Αφηρημένο

Ιστορικό

Nimotuzumab είναι ένα ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα IgG 1 που στοχεύουν ειδικά EGFR. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ως στόχο να διερευνήσει τις μοριακών μηχανισμών της nimotuzumab ως προς τις επιπτώσεις της ενίσχυσης των καρκινικών κυττάρων ακτινοευαισθησία.

Κύρια εύρεση

πνεύμονα κύτταρα καρκίνου του Α549 και MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ή χωρίς nimotuzumab για 24 ώρες πριν από την ακτινοβολία για να εκτελεστεί ο προσδιορισμός κλωνογονική επιβίωση και για την ανάλυση της κυτταρικής απόπτωσης από ctyometry ροής. γ-H2AX εστίες ανιχνεύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία να εκτιμηθεί η επίδραση της nimotuzumab επί επαγόμενης ακτινοβολίας επιδιόρθωσης του DNA. ενεργοποίηση EGFR εξετάστηκε και τα επίπεδα των πρωτεϊνών που σχετίζονται με επιδιόρθωση του DNA βλάβη σε κύτταρα Α549 σε διαφορετικές χρονικό σημείο και σε διάφορες δόσεις μετά την έκθεση nimotuzumab και ακτινοβολία θεραπεία εξετάστηκαν με κηλίδα Western. Προθεραπεία με nimotuzumab μειωμένη κλωνογονική επιβίωση μετά την ακτινοβολία, ανέστειλε την ενεργοποίηση του EGFR που προκαλείται από ακτινοβολία και αύξησε την προκαλούμενη από ακτινοβολία απόπτωση σε δύο Α549 κύτταρα και κύτταρα MCF-7. Το εστίες γ-Η2ΑΧ 24 ώρες μετά την ακτινοβολία αυξήθηκε σημαντικά σε nimotuzumab προεπεξεργασία των κυττάρων με διάφορες δόσεις. Η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ και DNA-PKcs ήταν εντυπωσιακά αναστέλλεται στην ομάδα συνδυασμού σε κάθε σημείο της δόσης, καθώς και το σημείο του χρόνου.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι ο πιθανός μηχανισμός nimotuzumab ενίσχυση του καρκίνου ακτινοευαισθησία είναι ότι nimotuzumab ανέστειλε την ακτινοβολία που προκαλείται από την ενεργοποίηση του DNA-PKcs μέσω μπλοκάροντας το μονοπάτι PI3K /AKT, η οποία επηρέασε τελικά την επιδιόρθωση του DNA DSBs

Παράθεση:. Qu Yy, Χου Sl, Xu ΧΥ, Wang Rz, Yu Hy, Xu Jy, et al. (2013) Nimotuzumab Ενισχύει τις ραδιοευαισθησία των καρκινικών κυττάρων in vitro με ανασταλτικός επισκευής ζημιών DNA Μετακτινική. PLoS ONE 8 (8): e70727. doi: 10.1371 /journal.pone.0070727

Επιμέλεια: Xianglin Shi, το Πανεπιστήμιο του Κεντάκι, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Ιανουαρίου 2013? Αποδεκτές: 18, Ιούνη 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 Αυγ, 2013

Copyright: © 2013 Qu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ακτινοθεραπεία παίζει σημαντικό ρόλο στη θεραπεία πολλών μορφών καρκίνου με. θεραπευτική ή καταπραϋντική πρόθεση. Περίπου το 50% των ασθενών που πάσχουν με καρκίνους χρειάζονται ακτινοθεραπεία καθ ‘όλη τη διαδικασία της θεραπείας τους. Ωστόσο, το ποσοστό ελέγχου της νόσου και την επιβίωση των ασθενών που λαμβάνουν ακτινοθεραπεία μόνο του ή σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία παραμένουν πάρα πολύ μικρή. Παραδοσιακά κυτταροτοξικών παραγόντων με ραδιοευαισθητοποίησης λειτουργία συχνά ταυτόχρονα αυξάνουν την κανονική τοξικότητα του ιστού, η οποία περιορίζει την κλινική εφαρμογή τους όταν συνδυάζεται με ακτινοθεραπεία. Πρόσφατα, οι θεραπείες στόχευσης του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) έχουν επιδείξει εξαιρετικές αντικαρκινικές δράσεις με ήπια δυσμενείς επιπτώσεις και σημαντικά ενισχυμένη ραδιοευαισθησία καρκίνου σε προκλινικές και κλινικές μελέτες [1], [2]. EGFR στοχευμένες θεραπείες σε συνδυασμό με ακτινοθεραπεία έχει θεωρηθεί ως ένα πολύ δυναμικό στρατηγική για τη θεραπεία ορισμένων μορφών καρκίνου επιθηλιακής προέλευσης

EGFR στοχευμένες θεραπείες αποτελούνται κυρίως από δύο προσεγγίσεις:. 1) μονοκλωνικά αντισώματα (mAb) που στοχεύουν το εξωκυτταρικό πεδίο του υποδοχέα στην περιοχή σύνδεσης συνδετήρα, δηλαδή cetuximab, nimotuzumab και panituzumab? ή 2) μικρά μόρια τα οποία αναστέλλουν την ενδοκυτταρική δραστικότητα κινάσης τυροσίνης EGFR, όπως τα gefitinib και erlotinib [3]. Οι περισσότεροι από αυτούς τους παράγοντες έχουν μελετηθεί εκτενώς

in vitro

και

in vivo

υπό την ιδιότητά τους για την ενίσχυση ακτινοευαισθησία όγκου. Αποκλείοντας την ενεργοποίηση του EGFR και κατάντη σηματοδότηση της, όπως οι οδοί ΡΙ3Κ-ΑΚΤ και RAS-ΜΑΡΚ, αυτά τα αντι-ΕΟΡΚ παράγοντες ενισχύουν την κυτταροτοξική δράση της ιονίζουσας ακτινοβολίας επάγοντας διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης και αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της μετάστασης και αγγειογένεσης όγκου [ ,,,0],4], [5].

