Αφηρημένο

μικροδορυφορικού αστάθεια (MSI) χαρακτηρίζεται από την επέκταση ή συρρίκνωση της επανάληψης DNA εκτάσεις ως συνέπεια της έλλειψης επιδιόρθωση του DNA αναντιστοιχία (MMRD). Ακριβής ανίχνευση του MSI σε καρκινικά κύτταρα είναι σημαντική αφού MSI σχετίζεται με αρκετές υποτύπους του καρκίνου και μπορεί να βοηθήσει να ενημερώσει θεραπευτικές αποφάσεις. Αν και έχουν πειραματικές δοκιμασίες έχουν αναπτυχθεί για την ανίχνευση MSI, που κατά κανόνα εξαρτώνται από ένα μικρό αριθμό γνωστών loci μικροδορυφορικών ή αναντιστοιχία επισκευή γονίδια και έχουν περιορισμένη αξιοπιστία. Εδώ, αναφέρουμε μια νέα προσέγγιση γονιδίωμα κλίμακα για ανίχνευση MSI βασίζεται στην παγκόσμια ανίχνευση εισαγωγές και διαγραφές (indels) σε μικροδορυφόρων βρέθηκαν σε εκφρασμένα γονίδια. μεγάλης κλίμακας μας αναλύσεις 20 καρκινικές κυτταρικές γραμμές και 123 φυσιολογικά άτομα αποκάλυψε έντονα στοιχεία Indel σχετίζεται με MSI: υπάρχει μια σημαντική αύξηση του μικρού μικροδορυφορικών διαγραφές σε δείγματα MSI σε σύγκριση με μικροδορυφορική σταθερές (MSS) αυτά, προτείνοντας μια μηχανιστική προκατάληψη αποτελεσματικότητας επισκευή μεταξύ εισαγωγές και διαγραφές σε φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα. Με την ενσωμάτωση αυτή την παρατήρηση σε MSI μας σκοράροντας μετρικό, δείχνουμε ότι η προσέγγισή μας μπορεί να διακρίνει σωστά μεταξύ καρκινικές κυτταρικές σειρές MSI και MSS. Επιπλέον, όταν θα εφαρμόσει αυτή την προσέγγιση σε δείγματα αρχέγονη όγκου, μετρικό μας είναι επίσης συνεπής με διαγνωσμένη κατάσταση MSI. Έτσι, η μελέτη μας προσφέρει νέες γνώσεις στο σύστημα επιδιόρθωση του DNA αναντιστοιχία, και επίσης παρέχει μια νέα MSI μέθοδο διάγνωσης για την κλινική ογκολογία με την καλύτερη αξιοπιστία

Παράθεση:. Lu Υ, Soong TD, Elemento O (2013) Μια νέα προσέγγιση για το χαρακτηρισμό του μικροδορυφορικού αστάθεια στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (5): e63056. doi: 10.1371 /journal.pone.0063056

Επιμέλεια: Yousin Σου, Albert Einstein College of Medicne, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 του Σεπτέμβρη του 2012? Δεκτές: 1 Απρίλη του 2013? Δημοσιεύθηκε: May 6, 2013

Copyright: © 2013 Lu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Ο.Ε. θα ήθελα να σας γνωρίσω τη λήψη της National Science Foundation (NSF) Career Grant 1054964. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Σε φυσιολογικά κύτταρα, το σύστημα επισκευής αναντιστοιχία (MMR) παρέχει ένα εξαιρετικά αποτελεσματικό μηχανισμό για τη διόρθωση των λαθών που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του DNA. Όταν απομείωση, π.χ. μέσω απενεργοποίηση των γονιδίων του ανθρώπου επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων όπως MLH1, MSH2 και MSH3, ανεπάρκεια επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων οδηγεί σε μη διορθωμένη ενθέσεις /απαλοιφές (indels), ιδιαίτερα σε μικροδορυφόρων όπου επαναλαμβάνεται μία μονάδα σύντομη ακολουθία (ένα έως έξι νουκλεοτιδίων μακρύ) πολλαπλές φορές [1] .

μικροδορυφορικού αστάθεια (MSI) αναφέρεται στην γενετικά παρεκκλίνουσα κατάσταση στην οποία μικροδορυφορικού αλληλόμορφα στο κέρδος γονιδίωμα ή να χάσει επαναλάβετε μονάδες σε πολύ μεγαλύτερη συχνότητα από ό, τι στα φυσιολογικά κύτταρα. Η κανονική κατάσταση είναι συχνά αναφέρεται ως μικροδορυφορικού σταθερό, ή MSS. Ευρεία MSI δηλώνει συνήθως αναντιστοιχία ανεπάρκεια επιδιόρθωσης (MMRD), το οποίο μπορεί να προκαλέσει συσσώρευση μεταλλάξεων στα γονίδια σχετίζονται με τον καρκίνο και να οδηγήσει σε καρκινογένεση και την εξέλιξη του όγκου. Κατά συνέπεια, MSI συχνά παρατηρείται σε διάφορους τύπους καρκίνων, κυρίως στον καρκίνο του παχέος εντέρου [2] και του καρκίνου του προστάτη [3]. Η παρουσία του MSI μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένας δείκτης για ειδικούς υποτύπους του όγκου και μπορεί να προβλέψει την ευαισθησία στη χημειοθεραπεία [1]. Επιπλέον, MSI δημιουργεί σημαντική γενετική ετερογένεια και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για άλλους σκοπούς, όπως η απομόνωση των ανθεκτικών στα φάρμακα κλώνων και την επακόλουθη χαρακτηρισμό των μηχανισμών αντοχής φαρμάκου [4].

