Αφηρημένο

Η καπεσιταβίνη (ΚΑΠ) είναι ένα 5-FU προ-φάρμακο εγκριθεί για τη θεραπεία πολλών μορφών καρκίνου και είναι που χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη (GEM) στη θεραπεία των ασθενών με παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα (PDAC). Ωστόσο, η περιορισμένη προ-κλινικά δεδομένα από τις επιδράσεις της ΚΓΠ στο PDAC είναι διαθέσιμες για να υποστηρίξουν τη χρήση του συνδυασμού GEMCAP στην κλινική. Συνεπώς, διερευνήσαμε τη φαρμακοκινητική και την αποτελεσματικότητα της ΚΓΠ ως μονοθεραπεία πρώτα και στη συνέχεια σε συνδυασμό με GEM να εκτιμηθεί η χρησιμότητα της θεραπείας GEMCAP σε κλινικό περιβάλλον. Χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο αυθόρμητης PDAC συμβαίνουν σε Kras

G12D? p53

R172H? Pdx1-Cre (KPC) ποντίκια και υποδόρια αλλομοσχεύματα του KPC PDAC που προέρχονται από κυτταρική σειρά (K8484), δείξαμε ότι ΚΓΠ επιτυγχάνονται συγκεντρώσεις όγκου (~ 25 μΜ) της 5-FU και στα δύο μοντέλα, ως μονοθεραπεία, και προκαλείται από την επιβίωση παρόμοιο με GEM σε ποντίκια KPC, προτείνοντας παρόμοια αποτελεσματικότητα.

In vitro

μελέτες που διεξήχθησαν σε K8484 κύτταρα καθώς και σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές του παγκρέατος έδειξαν ένα προσθετικό αποτέλεσμα του συνδυασμού GEMCAP ωστόσο, αυξημένη τοξικότητα

in vivo

και κανένα όφελος ενός ανεκτού συνδυασμού GEMCAP ταυτοποιήθηκε στο μοντέλο αλλομοσχεύματος σε σύγκριση με GEM μόνο. Η εργασία μας παρέχει προ-κλινικές ενδείξεις της παράδοσης 5-FU σε όγκους και την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου μετά από του στόματος χορήγηση ΚΓΠ η οποία ήταν παρόμοια με τα αποτελέσματα του GEM. Παρ ‘όλα αυτά, ο συνδυασμός GEMCAP δεν βελτιώνει το θεραπευτικό δείκτη σε σύγκριση με μόνη GEM. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η ΚΓΠ θα μπορούσε να θεωρηθεί ως εναλλακτική λύση για την GEM στο μέλλον, ορθολογικά σχεδιασμένη, στρατηγικές συνδυασμού θεραπείας για προχωρημένο καρκίνο του παγκρέατος

Παράθεση:. Courtin Α, Richards FM, Bapiro ΤΕ, Bramhall JL, Neesse Α, Cook Ν, et al. (2013) Αντι-όγκου αποτελεσματικότητα του Capecitabine σε ένα γενετικά τροποποιημένο μοντέλο ποντικού του καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 8 (6): e67330. doi: 10.1371 /journal.pone.0067330

Επιμέλεια: Hana Algul, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 6, Φεβρουαρίου του 2013? Αποδεκτές: 16η του Μάη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 28 Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Courtin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Cancer Research UK (www.cancerresearchuk.org) μέσω του προγράμματος επιχορήγησης C96 /A8333 με DJ και μέσω χρηματοδότησης CRUK Cambridge Ινστιτούτο Ομάδα Leader για DJ και DT. Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από το Πανεπιστήμιο του Cambridge, το Ίδρυμα Li Ka Shing και από μια φιλανθρωπική δωρεά στο Πανεπιστήμιο του Cambridge από Hutchison-Whampoa Ltd. Το έργο υποστηρίζεται επίσης από χρηματοδότηση από το Ερευνητικό Κέντρο NIHR Cambridge Βιοϊατρικής (www.nihr .ac.uk). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. DJ έχει λάβει στήριξη των κλινικών δοκιμών από τη Roche και έχει επίσης υπηρετήσει σε μια συντακτική επιτροπή για το web site Xeloda (καπεσιταβίνη). Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από την Hutchison Whampoa-Ltd, με τη μορφή ενός φιλανθρωπική δωρεά στο Cambridge Ινστιτούτο CRUK που συνέβαλαν με τον μισθό της DT. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων και υλικών. Όλοι οι άλλοι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα του πόρου (PDAC) είναι η τέταρτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στις βιομηχανικές χώρες. Συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι λιγότερο από το 5% [1]. Ο υψηλός βαθμός θνησιμότητας των PDAC οφείλεται στην έλλειψη μεθόδων έγκαιρης ανίχνευσης και της κακής αποτελεσματικότητας των υπάρχουσες θεραπείες. Γεμσιταβίνη (GEM) είναι η τυπική θεραπεία, αλλά ο μέσος χρόνος επιβίωσης παραμένει μόνο 5-7 μήνες σε ασθενείς με προχωρημένη νόσο [2]. Ως εκ τούτου, οι πιο αποτελεσματικές στρατηγικές θεραπείας που απαιτείται