Nimotuzumab είναι ένα εξανθρωπισμένο μονοκλωνικό αντίσωμα IgG 1 που μπλοκάρει EGF, ΤΟΡ-α και άλλα προσδέματα από τη σύνδεση με το EGFR, όπως επίσης και παρεμποδίζουν τον υποδοχέα από εκθέτοντας τον διμερισμό μοτίβο της [6]. Nimotuzumab αποδίδει στο EGFR με μέτρια συγγένεια δέσμευσης (Kd: 4,5 × 10

-8 m) σε σύγκριση με το cetuximab, το οποίο έχει συγγένεια δέσμευσης περισσότερο από 10 φορές υψηλότερα [6]. Μελέτες

in vitro

έχουν δείξει ότι η nimotuzumab δεσμεύεται δισθενώς (δηλαδή, με τα δύο χέρια αντίσωμα σε δύο στόχους ταυτόχρονα) να EGFR με μέτρια ή υψηλή πυκνότητα, η οποία είναι η σταθερή πρότυπο προσάρτησης [7], [8]. Σε φυσιολογικούς ιστούς με χαμηλή πυκνότητα EGFR, nimotuzumab έχει μικρότερη συγγένεια και δεσμεύει EGFR με λιγότερη απληστία, η οποία απαλλάσσει τους φυσιολογικούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του δέρματος και του βλεννογόνου, από σοβαρή κυτταροτοξικότητα. Αυτό εξηγεί γιατί nimotuzumab χαρακτηρίζεται από μικρή τοξικότητα σχετιζόμενη με τη θεραπεία στην κλινική εφαρμογή, ενώ εμφανίζει παρόμοια ή ανώτερη αντικαρκινικά αποτελέσματα σε σύγκριση με άλλα αντι-EGFR μονοκλωνικά αντισώματα. Ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική μονοκλωνικό αντίσωμα, nimotuzumab σε συνδυασμό με ακτινοβολία μελετάται εκτενώς στην αποτελεσματικότητα της θεραπευτικής αγωγής καρκίνων επιθηλιακής προέλευσης.

Nimotuzumab έχει αποδειχθεί για να ενισχύσει επιλεκτικά κατά του όγκου επιπτώσεις της ιονίζουσας ακτινοβολίας κυτταρικών γραμμών NSCLC με υψηλή EGFR έκφραση [9]. Επιπλέον, μια in vivo μελέτη σε ξενομοσχεύματα ποντικών μεταμοσχεύονται με ένα γλοίωμα κυτταρική γραμμή έδειξε ότι τόσο nimotuzumab και cetuximab αυξημένη ραδιοευαισθησία των μεταμοσχευμένων υποδόριων όγκων [10]. Στη φάση ΙΙ /ΙΙΙ των κλινικών δοκιμών, nimotuzumab σε συνδυασμό με ακτινοθεραπεία έχει επιτύχει εξαιρετικά αποτελέσματα στην αντιμετώπιση τοπικά προχωρημένο καρκίνο κεφαλής και τραχήλου [11], [12]. Έχει αναφερθεί ότι το cetuximab αναστέλλει προκαλούμενη από ακτινοβολία EGFR πυρηνική μετατόπιση, και η διαδικασία αυτή συνδέεται με την καταστολή της DNA-PKcs δραστηριότητα [13], [14]. Άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι οι αναστολείς κινάσης τυροσίνης ενισχύσει ραδιοευαισθησία καταστέλλοντας κυτταρική ικανότητα της ακτινοβολίας που προκαλείται επιδιόρθωσης DNA-βλάβη [15], [16]. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η θεραπευτική αγωγή μονοκλωνικό αντίσωμα σε συνδυασμό με θεραπεία ακτινοβολίας μπορεί να επηρεάσουν την προκαλούμενη από ακτινοβολία απόκριση βλάβης του DNA. Ωστόσο, οι υποκείμενοι μηχανισμοί με τους οποίους nimotuzumab λειτουργίες σε ραδιοευαισθητοποίηση εξακολουθούν να παραμένουν ασαφείς. Σε αυτή τη μελέτη, με τη χρήση δύο καλλιεργημένων κυτταρικών γραμμών καρκίνου, στοχεύσαμε να διερευνήσει δυναμικό μοριακός μηχανισμός nimotuzumab στην ενίσχυση της κυτταρικής ραδιοευαισθησία των καρκίνων.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells, κυτταρική καλλιέργεια και τα αντιδραστήρια

Η ανθρώπινη NSCLC κυτταρική σειρά Α549 και του μαστού κυτταρική γραμμή MCF-7 (που παρέχεται από την επαρχία Heilongjiang Ινστιτούτο έρευνας καρκίνου, Harbin, Κίνα) διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (GIBCO) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS ) (NQBB, Αυστραλία) υπό υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2 στους 37 ° C. Nimotuzumab παρέχεται από Biotech Pharmaceutical Co. Ltd (Πεκίνο, Κίνα).

