Αφηρημένο

Μυθιστόρημα βιοδεικτών για τη διάγνωση του καρκίνου και την επιλογή της θεραπείας χρειάζονται επειγόντως για να διευκολυνθεί η έγκαιρη ανίχνευση και τη βελτίωση των αποτελεσμάτων της θεραπείας. Έχουμε εντοπίσει προηγουμένως μία νέα θέση φωσφορυλίωσης στη σερίνη 506 (PS506) επί τοποϊσομεράσης-Ι (topo-I) και έχουν δείξει ότι εκφράζεται ευρέως σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, αλλά έχει χαμηλή περιεκτικότητα σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από μη-καρκινικούς ιστούς. Εδώ έχουμε ερευνήσει το πώς η έκφραση PS506 σε δείγματα ιστών του πνεύμονα συσχετίζεται με κακοήθη τους κατάσταση. Θεωρούμε ότι η έκφραση PS506 είναι σημαντικά αυξημένα σε κακοήθεις όγκους του μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) σε σύγκριση με παρακείμενες, μη-καρκινικό ιστό πνεύμονα και καλοήθεις όγκους του πνεύμονα. έκφραση PS506 ήταν μέχρι και 6 φορές υψηλότερη σε κακοήθη δείγματα από ό, τι σε ζεύγη μη κακοήθη ιστό. Χρησιμοποιώντας την καλά χαρακτηρισμένη πάνελ ΝΙΗ /NCI 60-κυτταρική γραμμή, μπορούμε συσχετίζουν τα πιο αυξημένα επίπεδα έκφρασης του PS506 στον πνεύμονα, των ωοθηκών και του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα γραμμές με αυξημένη ευαισθησία σε καμπτοθεκίνη, ένα φυτικό αλκαλοειδές που στοχεύει τοπο-Ι. Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες μας σε μια μικρότερη δειγματοληψίας κυτταρικών γραμμών και με το εύρημα μας ότι PS506 αυξάνει δεσμευτικός topo-Ι DNA. Δύο ευρέως χρησιμοποιούμενες χημειοθεραπευτικά φάρμακα για ωοθηκών και καρκίνο του παχέος εντέρου, η τοποτεκάνη και ιρινοτεκάνη, αντίστοιχα, προέρχονται από την καμπτοθεκίνη. Ιρινοτεκάνη έχει επίσης εμφανιστεί αποτελεσματικότητα σε κλινικές δοκιμές με NSCLC. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αυξημένη έκφραση PS506 μπορεί να συσχετίζεται με τις κλινικές χημειοευαισθησία σε αυτούς τους παράγοντες σε ωοθηκών, του παχέος εντέρου, και NSCLC. PS506 μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα βιοδείκτη για διάγνωση ή επιλογή θεραπείας

Παράθεση:. Zhao Μ, Gjerset RA (2015) τοποϊσομεράσης-Ι PS506 ως διπλή λειτουργία Καρκίνος βιοδεικτών. PLoS ONE 10 (8): e0134929. doi: 10.1371 /journal.pone.0134929

Επιμέλεια: Zhiqian Zhang, το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο & amp? Ινστιτούτο, ΚΙΝΑ

Ελήφθη: 4 Οκτωβρίου, 2014? Αποδεκτές: 15 Ιουλ, 2015? Δημοσιεύθηκε: 6, Αυγ 2015

Copyright: © 2015 Zhao, Gjerset. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. RG Biopharma παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς (RAG, ΜΖ), αλλά δεν είχε καμία πρόσθετη ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων και η ανάλυση, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι των συγγραφέων αρθρωτά στην ενότητα «συγγραφέας συνεισφορές»

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. MZ και η RAG είναι συνδεδεμένες με RG Biopharma, όπου διεξήχθη η έρευνα. Η εν λόγω εταιρεία ασφάλισης δεν μεταβάλλει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. RG είναι εφευρέτης στις ΗΠΑ δίπλωμα ευρεσιτεχνίας # 8431353 και Ηνωμένων Πολιτειών Προσωρινή Patent εφαρμογή 62054242.

Εισαγωγή

Νέα μοριακοί βιοδείκτες για τον καρκίνο, ιδιαίτερα εκείνων που σχετίζονται με το μηχανισμό του καρκίνου ή της θεραπείας του καρκίνου, θα μπορούσε να ενισχύσει η δύναμη της χρησιμοποιούνται σήμερα διαγνωστικές προσεγγίσεις, τη μείωση του κινδύνου πάνω διάγνωση, να διευκολύνουν την επιλογή της θεραπείας, και να βελτιώσει σημαντικά την επιβίωση του καρκίνου. Έχουμε εντοπίσει προηγουμένως μία νέα θέση φωσφορυλίωσης επί της τοποϊσομεράσης Ι (topo Ι) στο κατάλοιπο σερίνης 506 (PS506) που εκφράζεται υψηλά σε καρκίνο που προέρχεται από κυτταρικές σειρές αλλά είναι χαμηλά έως μη ανιχνεύσιμα σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από φυσιολογικούς ιστούς, καθιστώντας το ένα πιθανός υποψήφιος ως ένα κακοήθεια που σχετίζεται βιοδείκτη για τη διάγνωση [1].