Η καπεσιταβίνη. (Καπεσιταμπίνη? Hoffmann La Roche) είναι ένας από του στόματος χορηγούμενη καρβαμιδική φθοριοπυριμιδίνη, μεταβολίζεται στο ήπαρ και όγκου με καρβοξυλοεστεράσες και απαμινάσης της κυτιδίνης σε 5′-δεοξυ-5-φθοροκυτιδίνης (5′-DFCR) και 5′-δεοξυ-5-φθοροουριδίνης (5′-DFUR) αντιστοίχως. Το τελικό βήμα της ενεργοποίησης της καπεσιταβίνης (CAP), η μετατροπή του 5′-DFUR στην κυτταροτοξική 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), προκαλείται από φωσφορυλάση θυμιδίνης [3] – [5], η οποία εκφράζεται πιό ιδιαίτερα σε νεοπλασματικά από φυσιολογικό ιστό, καθιστώντας ΚΓΠ πιο ειδικά για όγκο από 5-FU [5], [6]. αποτελεσματικότητα κατά του όγκου του CAP έχει δειχθεί σε πολυάριθμες μελέτες χρησιμοποιώντας ανθρώπινα μοντέλα ξενομοσχεύματος καρκίνου του μαστού, του παχέος εντέρου, του στομάχου, του τραχήλου της μήτρας, των ωοθηκών κύστη και ο καρκίνος του προστάτη (βλέπε για ανασκόπηση [7]), αλλά μόνο μία μελέτη έχει αναφερθεί σε ένα μοντέλο πάγκρεας [8] και αυτό ήταν ένα άτυπο KRAS άγριου τύπου ξενομοσχεύματος καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων. Στην κλινική, η ΚΓΠ έχει εγκριθεί από το FDA ως θεραπεία μοναδικός παράγοντας πρώτης γραμμής σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου και μεταστατικό καρκίνο του μαστού ως μονοθεραπεία ή σε συνδυασμό με ντοσεταξέλη, μετά την αποτυχία της προηγούμενης ανθρακυκλίνης-χημειοθεραπεία με βάση. Σε ασθενείς με εντελώς resected καρκίνο του παγκρέατος, έχει αποδειχθεί ότι το συνδυασμένο ενδοφλέβια bolus 5-φθοριοουρακίλη και φολινικό οξύ (Fufa) είναι ένα ενεργό επικουρική θεραπεία και η χρήση των Fufa είναι ισοδύναμη με GEM όταν συνολική επιβίωση είναι το τελικό σημείο [9 ], [10]. Σε προχωρημένη PDAC, ιδίως στο Ηνωμένο Βασίλειο, CAP έχει αντικαταστήσει Fufa και χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με GEM (GEMCAP), με βάση τα αποτελέσματα της μετα-ανάλυση που πραγματοποιήθηκε από Heinemann και al. που δείχνει ένα μικρό αλλά σημαντικό όφελος επιβίωσης από το συνδυασμό του GEM με φθοριοπυριμιδίνη και ιδιαίτερα με ΚΓΠ [2]. Μια πρόσφατη κλινική μελέτη επιβεβαίωσε το όφελος της GEMCAP σε μη επιλεγμένους ασθενείς με προχωρημένο PDAC [11].

Λόγω των περιορισμένων προ-κλινικά δεδομένα με τη χρήση της ΚΓΠ το PDAC,

in vivo

μελέτες πραγματοποιήθηκαν να αξιολογήσει CAP σε ένα γενετικά μοντέλο ποντικού της νόσου. KRAS

G12D? p53

R172H? Pdx1-Cre (KPC) ποντικούς υπό όρους εκφράζουν ενδογενές μεταλλαγμένο Kras και ρ53 αλληλίων σε παγκρεατικά κύτταρα [12] και την ανάπτυξη παγκρεατικών όγκων, η οποία ανακεφαλαίωση των παθοφυσιολογικών πτυχές και τα μοριακά χαρακτηριστικά της ανθρώπινης PDAC [13]. Χρησιμοποιήσαμε επίσης μια αλλομοσχεύματος ενός παγκρεατικού καρκίνου κυτταρική γραμμή (K8484) απομονώθηκε από ένα PDAC KPC. μελέτες φαρμακοκινητικής και αποτελεσματικότητας διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ενιαίο ΚΓΠ παράγοντα και τον συνδυασμό των GEM και της ΚΑΠ. Μελέτες από τη βιβλιογραφία προτείνεται σύνδεσης μεταξύ απαμινάσης της κυτιδίνης (CDA) δραστηριότητα του ενζύμου και τον κίνδυνο τοξικότητας σε ασθενείς που λαμβάνουν GEM ή CAP-θεραπεία με βάση [14], [15]. CDA εμπλέκεται στην ενεργοποίηση του ΚΓΠ μέσω του απαμίνωση της DFCR σε DFUR αλλά είναι αντιστρόφως υπεύθυνη για την απαμίνωση της GEM σε ανενεργό μεταβολίτη της dFdU [4], [5], [16], [17]. Λόγω της τοξικότητας που παρατηρήθηκαν με το συνδυασμό GEMCAP έχουμε ποσοτικά δραστικότητα του ενζύμου CDA στον ιστό του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ποντίκι Στελέχη

KPC ποντίκια ανάπτυξη προηγμένων PDAC από 2 για 3 μήνες και έχουν μια κοντύτερη μέση επιβίωση 5 περίπου μήνες [12], [18]. κουτάβια αναφοράς τους, Kras? p53

R172H? Pdx1-Cre (PC) ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν επίσης στη μελέτη αυτή να μεταμοσχεύσει υποδορίως την κυτταρική γραμμή K8484. Έτσι, όλα τα πειράματα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ποντικούς από το ίδιο μίγμα 129 /SvJal /C57BL /6 γενετικό υπόβαθρο. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με το Ηνωμένο Βασίλειο Ζώα (Scientific Procedures) Act του 1986 με την έγκριση από την τοπική Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων, και ακολουθώντας τις κατευθυντήριες γραμμές για το 2010 από την Συντονιστική Επιτροπή του Ηνωμένου Βασιλείου για την Έρευνα του Καρκίνου [19].

κυτταρικές σειρές

Η κυτταρική σειρά K8484 ιδρύθηκε από έναν όγκο KPC PDAC από Olive et al. [18], [20]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ (Life Technologies) συμπληρωμένο με ορό 5% εμβρυϊκό ορό (FBS). Οι ανθρώπινες παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές Panc-1 και MiaPaCa-2 ελήφθησαν από την ECACC (Salisbury, UK) και αναπτύχθηκαν σε DMEM με 10% FBS. Η ταυτότητα του όλες τις κυτταρικές σειρές ανθρώπινου επαληθεύτηκαν από STR γονότυπου και βρέθηκαν αρνητικά για μυκόπλασμα.

Η κυτταροτοξικότητα Δοκιμασία

κυτταροτοξικότητα των ναρκωτικών

in vitro

εκτιμήθηκε από τα μέσα του σουλφοροδαμίνη Β χρωματομετρική (SRB) δοκιμασία. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων και δοσολογήθηκαν με ένα εύρος συγκεντρώσεων του 5-FU (0,03 μΜ έως 30 μΜ) σε σειρές και gemcitabine (3 χ 10

-4 μΜ έως 0.3 μΜ) σε στήλες, δίνοντας ένα πλέγμα 8 × 8 συνδυασμοί συγκέντρωσης. Μετά από 72 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα μετά μονιμοποιήθηκαν (3% τριχλωροξικό οξύ, 90 λεπτά, 4 ° C), πλύθηκαν σε ύδωρ και βάφτηκαν με ένα SRB 0,057% διάλυμα (Sigma) σε οξικό οξύ (w /v) για 30 λεπτά. Οι πλάκες πλύθηκαν (1% οξικό οξύ, 4 φορές), και η χρωστική πρωτεΐνη συνδεδεμένη διαλύθηκε σε 10 mM Tris διάλυμα βάσης (ρΗ 10,5). Ο φθορισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Tecan Άπειρο M200 πλάκα-reader (διέγερση 488 nm, εκπομπή 585 nm). Η% αναστολή ανάπτυξης (GI) σε σύγκριση με διαλύτη κύτταρα ελέγχου επεξεργασμένα υπολογίστηκε για κάθε συνδυασμό συγκέντρωση φαρμάκου.