Κλωνογόνος

δοκιμασία επιβίωσης

εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα σε 25 εκατοστά

2 φιάλες τρυψινοποιήθηκαν, συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν. Αυτά αραιώθηκαν σειριακά σε κατάλληλες πυκνότητες, και επιστρώθηκαν εις τριπλούν με ορισμένους αριθμούς (αριθμοί διαφορετικών κυτταρικών ανάλογα με τη δόση ακτινοβοληθεί. Για παράδειγμα, 200 κύτταρα ανά φιάλη για 2Gy, 500 κύτταρα για 4Gy, 1000 κύτταρα για 6Gy, 4000 κυττάρων για 8 Gy, 10.000 κύτταρα για 10Gy και 100 κύτταρα για τον έλεγχο.) σε 25 cm

2 φιάλες που περιέχουν 5 ml μέσου καλλιέργειας με την απουσία ή παρουσία 700 ηΜ nimotuzumab. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επώαση, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 2, 4, 6, 8 και 10 Gy από 4MV ακτίνων Χ που δημιουργούνται από έναν γραμμικό επιταχυντή υψηλής ενέργειας (Elekta συνέργεια, Στοκχόλμη, Σουηδία) με ρυθμό δόσης 3 Gy min

-1. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για 10-14 ημέρες για να σχηματίσουν αποικίες. Μετά από αυτό, οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με methanol:acetic οξύ (10:01, ν /ν), και στη συνέχεια χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες. Αποικίες που περιέχουν ≥50 κύτταρα μετρήθηκαν. Το κλάσμα επιβίωσης υπολογίστηκε ως: (μέσος αριθμός των αποικιών) /(αριθμός των κυττάρων που εμβολιάσθηκαν × αποδοτικότητα επιμετάλλωση). Επιμετάλλωση αποτελεσματικότητα ορίστηκε ως: (μέσος αριθμός των αποικιών) /(ο αριθμός των εμβολιασμένων κυττάρων για τον έλεγχο, που δεν είχαν εκτεθεί σε ακτινοβολία, με ή χωρίς nimotuzumab). Τα δεδομένα προσαρμόστηκαν στο κλασικό single-χτύπημα μοντέλο πολλαπλών στόχων: SF = 1- (1-ε

-D /D0)

N για να επιστήσει την καμπύλη δόσης επιβίωση, από την οποία οι παράμετροι (D0, dq, Ν και SF2) που αντιπροσωπεύουν την ενδογενή κυτταρική ραδιοευαισθησία προήλθαν. Ο λόγος βελτίωση της ευαισθησίας (SER) υπολογίστηκε ως: (D

0 κυττάρων θεραπεία ακτινοβολίας /D

0 της nimotuzumab σε συνδυασμό με κύτταρα επεξεργασμένα ακτινοβολία)

ανάλυση κυτταρικής απόπτωσης

κύτταρα κατεργασμένα με ή χωρίς 700 ηΜ nimotuzumab για 24 ώρες εκτέθηκαν σε διαφορετικές δόσεις ακτινοβολίας (0, 2, ή 8 Gy), και συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά την ακτινοβολία για ανάλυση κυτταρικής απόπτωσης. Περίπου 1 χ 10

6 κύτταρα σε κάθε ομάδα βάφτηκαν με αννεξίνη V-FITC και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) για την ανάλυση απόπτωσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Beyotime, Κίνα). Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν με ενεργοποιούμενη με φθορισμό ταξινόμηση κυττάρων (FACS, Calibur, BD, ΗΠΑ).

γ-Η2ΑΧ εστίες ανίχνευση με συνεστιακή μικροσκόπηση

Τα κύτταρα που αναπτύχθηκαν πάνω σε καλυπτρίδες σε έξι-βοθρίων ήσαν υποβάλλεται σε επεξεργασία με ή χωρίς 700 ηΜ nimotuzumab για 24 ώρες. Ακολούθως, τα κύτταρα που ακτινοβολείται σε ποικίλες δόσεις (1, 2, 4 ή 8 Gy) που ακολουθείται από επώαση για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη αιθανόλη 70% για 30 λεπτά, πλύθηκαν 3 φορές με PBS και αποκλείστηκαν με 3% BSA και 0.1% Triton-X100 σε PBS για 30 λεπτά. Μετά την απομάκρυνση του ρυθμιστικού αποκλεισμού, τα κύτταρα επωάστηκαν με 2-4 ug /ml γ-Η2ΑΧ αντίσωμα συζευγμένο με FITC (Millipore, Billerica, ΜΑ) σε ρυθμιστικό αποκλεισμού για 2 ώρες στο σκοτάδι. Οι υπερβολικές αντισώματα πλένονται μακριά με PBS. Τέλος, το 24 h υπολειμματική γ-Η2ΑΧ εξετάστηκε με συνεστιακή μικροσκοπία (Zeiss, LSM700, Germany). Για κάθε σημείο δεδομένων αξιολογήθηκαν τουλάχιστον 300 πυρήνες.