Τορο Ι παίζει ουσιαστικό ρόλο στον μεταβολισμό του DNA, και είναι το μοναδικό κυτταρικό στόχο για ιρινοτεκάνη και τοποτεκάνη, δύο ευρέως χρησιμοποιούμενες χημειοθεραπευτικά φάρμακα που προέρχονται από το φυτό καμπτοθεκίνης αλκαλοειδές (CPT) [2, 3]. Με χαλάρωση υπερσπειραμάτων DNA που σχηματίζουν κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του DNA και η μεταγραφή, Τορο Ι ανακουφίζει στρεπτική καταπόνηση DNA και επιτρέπει την περαιτέρω εξέλιξη της διχάλας αντιγραφής και πολύπλοκη μεταγραφή, αντίστοιχα [4-6]. Ένα βασικό επίπεδο φωσφορυλίωσης, κυρίως όσον αφορά τα κατάλοιπα σερίνης σε Ν-τερματικό πεδίο του διακρίνεται από PS506 είναι απαραίτητη για topo Ι DNA δεσμευτική και δραστηριότητα [7]. Αυξημένη topo I φωσφορυλίωσης εμφανίζεται σε πολλά καρκινικά κυτταρικές γραμμές που παράγονται και συσχετίζεται με την έκφραση του PS506 στον πυρήνα περιοχή της πρωτεΐνης [8, 9]. Βρήκαμε ότι η έκφραση PS506 συσχετίζεται επίσης με αυξημένα επίπεδα της σερίνης-θρεονίνης πρωτεΐνης κινάσης, CK2, και ότι η ανασυνδυασμένη topo Ι μπορεί να φωσφορυλιωθεί στη σερίνη 506 από καθαρισμένο CK2 [1]. CK2, το οποίο συστατικώς εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα σε κανονικά κύτταρα [10], τείνει να αυξήσει στον καρκίνο, και τα υψηλά επίπεδα είναι ενδεικτικά φτωχή πρόγνωση [11-15]. Στα ποντίκια, αυξημένα CK2 ενισχύει μονοπάτια pro-ογκογόνο σηματοδότηση και συνεργάζεται με ογκογονίδια για την προώθηση των όγκων [16-22], γεγονός που υποδηλώνει ότι CK2 μπορεί να διαδραματίσει έναν θεμελιώδη ρόλο στον καρκίνο, με τη δημιουργία ενός ευνοϊκού περιβάλλοντος για την περαιτέρω ογκογόνο αλλαγές. Έτσι, παρεκκλίνουσα έκφραση PS506 μπορεί να είναι συμπτωματική της φιλο-ογκογόνο περιβάλλον που δημιουργείται από αυξημένα CK2.

Η θεραπευτική αξία της topo μου κάνει επίσης PS506 ένας πιθανός βιολογικός δείκτης για την επιλογή της θεραπείας. CK2 μεσολάβηση S506 φωσφορυλίωση της φωσφορυλιωμένης basally ανασυνδυασμένου topo I παράγει ένα τοπο Ι με δραστικότητα σύνδεσης αυξημένη DNA και την αυξημένη δραστηριότητα χαλάρωσης DNA σε πλασμίδια υπερελικωμένου [1, 8]. Παρατηρήσαμε ότι κυτταρικές σειρές που εκφράζουν υψηλά επίπεδα PS506 ήταν συχνά πιο ευαίσθητα σε CPT, σύμφωνα με το μηχανισμό δράσης αυτού του φαρμάκου, η οποία χρησιμοποιεί την ενζυματική δραστικότητα του τόπο Ι για τη δημιουργία θανατηφόρο επίδραση της [1]. Επειδή CPT και σχετικά φάρμακα επιτρέπουν την τοπο Ι με τη μεσολάβηση DNA nicking αλλά αναστέλλουν topo I μεσολάβηση DNA επανασύνδεση, προκαλούν το διάλειμμα κλώνου DNA να διατηρείται και τελικά να σχηματίσουν ένα θανατηφόρο DNA διπλό σκέλος διάλειμμα. Αυτός ο μηχανισμός πιστεύεται ότι ευθύνονται για τα θεραπευτικά αποτελέσματα της ιρινοτεκάνης και τοποτεκάνη [2, 23, 24]. δεσμευτικές Η ενισχυμένη DNA και τη δραστηριότητα χαλάρωσης DNA παρατηρούμε με τη μορφή PS506 της topo λοιπόν, μπορεί να συμβάλλει στην κλινική απαντήσεις σε ιρινοτεκάνη και τοποτεκάνη προωθώντας το σχηματισμό του DNA διπλό σκέλος διαλείμματα.

Σε αυτή τη μελέτη έχουμε διερευνήσει η υπόθεση ότι η έκφραση PS506 είναι ένα χαρακτηριστικό της κακοήθειας, και ότι τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης συσχετίζονται με κυτταρικές αποκρίσεις σε φάρμακα CPT που βασίζεται. Για να αξιολογηθεί η σχέση του PS506 σε κακοήθεια έχουμε εξετάσει δείγματα ιστών των κακοήθων όγκων του πνεύμονα, σε συνδυασμό μη-κακοήθεις γειτονικά επιθήλιο του πνεύμονα, και καλοήθεις όγκους του πνεύμονα. Για να εκτιμηθεί η χρησιμότητα του PS506 ως δείκτη της ανταπόκρισης σε φάρμακα CPT που βασίζεται, έχουμε διαλογή έκφρασή του σε κυτταρικές σειρές από τον πίνακα NCI-60 κυτταρική σειρά για την οποία τα προφίλ ευαισθησίας CPT ήταν διαθέσιμα από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου /Developmental Therapeutics Program ( NCI /DTP) βάσης δεδομένων. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν μια εξαιρετικά επιλεκτική υπερέκφραση του PS506 σε όλες τις κακοήθεις δείγματα πνεύμονα εξετάσθηκαν, σε σύγκριση με παρακείμενες μη κακοήθη ιστό και καλοήθεις δείγματα όγκων. Σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από πνεύμονα, του παχέος εντέρου και των ωοθηκών, διαπιστώνουμε ότι τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης PS506 συσχετίζονται με αυξημένη ευαισθησία CPT.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα

Η IgG κουνελιού pAb506P δημιουργήθηκε σε ένα φωσφοπεπτίδιο 21-αμινοξέων (TVGCCS * LRVEHINLHPELKKC, στην οποία φωσφοσερίνη 506 υποδεικνύεται με *), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [1]. Goat anti-ΤΟΡΟ Ι IgG, το οποίο αναγνωρίζει την ΤΟΡΟ Ι Ο-άκρο, και μονοκλωνικά ποντικού αντι-ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). ποντικού μονοκλωνικό αντι-τουμπουλίνης αγοράστηκε από Novus Biologicals (Littleton, CO). Τα δευτερεύοντα αντισώματα κατσίκας αντι-κουνελιού-υπεροξειδάσης αρμορακίας (HRP), γίδινη αντι-ποντικού-HRP, και γαϊδάρου αντι-κατσίκας-HRP (Santa Cruz Biotechnology). Για μετα-ανοσοκαταβύθιση γουέστερν, το πρωτογενές αντίσωμα ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο Pierce Clean-Blot IP ανίχνευσης (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ), το οποίο αναγνωρίζει μόνο ολόκληρα, άθικτα IgG και όχι τα διαχωρισμένα ελαφριάς ή βαριάς αλυσίδας υπομονάδων.