Η επίδραση του συνδυασμού αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το μοντέλο Bliss Independance [21], [22] σύμφωνα με τη πρωτόκολλο περιγράψαμε προηγουμένως [23]. Εν συντομία, ένα μοντέλο προσθετικότητα χτίστηκε με βάση τα στοιχεία και μόνο παράγοντα από 5-FU και GEM. τιμές GI που λαμβάνεται από αυτό το μοντέλο στη συνέχεια αφαιρούνται από τις πειραματικές τιμές για τον εντοπισμό περιοχών του συνέργειας και ανταγωνισμού. Οι αρνητικοί αριθμοί δείχνουν λιγότερο από αθροιστικών επιδράσεων (κίτρινο σε κόκκινο χρώμα) και θετικούς αριθμούς δείχνουν μεγαλύτερο από προσθετικό αποτέλεσμα (πράσινο σε μπλε).

παρασκευή ναρκωτικών

σκόνη καπεσιταβίνη (Sequoia Research) αιωρήθηκε και πάλι σε 40 mM κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα και 5% αραβικό κόμμι σε 100 mg /ml και χορηγήθηκε από του στόματος καθετηριασμό. υδροχλωρική γεμσιταβίνη (Tocris Bioscience) διαλύθηκε σε αλατόνερο σε 20 mg /ml και χορηγήθηκε με ενδοπεριτοναϊκή ένεση.

Φαρμακοκινητική και Μελέτες Αποτελεσματικότητας σε K8484 αλλομοσχεύματος Μοντέλο

Διμερείς αλλομοσχεύματα K8484 ελήφθησαν με υποδόρια ένεση 10

6 κύτταρα ανά πλευρά. Για τις μελέτες της φαρμακοκινητικής, ποντίκια που φέρουν όγκο αλλομοσχεύματος υποβλήθηκαν σε αγωγή με μία μόνο δόση ΚΓΠ σε 755 mg /kg και τα δείγματα συλλέχθηκαν 10 λεπτά, 20 λεπτά, 40 λεπτά, 1 ώρα, 2 ώρες και 4 ώρες μετά, τρία ζώα ανά χρονικό σημείο. Το αίμα συλλέχθηκε σε ηπαρίνη λιθίου, και απομονώνεται το πλάσμα και φυλάσσεται στους -80 ° C. Ήπαρ και οι όγκοι αφαιρέθηκαν και καταψύχθηκαν ταχέως σε υγρό άζωτο.

Σε μελέτες αποτελεσματικότητας CAP, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με CAP στο 755 mg /kg ή όχημα για 5 συνεχείς ημέρες ανά εβδομάδα για 3 εβδομάδες. Σε GEMCAP μελέτη συνδυασμού αποτελεσματικότητα, τα ποντίκια έλαβαν δόσεις gemcitabine στα 75 mg /kg, κάθε 3 ημέρες μόνο του ή σε συνδυασμό με από του στόματος δόσεις ΚΓΠ σε 539 mg /kg χορηγούμενη 5 ημέρες την εβδομάδα. Οι όγκοι μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας με δαγκάνες. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε ως μήκος Χ πλάτος

2 × π /6.

Η αποτελεσματικότητα και η Μελέτη Επιβίωσης σε KPC μοντέλο ποντικού

Η εγγραφή των KPC ποντίκια στη μελέτη βασίστηκε σε μέγεθος του όγκου, μετράται με υπερήχους σε ένα αξονικό προσανατολισμό. Ποντίκια με μέση PDAC διαμέτρους όγκου 6-9 mm εγγράφηκαν. Για τη μελέτη βραχυπρόθεσμη αποτελεσματικότητα, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με CAP στο 755 mg /kg ή όχημα για 7 συνεχόμενες ημέρες. Κατά τη διάρκεια της θεραπείας, οι ποντικοί απεικονίζεται δύο φορές με απεικόνιση υπερήχων υψηλής ανάλυσης με τη χρήση του Συστήματος Vevo 770 (Visual Sonics, Inc) [24] και οι όγκοι του όγκου προσδιορίστηκαν ποσοτικά [18]. Την ημέρα 7, τα ποντίκια θανατώθηκαν 2 ώρες μετά τη δόση ΚΓΠ. Plasma, όγκων και το ήπαρ συλλέχθηκαν ως ανωτέρω. Για τη μελέτη επιβίωσης, οι ποντικοί που εγγράφονται, και απεικονίζεται κάθε 3 ημέρες, ενώ θεραπεία με CAP στο 755 mg /kg επί 5 διαδοχικές ημέρες την εβδομάδα ή με GEM 100 mg /kg κάθε 3 ημέρες έως ότου εξήχθησαν τα τελικού σημείου κριτήρια. Αυτά περιελάμβαναν την ανάπτυξη των κοιλιακών ασκίτη, σοβαρή καχεξία, σημαντική απώλεια βάρους (που πλησιάζει το 20%) του αρχικού βάρους ή ακραία αδυναμία ή αδράνεια.

Η ανοσοϊστοχημεία

, ενσωματωμένα σε παραφίνη τομές ιστών φορμόλη-σταθερής ήταν χρωματισμένο χρησιμοποιώντας φωσφο-ιστόνης Η3 αντίσωμα (Upstate, # 06-570) και ανιχνεύεται με τη χρήση DAB υποστρώματος υπεροξειδάσης (Vector Labs). Χρώση απεικόνιση και ποσοτικά χρησιμοποιώντας το Ariol συστήματος (Leica Microsystems). Ένα ελάχιστο 3 πεδίων ανά όγκου ποσοτικά. PH3 θετικά κύτταρα θεωρούνται όσα έχουν θετικά χρώση συμπυκνωμένη χρωματίνη.