Ανίχνευση φωσφορυλίωσης EGFR και επισκευής της βλάβης του DNA που σχετίζονται με πρωτεΐνες που

Western κηλίδας

κύτταρα Α549 και MCF-7 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 700 ηΜ nimotuzumab για 24 ώρες και είχαν ακτινοβολείται με 4 Gy ακτινών Χ για την ανίχνευση της φωσφορυλίωσης του EGFR. Τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 2 ώρες μετά την ακτινοβολία. Α549 κύτταρα που κατεργάζονται όπως περιγράφεται παραπάνω συλλέχθηκαν σε 0.5, 1, 2, ή 6 ώρες μετά την ακτινοβολία για τη δυναμική ανάλυση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την επισκευή βλάβης του DNA. Ίδιες ποσότητες των Α549 κυττάρων με το ίδιο σχήμα θεραπείας είχαν ακτινοβοληθεί με διαφορετική δόση (0, 1, 2, 4, 6Gy), επωάστηκαν για 2 ώρες, στη συνέχεια συλλέχθηκαν. Στη συνέχεια, σφαιρίδια κυττάρων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Beyotime, Κίνα), 1 mM PMSF (Beyotime, Κίνα) και 1 πρωτεάσης ταμπλέτα κοκτέιλ αναστολέα (Roche εφαρμοσμένη επιστήμη, Mannheim, Germany) ανά 10 ml διαλύματος προστέθηκε, και ολικές πρωτεΐνες απομονώθηκαν . Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών (30 μ§) διαχωρίστηκαν σε 8% πηκτές SDS-PAGE, και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε TBS-T20 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Μετά από πλύση τρεις φορές με TBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας (Zhongshan, Κίνα) για 1 ώρα. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν με κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας για HRP (BI, Isreal) και οπτικοποιήθηκε με ένα σύστημα απεικόνισης χημειοφωταύγειας (FLuorchemFC2, η Alpha Innotech, US)

Τα πρωτογενή αντισώματα αραιώθηκαν ως εξής:. Αντι-ΕΟΡΚ και αντί -pEGFR (Cell Signaling Technology, Denvers, ΜΑ), 1:1000? αντι-DNA-PK (Cell Signaling Technology, Denvers, ΜΑ), 1:1000? αντι-pDNA-PK (Abcam, Cambridge, UK), 1:500? αντι-Ku70 (Epitomic, Burlingame, Καλιφόρνια), 1:4000? αντι-ATM (Cell Signaling Technology, Denvers, ΜΑ), 1:1000? αντι-Patm (Cell Signaling Technology, Denvers, ΜΑ), 1:1000? αντι-ΑΚΤ (Cell Signaling Technology, Denvers, ΜΑ), 1:1000? αντι-ρΑΚΤ (Cell Signaling Technology, Denvers, ΜΑ), 1:1000? αντι-γ-Η2ΑΧ (Cell Signaling Technology, Denvers, ΜΑ), 1:1000? και αντι-β-ακτίνης (Zhongshan, Beijing, Κίνα), 1:2000.

Στατιστική ανάλυση

Δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας paired t-test και περιγράφεται ως μέση τιμή ± SD. Μια διαφορά θεωρείται σημαντική εάν P & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

θεραπεία Nimotuzumab αυξημένη κυτταρική ραδιοευαισθησία στον

δοκιμασία κλωνογονικού επιβίωσης

Για να εξεταστεί αν nimotuzumab ενίσχυσε την αντικαρκινική δράση της ιονίζουσας ακτινοβολία, εκτελέσαμε την δοκιμασία κλωνογονική επιβίωση με Α549 και MCF-7 κύτταρα (Σχήμα 1? ραδιοβιολογικές παράμετροι συνοψίζονται στον πίνακα 1). Δεν βρήκαμε ότι η αποτελεσματικότητα επιμετάλλωση των δύο Α549 και MCF-7 κύτταρα ήταν σημαντικά μειωμένη μετά από προθεραπεία με nimotuzumab (P: 0.256, και 0.063 αντίστοιχα, που φαίνονται ως Εικόνα 1Β). Οι καμπύλες δόσης-επιβίωσης έδειξαν ότι προκατεργασία με nimotuzumab κατέστειλε την κλωνογονική επιβίωση τόσο των Α549 κυττάρων και MCF-7 μετά διάφορες δόσεις ακτινοβολίας (Σχήμα 1Α). Η αναλογία ενίσχυσης δόση ήταν 1,36 και 1,47, αντίστοιχα, η οποία πρότεινε ότι nimotuzumab ήταν πιο αποτελεσματική στην ραδιοευαισθητοποίησης κύτταρα MCF-7 από κύτταρα Α549 in vitro.

(Α) κύτταρα Α549 και MCF-7 κύτταρα προεπωάστηκαν με και χωρίς 700 ηΜ nimotuzumab για 24 ώρες, και στη συνέχεια ακτινοβολείται με δόσεις ιονίζουσας ακτινοβολίας μεταξύ 2 και 10 Gy. After10-14 ημέρες, οι αποικίες χρωματίζονται και μετρώνται. Surviving κλάσματα υπολογίστηκαν με βάση μετρήσεις αποικιών και την αποτελεσματικότητα επιμετάλλωση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι καμπύλες προσαρμόσθηκαν με SF = 1- (1-e

-D /D0)

Ν (Β) ικανότητα επίστρωσης των κυττάρων Α549 και MCF-7 κύτταρα. Επιμετάλλωση απόδοση = (μέσος αριθμός των αποικιών) /(ο αριθμός των εμβολιασμένων κυττάρων, τα οποία υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ή χωρίς nimotuzumab). Δεν υπήρχαν στατιστικά έννοιες μεταξύ των κυττάρων nimotuzumab προεπεξεργασία Α549 /MCF-7 και ελέγχου, με P:. 0.256 και 0.063, αντίστοιχα

Η

Nimotuzumab ανέστειλε την ενεργοποίηση του EGFR μετά την ακτινοβολία

Για να αποδείξει την ικανότητα των nimotuzumab στην αναστολή της ενεργοποίησης EGFR, ο φωσφορυλίωση του EGFR σε Tyr1173 ανιχνεύθηκε με western-blot (Σχήμα 2). Όπως έδειξε, ακτινοβολία με 4Gy επαγόμενη ενεργοποιημένο φωσφορυλίωση του EGFR, τόσο Α549 και MCF-7 κύτταρα. Με την προεπεξεργασία των nimotuzumab, τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου EGFR μειώθηκαν σημαντικά μετά την ακτινοβολία.