Επί του παρόντος, υπάρχουν αρκετές αναλύσεις για την ανίχνευση της MSI , συμπεριλαμβανομένων εκείνων που ψάχνουν για μεταλλάξεις στα MMR γονίδια, μετρώντας την έκφρασή τους, ή να ψάχνει για τον αριθμό μονάδας αλλοιώσεις σε ένα σύνολο μικροδορυφόρων που πλήττονται συχνά από MSI [5], [6]. Ωστόσο, αυτές οι δοκιμασίες δεν είναι πάντα αξιόπιστο. Για παράδειγμα, δύο μελέτες που χρησιμοποιούν διαφορετικές δοκιμασίες που προβλέπονται αντίθετα αποτελέσματα σχετικά με την κατάσταση του MSI κυτταρική σειρά καρκίνου προστάτη PC3 [3], [7]. Επιπλέον, χρησιμοποιούνται συνήθως δείκτες MSI είναι τύπου κυττάρου ειδικό. Για παράδειγμα, έχει αναφερθεί ότι χρησιμοποιούνται συνήθως δείκτες σε καρκίνο του παχέος εντέρου έχουν χαμηλή ευαισθησία στην οξεία μυελογενή λευχαιμία [8].

Πολλοί άλλοι παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν αρνητικά την ακρίβεια των διαθέσιμων τεχνικών ανίχνευσης MSI. Μέθοδοι που χρησιμοποιούν απώλεια της έκφρασης ή μετάλλαξη γνωστών MMR γονίδια μπορεί να παρεμποδιστεί από την πολυπλοκότητα του συστήματος MMR, το οποίο αποτελείται από πολλαπλά γονίδια και πιθανώς άλλες μη χαρακτηρισμένο αυτά. Η χαμηλή ευαισθησία του αριθμού προσεγγίσεων βασισμένων μονάδα μπορεί να εξηγηθεί από την τυχαία φύση της MSI: MMRD μπορεί να επηρεάσει διαφορετικά σύνολα των μικροδορυφόρων σε διαφορετικά άτομα. Αυτό μπορεί να εξηγήσει γιατί τα περιορισμένα σύνολα των δεικτών που χρησιμοποιούνται στην τρέχουσα δοκιμασίες ανίχνευσης MSI μερικές φορές δίνουν ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα.

Για να ξεπεραστούν αυτοί οι περιορισμοί, έχουμε αναπτύξει μια νέα μέθοδο που βελτιώνει την ευαισθησία της ανίχνευσης MSI με την ενσωμάτωση όλων των ανιχνεύσιμων μικροδορυφόρων σε όλη την γονιδίωμα που χαρακτηρίζεται από αλληλούχιση επόμενης γενιάς. Επιλέξαμε να βασίσει την ανάλυσή μας σε RNA-Seq, καθώς είναι ένα σχετικά ώριμη τεχνική αλληλούχισης επόμενης γενιάς και έχει ήδη ευρέως εκτελεστεί για διάφορες εφαρμογές. Αν και μικρής διαβάσετε ακολουθίες θέτουν προκλήσεις για τη χαρτογράφηση και το χαρακτηρισμό μικροδορυφόρων, έχουμε ξεπεράσει αυτά τα ζητήματα και να αποδείξει την αξιοπιστία του γονιδιώματος-ευρεία προσέγγιση σάρωσης μας για την ανίχνευση MSI. Εκτός από βασίζοντας την ανίχνευση σε ένα πολύ αυξημένο αριθμό indels μικροδορυφόρων στα κύτταρα MSI, η προσέγγισή μας εκμεταλλεύεται ένα φαινόμενο μέχρι στιγμής αναφερθεί μόνο στη ζύμη, αλλά ότι παρατηρήσαμε σε ανθρώπινα κύτταρα σε αυτή τη μελέτη: διανομές μήκος Indel σε δείγματα MSI και MSS είναι σημαντικά διαφορετική [9]. Γονιδίωμα-ευρύ ανίχνευση των μικροδορυφόρων indels αποφεύγει τις ελλείψεις του περιορισμένου συνόλου δεικτών και παρέχει υψηλότερη ευαισθησία για την ανίχνευση MSI. Πέραν του ότι είναι ευαίσθητα, η προσέγγισή μας δεν απαιτεί μια αντίστοιχη ελέγχου βλαστικής σειράς από το ίδιο άτομο, και ως εκ τούτου μπορεί να εφαρμοστεί σε καρκινικές κυτταρικές σειρές.