GEMCAP Συνδυασμός μελέτες ανοχής

ποντίκια PC φέρουν αλλομοσχεύματα κυττάρων K8484 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με GEM 100 mg /kg ή 75 mg /kg κάθε 3 ημέρες μόνο του ή σε συνδυασμό με CAP στο 755 mg /kg ή 539 mg /kg ή 378 mg /kg, 5 συνεχείς ημέρες ανά εβδομάδα και σκοτώθηκαν αν υπάρχουν κλινικά σημεία πλησίασε τα επιτρεπόμενα όρια (τα οποία περιλαμβάνονται διάρροια, αιμορραγία και η απώλεια βάρους που πλησιάζει 20%). Χρησιμοποιήθηκαν δύο ζώα ανά δόση. H ανταπόκριση του όγκου εκτιμήθηκε με καθημερινή μέτρηση των όγκων με δαγκάνες.

Προσδιορισμός της καπεσιταβίνης και των μεταβολιτών οι συγκεντρώσεις στο πλάσμα, το ήπαρ και όγκοι

ΚΓΠ, DFCR, DFUR και 5FU προσδιορίστηκαν τόσο στο πλάσμα και ιστούς χρησιμοποιώντας μία τροποποιημένη έκδοση του πρωτοκόλλου προηγουμένως δημοσιευθεί [25]. Εν συντομία, δείγματα ιστού ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν ομογενοποιητή Precellys 24 με έδρανα μικρή μπάλα (Kit Precellys MK28-R) για 2 × 50 δευτερόλεπτα σε 6 000 rpm σε παγωμένο 50:50 ακετονιτρίλιο: νερό (ν /ν) που περιείχε 25 μg /ml τετραϋδρουριδίνη (Promega) για να κάνει μια τελική συγκέντρωση 50 mg ιστού ανά ml. Πενήντα μΙ ομογενοποίημα μεταφέρθηκε σε έναν καθαρό σωλήνα prespiked με 200 μΙ παγωμένου ακετονιτριλίου που περιέχει 50 ng /ml σταθερό επισημασμένο (SIL) εσωτερικά πρότυπα και των 4 αναλυτών (Toronto Research Chemicals). Μετά από φυγοκέντρηση στα 20.000 g για 5 λεπτά το υπερκείμενο εξατμίστηκε μέχρι ξηρού, επαναιωρήθηκαν σε 100 μι νερού και εγχύθηκε επί της LC-MS /MS. Για δείγματα πλάσματος, 50 μι πλάσματος καταβυθίζεται με 150 μΙ ακετονιτριλίου που περιέχει 50 ng /ml σταθερά σημασμένα εσωτερικά πρότυπα και επεξεργασία παρομοίως.

Η ανίχνευση επιτυγχάνεται με LC-MS /MS χρησιμοποιώντας ένα Thermo TSQ Vantage φασματόμετρο μάζας με έναν ανιχνευτή HESI-ΙΙ που λειτουργούν σε θετικό και αρνητικό τρόπο σε μια τάση ψεκασμού 3 kV και ψεκαστήρα θερμοκρασία 325 ° C. Η ανίχνευση των ιόντων διεξήχθη σε κατάσταση πολλαπλών παρακολούθηση της αντίδρασης, τα ειδικά για κάθε ένωση. Συγκεντρώσεις της καπεσιταβίνης και των μεταβολιτών στα δείγματα προσδιορίστηκαν με σύγκριση σε σχέση με τις γραμμές αναφοράς που χαράχτηκε χρησιμοποιώντας αυθεντικά πρότυπα αναφοράς.

CDA ενζυμική δραστηριότητα

Για την προετοιμασία του αργού μήτρα ενζύμου, καρκινικός ιστός ομογενοποιείται σε 500 μL 0,1 Μ Tris-HCl ρΗ 8 ρυθμιστικό για 2 × 50 δευτερόλεπτα σε 6000 rpm χρησιμοποιώντας έναν ομογενοποιητή Precelly. προϊόντα λύσης του όγκου στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στα 14500 rpm στους 4 ° C, τα υπερκείμενα αποχύθηκαν και το περιεχόμενο πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης DC-BIORAD.

Για την δοκιμασία δραστικότητας ενζύμου CDA, διαλύματα παρακαταθήκης GEM παρασκευάστηκαν νερό. Για κάθε αντίδραση, 20 μι του εκχυλίσματος ενζύμου όγκου αναμίχθηκε με 170 μί 0.1 Μ Tris-HCl, 50 mM β-μερκαπτοαιθανόλη και 10 μL του κατάλληλου διαλύματος αποθέματος γεμσιταβίνη να αποκτηθούν τελικές συγκεντρώσεις υποστρώματος GEM 50 μΜ έως 5.000 μΜ. Τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά, η αντίδραση διακόπηκε με προσθήκη 600 μL ακετονιτριλίου και 50 μι εσωτερικού προτύπου dFdU-

13C,

15Ν

2 προστέθηκαν σε κάθε δείγμα. Το ίδιο πρωτόκολλο χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή μίας πρότυπης καμπύλης dFdU που κυμαίνονται από 2,5 ng /mL έως 5000 ng /mL, καθώς και High (3500 ng /mL), μέσο (200 ng /mL) και χαμηλής (37,5 ng /mL) τον έλεγχο της ποιότητας πρότυπα dFdU.

Όλα τα δείγματα αναμίχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στις 5000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C. 200 μι του υπερκείμενου μεταφέρθηκαν σε μια πλάκα 96 φρεατίων και εξατμίστηκε μέχρι ξηρού. Τα δείγματα στη συνέχεια ανασυστάθηκαν σε 200 μί νερό, στροβιλίζεται επί 5 λεπτά και το dFdU ποσοτικοποιήθηκε με LC-MS /MS και ομαλοποιήθηκε ως προς το σύνολο των συγκεντρώσεων πρωτεΐνης.

Ο

in vitro

δοκιμασία ανταγωνισμού ήταν πραγματοποιήθηκε σε ένα εκχύλισμα ενζύμου από έναν μη επεξεργασμένο όγκο αλλομοσχεύματος χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο που περιγράφεται παραπάνω. Το εκχύλισμα του ενζύμου αναμίχθηκε με μια σταθερή συγκέντρωση 1.800 μΜ GEM, που αντιστοιχεί στο χιλιόμετρα του CDA σε αυτού του ενζύμου εκχύλισμα, και κυμαίνονται δόσεις DFCR (0 έως 1200 μΜ) ως ανταγωνιστή. Η dFdU μετατραπεί από GEM ποσοτικά με LC-MS /MS.

Στατιστική Ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism έκδοση 5.0. Σημασία των διαφορών στην αποτελεσματικότητα κατά του όγκου CAP, CDA Vmax και Km για CAP έναντι όχημα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωμένο t-test. Σε μελέτες ανεκτικότητας και GEMCAP συνδυασμό, διάκριση σε αυξήσεις του όγκου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένας τρόπος ANOVA που ακολουθείται από μια Newman-Keuls πολλαπλών συγκρίσεων post-test.