κύτταρα Α549 και MCF-7 κύτταρα προκατεργάστηκαν με ή χωρίς nimotuzumab για 24 ώρες πριν από την ακτινοβολία με 4 Gy. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε 2 ώρες μετά την ακτινοβολία. Τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση και επωάστηκαν με αντισώματα έναντι EGFR, pEGFR και β-ακτίνης. Τα παρακάτω διαγράμματα στήλη είναι ποσοτικοποίηση των ζωνών με βάση την πυκνομετρική ανάλυση. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD του λόγου σχετική πυκνότητα με τον έλεγχο. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά (Ρ & lt? 0,05).

Η

Nimotuzumab αυξημένη κυτταρική απόπτωση που επάγεται από ακτινοβολία

ποσοστά κυτταρικής απόπτωσης ρουτίνας αναλύθηκαν για να αξιολογηθούν οι αντικαρκινικές επιδράσεις της ακτινοβολίας. Σε αυτή τη μελέτη, τα ποσοστά απόπτωσης των Α549 και MCF-7 σε κατεργασία με nimotuzumab ήταν υψηλότερες από αυτές των κυττάρων ελέγχου δέχτηκε διαφορετικές δόσεις της ακτινοβολίας (Σχήμα 3). Το αποτέλεσμα έδειξε ότι nimotuzumab αύξησε το κυτοτοξικό αποτέλεσμα της ιονίζουσας ακτινοβολίας επάγοντας κυτταρική απόπτωση.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ή χωρίς 700 ηΜ nimotuzumab για 24 ώρες, και στη συνέχεια ακτινοβολούνται με 0, 2 ή 8 Gy. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την ακτινοβολία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η κυτταρική απόπτωση εξετάστηκε με κυτταρομετρία ροής. Ένας εκπρόσωπος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων των δύο κυττάρων που εμφανίζεται (A, C). Συγκρίσεις των ποσοστών απόπτωση κυττάρων Α549 και MCF-7 μεταξύ των niomtuzumab προεπεξεργασία και ελέγχου ομάδες εμφανίζονται (Β, D). Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD του ρυθμού απόπτωσης. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά (P & lt? 0,05).

Η

Η προεπεξεργασία των nimotuzumab αυξημένη γ-H2AX σχηματισμό ως απάντηση στην ακτινοβολία

Η ποσοτικοποίηση του σχηματισμού γ-H2AX είναι ένας βασικός δείκτης για την ακτινοβολία διαλείμματα επαγόμενη DNA διπλό σκέλος (DSBs). Για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της συνδυασμένης θεραπείας με nimotuzumab και ακτινοβολία στην επιδιόρθωση του DNA, έχουμε ποσοτικά το απομένον γ-H2AX εστίες 24 ώρες μετά την ακτινοβολία με ποικίλες δόσεις με συνεστιακή μικροσκοπία. Παρατηρήσαμε ότι προθεραπεία με nimotuzumab μόνο δεν αυξάνουν την παραγωγή γ-Η2ΑΧ τόσο Α549 και MCF-7 κύτταρα σε σύγκριση με τον έλεγχο, ενώ η θεραπεία ακτινοβολίας με διαφορετικές δόσεις σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές προεπεξεργασία με nimotuzumab αριστερά περισσότερο σχηματισμό γ-Η2ΑΧ μετά από 24 ώρες από ό, τι κυττάρων με ακτινοβολία μόνο (σχήμα 4).

Α549 και MCF-7 κύτταρα προκατεργάστηκαν με ή χωρίς 700 ηΜ nimotuzumab για 24 ώρες, και ακολούθως ακτινοβολείται με 1, 2, 4 και 8 Gy. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά τα κύτταρα ακτινοβολία μονιμοποιήθηκαν και επωάστηκαν με αντίσωμα γ-Η2ΑΧ συζευγμένο με FITC. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD του υπολειμματικού γ-H2AX εστίες ανά κύτταρο. Για κάθε σημείο δεδομένων αξιολογήθηκαν τουλάχιστον 300 πυρήνες. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά (P & lt? 0,05). Οι παρακάτω εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές πυρήνες με γ-H2AX εστίες κάτω από μικροσκοπία ανοσοφθορισμού, αντιμετωπίζονται με 1Gy ή 1Gy σε συνδυασμό με nimotuzumab.

Η

Η προεπεξεργασία των nimotuzumab ρυθμίζεται την επισκευή βλάβης του DNA σε απάντηση στην ακτινοβολία σε κύτταρα Α549

μετακτινική επιδιόρθωση του DNA βλάβη χαρακτηρίζεται από την έκφραση πολλαπλών πρωτεϊνών που σχετίζονται με την επισκευή βλάβη του DNA. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε μερικές από τις συναφείς εκφράσεις πρωτεΐνης και ενεργοποιημένων μορφών τους στο πλαίσιο συνδυασμένης θεραπείας με nimotuzumab και ακτινοβολίας σε κύτταρα Α549.