Υλικά και Μέθοδοι

Σύνολα

σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε σύνολα δεδομένων RNA-seq για 20 διαφορετικά καρκινικές κυτταρικές γραμμές με σκοπό τη διερεύνηση των συχνοτήτων MSI σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου. Όλα τα σύνολα δεδομένων γραμμή καρκινικών κυττάρων ελήφθησαν από δημοσιευμένες μελέτες, και η κατάσταση MSI πολλών από αυτές τις κυτταρικές γραμμές έχει ήδη αναφερθεί (αν και για ορισμένες κυτταρικές σειρές αποτελέσματα από διαφορετικές σύγκρουση μελέτες). Ο Πίνακας 1 δείχνει την πληροφορία κατάστασης MSI και τις πηγές RNA-seq σύνολα δεδομένων. Χρησιμοποιήσαμε επίσης δύο δημοσιευθεί RNA-seq μελέτες HapMap δειγμάτων λεμφοβλαστοειδείς συλλέχθηκαν από 69 Νιγηρίας [10] και 54 ευρωπαϊκών άτομα [11] ως έλεγχοι για να καθορίσουν την κατάσταση MSI σε φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα, όπως MSI δεν αναμένεται σε αυτά τα δείγματα. Αναλύσαμε επίσης συνδυάζεται κόλον καρκινικού όγκου και φυσιολογικό RNA-Seq δείγματα από 14 ασθενείς που διαγιγνώσκονται με καρκίνο MSI και 14 ασθενείς που διαγιγνώσκονται με καρκίνο MSS [12].

Η

Ανίχνευση Μικροδορυφορικοί indels

πρώτη εξάγεται μικροδορυφόρων σε όλες τις ανθρώπινες μεταγραφές REFSEQ χρησιμοποιώντας διαδοχικές επαναλήψεις Finder (TRF) [13]. Σε αυτή τη μελέτη μικροδορυφόρων ορίστηκαν ως διαδοχικές επαναλήψεις με επαναλαμβανόμενες μονάδες από 1 έως 6 ζεύγη βάσεων. Για κάθε RNA-επόμενα σύνολο δεδομένων, μπορούμε στη συνέχεια να ευθυγραμμίζονται με το σύντομο διαβάζει σε μεταγραφές REFSEQ χρησιμοποιώντας BWA [14], η οποία επιτρέπει gapped-ευθυγράμμιση. Χρησιμοποιήσαμε ένα μέγιστο μέγεθος χάσμα των 20 bp για όλες τις αναλύσεις που αναφέρονται εδώ. Δοκιμάσαμε επίσης μεγαλύτερα μεγέθη θέση αλλά δεν αυξάνουν τον αριθμό των εντοπισμένων indels στις αναλύσεις που ακολουθούν. Για το υπόλοιπο των παραμέτρων που χρησιμοποιούνται BWA προεπιλεγμένες παραμέτρους. Στη συνέχεια χρησιμοποιείται DINDEL [15] για να καλέσετε indels από ευθυγραμμισμένες διαβάζει. Από την έξοδο του dindel, έχουμε φιλτράρει κοινή indels περιλαμβάνονται στη βάση δεδομένων πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου (dbSNP? ​​Build 132) [16]. Τέλος, σε σύγκριση με τις συντεταγμένες των indels με τις συντεταγμένες των μικροδορυφόρων που βρέθηκαν από TRF και προσδιορίζονται indels μέσα μικροδορυφόρων (Σχήμα 1α).

PI αναφέρεται στην αναλογία των παρεμβολών σε μικροδορυφόρων πάνω από όλες τις παρεμβολές, και του Π.Δ. αναφέρεται στην ποσοστό των διαγραφών σε μικροδορυφόρων πάνω από όλες τις διαγραφές.

η

η ποσοτικοποίηση MSI Χρησιμοποιώντας το MSI-επόμενα Δείκτης

Αξιολογήσαμε διάφορα μέτρα MSI με βάση τον αριθμό των indels και μικροδορυφόρων καθορίζεται από αγωγό ανάλυσή μας . Τα μέτρα αυτά περιλαμβάνεται το ποσοστό των μικροδορυφόρων ενθέσεις επί όλων ενθέσεις (συμβολίζεται ως PI), και το ποσοστό των μικροδορυφόρων διαγραφές έναντι όλων των διαγραφών (συμβολίζεται ως PD? Σχήμα 1β). Αξιολογήσαμε επίσης PI /PD, δεδομένου ότι τα αποτελέσματά μας, σε συμφωνία με μια προηγούμενη μελέτη σε ζύμη [9], πρότεινε ότι MMRD θα μπορούσε να μεταβάλει τις σχετικές τιμές των εισαγωγές και διαγραφές. PI /PD είναι επίσης αναφέρεται ως MSI-επόμενα δείκτη σε αυτή τη μελέτη.