Αποτελέσματα

φαρμακοκινητική και φαρμακοδυναμική της ΚΓΠ και της οι μεταβολίτες σε ιστούς ποντικού

Για να διερευνηθεί η φαρμακοκινητική της ΚΓΠ και των μεταβολιτών της, αναλύσαμε με φασματομετρία μάζας τα ομογενοποιήματα πλάσματος, όγκου και ήπατος από ποντικούς που φέρουν όγκο K8484 αλλομοσχεύματος συλλέγονται σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά από μία απλή δόση του CAP χορηγείται από το στόμα σε 755 mg /kg (2.1 mmol /kg /ημέρα). Αυτή η δόση είναι η ανθρώπινη ισοδύναμη δόση, που προσδιορίζεται σύμφωνα με την μέθοδο του Reagan-Shaw et al [26]. CAP, DFCR και DFUR βρέθηκαν στις 3 ιστούς σε κάθε χρονικό σημείο (Σχήμα 1). Πλάσμα C

max για DFCR ήταν 393 ± 27 μΜ (20 λεπτά) και για DFUR 125 ± 90 μΜ (40 λεπτά) (Σχήμα 1Α). Σε ιστό όγκου, DFCR και DFUR C

max ήταν 256 ± 7 μΜ και 101 ± 7 μΜ αντίστοιχα 45 λεπτά μετά τη χορήγηση της ΚΓΠ και έπεσε στο 64,4 ± 45,3 μΜ και 46,4 ± 28,1 μΜ μετά από 4 ώρες (Εικόνα 1Β). Στο ήπαρ, C

max για όλους τους μεταβολίτες έφτασε 10 λεπτά μετά τη χορήγηση και στη συνέχεια μειώθηκε προοδευτικά (Εικόνα 1Γ). Οι συγκεντρώσεις των ηπατικών DFCR ήταν υψηλότερες από ό, τι σε όγκο από τους ίδιους ποντικούς και το ήπαρ Οι συγκεντρώσεις DFUR ήταν χαμηλότερες, σύμφωνα με τις προηγουμένως αναφερθείσες κατανομές των CES και CDA σε ιστούς [5]. Intra των όγκων συγκεντρώσεις 5-FU αυξηθεί προοδευτικά από 12,7 ± 3,7 μΜ μετά από 10 λεπτά σε 49,5 μΜ μετά από 1 ώρα και έπεσε στο 10,7 ± 3,4 μΜ μετά από 4 ώρες (Εικόνα 1Β). Όπως μας

in vitro πειράματα σε

K8484 κύτταρα έδειξαν ένα IC

50 για 5-FU από 2,56 ± 0,55 μΜ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), αυτά

in vivo

τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι μία από του στόματος δοσολογία CAP παρέχει μια θεραπευτικά αποτελεσματική δόση στους όγκους αλλομοσχεύματος. 5-FU τα επίπεδα ήταν πάνω από 30 φορές μικρότερη σε πλάσμα (1.9 ± 0.5 μΜ σε 40 λεπτά και 0.3 ± 0.2 μΜ μετά από 4 ώρες) από ό, τι στον όγκο και ήταν κάτω από το όριο ποσοτικοποίησης στο ήπαρ από 2 ώρες (Εικόνα 1 C). Μία φαρμακοδυναμική μελέτη πραγματοποιήθηκε επίσης για να προσδιοριστεί η επίδραση μιας εφάπαξ δόσης 755 mg /kg CAP επί του πολλαπλασιασμού σε όγκους αλλομοσχεύματος K8484. Οι όγκοι συλλέχθηκαν από 40 λεπτά, 2 ώρες και 4 ώρες μετά τη λήψη και ανοσοϊστοχημεία για φωσφο-ιστόνης Η3 (ΡΗ3) ποσοτικοποιήθηκε. χρώση ΡΗ3 ήταν σημαντικά μειωμένη 4 ώρες μετά τη χορήγηση (Ρ & lt? 0,01? σχήμα 1Δ). σύγκριση με τον έλεγχο, αποκαλύπτοντας μια μείωση στον μιτωτικό κυτταρικό αριθμό μετά από αγωγή ΚΓΠ

μεταβολιτών συγκεντρώσεις στο πλάσμα (Α), K8484 ομογενοποιήματα όγκου αλλομοσχεύματος (Β) και προϊόντα ομογενοποίησης ήπατος (C) μετά από μία μόνο δόση ΚΓΠ σε 755 mg /kg. Μέση ± SD (η = 3 εκτός για 45 λεπτά και 1 ώρα όπου η = 2). (D) Ανοσοϊστοχημεία για φωσφο-ιστόνης Η3 (ΡΗ3) ποσοτικοποιούνται σε KPC όγκους αλλομοσχεύματος σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά από μία εφάπαξ δόση 755 mg /kg ΚΓΠ. Η μέση ± SEM από τουλάχιστον τρία όγκους (** ρ & lt? 0,01). συγκεντρώσεις (Ε) μεταβολίτη στο KPC ιστούς ποντικού 2 ώρες μετά την τελευταία της 7 διαδοχικές δόσεις ΚΓΠ σε 755 mg /kg, Μέση και SEM από 6 ποντικούς. συγκεντρώσεις (F) 5-FU 2 ώρες μετά από εφάπαξ δόση (συνεχής γραμμή) ή πέντε διαδοχικές δόσεις (διακεκομμένη γραμμή) του CAP (755 mg /kg) που χορηγείται σε ποντίκια που φέρουν όγκους αλλομοσχεύματος K8484.