Κατ ‘αρχάς, σε σύγκριση με την κινητική μεταβολή αυτών που σχετίζονται με το DNA αποκατάστασης των ζημιών πρωτεΐνες σε nimotuzumab αντιμετωπίζονται και μη κύτταρα κατεργασμένα μετά την έκθεση σε ακτινοβολία (βλέπε Σχήμα 5). Σε αυτό το πείραμα, γ-Η2ΑΧ σε αμφότερες τις κυτταρικές ομάδες παρουσίασαν μια τάση εξαρτώμενη από το χρόνο αύξηση. Σε nimotuzumab προεπεξεργασμένα ομάδα, τα επίπεδα του γ-Η2ΑΧ ήταν σημαντικά υψηλότερες από αυτές της ομάδας ελέγχου σε 1 ώρα, 2 ώρες και 6 ώρες (Σχήμα 5Β). DNA-PKcs, Κιι70, ΑΤΜ και ΑΚΤ μετά την ακτινοβολία δεν μετέβαλε σε κάθε χρονικό σημείο τόσο τον έλεγχο και nimotuzumab προεπεξεργασμένα ομάδες. Ωστόσο, η φωσφορυλιωμένη μορφή του DNA-PKcs στο Thr2609 και η φωσφορυλιωμένη μορφή του ΑΚΤ σε Thr308, τα οποία ενεργοποιούνται μορφές των δύο πρωτεϊνών που προκαλείται από ακτινοβολία, εκφράστηκαν σε χαμηλότερα επίπεδα στην προεπεξεργασία ομάδα nimotuzumab από εκείνες στον έλεγχο σε διαφορετικά χρονικά σημεία . Δυστυχώς, και οι δύο τα επίπεδα της φωσφο-DNA-PKcs και φωσφο-ΑΚΤ έλειπε η τακτική αυξανόμενη τάση σε αντιστοιχία με το χρόνο (Σχήμα 5C, D). Η φωσφορυλιωμένη μορφή των ΑΤΜ στο Ser1981 έδειξαν μικρή μεταβολή τόσο της ομάδας, καθώς και σε διαφορετικά χρονικά σημεία (Σχήμα 5Ε).

(Α) κύτταρα Α549 προκατεργάστηκαν με ή χωρίς nimotuzumab για 24 ώρες είχαν ακτινοβοληθεί με 4 Gy . Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε υποδεικνυόμενους χρόνους. Τα προϊόντα λύσης στη υποδεικνυόμενους χρόνους υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση και επωάστηκαν με αντισώματα έναντι γ-Η2ΑΧ, ΑΚΤ, ρΑΚΤ, DNA-PKcs, pDNA-PKcs, Κιι70, ΑΤΜ, Patm και β-ακτίνης. (Β-Ε) Ποσοτικοποίηση των ζωνών με βάση την πυκνομετρική ανάλυση. Τα αποτελέσματα είναι σχετική αναλογία πυκνότητας με το μη-εκπέμπον έλεγχο. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά (Ρ & lt? 0,05).

Η

Δεύτερον, να διερευνήσει κατά πόσον η αύξηση της δόσης της ακτινοβολίας προκάλεσε περισσότερο την έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με βλάβες στο DNA, και αν nimotuzumab μπορούσε να αναστείλει την ενεργοποίηση του DNA-PKcs και ΑΚΤ, εμείς ακτινοβολείται nimotuzumab προεπεξεργασία των κυττάρων Α549 και κύτταρα ελέγχου με διαφορετικές δόσεις. γ-Η2ΑΧ έδειξε μια εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση τόσο του ελέγχου και nimotuzumab προεπεξεργασμένα ομάδα, και nimotuzumab προεπεξεργασία είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική αύξηση του γ-Η2ΑΧ (Σχήμα 6Β). Τα επίπεδα της DNA-PKcs, Κιι70, ΑΤΜ, Patm και ΑΚΤ δεν άλλαξε παρά την έντονη δόση ακτινοβολίας και προεπεξεργασίας με nimotuzumab (Σχήμα 6Α, E). ρϋΝΑ-PKcs και ρΑΚΤ ήταν προφανώς χαμηλότερη στην nimotuzumab προεπεξεργασία ομάδα από εκείνες στην ομάδα ελέγχου, αλλά δεν έδειξε κάποια σημαντική μεταβολή σε κάθε δόση και στις δύο ομάδες (Σχήμα 6C, D).