η κυτταρική γραμμή

NCI-H358 (H358), αριθμός καταλόγου CRL-5907, αγοράστηκαν Μάιο του 2011 από την American Type Culture Collection και ήταν μυκόπλασμα-free. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε 10% CO

2 σε Τροποποιημένο Μέσο Eagles Dulbecco συμπληρωμένο με 10% ορό νεογέννητου μόσχου και πρόσθετα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Για τη θεραπεία της καμπτοθεκίνης, τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες σε παρουσία 0.1 ή 1 μΜ καμπτοθεκίνης (Sigma, St. Louis, ΜΟ), που ακολουθείται από τη συγκομιδή και ανάλυση Western όπως περιγράφεται παρακάτω.

Σφαιρίδια

Κυττάρων

Κατεψυγμένα κυτταρικά ιζήματα από το NCI panel γραμμή 60-κυττάρων ελήφθησαν από τη διαίρεση των καρκινικών θεραπεία και διάγνωση (DCTD) Tumor αποθετήριο του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου (NCI) και φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Οι κυτταρικές σειρές για τις οποίες υποβλήθηκαν σφαιρίδια κυττάρου που αναφέρονται στο (S3 πίνακα).

δείγματα ιστών

Όλα τα δείγματα ιστών που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη είχαν παγώσει, ανώνυμα, στη διάθεση του κοινού αρχειακό δείγματα των μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα με ζεύγη μη κακοήθη ιστό ελέγχου ή δείγματα από καλοήθεις όγκους του πνεύμονα. Όλα τα δείγματα ελήφθησαν από το Δυτικό Τμήμα της Συνεταιριστικής Ανθρώπινο Δίκτυο Tissue (CHTN), του Πανεπιστημίου Vanderbilt, Nashville, TN. Δεν αναγνωρίσιμες προσωπικές πληροφορίες του ασθενούς ή του δότη παρέχεται με τα υποδείγματα. Δεδομένου ότι δεν υπάρχουν δεδομένα ελήφθησαν μέσω της παρέμβασης ή την αλληλεπίδραση με το άτομο και εφόσον δεν αναγνωρίσιμες προσωπικές πληροφορίες παρασχέθηκαν σε εμάς, η έρευνα αυτή δεν συνιστά έρευνα άνθρωπο, όπως ορίζεται από CFR 46.102f και την OHRP Καθοδήγηση σχετικά με την έρευνα στην οποία συμμετέχουν Κωδικοποιημένο προσωπικών πληροφοριών ή βιολογικών δειγμάτων και χορηγήθηκε απαλλαγή από τον έλεγχο του Torrey Pines Ινστιτούτο Μοριακής Σπουδών IRB.

Δυτική αναλύει

Οι σβώλοι κυττάρων (ισοδύναμο με ~ 10

7 κύτταρα /σφαιρίδιο) ή δύο κοντινού 10-cm τρυβλία συρρέουσες του PBS-πλένονται Η358 κύτταρα (ισοδύναμο με ~ 2 χ 10

7 κύτταρα) λύθηκαν με την προσθήκη 350 μΐ ανά σφαιρίδιο ή 700 μl ανά τρυβλίο ψυχρού ρυθμιστικού RIPA (10 mM TRIS ρΗ 8, 0,15 Μ NaCl, 0,1% SDS, 1% ΝΡ40, 1% δεοξυχολικό), στην οποία πλήρης αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης (Roche, Nutley, NJ) προστέθηκαν μόλις πριν την χρήση, και υποβάλλονται σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Τα κατεψυγμένα δείγματα ιστού (μέσο βάρος ~ 0.3-0.5 g) ομογενοποιήθηκαν σε 3 ml ρυθμιστικό RIPA επί πάγου χρησιμοποιώντας μύλο ιστών και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθούν τα θραύσματα. Οι κυττάρων και ιστών προϊόντα λύσης κλασματοποιήθηκαν και καταψύχθηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Ένα προσφάτως αποψυχθεί λύμα χρησιμοποιήθηκε για κάθε ανάλυση γέλης.

Τα προϊόντα λύσης (70 μg πρωτεΐνης, εκτός όπου υποδεικνύεται) αναλύθηκαν με SDS-PAGE χρησιμοποιώντας Κριτήριο 10-20% πηκτώματα προκατασκευασμένων Tris-HCl (Bio-Rad Laboratories , Hercules, CA). Μία ισοδύναμη ποσότητα ενός πρόσφατα αποψυγμένα υποπολλαπλάσιο του αποθέματος αναφοράς του Η358 λύμα περιλαμβάνονται σε κάθε πείραμα ως κοινό έλεγχο. Μετά ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF και ανοσοχρώση με επώαση με πρωτογενές αντίσωμα (1: 500 για τουμπουλίνης? Όλα τα άλλα στο 1: 100), που ακολουθείται από κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με HRP (1: 1000), και αντιδραστήριο Pierce ECL ( Thermo Scientific), που ακολουθείται από έκθεση σε φιλμ. Ταινίες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Imager Άλφα και οι ζώνες ποσοτικά χρησιμοποιώντας το συνοδευτικό λογισμικό. εντάσεις ζωνών PS506 κανονικοποιήθηκαν με τον έλεγχο Η358 αναφοράς.

Ανοσοκαταβύθιση /Western blotting

ανοσοκαθιζήσεις πραγματοποιήθηκαν ουσιαστικά όπως περιγράφεται [25]. Εν συντομία, προϊόντα λύσεως κυττάρου από εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα Η358 παρασκευάσθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA, όπως περιγράφεται παραπάνω. Οι κυτταρικές πρωτεΐνες (1-2 mg) ανοσοκατακρημνίστηκαν με λίκνισμα διάρκεια της νύχτας με 50 μΐ αντισώματος κατσίκας αντι-ΤΟΡΟ I (~ 10 μg). Ανοσοσύμπλοκα συλλέχθηκαν με την προσθήκη 20 μΙ πρωτεΐνης AG ακολουθούμενη αγαρόζης με φυγοκέντρηση. Ανοσοσυμπλέγματα διαχωρίστηκαν σε χαμηλό ρΗ εν απουσία διθειοθρεϊτόλης ή β-μερκαπτοαιθανόλη για να αποφευχθεί διάσπαση του IgG. ρυθμιστικό δείγμα ηλεκτροφόρησης προστέθηκε και τα δείγματα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE όπως περιγράφεται για γουέστερν, χωρίς προηγούμενη βρασμού να διασφαλιστεί περαιτέρω ότι η IgG παρέμεινε άθικτο. Η Western υπέστη επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω, εκτός του ότι το αντιδραστήριο Clean-Blot IP ανίχνευσης (Thermo Scientific) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του πρωτογενούς αντισώματος.