Έκφραση προφίλ του MMR σχετικών γονιδίων

Για να συγκρίνετε την προσέγγισή μας με τις μεθόδους που χρησιμοποιούν το επίπεδο έκφρασης και της κατάστασης μετάλλαξης των συνιστωσών του συστήματος MMR , προσδιορίσαμε το επίπεδο έκφρασης γονιδίων MMR (συμπεριλαμβανομένων MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH4, MSH5, MSH6, PMS1 και PMS2) σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές από τα δεδομένα RNA-seq. Χρησιμοποιήσαμε Μανικετόκουμπα [17] για τον υπολογισμό κανονικοποιημένα επίπεδα έκφρασης μετρήθηκαν σε τμήματα ανά κιλοβάσεων της μεταγραφής ανά εκατομμύριο διαβάζει (FPKM). Έχουμε, επίσης, έψαξε για indels στο MMR γονίδια χρησιμοποιώντας τα αποτελέσματα DINDEL (δεν περιορίζεται σε μικροδορυφόρων). Τέλος, ψάξαμε για ενιαία παραλλαγές νουκλεοτιδίου στις ίδιες MMR γονιδίων χρησιμοποιώντας SNVseeqer [4], [18], [19]. Όπως κάναμε για Indel κλήση, θα διατηρηθούν μόνο SNVs που δεν αναφέρεται στο dbSNP για περαιτέρω ανάλυση.

Αποτελέσματα

Indel Ανίχνευση σε RNA-επόμενα στοιχεία της MSI /MSS δείγματα

Πρέπει πρώτα προσπάθησαν να προσδιορίσουν indels εντός των ΠΝΑ-seq δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη (MSI, MSS, HapMap). Μετά από σύντομη ανάγνωση ευθυγράμμιση χρησιμοποιώντας BWA, χρησιμοποιήσαμε DINDEL να καλέσετε indels σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του 20 μας και 123 HapMap RNA-επόμενα σύνολα δεδομένων. Από τις εξόδους DINDEL, θα φιλτράρονται indels περιλαμβάνονται στη βάση δεδομένων πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου (dbSNP? ​​Build 132) [16]. Μετά το φιλτράρισμα, απόλυτοι αριθμοί Indel κυμαίνονται από περίπου 200 έως περισσότερο από 2000 (Σχήμα 2).

(α) δείγματα HapMap (β) κυτταρικές σειρές καρκίνου.

Η

διαφορετικές διανομές του μικροδορυφορικού Indel Αλλαγές στην MSI /MSS δείγματα

στη συνέχεια, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί η συχνότητα με την οποία οι αλληλουχίες μικροδορυφορικού μεταβάλλονται από indels σε κάθε RNA-επόμενα δείγμα. Συνολικά 505.657 μικροδορυφόρων βρέθηκαν σε 32.199 ακολουθίες μεταγραφής REFSEQ χρησιμοποιώντας TRF. Στη συνέχεια προσδιορίζεται ο αριθμός των μικροδορυφόρων μεταβληθεί από τουλάχιστον ένα Indel σε κάθε RNA-επόμενα δείγμα. Η ποσότητα αυτή είναι μεταξύ 54 και 482 σε HapMap δείγματα, καθώς και από 77 να 1454 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Σε όλες τις παρακάτω αναλύσεις, μελετάμε μόνο indels μέσα μικροδορυφόρων. Σε κάθε δείγμα, τότε να προσδιοριστεί το ποσοστό των μικροδορυφόρων μεταβάλλεται από indels βρίσκεται στο 5 ‘UTR, αλληλουχία κωδικοποίησης, 3’ UTR ή μη-κωδικοποίησης RNAs, και προσδιορίζεται κατά πόσον αυτές οι αναλογίες διαφέρουν σημαντικά μεταξύ MSI και δείγματα HapMap και μεταξύ των MSS και HapMap δείγματα. Παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση στο ποσοστό των indels σε ακολουθίες κωδικοποίησης δείγματα MSI »(σ = 1e-5, του Student t-test? Σχήμα 3α), σε σύγκριση με HapMap δειγμάτων, ενώ το ποσοστό παρέμεινε παρόμοια και στα δείγματα MSS (ρ = 0,15, t-test του Student). Που αντιστοιχεί σε αυτή την αύξηση, το ποσοστό των indels μικροδορυφόρων σε άλλες περιοχές ήταν χαμηλότερη σε δείγματα MSI σε σύγκριση με HapMap (5 ‘UTR: p = 0,0149? 3’ UTR: p = 0,0108), ενώ δεν υπάρχει καμία διαφορά μεταξύ των δειγμάτων MSS και HapMap (ρ & gt ? 0,05? Σχήμα 3β-c). Σε μη-κωδικοποίησης RNAs, παρατηρήσαμε σημαντικές διαφορές μεταξύ HapMap, MSI και MSS (p & gt? 0,05? Σχήμα 3δ). Ο επιπολασμός της indels μικροδορυφόρων σε περιοχές κωδικοποίησης του MSI (και σε κάποιο βαθμό στο MSS) καρκινικά κύτταρα προτείνουν ότι αυτά τα indels θα μπορούσε να οδηγήσει σε ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα σε καρκινικά κύτταρα, σε συμφωνία με τα ευρήματα σε άλλους οργανισμούς [20].