Η

έχει αποδειχθεί στο παρελθόν ότι

in situ

KPC PDAC όγκοι είναι λιγότερο ευαίσθητες σε GEM από KPC αλλομοσχεύματα παρά πανομοιότυπα

Kras

τους και

p53

γονότυπους, και αυτή η διαφορά στην ευαισθησία αποδόθηκε στην περιορισμένη παροχή φαρμάκου στους όγκους KPC [18]. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε το ποσό της ΚΓΠ και των μεταβολιτών σε ιστούς από ποντίκια KPC φέρουν όγκο μετά από επτά ημέρες θεραπείας ΚΓΠ (755 mg /kg). Στο πλάσμα και το ήπαρ CAP, DFCR, DFUR και οι συγκεντρώσεις 5-FU ήταν συγκρίσιμα μεταξύ ποντικών KPC και τους οικοδεσπότες αλλομοσχεύματος 2 ώρες μετά την τελευταία δόση (Σχήμα 1 Ε). Σε όγκους KPC PDAC, οι συγκεντρώσεις 5-FU ήταν 26,9 ± 14,3 μΜ (Σχήμα 1 Ε) σε σύγκριση με 23,0 ± 8,1 μΜ σε όγκους αλλομοσχεύματος KPC, 2 ώρες μετά από εφάπαξ δόση ΚΓΠ (Σχήμα 1Β). Λόγω της διαφοράς στο πρωτόκολλο της μελέτης (7 δόσεις στην KPC ποντίκια έναντι εφάπαξ δόση στα αλλομοσχεύματα K8484), συγκρίναμε επίσης τα δεδομένα με αυτά από μια ανεξάρτητη μελέτη φαρμακοκινητικής πραγματοποιήθηκε μετά από 5 ημερήσιες δόσεις της ΚΓΠ χορηγείται σε ποντίκια που φέρουν K8484 αλλομοσχεύματα. Σε αυτή τη μελέτη οι συγκεντρώσεις 5-FU σε όγκο 2 ώρες μετά την πέμπτη συνεχόμενη δόση του CAP ήταν 22,7 ± 7,7 μΜ (Σχήμα 1 F), που ισοδυναμεί με την συγκέντρωση 5-FU μετά από εφάπαξ δόση σε όγκο αλλομοσχεύματος (Σχήμα 1Β) ή μετά από 7 συνεχόμενες δόσεις σε όγκους KPC (Σχήμα 1 Ε). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι πολλαπλές δόσεις του ΚΓΠ δεν οδήγησε σε 5-FU συσσώρευση στον όγκο. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η από του στόματος ΚΓΠ παραδοθεί ένα παρόμοιο ποσό των 5-FU στο

in situ

όγκους PDAC και στους όγκους μοσχεύματος.

Αποτελεσματικότητα

ΚΓΠ αντι-όγκου σε παγκρέατος Όγκοι

Μελετήσαμε πρώτα το αποτέλεσμα της ΚΓΠ στην ανάπτυξη όγκων αλλομοσχεύματος K8484. Οι ποντικοί δοσολογούνται με όχημα ή CAP στο 755 mg /kg για 5 ημέρες την εβδομάδα. Μετά από 3 εβδομάδες, τα ποντίκια υπό αγωγή με όχημα παρουσίασαν κατά μέσο όρο όγκου του όγκου του 1840 ± 201 mm

3 σε σύγκριση με 629 ± 86 mm

3 σε CAP-αγωγή ποντικούς (Σχήμα 2Α), με σημαντική αύξηση του χρόνου του όγκου διπλασιασμού από 3,5 ± 0,5 ημέρες σε όχημα σε 7,5 ± 3,0 ημέρες σε CAP-αγωγή ποντικών (Ρ = 0,0002? Σχήμα 2Β).

(Α) αποτελεσματικότητα καπεσιταβίνη σε ποντικούς που φέρουν όγκους αλλομοσχεύματος K8484. Τα ζώα έλαβαν 755 mg /kg ημερησίως για 5 διαδοχικές ημέρες την εβδομάδα για 3 εβδομάδες. Οι όγκοι του όγκου αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος ± SEM των 12 με φορέα και 13 ποντίκια CAP-αγωγή (** ρ & lt? 0,01). (Β) Ο όγκος χρόνος διπλασιασμού για κάθε όγκου (*** p & lt? 0.001).

Η

Στη συνέχεια προχώρησε σε μια βραχυπρόθεσμη μελέτη αποτελεσματικότητας στο

in situ

μοντέλο KPC PDAC . ποντίκια KPC υποβλήθηκαν σε αγωγή με CAP στο 755 mg /kg για 7 συνεχόμενες ημέρες και οι όγκοι των όγκων παρακολουθήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα με 3D υπερηχογραφία. Η ανάπτυξη του όγκου μειώθηκε σε CAP-ποντικούς που υπέστησαν αγωγή KPC σε σύγκριση με τους λαβόντες όχημα ποντικούς (Σχήμα 3Α). Ο όγκος των όγκων την ΚΓΠ αγωγή ήταν 121 ± 10,2% σε σύγκριση με 199 ± 21,8% στον έλεγχο (ρ & lt? 0,01? Σχήμα 3Β). Όγκου ιστός συλλέχθηκε 2 ώρες μετά την τελευταία δόση του ΚΓΠ. χρώση PH3 αποκάλυψε λιγότερα κύτταρα σε μίτωση σε όγκους ΚΓΠ σε σύγκριση με το μάρτυρα (ρ & lt? 0,05? Σχήμα 3C), γεγονός που υποδηλώνει διακοπή της ανάπτυξης

(α) Βραχυπρόθεσμες μελέτη αποτελεσματικότητας καπεσιταβίνη σε ποντίκια KPC με

σε. situ

PDAC, δοσολογήθηκαν με 755 mg /kg για 7 συνεχόμενες ημέρες. Οι όγκοι του όγκου για το όχημα και CAP μετρήθηκαν με υπέρηχο και ομαλοποιήθηκε ως προς τον όγκο του όγκου κατά την ημέρα της εγγραφής στη μελέτη (μέσος όρος ± SEM, η = 6 ανά ομάδα). (Β) Ο όγκος του όγκου μέχρι το τελικό σημείο ως ποσοστό του όγκου στην αρχή, σε KPC ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με όχημα ή CAP (μέση ± SEM, η = 6 σε κάθε ομάδα? ** Ρ & lt? 0,01). (Γ) Ανοσοϊστοχημεία για φωσφο-ιστόνης Η3 ποσοτικοποιήθηκε σε όγκους PDAC 2 ώρες μετά την 7

ου και τελευταία δόση του CAP 755 mg /kg. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM (n = 6 ανά ομάδα? * p = 0,027).