ELISA ανάλυση

Σερίνη 506-φωσφορυλιωμένων και μη φωσφορυλιωμένων μορφών της topo 21-αμινοξέων Ι πεπτιδίου που περιγράφεται παραπάνω (βλέπε παράγραφο αντισώματα) συντέθηκαν με Biopeptide Co., Inc. (San Diego, CA). Πλάκες Immulon Η2Β ELISA (Thermo Scientific) επικαλύφθηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με 100 μΐ πεπτιδίων επανεναιωρήθηκαν σε 2 μg /ml σε ρυθμιστικό επικάλυψης (50 mM NaHCO

3, ρΗ 9). Τα τρυβλία πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα [TBS] ρΗ 7.5, 0.5% Tween) και αποκλείστηκαν με TBS που περιέχει 1% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA). Οι πλάκες πλύθηκαν μια φορά με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα με σειριακές αραιώσεις (εις διπλούν) του pAb506P σε TBS /1% BSA, πλύθηκε και πάλι, και επωάστηκαν για 1 ώρα με γίδινο αντι-κουνελιού-ΗΚΡ. Μετά ένα άλλο βήμα πλύσης, οι πλάκες επωάστηκαν με HRP 3,3 υπόστρωμα ‘, 5,5’-τετραμεθυλοβενζιδίνη (1-βήμα ΑΡΓΟ ΤΜΒ ELISA, Thermo Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση στα 450 nm αναγνώστηκε.

αλκαλική φωσφατάση θεραπεία

300 μg του κυτταρικού λύματος που παρασκευάζεται σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA απουσία αναστολέων φωσφατάσης υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 1 ώρα στους 37 ° C με 300 μονάδες μοσχάρι εντερική αλκαλική φωσφατάση (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, ΜΟ) σε ρυθμιστικό προσαρμόστηκε σε 0.1 Μ NaCl, 0,01 Μ MgCl

2, 0.001Μ ϋΤΤ όπως προτείνεται από τον κατασκευαστή. Μια παράλληλη κυτταρόλυμα ελέγχου παρασκευάζεται παρουσία αναστολέων φωσφατάσης επωάστηκε σε ρυθμιστικό που στερείται αλκαλική φωσφατάση.

Στατιστικές αναλύσεις

Οι στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Prism GraphPad® (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά του pAb506P

Το πολυκλωνικό IgG κουνελιού, pAb506P, αυξήθηκε σε ένα πεπτίδιο PS506 περιέχει μοναδικά για Τορο Ι, υπήρξε στο παρελθόν φαίνεται να αναγνωρίζουν την κυτταρική ΤΟΡΟ 90 KDa Ι στον καρκίνο που προέρχεται από κυτταρικές σειρές, καθώς και το PS506 περιέχον μορφή ανασυνδυασμένης topo κατεργάζεται με CK2 πρωτεΐνης κινάσης [1]. Ο αντιορός είναι εξαιρετικά ειδικό για την φωσφορυλιωμένη μορφή του πεπτιδίου ανοσοποίησης, όπως φαίνεται από τις συγκριτικές καμπύλες τιτλοδότησης σε δοκιμασίες πεπτίδιο ELISA (Σχήμα 1Α). Ένα επιπλέον πιο εμφανή pAb506P-αντιδραστικά είδη που μεταναστεύουν σε περίπου 45 kDa σε SDS-PAGE /Westerns είναι επίσης παρόν (Σχήμα 1Β, λωρίδα 1, βέλη υποδεικνύουν τις θέσεις των ειδών 45 kDa και πλήρους μήκους topo Ι σε προϊόντα λύσης κυττάρου Η358 NSCLC). Ένα topo είδος Ι παρόμοιου μεγέθους έχει αναφερθεί σε Jurkat λευχαιμικά κύτταρα [26]. Το είδος 45 kDa εμφανίζεται ως ελάσσονα ζώνη στην στυπώματα ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα κατσίκας αντι-ΤΟΡΟ Ι (Σχήμα 1Β, λωρίδα 2), και μπορεί να ανοσοκαταβυθίζεται από κυτταρολύματα Η358 με κατσίκα αντι-ΤΟΡΟ Ι (Σχήμα 1 C), υποδεικνύοντας ότι μοιράζεται ανοσολογική αντίδραση με πλήρους μήκους topo Ι, αλλά είναι πιθανό να είναι μια ελάσσονα είδη. Η ασθενέστερη αντίδραση της πλήρους topo μήκους εγώ με pAb506P μπορεί να υποδεικνύει ότι δεν είναι πλήρως φωσφορυλιωμένη σε αυτό το site. pAb506P αντιδραστικότητα μειώνεται μετά από θεραπεία των κυτταρολυμάτων Η358 με αλκαλική φωσφατάση, επιβεβαιώνοντας ότι αντιπροσωπεύει φωσφορυλιωμένο είδος (Εικ 1D). Τόσο πλήρους μήκους topo Ι και τα 45 kDa PS506-θετικά είδη επιλεκτικά κάτω ρυθμίζονται μετά από αγωγή με camptothecin (CPT), κάτω από συνθήκες όπου ο έλεγχος τουμπουλίνης παραμένει αμετάβλητη, δείχνοντας ότι όλο το μήκος topo Ι και τα είδη 45 kDa ρυθμίζονται ομοίως σε απόκριση σε CPT (Εικ 1Ε). Τορο Ι είναι η μοναδική στόχος της CPT, και έχει προηγουμένως δειχθεί ότι είναι ειδικώς ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κύτταρα CPT-αγωγή [27]. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το είδος 45 kDa είναι πιθανό να είναι ένα φωσφορυλιωμένο προϊόν αποικοδόμησης της topo I. Επειδή είναι το κύριο είδος ανιχνεύθηκαν στα κυτταρολύματα, αξιολογήσαμε την έκφρασή του σε δείγματα ιστού.