(α) που κωδικοποιεί αλληλουχίες (β) 3’UTR (γ) 5’UTR (δ) μη-κωδικοποίησης του RNA.

η

σε προηγούμενη μελέτη σε ζύμη, διαπιστώθηκε ότι μετά τη μετάλλαξή του DNA επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων πρωτεΐνες, υπήρξε μια σημαντική αύξηση στον αριθμό των σύντομων διαγραφές σε μικροδορυφόρων, ενώ ο αριθμός των παρεμβολών σε μικροδορυφόρων δεν μεταβλήθηκε σημαντικά [9]. Εμπνευσμένο από τα αποτελέσματα αυτά, μελετήσαμε επίσης τη διανομή ανιχνεύεται μήκη μικροδορυφόρων Indel σε δείγματα MSI /MSS. Παρατηρήσαμε ότι οι βραχυπρόθεσμες διαγραφές από 1 bp είναι πιο συχνές κυτταρικές σειρές MSI ό, τι είναι στην HapMap δείγματα (Σχήμα 4α). Για να διερευνηθεί περαιτέρω αυτή την παρατήρηση, συγκρίναμε τις κατανομές της εισαγωγής και τις διαγραφές που λαμβάνεται από κάθε μία από τις 7 καρκινικές κυτταρικές γραμμές MSI και 5 κυτταρικές γραμμές MSS στις συνολικές κατανομές της εισαγωγής και διαγραφές από όλες τις 123 HapMap ελέγχους. δοκιμασία Kolmogorov-Smirnov έδειξε ότι οι διανομές μήκος μικροδορυφόρων διαγραφές σε δείγματα MSI ήταν σημαντικά διαφορετικό από το HapMap δείγματα (p & lt? 0,05). Σε αντίθεση, όλα εκτός από ένα δείγματα MSS δεν δείχνουν σημαντική διαφορά στα μήκη διαγραφή (ρ & gt? 0,05). Οι κατανομές των μηκών εισαγωγής, από την άλλη πλευρά, δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές μεταξύ των 3 ομάδων (Σχήμα 4β). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η ανεπάρκεια με τα μηχανήματα επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων που σχετίζεται με αστάθεια μικροδορυφόρου προτίμηση οδηγούν σε σύντομο διαγραφές.

(α) μικροδορυφορικών διαγραφές (β) ενθέσεις Μικροδορυφορικοί.

Η

Η MSI-επόμενα δείκτης προβλέπει σωστά MMRD τηλέφωνα Γραμμές

Ο πρωταρχικός στόχος μας ήταν να προσδιορίσει ένα δείκτη γονιδίωμα ολόκληρη ή ένα μέτρο που διακρίνει αξιόπιστα δείγματα MSI από δείγματα MSS. Αρχικά διερευνήθηκαν δύο πιθανά μέτρα: το ποσοστό των παρεμβολών μικροδορυφόρων έναντι όλων ενθέσεις (συμβολίζεται ως PI), και το ποσοστό των μικροδορυφόρων διαγραφές έναντι όλων των διαγραφών (συμβολίζεται ως PD? Σχήμα 1β). Η ανάλυση στο προηγούμενο τμήμα αποκάλυψε ότι σε σύγκριση με φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα, αριθμό σύντομων διαγραφών αυξήθηκε σημαντικά σε κυτταρικές σειρές MSI αλλά όχι σε μικροδορυφορικών σταθερές (MSS) καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Λόγω της διαφοράς αυτής, PD διάκριση μεταξύ των δειγμάτων MSI και MSS, αν και όχι τέλεια (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε αντίθεση, αν και PI είναι σε θέση να διακρίνουν μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων, εξακολουθεί να αντανακλά τον απόλυτο αριθμό των indels μικροδορυφόρων. Ως αποτέλεσμα, ομαλοποίηση PD με PI μπορεί να κάνει MSI καταστάσεις διαφορετικών δειγμάτων πιο συγκρίσιμα. έτσι ερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ δύο αναλογίες ως εναλλακτική λύση δείκτης για τη διάκριση μεταξύ των κυτταρικών σειρών MSI και MSS. Όταν υπολογίζεται PI /PD για τις καρκινικές κυτταρικές σειρές MSI και MSS, παρατηρήσαμε σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων (p = 2.4e-5, t-test), με MSI δείχνουν χαμηλότερα PI /PD (Σχήμα 5α). Όπως ήταν αναμενόμενο, οι τιμές PI /PD ήταν επίσης σημαντικά διαφορετική μεταξύ MSI και HapMap (p = 1.5e-10, t-test). Το γεγονός ότι τα δείγματα MSI και MSS έχουν στατιστικά διαφορετικές τιμές PI /PD δεν σημαίνει ότι η PI /PD είναι πολύ αξιόπιστο σε διακρίσεις MSI και MSS. Ωστόσο, παρατηρήσαμε περαιτέρω ότι PI /PD διαχωρίζει σαφώς κυτταρικές σειρές MSI και MSS σε δύο διακριτές ομάδες (Σχήμα 5α). Πράγματι, όλοι οι κυτταρικές σειρές που έχουν ταυτοποιηθεί ως MSI (Πίνακας 1) επιδεικνύουν PI /αναλογίες PD μικρότερη από 1. Σε αντίθεση, κυτταρικές σειρές MSS έχουν όλες οι αναλογίες μεγαλύτερες από 1, παρόμοιο με HapMap δείγματα (Σχήμα 5α). Τα αποτελέσματα αυτά αποδεικνύουν ότι ο λόγος PI /PD, το οποίο εμείς αναφερόμαστε ως MSI-επόμενα δείκτη, μπορεί να προβλέψει με ακρίβεια την κατάσταση MSI σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, ακόμα και εκτείνονται σε πολλούς τύπους καρκίνου.