Η

Η Επίδραση της Διοίκησης της ΚΓΠ για την KPC ποντίκια επιβίωση συγκριτικά με την GEM

φαρμακοκινητικές μας δεδομένα έδειξαν αποτελεσματική παράδοση 5-FU και τα δεδομένα βραχυπρόθεσμη μελέτη αποτελεσματικότητας της ΚΓΠ μας οδήγησε να συγκρίνει ΚΓΠ GEM σε μια πιο μακροπρόθεσμη μελέτη, χρησιμοποιώντας την επιβίωση ως το τελικό σημείο. KPC ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με ΚΓΠ σε 755 mg /kg για 5 ημέρες την εβδομάδα ή 100 mg /kg GEM κάθε 3 ημέρες. Αποτελέσματα διαπίστωσε ότι η επιβίωση ήταν παρόμοια και στις 2 ομάδες? διάμεση επιβίωση 8 και 10,5 ημέρες για την ΚΓΠ και GEM, αντίστοιχα, P = 0,61 (Εικόνα 4Α). Η μακρύτερη επιβίωση ήταν 67 ημέρες στην ομάδα ΚΓΠ σε σύγκριση με 26 ημέρες στην ομάδα GEM. Επιπλέον, δεν υπήρχε καμία διαφορά στην ανάπτυξη του όγκου μεταξύ των ανωτάτων ορίων και GEM- αντιμετωπίζονται ομάδες (Εικόνα 4Β), γεγονός που υποδηλώνει παρόμοια αποτελεσματικότητα του GEM και ΚΑΠ στο PDA

(Α):. Kaplan-Meier για καπεσιταβίνη (εκκολαφθεί ) και γεμσιταβίνη (στερεά) επιβίωση. P = 0,61 δοκιμασία log-rank, Λόγος κινδύνου = 0,78, 95% CI 0,29 – 2,06 (n = 10 ανά ομάδα). (Β): Ατομική καμπύλες ανάπτυξης για την ΚΓΠ (μαύρο) και οι όγκοι GEM-αγωγή (κόκκινο). Τόμοι ομαλοποιήθηκαν με τον όγκο κατά την ημέρα της εγγραφής στη μελέτη επιβίωσης.

Η

αποτέλεσμα του συνδυασμού GEMCAP

Στη συνέχεια, ο συνδυασμός των GEMCAP διερευνήθηκε. Για να επιλέξετε τις κατάλληλες δόσεις, ερευνήσαμε πρώτα την ανεκτικότητα του συνδυασμού σε ποντίκια που φέρουν K8484 αλλομοσχεύματα. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με GEM 100 mg /kg κάθε 3 ημέρες μόνο του ή σε συνδυασμό με CAP δίνεται 5 ημέρες ανά εβδομάδα σε 755 mg /kg, 539 mg /kg ή 378 mg /kg. Και οι τρεις συνδυασμοί χρησιμοποιώντας την πλήρη GEM δόση επαγόμενη σημειώνονται γαστρεντερικής τοξικότητας που υποδεικνύεται από την απώλεια βάρους σώματος ποντικού και την ιστολογία του λεπτού εντέρου ποντικού: συντομευθεί λαχνών με διαταράσσεται αρχιτεκτονική και κρύπτης απώλεια (Συμπληρωματικό Σχήμα S1 D, F). Ούτε CAP 755 mg /kg ή GEM 100 mg /kg και μόνο δεν έδειξε γαστρεντερική τοξικότητα (σχήμα S1, Α – Γ) Ως εκ τούτου, επαναλάβαμε το πείραμα με τις ίδιες δόσεις CAP σε συνδυασμό με μειωμένη δόση GEM (75 mg /kg). Η ομάδα συνδυασμός υποβάλλεται σε επεξεργασία με 755 mg /kg CAP έδειξε νωρίς τοξικότητα, η οποία επιβεβαιώθηκε από το λεπτό έντερο ιστολογία (Σχήμα S1, G). Ο συνδυασμός με 539 mg /kg ΚΓΠ (71% της πλήρους δόσης) δεν εμφάνισαν σημεία τοξικότητας επί δύο κύκλους θεραπείας (11 ημέρες). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται τα πιο ασφαλή δόσεις των 539 mg /kg ΚΓΠ και 75 mg /kg GEM να μελετήσει την αποτελεσματικότητα του συνδυασμού GEMCAP σε ποντίκια με K8484 αλλομοσχεύματα. Μετά από 3 εβδομάδες, GEM μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου (ρ & lt? 0.001) σε σύγκριση με όχημα, όπως έκανε CAP μόνο (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 5). Η διαφορά που παρατηρείται μεταξύ του GEM και ΚΑΠ από μόνη της δεν ήταν σημαντική (Ρ & gt? 0,05). Ο συνδυασμός GEMCAP ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου με όγκο χρόνο 8,6 ± 10,8 ημέρες (σε σύγκριση με 2,7 ± 0,9 ημέρες σε μάρτυρες) διπλασιασμό αλλά αυτό δεν ήταν ανώτερη από μόνος GEM (όγκος διπλασιασμού του χρόνου του 7,2 ± 2,8 ημέρες) και όχι σημαντικά διαφορετική από ΚΓΠ μόνο. Κατά τη διάρκεια της εβδομάδας 3

rd της θεραπείας, τα ποντίκια που έλαβαν το συνδυασμό GEMCAP άρχισαν να δείχνουν τοξικότητα (απώλεια βάρους), σε σύγκριση με μόνο παράγοντα ποντικούς αγωγής αλλά εντερική ιστολογία στο τελικό σημείο εμφανίστηκε φυσιολογική (Εικόνα S1, H και Ι).

συνδυασμό αποτελεσματικότητα GEMCAP σε ποντίκια που φέρουν όγκους μοσχεύματος KPC. Τα ζώα έλαβαν όχημα ή GEM κάθε 3 ημέρες σε 75 mg /kg ή CAP στο 539 mg /kg, 5 ημέρες ανά εβδομάδα ή ένα συνδυασμό αυτών των δύο δόσεων. Οι όγκοι του όγκου παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM (n = 5 ανά ομάδα? * ρ & lt? 0,05, *** p & lt? 0.001 σε σύγκριση με το όχημα? ns: όχι σημαντική).

Η

αυτά τα δεδομένα, που δείχνει την έλλειψη συνέργειας του συνδυασμού, είναι συνεπείς με αυτές από

in vitro δοκιμασίες κυτοτοξικότητας

εκτελέσαμε επί K8484 κύτταρα και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές του παγκρέατος (MiaPaCa-2 και Panc-1) δοσολογήθηκαν με μια σειρά από 5- FU και GEM συνδυασμούς, όπου παρατηρήθηκαν πρόσθετο αλλά όχι συνεργικά αποτελέσματα (Εικόνα S2). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας έδειξαν πρόσθετο κυτταροτοξική δράση

in vitro

αλλά και πρόσθετο τοξικότητα

in vivo

. Ως εκ τούτου, GEMCAP δεν οδηγεί σε βελτιωμένη θεραπευτικό δείκτη σε ποντίκια σε σύγκριση με μόνη GEM.