(Α) κύτταρα Α549 προεπεξεργασία με ή χωρίς nimotuzumab ακτινοβολήθηκαν με ενδεικνυόμενες δόσεις. Δύο ώρες μετά τα κύτταρα ακτινοβολία συλλέχθηκαν και λύθηκαν. Τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση και επωάστηκαν με αντισώματα που περιγράφονται στο σχήμα 5. (Β-Ε) Ποσοτικοποίηση των ζωνών με βάση την πυκνομετρική ανάλυση. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά (P & lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

έχει

Αν και μονοθεραπείας με αντι-EGFR μονοκλωνικά αντισώματα παρουσιάζει περιορισμένη αποτελεσματικότητα σε κλινικές μελέτες, ο συνδυασμός τους με ακτινοθεραπεία ή /και χημειοθεραπεία δείξει υποσχόμενα αποτελέσματα στην αγωγή προχωρημένο καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων της κεφαλής και του τραχήλου, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και του παχέος εντέρου [17] – [22]. Η επιτυχία αυτής της συνδυαστικής θεραπείας είναι πολύ αποδίδεται στις ευαισθητοποίηση των αντι-EGFR mAbs σε ιονίζουσα ακτινοβολία ή /και κυτταροτοξικών παραγόντων. Nimotuzumab, ένα εξανθρωπισμένο αντι-ΕΟΡΚ mAbs, απέδειξε μοναδική ικανότητα της στην παραγωγή ραδιοευαισθητοποίησης επιδράσεις ενώ θα προκαλεί ήπιες τοξικότητες των φυσιολογικών ιστών σε κλινικές δοκιμές [8], [12]. Αν και οι αντικαρκινικές δράσεις της nimotuzumab έχει επιβεβαιωθεί in vitro και in vivo πρέπει ακόμη να διερευνηθούν [23], τα πιθανά μοριακών μηχανισμών της nimotuzumab να ραδιοευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα.

Στην παρούσα μελέτη, επιβεβαίωσε ότι το ακτινοευαισθησία του καρκινικές κυτταρικές γραμμές θα μπορούσε να ενισχυθεί με προεπεξεργασία με nimotuzumab. Από nimotuzumab μόνη της δεν επηρέασε το σχηματισμό αποικιών, έπαιξε ευαισθητοποίηση αλλά όχι πρόσθετο ρόλο όταν συνδυάζονται με ακτινοβολία. Καθώς ο στόχος της nimotuzumab, η ενεργοποίηση του EGFR που προκαλείται από την ακτινοβολία ήταν προφανώς ανέστειλε όπως ήταν αναμενόμενο. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι nimotuzumab αυξημένη ακτινοβολία απόπτωση που επάγεται από τις δύο κυτταρικές σειρές. Crombet-Ramos

et al

[23] ανέφερε ότι Α431 κύτταρα επωάζονται με imotuzumab για 48 ώρες δεν παρουσιάζουν εμφανή σημάδια αποπτωτικών και κατέληξε στο συμπέρασμα ότι ο παράγοντας έδρασε κυρίως ως κυτταροστατικά, αντί κυτταροτοξικών. Στη μελέτη μας, ωστόσο, βρήκαμε ότι nimotuzumab αύξησε το ποσοστό απόπτωσης των δύο Α549 κύτταρα και τα κύτταρα MCF-7 θεμελιωδώς, η οποία πρότεινε ότι nimotuzumab ως θεραπευτικός παράγοντας θα μπορούσε να επάγει απόπτωση των κυττάρων τουλάχιστον in vitro. Όπως ακτινοβολία σε συνδυασμό με nimotuzumab είχε ως αποτέλεσμα μια συνεργική επίδραση στην κυτταρική απόπτωση μεγαλύτερη από το άθροισμα της απόπτωσης που επάγεται από nimotuzumab και με ακτινοβολία μόνο (δηλαδή 1 + 1 & gt? 2 αποτέλεσμα), αυτό αποδεικνύεται ότι nimotuzumab έχει την ικανότητα της ραδιοευαισθητοποίησης αυτά τα καρκινικά κύτταρα . Επιπλέον, στη μελέτη μας, αν και nimotuzumab αύξησε την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων, δεν υπονομεύουν το σχηματισμό αποικιών. Εμείς Πιθανολογείται ότι οι κλωνογόνων κυττάρων των καρκίνων ήταν πιο ανθεκτικά και δύσκολο να επηρεαστούν από nimotuzumab, και ήταν η πολλαπλασιαστική κύτταρα που επάχθηκαν για απόπτωση με nimotuzumab.

Με βάση τα ανωτέρω αποτελέσματα, τότε επικεντρώθηκε στην πιθανών μοριακών μηχανισμών της ραδιοευαισθητοποίησης αποτελέσματα nimotuzumab του. Είναι γνωστό ότι ο καρκίνος ραδιοευαισθησία καθορίζεται κυρίως από την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να επισκευάσει αποτελεσματικά προκαλείται από ακτινοβολία βλάβες του DNA. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι nimotuzumab μπορεί να ραδιοευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα επηρεάζοντας τον μηχανισμό ϋδΒδ επισκευή. γ-Η2ΑΧ σχηματισμός είναι ένας ευαίσθητος δείκτης για την DSB βλάβες και χρησιμοποιείται συνήθως για να αξιολογήσει την κυτταρική ραδιοευαισθησία. Περισσότερα γ-H2AX εστίες σημαίνει περισσότερα ϋδΒδ αριστερά επιδιορθώθηκε. Η ποσοτικοποιημένη ανίχνευση της γ-H2AX με ανοσοφθορισμό και ανοσοαποτύπωση απέδειξαν ότι περισσότερο DSBs DNA αφέθηκαν επιδιορθώθηκε μετά την ακτινοβολία στην nimotuzumab προεπεξεργασία των κυττάρων, η οποία τελικά οδήγησε στην κυτταρική απόπτωση, και έδειξε μια γραμμική συσχέτιση με δόσεις ακτινοβολίας ή χρόνο μετά την ακτινοβολία.