(Α ) Συγκριτική καμπύλες τιτλοδότησης των pAb506P σε πλάκες ELISA επικαλυμμένη με τοπο Ι πεπτίδιο που περιβάλλει τη σερίνη 506 θέση, είτε σε φωσφορυλιωμένη και μη φωσφορυλιωμένη μορφή της. (Β) αναλύσεις Western κυτταρολυμάτων Η358 (100 μg /λωρίδα) ανιχνεύθηκαν με pAb506P (λωρίδα 1) ή με αντίσωμα κατσίκας αντι-ΤΟΡΟ Ι (λωρίδα 2). Τα βέλη υποδεικνύουν τις θέσεις των 45 kDa είδος και topo πλήρους μήκους Ι (Γ) Τορο I ανοσοκαταβύθιση (κατσίκας αντι-ΤΟΡΟ Ι Ο-άκρο) που ακολουθείται από pAb506P Western των προϊόντων λύσης κυττάρου Η358. Lane αντιπροσωπεύει 200 ​​μg πρώτης ύλης. (Δ) Ανάλυση Western των PS506 και ακτίνης σε κυτταρολύματα H358 πριν (CNTR) και μετά από κατεργασία με αλκαλική φωσφατάση (ΑΡ). (Ε) ανάλυση Western του PS506 (χρησιμοποιώντας pAb506P), πλήρους μήκους topo I (χρησιμοποιώντας αντίσωμα κατσίκας αντι-topo Ι) και της τουμπουλίνης σε Η358 κύτταρα πριν και μετά από μια θεραπεία 24 ώρες των κυττάρων με 0,1 ή 1 μΜ CPT.

έκφραση PS506 σε κακοήθη, καλοήθη, και φυσιολογικό ιστό πνεύμονα

pAb506P χρησιμοποιήθηκε για έκφραση PS506 οθόνη ανώνυμα δείγματα των μη μικρών όγκων του πνεύμονα (καρκινώματα, αδενώματα) και μη κακοήθεις πνευμονικό ιστό ( ως ζεύγη δειγμάτων από τον ίδιο ασθενή), καθώς και καλοήθεις όγκους του πνεύμονα. Τα δείγματα ελήφθησαν από το Δυτικό Τμήμα της Συνεταιριστικής Ανθρώπινο Δίκτυο Tissue (CHTN) και παρατίθενται με περιγραφές τους σε (S1 πίνακα Χαρακτηριστικά ζευγών όγκου /μη όγκου (που παρέχεται από CHTN)?.. S2 Πίνακας Χαρακτηριστικά καλοήθεις όγκους (με την προϋπόθεση από CHTN)). ομογενοποιήματα ιστού που παρασκευάζεται από την αντιστοιχισμένη μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα όγκου και μη κακοήθη ιστό των πνευμόνων, και η καλοήθης δείγματα όγκων του πνεύμονα αναλύθηκαν με SDS-Page /Western για την παρουσία του PS506, και τα επίπεδα ποσοτικοποιήθηκαν με ψηφιακή ανάλυση των εντάσεων ζώνης. Για να εξασφαλισθεί η τυποποίηση σε διάφορες γέλες, έχουμε ετοιμάσει ένα ενιαίο προϊόν λύσης των κυττάρων Η358, το οποίο καταψύχθηκε σε κλάσματα. Ένα προσφάτως αποψυγμένα κλάσμα αυτού του προϊόντος λύσης που περιλαμβάνονται σε κάθε γέλη τρέξει ως πρότυπο αναφοράς.

Το σχήμα 2Α δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό Western blot για PS506 σε συμφωνημένα κακοήθη /ζεύγη μη κακοήθεις δείγμα 8-13, μαζί με το Η358 πρότυπο αναφοράς. επίπεδα PS506 σε σχέση με Η358 παρομοίως αξιολογήθηκαν για όλους τους 21 ζεύγη συν 8 καλοήθεις όγκοι και τα αποτελέσματα επαληθεύονται σε ένα δεύτερο ανεξάρτητο πείραμα. Οι μέσοι όροι και οι τυπικές αποκλίσεις για τα δύο πειράματα παρατίθενται στον Πίνακα 1 (ζεύγη) και τον πίνακα 2 (καλοήθεις όγκοι) και απεικονίζονται στο Σχ 2Β. Σε όλες τις 21 κακοήθων /ζεύγη μη κακοήθεις δείγμα, η έκφραση PS506 ανυψώθηκε στα κακοήθη δείγμα. Δεκαέξι από τους 21 (76%) κακοήθεις δείγματα εξέφρασε περίπου 2-6 φορές πιο PS506 από ό, τι οι μη-κακοήθεις σε συνδυασμό δείγματος, με μέσο όρο περίπου 3 φορές υψηλότερη. Δεκαπέντε από τα 21 (71%) κακοήθη δείγματα εξέφρασαν PS506 σε επίπεδα πάνω από τον γενικό μέσο όρο του 0,39 για όλα τα δείγματα (κόκκινη διακεκομμένη γραμμή στο σχήμα 2Β). Σημαντικά, κανένα από τα 8 δείγματα καλοηθών και μόνο 2 από τα 21 ζεύγη μη κακοήθη δείγματα (για ένα σύνολο 2/29 [7%]) εξέφρασε PS506 πάνω από αυτό το μέσο επίπεδο. Έτσι, ένας κακοήθης δείγμα ήταν & gt?. 10 φορές περισσότερες πιθανότητες από ό, τι ένα μη-κακοήθεις δείγμα να εκφράσουν PS506 σε μεγαλύτερο από το μέσο επίπεδο για όλα τα δείγματα

(Α) Εκπρόσωπος PS506 Western blot των δειγμάτων των NSCLC και τους ζεύγη μη κακοήθη δείγματα (δείγμα ζεύγη 8-13). H358 είναι ο έλεγχος αναφοράς για την ποσοτικοποίηση όλων των κηλίδων PS506. Οι πίνακες 1 και 2 απαριθμούν τα δείγματα που αναλύθηκαν και ποσοτικοποίηση των επιπέδων PS506 σε σχέση με Η358. (Β) Μπαρ γράφημα των επιπέδων PS506 παρουσιάζονται στους Πίνακες 1 και 2, ομαδοποιούνται ως ζεύγη κακοήθεις /μη-κακοήθεις δείγματα και καλοήθεις όγκους. (Γ) Διάγραμμα διασποράς των επιπέδων PS506 από τους πίνακες 1 και 2, ομαδοποιούνται ως κακοήθη (Μ), μη κακοήθεις (Ν), και καλοήθη (Β) όγκων. Οι τιμές ρ υπολογίστηκαν από ένα αταίριαστο δοκιμασία t