(α) Σύγκριση μεταξύ της PI /αναλογίες PD δειγμάτων HapMap, καρκινικές κυτταρικές σειρές MSI και καρκινικές κυτταρικές γραμμές MSS (β) οι αναλογίες PI /PD για όλα τα δείγματα και HapMap καρκινικές κυτταρικές σειρές. Οι αναλογίες PI /PD δείγματα HapMap »που εκπροσωπούνται από την εμπειρική καμπύλη πυκνότητας κατανομής. Οι αναλογίες για γνωστές κυτταρικές γραμμές απεικονίζονται με κόκκινο χρώμα κάθετες γραμμές. Οι γνωστές κυτταρικές σειρές MSS απεικονίζονται με μπλε χρώμα, και όλες οι άλλες κυτταρικές σειρές σχεδιάζονται σε μωβ.

Η

Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η MSI-επόμενα δείκτη μπορεί αξιόπιστα να προβλέψει την κατάσταση MSI. Ως εκ τούτου, εφαρμόζεται η ανάλυσή μας σε κυτταρικές σειρές των οποίων η κατάσταση MSI δεν είχαν χαρακτηριστεί. Στη μελέτη μας, όλοι αυτοί οι κυτταρικές σειρές έπεσε στην περιοχή των HapMap δείγματα (Σχήμα 5β). Επομένως, με τα κριτήριά μας, είναι πιθανό να είναι κυτταρικές γραμμές MSS. Προγνωστικά για ορισμένες κυτταρικές σειρές που υποστηρίζονται από πρόσθετες αποδείξεις. Για παράδειγμα, οι τρεις MSI-μη χαρακτηρισμένα καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές κατηγοριοποιούνται ως MSS. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες που προτείνουν ότι η MSI μπορεί να παίξει μόνο ένα μικρό ρόλο στην ογκογένεση του καρκίνου του μαστού σε σύγκριση με άλλους τύπους όγκων [21].

έκφραση ή μετάλλαξη της Γνωστό MMR γονίδια αποτυγχάνει να προβλέψει σοβαρά MSI Κατάσταση

στη συνέχεια προσπάθησε να καθορίσει αν άλλες απλούστερες προσεγγίσεις που βασίζονται στην έκφραση ή μετάλλαξη των γνωστών MMR γονίδια θα μπορούσαν να προβλέψουν την κατάσταση MSI. Προηγούμενα ευρήματα έχουν πράγματι προταθεί ότι η απενεργοποίηση του MMR γονίδια θα μπορούσαν να προκαλέσουν MMRD [1]. Ως εκ τούτου, κατ ‘αρχήν, το προφίλ έκφρασης του MMR που σχετίζονται με τα γονίδια θα μπορούσαν επίσης να προβλέψουν MMRD και MSI. Κοιτάξαμε 7 κυτταρικές σειρές MSI και 5 κυτταρικές σειρές MSS με MSI καταστάσεις επικυρωθεί από προηγούμενες μελέτες

Τα επίπεδα έκφρασης των γνωστών MMR γονίδια δεν σχετίζεται με την κατάσταση MSI (Σχήμα 6?. Οι τιμές FPKM ομαλοποιηθεί από τη μέση τιμή της κάθε στήλης). Για παράδειγμα, η έκφραση MLH1 καταστέλλεται σε δύο κυτταρικές σειρές, HCT116 και DU145. Μια τέτοια απώλεια συνοδεύεται από την απώλεια της έκφρασης MLH3 σε DU145 και η απώλεια της έκφρασης MSH3 σε HCT116, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [22]. Σε μια άλλη κυτταρική γραμμή LNCaP MSI, ωστόσο, όλα αυτά τα γονίδια που εκφράζονται σε φυσιολογικά επίπεδα, ενώ η καταπιεσμένη έκφραση του MSH2 μπορεί να είναι υπεύθυνη για MSI [3], [23]. Ανάλυση των σημειακών μεταλλάξεων και indels έδειξε επίσης την έλλειψη συσχετισμού με την κατάσταση MSI, με δείγματα MSS δείχνουν παραλλαγές εσφαλμένου νοήματος σε MMR γονίδια ενώ πολλά κύτταρα MSI δεν έχουν παραλλαγές (Πίνακας 2). Ως εκ τούτου, σε αντίθεση με το δείκτη MSI-seq, ούτε MMR επίπεδα γονιδιακής έκφρασης ούτε μεταλλάξεις είναι πραγματικά αξιόπιστη για την ανίχνευση MSI.