Στη συνέχεια, μελετήσαμε το πώς nimotuzumab ανέστειλε την προκαλούμενη από ακτινοβολία ϋδΒδ επισκευής. DNA-PKcs είναι ένα κρίσιμο πρωτεΐνη που εμπλέκεται σε μη ομόλογες άκρο συναρμογής επιδιόρθωση του DNA DSBs. Η ενεργοποίηση του DNA-PKcs ρυθμίζει άμεσα την επισκευή της ακτινοβολίας που προκαλείται DSBs. Στην παρούσα μελέτη, το επίπεδο έκφρασης της DNA-PKcs μετά την ακτινοβολία δεν μετέβαλε αν προεπεξεργασία με nimotuzumab ή όχι. Όμως, η φωσφορυλιωμένη μορφή του DNA-PKcs στο Thr2609, η οποία σχετίζεται με την επισκευή DSB και κυτταρικής ραδιοευαισθησίας, αυξημένα έντονα μετά την ακτινοβολία, υποδεικνύοντας μια ιδιότητα radioresistent κυττάρων Α549 και μειώθηκε σημαντικά το nimotuzumab ομάδα προεπεξεργασίας. Επιπλέον, εξετάσαμε μία από τις ρυθμιστικές υπομονάδες της ΟΝΑ-ΡΚ συμπλόκου Κυ70. Ωστόσο, Ku70 δεν μετέβαλε σε κάθε ομάδα. Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι nimotuzumab ανέστειλε τη λειτουργία του DNA-PKcs στην επισκευή DSB καταστέλλοντας την ενεργοποίηση της.

Toulany

et al

[24] ανέφερε ότι ο EGFR-PI3K-AKT οδό ήταν που εμπλέκονται στη ρύθμιση της DNA-PKcs. Πρότειναν ότι είτε EGFR αναστολέας της τυροσινικής κινάσης ή αναστολέα ΑΚΤ καταργηθεί ακτινοβολία που προκαλείται DNA-PKcs φωσφορυλίωση σε Thr2609 σε κύτταρα μεταλλαγμένα καρκινικά K-RAS. Από μπλοκ nimotuzumab EGFR κατάντη σηματοδότησης, είναι πιθανό ότι nimotuzumab διαμορφώνει τη φωσφορυλίωση του DNA-PKcs μέσω καταστολή της ενεργοποίησης ΑΚΤ. Βρήκαμε ότι η φωσφορυλιωμένη μορφή της ΑΚΤ σε Thr308, η οποία είναι η ενεργοποιημένη μορφή που σχετίζεται με την κυτταρική επιβίωση, ιδιαίτερα αυξημένη σε ακτινοβολούμενης κύτταρα Α549, αλλά είναι παρόμοια με φωσφο-DNA-PKcs (Thr2609), ανεστάλη ολοκληρωτικά μετά από προθεραπεία με nimotuzumab. Έτσι, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι nimotuzumab μεσολάβηση επιπτώσεις της στην μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA μέσω της καταστολής της PI3K-AKT οδό. Επιστροφή στην ανάλυση κυτταρικής απόπτωσης, επιβεβαίωσε ότι η αναστολή της ενεργοποίησης ΑΚΤ από nimotuzumab σχετίζεται με την προώθηση της κυτταρικής απόπτωσης. Ο πιθανός μηχανισμός είναι μέσω αναστολής της ενεργοποίησης του DNA-PKcs, την επισκευή των προκαλούμενων από ακτινοβολία DSBs DNA εμποδίστηκε, η οποία τελικά επάγεται κυτταρικής απόπτωσης.

ATM, μια σημαντική πρωτεΐνη που συμμετέχει στην προκαλούμενη από ακτινοβολία επισκευή βλάβης του DNA, ήταν μελετηθεί για να προσδιορίσει αν η έκφραση ή η δραστηριότητα της θα μπορούσε να επηρεαστεί από την προεπεξεργασία με nimotuzumab. ΑΤΜ και ενεργοποιημένη μορφή της, η φωσφορυλιωμένη μορφή των ATM σε Ser1981, δεν αλλάζουν αν προεπεξεργασία με nimotuzumab ή όχι. Και οι δύο DNA-PKcs και ΑΤΜ φωσφορυλιώνει γ-H2AX μετά από ιονίζουσες ακτινοβολίες [24], [25]. Στη μελέτη μας, μετά την ενεργοποίηση του DNA-PKcs μετά ακτινοβολία αναστάλθηκε από nimotuzumab μέσω αποκλεισμού ΡΙ3Κ-ΑΚΤ οδού, η φωσφορυλίωση του Η2ΑΧ μπορεί να οφείλεται στη δραστηριότητα του ΑΤΜ.

Συνοπτικά, δείξαμε ότι η αντι-EGFR mAb nimotuzumab radiosensitizes καρκινικά κύτταρα επάγοντας πιο απόπτωση και επιδιορθώθηκε ϋδΒδ. Ο βασικός μηχανισμός αυτού του αποτελέσματος ραδιοευαισθητοποίησης σχετίζεται με την αναστολή της ΟΝΑ-ΡΚ εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA DSBs μέσω της απόφραξης του ΡΙ3Κ-ΑΚΤ οδού. Από nimotuzumab είναι ένα εγκεκριμένο αντι-EGFR mAb για θεραπευτική χρήση στη θεραπεία του καρκίνου, εξερευνώντας τις ακριβείς αντικαρκινικά μηχανισμούς nimotuzumab θα βοηθήσει να αυξήσει την αποτελεσματικότητα αυτού του παράγοντα στην κλινική πράξη.