Η

Η

Το διάγραμμα διασποράς στο Σχήμα 2C δείχνει τα επίπεδα PS506 στα τρία σετ των δειγμάτων:. 21 σε συνδυασμό κακοήθη (Μ) και μη κακοήθεις (Ν) ιστών, και τα 8 καλοήθεις ιστούς όγκων (Β). Τα μέσα επίπεδα PS506 (υποδεικνύεται από τις μαύρες γραμμές σε κάθε σετ) είναι 0.60 (κακοήθη), 0,24 (μη-κακοήθεις Paired), και 0,24 (καλοήθης). Οι διαφορές στα μέσα επίπεδα PS506 μεταξύ των σετ δείγμα αξιολογήθηκαν με ένα ασύζευκτο, δύο-tailed t-test. Όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 2C, η διαφορά μεταξύ κακοήθη ιστό και μη κακοήθη ιστό ζεύγη ήταν πολύ σημαντική (

ρ

& lt? 0,0001), και η διαφορά μεταξύ κακοήθους ιστού και καλοήθη ιστό όγκου ήταν σημαντική (

p

= 0,0115). Καμία σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε μεταξύ των επιπέδων PS506 σε καλοήθεις και μη κακοήθεις ιστούς (

σ

= 0,86). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση PS506 συνδέεται στενά με κακοήθεια.

έκφραση PS506 και CPT ευαισθησία

Σε μια προηγούμενη μελέτη εξετάζει τα επίπεδα PS506 σε μια ποικιλία κυτταρικών σειρών καρκίνου, βρήκαμε ότι τα υψηλότερα PS506 επίπεδα ήταν παρούσα σε κυτταρικές σειρές με την μεγαλύτερη ευαισθησία στο topo I-στοχευμένες αλκαλοειδές φυτό, CPT, με τις διαφορές των περίπου 2-3 ​​φορές μεταξύ CPT-ευαίσθητα και ανθεκτικά κυτταρικές γραμμές [1]. Να επεκτείνει αυτές τις παρατηρήσεις, θα αξιολογούνται σε σχέση με τα επίπεδα PS506 μεταξύ του NCI πίνακα γραμμή 60-κυττάρων, που διατίθεται ως κατεψυγμένα κυτταρικά ιζήματα από τη διαίρεση των καρκινικών θεραπεία και διάγνωση των όγκων αποθετήριο του NCI. Ο πίνακας περιλαμβάνει κυτταρικές σειρές που προέρχονται από μια ποικιλία τύπων όγκου, συμπεριλαμβανομένης της λευχαιμίας, του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα, καρκίνος του παχέος εντέρου, του μελανώματος, του καρκίνου των ωοθηκών, νεφρικό καρκίνωμα, καρκίνο του προστάτη, καρκίνο του μαστού, και καρκίνων του κεντρικού νευρικού συστήματος. Επειδή οι κυτταρικές σειρές έχουν εκτεταμένα χαρακτηρίζεται από το NCI για την ευαισθησία στην CPT και άλλα πειραματικά και καθιερωμένες χημειοθεραπευτικά φάρμακα, παρέχουν ένα ιδιαίτερα τυποποιημένο πόρο με την οποία να συσχετίζεται μια πιθανή βιοδείκτη με χημειοευαισθησία [28].

κυτταρολύματα από τα κατεψυγμένα σφαιρίδια κυττάρου αξιολογήθηκαν για έκφραση PS506 με SDS-PAGE /Western με τον ίδιο τρόπο όπως τα δείγματα ιστών. Συγκροτήματα ποσοτικοποιήθηκαν ψηφιακά και τα επίπεδα PS506 σε σχέση με την τιμή ελέγχου Η358 ελέγχθηκαν σε ένα δεύτερο ανεξάρτητο πείραμα και ο μέσος όρος. Για τις κυτταρικές σειρές 42 για τις οποίες υπήρχαν διαθέσιμα δεδομένα ευαισθησίας CPT, βρήκαμε ότι τα επίπεδα PS506 διανεμήθηκαν σε μία ευρεία κλίμακα, όπως παρατηρήθηκε για τα δείγματα ιστού όγκου. Το μέσο επίπεδο των PS506 σε όλες τις κυτταρικές σειρές 42 ήταν 0,37 σε σχέση με τον κοινό έλεγχο H358? μια τιμή πολύ υψηλότερη από τη μέση τιμή των 0,24 που παρατηρήθηκε για μη κακοήθη ιστό ή ζευγαρωμένα καλοήθεις όγκους (Σχήμα 2). Είμαστε δίπλα σε σύγκριση με τις σχετικές τιμές PS506 των κυτταρικών σειρών 42 με την ευαισθησία τους σε CPT χρησιμοποιώντας τις τιμές% αύξηση NCI /Αναπτυξιακό Πρόγραμμα Θεραπευτικής (DTP), που συστάθηκε με δοκιμασία μόνο υψηλή δόση (10 μΜ) CPT [29]. Σε αυτή τη δοκιμασία, μια αρνητική τιμή ποσοστιαία αύξηση υποδεικνύει απώλεια της πρώτης κυτταρικής μάζας λόγω κυτταρικού θανάτου, ενώ μια θετική τιμή υποδεικνύει το ποσοστό της ανάπτυξης των κυττάρων χωρίς αγωγή, όπως περιγράφεται στην ιστοσελίδα DTP [28].