Οι τιμές κανονικοποιούνται με τη μέση τιμή της κάθε στήλης.

Η

Εφαρμογή σε κλινικά δείγματα

στη συνέχεια δοκιμάστηκε κατά πόσον η προσέγγισή μας δεν μπορεί να προβλέψει την κατάσταση MSI σε πρωτογενείς όγκους. Αναλύσαμε ζευγαρωμένα όγκων καρκίνου του κόλον και φυσιολογικό RNA-Seq δείγματα από 14 ασθενείς με διάγνωση όγκων MSI και 14 ασθενείς με διάγνωση MSS όγκους [12]. Οι αναλογίες για δείγματα όγκων MSI κυμαίνονται από 0,630 να 0,814, ενώ οι αναλογίες για δείγματα όγκων MSS κυμαίνονται από 0,986 να 1,573. Ως εκ τούτου, ένα όριο γύρω 0.9 θα είναι σε θέση να παράγει ακριβείς προβλέψεις κατάσταση MSI, το οποίο είναι παρόμοιο με αυτό που έχουμε παρατηρήσει σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, οι αναλογίες για δείγματα όγκων MSI παρουσίασαν σημαντική διαφορά σε σύγκριση με ζευγαρωμένα κανονικά δείγματα (ρ = 5.57e-11? T-test), ενώ δεν υπάρχει καμία διαφορά μεταξύ MSS όγκου και φυσιολογικών δειγμάτων (p = 0,6438? T-test) (Σχήμα 7). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η μέθοδός μας δεν λειτουργεί μόνο σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, αλλά είναι επίσης αποτελεσματική για την ανίχνευση κατάστασης MSI σε πρωτογενείς όγκους.

14 έχουν διαγνωστεί ως MSI και 14 έχουν διαγνωστεί ως MSS.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε εισαγάγει ένα νέο και αξιόπιστο δείκτη (MSI-επόμενα) για την ανίχνευση της αστάθειας του μικροδορυφορικού DNA χρησιμοποιώντας δεδομένα αλληλουχίας μεταγραφικό. Σε αντίθεση με άλλες προσεγγίσεις που περιορίζονται με επερωτήσεις σε μικρό αριθμό γονιδίων ή περιοχών μικροδορυφόρου, μέθοδος μας ενσωματώνει στοιχεία Indel από ένα μεγάλο αριθμό εκφράζονται μικροδορυφόρων. Η προσέγγισή μας δεν εξαρτάται από την βλαστικής σειράς DNA και επομένως είναι εξίσου εφαρμόσιμη σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και τα πρωτογενή δείγματα. Έχουμε δείξει ότι η προσέγγισή μας είναι πιο ακριβή από τις προσεγγίσεις που βασίζονται στην ανίχνευση της μετάλλαξης ή έκφραση αλλαγές σημείο αναντιστοιχία γονίδια επιδιόρθωσης. Ένα άλλο πλεονέκτημα της προσέγγισής μας είναι ότι η MSI-επόμενα δείκτης παρέχει μια συνεχή μέτρηση της MSI. Σε προηγούμενες μελέτες, MSI συχνά αντιμετωπίζεται ως μια εκδήλωση του όλα ή τίποτα. Παραδοσιακά δοκιμασίες θα μπορούσε να πει μόνο εάν ένα δείγμα είναι MSI ή MSS. Ωστόσο, σε βιολογικά κατάλληλες περιπτώσεις, η κατάσταση MSI των δειγμάτων είναι πιθανό να καλύπτουν ένα συνεχές φάσμα, και η έκταση της MSI μπορεί να έχει θεραπευτικές επιπτώσεις. Ως εκ τούτου, ο δείκτης MSI-seq (αναλογία PI /PD) που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη υποψήφια για την ποσοτικοποίηση της σχετικής βαθμός MSI ενός δείγματος.

