισμένες από τις σύντομες αλληλόμορφα δεν είναι επίσης όμοια κατά την κάθοδο). Ωστόσο, σε σύγκριση με τις τιμές D Tajima είναι η 5-επανάληψη φόρμας με τις δημοσιευμένες τιμές D Tajima από

Δ. Yakuba

και

Δ. santomea

για άλλους τόπους που βρίσκονται ομοίως σε περιοχές μειωμένης πέρασμα [26], λόγω της θέσης του

dmbrca2

κοντά στο τελομερών των χρωμοσωμάτων 2 και τις γνωστές επιδράσεις των χαμηλών ποσοστών ανασυνδυασμού σε φάσματα συχνοτήτων ιστοσελίδα [ ,,,0],30]. Οι παρατηρούμενες τιμές για

dmbrca2

ήταν καλά εντός του εύρους αυτών των άλλων δημοσιευθεί τιμές (

D Yakuba

:.. Μέση τιμή = -0,34, -1,03 έως 1,05 φάσμα?

D santomea

: μέσος όρος = -0.29, εύρος -1,27 έως 1,03), ως εκ τούτου, μας επιτρέπει να αποκλείσουμε άτυπες πιέσεις επιλογής αυτού του τόπου

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η εξελικτική ιστορία του

dmbrca2

σε

Δ. Yakuba

, και ίσως και σε άλλα

Drosophila melanogaster

είδη υποομάδα, είναι πιο περίπλοκη από ό, τι μπορεί να θεωρηθεί ότι από την εξέταση των μεμονωμένων δημοσιευμένες αλληλουχίες γονιδιώματος ανά είδος, και προειδοποιούν ενάντια χαρακτηρίζουν ολόκληρο το είδος ή εξελικτικές διαδικασίες από αυτές τις περιορισμένα δεδομένα (π.χ., [13]). Σας παρουσιάζουμε ένα μοντέλο για μια αρχαία επέκταση στο

dmbrca2

BRC αριθμό επανάληψης στο

Δ. Yakuba

(βλέπε σχήμα 4) και δείχνουν ότι παρατηρείται μικρότερη αλληλόμορφα στο

Δ. Yakuba

,

Δ. santomea

, και ίσως

Δ. erecta

και άλλα είδη προέκυψαν από συσπάσεις της προγονικής μεγάλη μορφή, παράγοντας homoplasious αλληλόμορφα. Τέτοιες επεκτάσεις και συστολές θα είναι συνεπής με τα μοντέλα της εξέλιξης του επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες tandem, όπως μικροδορυφόρων (π.χ., [31]). Το συμπέρασμά μας είναι δειλά, ωστόσο, δεδομένου ότι είμαστε σε θέση να εκτιμήσει το ρόλο της πιθανής μετατροπής ενδογονικοί γονιδίων μεταξύ των επαναλήψεων (δηλαδή, η εξέλιξη συγκλίνουσα) περιπλέκει συμπεράσματα μας – αυτές οι διαδικασίες είναι δύσκολο να διαχωριστούν πλήρως (π.χ., [32])

.

Αν και οι δοκιμές για τον ακριβή μηχανισμό των προτεινόμενων ιστορικές αυξήσεις και μειώσεις σε BRC αριθμός επανάληψης είναι πέρα ​​από το πεδίο εφαρμογής του παρόντος εγγράφου, υποστηρίζουμε ότι τα ευρήματα από τον πληθυσμό γενετικών και φυλογενετικές αναλύσεις των ειδών Drosophila [18], απευθύνει ενδιαφέρον φαινόμενο που περιβάλλει ένα σημαντικό χαρακτηριστικό ενός γονιδίου είναι σχετικές με την ανθρώπινη υγεία. Τουλάχιστον ένα BRC επανάληψης είναι παρούσα σε κάθε οργανισμό στον οποίο έχει ανακαλυφθεί το ομόλογο, και φαίνεται να είναι απολύτως αναγκαία για την μεσολάβηση της αλληλεπίδρασης με RAD51. Θα μπορούσε κανείς να υποθέσει ότι η φυσική επιλογή θα μπορούσε να ευνοήσει την αύξηση του αριθμού των επαναλήψεων, αφού πιο επαναλήψεις θα επιτρέψει στενότερη αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των δύο πρωτεϊνών απαραίτητη για το DNA διπλό σκέλος επισκευής διάλειμμα? Ωστόσο, η επιλογή για μεγαλύτερες αλληλόμορφα μπορούν μόνο εκτείνονται μέχρι ένα ορισμένο σημείο, αφού Gudmundsdottir και Ashworth [2] διαπιστώθηκε ότι υπερεκφράζουν ένα ενιαίο επανάληψη BRC σε κύτταρα θηλαστικών διαταράσσει πραγματικά σχηματισμό νήματος RAD51 και διαλύει προσυναρμολογημένο νημάτια δημιουργώντας έτσι ένα BRCA2 με ανεπάρκεια φαινότυπο. Η επιμονή των πολλαπλών μικρότερες μορφές του

dmbrca2

σε πληθυσμούς

Δ. Yakuba

και

Δ. santomea

υποστηρίζουν κατά συνεπή και ισχυρή κατεύθυνσης επιλογής των πλέον αλληλόμορφα. Μια ενδιαφέρουσα δυνατότητα να διερευνήσει αν διακύμανση

dmbrca2

BRC αριθμός επανάληψης συνοδεύεται από αντίστοιχες αλλαγές στο

Rad51

ακολουθία. Η συνεχιζόμενη διερεύνηση των μοντέλων της αύξησης επανάληψης BRC και μείωση θα επιτρέψει την περαιτέρω διαφώτιση ενός ελάχιστα κατανοητή μηχανισμό που ρυθμίζει την ευαισθησία του καρκίνου, ένα σημαντικό θέμα στην ιατρική σήμερα.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω L . Bukovnik (κέντρο IGSP αλληλούχιση) για την τεχνική βοήθεια, J. Coyne για τα στελέχη της Drosophila, VL Roth και L. Stevison για βοήθεια με τα στοιχεία, και C. Smukowski, S. McDermott, R. Varney, και δύο ανώνυμους αναθεωρητές για τα χρήσιμα σχόλια σχετικά με το χειρόγραφο.