Παρατηρήσαμε ένας συσχετισμός μεταξύ της έκφρασης PS506 και την ευαισθησία CPT σε ομαδοποίηση των 20 μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, και κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών, που αντιπροσωπεύουν τρεις καρκίνους για τους οποίους οι θεραπείες CPT που βασίζεται είτε εγκεκριμένη από την FDA (κόλον, ωοθηκών) ή αξιολογούνται σε συνεχιζόμενες κλινικές δοκιμές (μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα) [30, 31]. Ο πίνακας 3 καταγράφει αυτές τις κυτταρικές γραμμές, το μέσο επίπεδο PS506 από τα δύο πειράματα (σε σχέση με τα κύτταρα Η358), και τα δεδομένα ευαισθησίας CPT διαθέσιμα στην ιστοσελίδα DTP NCI /[28]. Το σχήμα 3 δείχνει ένα διάγραμμα διασποράς των σχετικών αξιών PS506 για τις τρεις υποομάδες ορίζονται από την ευαισθησία CPT τους: τα 8 πιο ευαίσθητη (40%), το 8 πιο ανθεκτικά (40%), και το υπόλοιπο 4 με ενδιάμεσο ευαισθησία (20%) . Το σχετικό επίπεδο PS506 μειωθεί, ανάλογα με την ευαισθησία CPT από 0,39 (πιο ευαίσθητα) σε 0,21 (ενδιάμεση ευαισθησία) σε 0,18 (ανθεκτικό). Μια μη ζευγαρωμένα, δύο-tailed t-test αποκάλυψε μια σημαντική διαφορά (

p = 0,028

) του μέσου επιπέδου PS506 μεταξύ του πιο ευαίσθητη και πιο ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές, σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες μας με ένα μικρότερο δειγματοληψία κυτταρικές γραμμές [1]. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι για πνεύμονα, του παχέος εντέρου, και των ωοθηκών, η έκφραση του PS506 είναι μία ορίζουσα της ευαισθησίας σε φάρμακα CPT που βασίζεται. Είναι σημαντικό ότι, τα μισά από τις κυτταρικές σειρές που ορίζονται ως ΟΡΤ ευαίσθητος-αλλά κανένας από αυτούς με ενδιάμεσο ευαισθησία CPT ή CPT αντίσταση-εκφράζεται PS506 σε επίπεδο που υπερβαίνει το μέσο όρο του 0,37 για όλες τις κυτταρικές σειρές 42.

Διάγραμμα διασποράς της σχετικής επίπεδα PS506 σε κυτταρικές σειρές που αντιπροσωπεύουν το 40% πιο ευαίσθητο CPT, το 40% πιο ανθεκτικές CPT, και το 20% με ενδιάμεσες ευαισθησία μεταξύ του συνόλου του καρκίνου των ωοθηκών, καρκίνου του παχέος εντέρου, και κυτταρικές σειρές NSCLC. Η κόκκινη διακεκομμένη γραμμή στο 0.37 δείχνει το μέσο επίπεδο PS506 στις κυτταρικές γραμμές για τις οποίες υπήρχαν διαθέσιμα στοιχεία ευαισθησία CPT. Η τιμή p ήταν υπολογίζονται ένα αταίριαστο δοκιμασία t

Η

Επίσης, σε σύγκριση επίπεδα PS506 με ευαισθησία CPT για την μεγαλύτερη ομάδα των 42 κυτταρικών σειρών που αντιπροσωπεύουν ένα ευρύτερο φάσμα των τύπων καρκίνου (βλ.: S3 πίνακα. επίπεδα ευαισθησίας CPT και PS506 σε κυτταρικές σειρές από NCI πίνακα γραμμή 60 κυττάρων). Εδώ, επίσης, παρατηρήσαμε μια θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων PS506 και την ευαισθησία CPT, με τις πιο ανθεκτικές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα PS506 (40% των γραμμών, σημαίνει επίπεδο PS506 = 0,34) και οι πιο ευαίσθητες κυτταρικές σειρές που εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα PS506 (40 % των γραμμών, σημαίνει επίπεδο PS506 = 0,41), σύμφωνα με ένα μοντέλο στο οποίο PS506 συμβάλλει στην CPT ευαισθησία. Στην ανάλυση αυτού του μεγαλύτερου ομίλου, οι διαφορές στις μέσες τιμές δεν ήταν στατιστικά σημαντική, ωστόσο (

σ

= 0,43), πιθανώς λόγω της συμβολής των κυτταρικών παραγόντων ανεξάρτητα από τόπο Ι, όπως πρόσληψη CPT, ενδοκυτταρικού μεταβολισμού CPT και της διανομής, και η κυτταρική απόκριση σε βλάβη του DNA, το σύνολο των οποίων μπορεί να επηρεάσει την έκβαση των θεραπειών CPT [32]. Παρ ‘όλα αυτά, τα αποτελέσματα αυτής της εξέτασης υποστηρίζουν την αντίληψη ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν επίπεδα PS506 για την επιλογή της θεραπείας για ορισμένους καρκίνους.

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι η έκφραση του PS506 είναι κακοήθεια-ειδική, και ότι τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης PS506 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, του παχέος εντέρου και του καρκίνου των ωοθηκών καταγωγή συσχετίζονται με αυξημένη ευαισθησία στο CPT. επίπεδα PS506 ήταν αυξημένα σε όλες τις 21 κακοήθη δείγματα του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με ζεύγη μη κακοήθη ιστό και σε 8 καλοήθη δείγματα όγκου πνεύμονος. Στην πλειονότητα των ζευγών δείγματος, η αύξηση στην έκφραση PS506 σε κακοήθεις έναντι μη κακοήθη ιστό κυμαινόταν από 2 φορές έως & gt? 6 φορές. Οι δύο μη-κακοήθεις ομάδες των δειγμάτων (21 μη-κακοήθεις ιστούς και 8 καλοήθεις ιστούς όγκου), δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές σε έκφραση PS506. Ενώ τα απόλυτα επίπεδα έκφρασης PS506 σε κακοήθη καρκινικά δείγματα ήταν μεταβλητή, το 71% των κακοήθων όγκων που εμφανίζονται επίπεδα PS506 πάνω από το μέσο όρο του πληθυσμού (όλα τα δείγματα σε συνδυασμό, δηλαδή, κακοήθη + μη κακοήθεις), ενώ μόνο το 7% των μη-κακοήθων δείγματα που εκφράζεται PS506 πάνω από το μέσο όρο του πληθυσμού.