Κατά τη διάρκεια των ερευνών μας σχετικά indels σε καρκινικές κυτταρικές σειρές , έχουμε κάνει μια σειρά από ενδιαφέρουσες παρατηρήσεις. Έχουμε βρει ότι οι βραχυπρόθεσμες διαγραφές σε μικροδορυφορικών περιοχών, ιδιαίτερα 1 διαγραφές bp, είναι σταθερά υψηλά υπερεκπροσωπούνται σε καρκινικές κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με MSI καρκινικές κυτταρικές σειρές MSS και αθανατοποιημένα αλλά τα δείγματα μη κακοήθεις HapMap. Από την άλλη πλευρά, δεν βρήκαμε καμία συνεπής αύξηση των πλέον διαγραφές ή προσθήκες σε δείγματα MSI. Μια παρόμοια παρατήρηση έχει γίνει σε ζύμη [9], όμως στο καλύτερο της γνώσης μας, είναι η πρώτη φορά που το φαινόμενο αυτό αναφέρεται στα ανθρώπινα κύτταρα. Αυτή η παρατήρηση επιβεβαιώνει ότι πολλαπλοί μηχανισμοί επιδιόρθωσης DNA είναι στο παιχνίδι σε φυσιολογικά κύτταρα και ότι εντός μικροδορυφόρων, τυχαίες διαγραφές και παρεμβολές διαφορετικών μηκών έχουν επισκευαστεί μέσω διαφορετικών μηχανισμών.

Μια άλλη παρατήρηση είναι ότι υπάρχουν περισσότερα μικροδορυφορικών indels στην κωδικοποίηση περιοχές σε καρκινικά κύτταρα και ειδικά σε MSI-θετικών καρκινικών κυττάρων. Αυτή η ανακάλυψη είναι εκπληκτική αφού ένα σημαντικό κλάσμα αυτών των indels αναμένεται να προκαλέσει εσωτερική μετατοπίσεις πλαισίου, με τη μεσολάβηση μη-νόημα φθορά και ως εκ τούτου το γονίδιο αδρανοποίησης. Τα αποτελέσματά μας από την άλλη πλευρά δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα με αυξημένη κωδικοποίησης indels μικροδορυφόρων μπορούν να επιλέγονται θετικά και ως εκ τούτου ότι κωδικοποίησης μικροδορυφόρων indels θα μπορούσαν να συμβάλουν στις φαινοτύπους του όγκου. Εναλλακτικά, αυτές οι indels μπορεί να δημιουργήσει λειτουργική ποικιλομορφία που επιτρέπει την ταχεία προσαρμογή των κυττάρων του όγκου στις μεταβαλλόμενες συνθήκες, ίσως παρόμοια με αυτό που έχει παρατηρηθεί σε ζυμομύκητες [20].

μέθοδος μας βασίζεται στην αλληλούχιση μεταγραφικό, η οποία έχει μερικά περιορισμούς, όταν χρησιμοποιείται για MSI χαρακτηρισμό. Για παράδειγμα, θα χάσει αλλαγμένη μικροδορυφόρων που βρίσκεται στην ρυθμιστικές αλληλουχίες, οι οποίες μπορεί επίσης να παίξει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση. Επιπλέον, καθώς η ανίχνευση Indel απαιτεί κάλυψη επαρκή ανάγνωσης, μπορεί να είναι δύσκολο να ανιχνευθούν indels μικροδορυφόρων σε μεταγραφές με χαμηλή αφθονία. Παρά τις παραπάνω μειονεκτήματα, επιθεώρηση εξέφρασε μεταγραφές εξακολουθεί να παρέχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με MMRD. Όπως τα πειράματα RNA-seq είναι ευρέως εκτελούνται και η τιμή για τα δείγματα καρκίνου του αλληλούχιση μειώνεται με ταχύ ρυθμό, στο μέλλον μέθοδο διάγνωσης RNA-seq βάση θα γίνει αποδοτική για κλινικές εφαρμογές. Επιπλέον, ένας μόνο ανάλυση RNA-Seq είναι σε θέση να παρέχει ακριβή διάγνωση MSI μαζί με πλούσιες πληροφορίες σχετικά με τις πολλές άλλες πτυχές της όγκου, συμπεριλαμβανομένων των λειτουργικών μεταλλάξεων, τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης, ενεργό μονοπάτια και συντήξεις γονιδίου, κλπ, κάνοντας εξειδικευμένες PCR δοκιμασίες για MSI περιττή .

Εν κατακλείδι, η μέθοδός μας είναι η πρώτη που επιτρέπουν γονιδίωμα-ευρεία χαρακτηρισμό της κατάστασης MMRD στο ανθρώπινο κύτταρο μέσω της ενσωμάτωσης των δεδομένων αλληλουχίας υψηλής απόδοσης. Συνεπής με τα προηγούμενα ευρήματα, έχουμε παρατηρήσει μια σημαντική αύξηση των βραχυπρόθεσμων διαγραφές στα κύτταρα MSI σε σύγκριση με αυτά που MSS. Με βάση αυτή την παρατήρηση, δείξαμε ότι ο λόγος PI /PD (τα οποία επίσης ορίζουν ως MSI-seq) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ποσοτικοποίηση κατάσταση MSI σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου και δείγματα αρχέγονη όγκων από τους ασθενείς, και έχει πολλαπλά πλεονεκτήματα έναντι των παραδοσιακών δοκιμασίες. Ως εκ τούτου, η μέθοδος μας έχει τη δυνατότητα να εξυπηρετεί ως νέου εργαλείο διάγνωσης της γονιδιωματικής αστάθειας για διαφορετικά δείγματα καρκίνου.