Στη συνέχεια διερευνήθηκε δραστηριότητα CDA όγκου. Χρησιμοποιώντας GEM ως υπόστρωμα, προσδιορίσαμε την τιμή μετατροπής του GEM σε dFdU και τις κινητικές σταθερές του CDA, Vmax και Km, στο φορέα και ΚΑΠ-αντιμετωπίζονται οι όγκοι μοσχεύματος (Σχήμα 6). Τα αποτελέσματα έδειξαν μειωμένη Vmax και Km στην ΚΓΠ-θεραπεία όγκων (15,1 ± 2,6 nmol /h /mg πρωτεΐνης και 1320 ± 147 μΜ, αντίστοιχα) σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα όγκους (56,3 ± 7,2 nmol /h /mg πρωτεΐνης και 1880 ± 82 μΜ, αντίστοιχα? Εικόνα 6C και 6D) υποδηλώνοντας ότι η ικανότητα γεμσιταβίνης μεταβολισμού του CDA μειώθηκε σε μεταμοσχευμένους όγκους PDAC τη διάρκεια της θεραπείας ΚΓΠ. Καθώς οι όγκοι συλλέχθηκαν μεταξύ 2 ώρες και 4 ώρες μετά την τελευταία δόση του CAP, αναρωτηθήκαμε εάν η μειωμένη δραστικότητα ήταν λόγω του ανταγωνισμού μεταξύ της προστιθέμενης υπόστρωμα GEM και το DFCR ήδη στους όγκους. Ως εκ τούτου, εκτελείται μια

in vitro

δοκιμασία ανταγωνισμού με τη χρήση του εκχυλίσματος ενζύμου από έναν μη επεξεργασμένο όγκο αλλομοσχεύματος, μια σταθερή συγκέντρωση GEM 1800 μΜ που αντιστοιχούν στο χιλιόμετρα του CDA στο εκχύλισμα του ενζύμου και των συγκεντρώσεων DFCR κυμαινόμενες από 0 έως 1200 μΜ . Τα αποτελέσματα, που παρουσιάζονται στο Σχήμα 6Ε, έδειξε ελάχιστες αλλαγές στο ποσοστό μετατροπής του GEM σε dFdU ακόμα και με την παρουσία του την υψηλότερη συγκέντρωση των DFCR. Η LC-MS /MS αναλύσεις των όγκων CAP-αγωγή αποκάλυψε ότι οι υψηλότερες συγκεντρώσεις DFCR ήταν 511 μΜ, εντός του εύρους δοκιμάστηκαν σε αυτόν τον προσδιορισμό του ανταγωνισμού, υποστηρίζοντας ότι η παρατηρούμενη μείωση της δραστηριότητας CDA σε όγκους CAP-αγωγή δεν ήταν συνδεδεμένη με ένα υπόστρωμα ανταγωνισμός. Αυτό υποδηλώνει ότι η θεραπεία μπορεί να ρυθμίζουν προς τα κάτω ΚΓΠ δραστικότητα CDA.

Ενζυμική δραστηριότητα

CDA προσδιορίστηκε σε χωρίς αγωγή (Α) και CAP-αγωγή όγκων (Β) KPC αλλομοσχεύματος χρησιμοποιώντας GEM ως υπόστρωμα. Η ισοτιμία του GEM σε dFdU μετρήθηκε σε ομογενοποιήματα από ατομικούς όγκους στο τέλος της μελέτης αποτελεσματικότητας ΚΓΠ παρουσιάζονται στο Σχήμα 2, και οι κινητικές σταθερές Vmax (C) και χιλιόμετρα (D) προσδιορίστηκαν (η = 10 ανά ομάδα? * * p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001). (Ε)

In vitro

δοκιμασία ανταγωνισμού πραγματοποιείται σε εκχύλισμα ενζύμου από ένα μη επεξεργασμένο όγκο μοσχεύματος. Ένα σταθερό συγκέντρωση GEM 1800 μΜ που αντιστοιχούν στο χιλιόμετρα του CDA στο εκχύλισμα του ενζύμου και των συγκεντρώσεων DFCR κυμαινόμενες από 0 έως 1200 μΜ χρησιμοποιήθηκαν.

Η

Λόγω του

in vivo

τοξικότητα και η έλλειψη ενισχυμένη επίδραση της GEMCAP σε σύγκριση με το GEM μόνη της στα αλλομοσχεύματα, δεν είχαμε δοκιμάσει GEMCAP σε ποντίκια KPC PDAC, η υγεία των οποίων είναι λιγότερο ισχυρή.

Συζήτηση

Οι μελέτες που παρουσιάζονται εδώ παρέχουν , για πρώτη φορά, προ-κλινικά δεδομένα σχετικά με τη φαρμακοκινητική και η αποτελεσματικότητα της καπεσιταβίνης σε ένα γενετικά μοντέλο ποντικού PDAC. Χρησιμοποιήσαμε το Kras

G12D? Trp53

R172H? μοντέλο ποντικού Pdx1-Cre [12], επειδή ανακεφαλαιώνει την κλινικό σύνδρομο και ιστοπαθολογία της ανθρώπινης ασθένειας. φαρμακοκινητικά δεδομένα μας έδειξαν ότι, μετά από χορήγηση από το στόμα, CAP υφίσταται εκτεταμένο μεταβολισμό στο πλάσμα, το ήπαρ και όγκου. Συγκεντρώσεις των μεταβολιτών CAP σε κάθε ένα από αυτά τα διαμερίσματα είναι συνεπή με εκείνα που βρέθηκαν σε ένα ανθρώπινο ξενομόσχευμα καρκίνου του παχέος εντέρου [27]. Επίσης, είναι συνεπής με την προηγουμένως αναφερθείσα κατανομή των ενζύμων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό ΚΓΠ το ανθρώπινο και ποντικού [5], [27]. 5-FU βρέθηκε σε υψηλότερα επίπεδα σε όγκο από ό, τι στο πλάσμα από 30 λεπτά μετά τη χορήγηση και ήταν μη ανιχνεύσιμη στο ήπαρ που επιβεβαιώνει τον όγκο εκλεκτικής χορήγησης του 5-FU μετά τη χορήγηση της ΚΓΠ περιγράφονται επίσης από Ishikawa et al. [6]. Η χαμηλή 5-FU στο πλάσμα και το ήπαρ μπορεί να ευθύνεται για την χαμηλή τοξικότητα του CAP στη δόση των 755 mg /kg: κανένας από τους ποντικούς έδειξε σημάδια τοξικότητας που οφείλεται σε θεραπεία ΚΓΠ μόνο.