Όταν αξιολογήσαμε τον πίνακα NCI-60 κυτταρική σειρά, βρήκαμε επίσης ότι το μέσο επίπεδο έκφρασης PS506 σε όλες τις κυτταρικές σειρές ήταν υψηλότερη από εκείνη των δειγμάτων μη κακοήθη ιστό (0,37 στην κυτταρικές σειρές έναντι 0,24 σε μη κακοήθεις δείγματα). Αναλύσαμε τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης PS506 με την κυτταρική ευαισθησία στην topo I-στοχευμένες CPT ναρκωτικών, χρησιμοποιώντας δεδομένα ευαισθησία CPT διαθέσιμα στην ιστοσελίδα NCI /DTP. Σε πνεύμονα, του παχέος εντέρου, και κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών, που αντιπροσωπεύουν τρεις καρκίνους για τους οποίους CPT προερχόμενο χημειοθεραπευτικά φάρμακα έχουν εγκριθεί ή βρίσκονται υπό κλινική δοκιμή, βρήκαμε ότι οι περισσότερες κυτταρικές σειρές CPT-ευαίσθητος 40% εξέφρασαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα PS506 από ό, τι ο 40% πιο ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές, σύμφωνα με προηγούμενες παρατηρήσεις μας σε ένα μικρότερο δείγμα των διαθέσιμων κυτταρικών σειρών [1]. Ενδιάμεσα επίπεδα έκφρασης PS506 παρατηρήθηκαν στο 20% των κυτταρικών γραμμών με ενδιάμεση ευαισθησία CPT. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι PS506 μπορεί να χρησιμεύσει, σε συνδυασμό με άλλους κλινικούς παράγοντες, για τη διευκόλυνση της λήψης αποφάσεων για τη θεραπεία των ασθενών με τα CPT που προέρχονται από τα ναρκωτικά, ιρινοτεκάνη και τοποτεκάνη. Η σωστή επιλογή του φαρμάκου είναι ζωτικής σημασίας για την επιτυχία της θεραπείας. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για θεραπεία δεύτερης γραμμής, ως μια αποτυχημένη θεραπεία μπορεί να οδηγήσει σε μια φθίνουσα φυσική κατάσταση του ασθενούς και αυξάνει την πιθανότητα ότι και άλλες επεξεργασίες, θα είναι ανεπιτυχής. Δεν υπάρχουν προς το παρόν δεν υπάρχουν αξιόπιστα προγνωστικά τεστ για την ευαισθησία στην CPT που προέρχονται από τα ναρκωτικά. Η εφαρμογή των PS506 ως βοήθημα για την επιλογή της θεραπείας θα αποτελούσε ένα σημαντικό βήμα προς την επίτευξη πιο εξατομικευμένες θεραπευτικές αγωγές.

Η ανάπτυξη των δοκιμασιών με βάση το αίμα για PS506 θα μπορούσαν δυνητικά να προσφέρει μια διαγνωστική δοκιμασία για την έγκαιρη ανίχνευση και την παρακολούθηση των πνευμόνων καρκίνο ή άλλων καρκίνων. Αρκετοί δείκτες πρωτεΐνη που κυκλοφορούν επί του παρόντος σε κλινική χρήση για ορισμένες μορφές καρκίνου, κυρίως για παρακολούθηση. Αυτές περιλαμβάνουν CA125 για τον καρκίνο των ωοθηκών, CA19-9 για τον καρκίνο του παγκρέατος, CEA για τον καρκίνο του παχέος εντέρου, και PSA για τον καρκίνο του προστάτη (που επισκοπείται στο [33]). CYFRA21-1, μια κυτοκερατίνη δείκτη για τα επιθηλιακά κύτταρα στο πλάσμα ή αίμα, έχει συσχετισθεί με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και άλλους επιθηλιακούς καρκίνους, αλλά έχει πολύ μεταβλητή ευαισθησία ή ειδικότητα για κακοήθεια. Μια πρόσφατη έκθεση περιγράφει μια δοκιμασία ELISA για την κινάση της θυμιδίνης σε δείγματα αίματος για την ανίχνευση του καρκίνου του πνεύμονα, [34]. Δεδομένου ότι Τορο Ι είναι ένα από τα 10-25% πιο άφθονο των κυτταρικών πρωτεϊνών σε κύτταρα και στο πλάσμα [35], μια παρόμοια δοκιμή για PS506 είναι πιθανό να είναι εφικτή και ευαίσθητο. Στην περίπτωση του καρκίνου του πνεύμονα, μία δοκιμασία πτύελα που βασίζεται μπορεί επίσης να είναι δυνατόν, όπως τα καρκινικά κύτταρα είναι παρόντα σε πτυέλων από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Αρκετές άλλες υποψήφιες δείκτες έχουν εντοπιστεί [36, 37]. Ωστόσο, δεν βιοδεικτών δεν έχει ακόμη αποδειχθεί ότι έχουν την απαραίτητη ευαισθησία, ειδικότητα, και η επαναληψιμότητα πρέπει να επικυρωθεί για τη συνήθη κλινική χρήση, και επιπλέον βιοδεικτών που απαιτούνται.

Η δυνατότητα που PS506 μπορεί να αιτιολογικά συνδέεται με τον καρκίνο αυξάνει σημαντικά το ενδιαφέρον του ως βιοδείκτη. Επειδή topo I διαθέτει DNA χάραξης /δραστηριότητας επανασύνδεση, σφιχτή ρύθμισή της είναι ζωτικής σημασίας να αποφευχθεί η παρεκκλίνουσα χάραξης DNA που θα μπορούσε να αποσταθεροποιήσει το γονιδίωμα και την προώθηση κακοήθη εξέλιξη [38]. Εκτοπικά υπερεκφράζεται topo Ι είναι ανασυνδυαστικογενική σε ζύμη και βακτήρια και μπορούν συνεπώς να προωθήσει αναδιατάξεων του DNA και άλλες μορφές γονιδιώματος αστάθεια σε κύτταρα θηλαστικών, καθώς και [39, 40]. Η δυνατότητα αυτή υποστηρίζεται από αποδεικτικά στοιχεία που Τορο Ι είναι απαραίτητη για την θραύση των χρωμοσωμάτων στα κοινά εύθραυστες περιοχές (ΚΠΣ), όπου αναδιατάξεις DNA απαντώνται συχνά στον καρκίνο [41, 42]. Ένα καλά χαρακτηρίζεται CFS, FRA3B, συχνά αναδιατάσσεται στον καρκίνο του πνεύμονα [43].