έχουν

Αφηρημένο

βιοενεργά πεπτίδια, είτε προέρχονται από τη φύση τους πόρους ή να συντεθούν από τον ορθολογικό σχεδιασμό, έχει καταδειχθεί το δυναμικό για θεραπευτικούς παράγοντες εναντίον πολλών ανθρώπινων ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Ωστόσο, ο μηχανισμός της θεραπευτικών πεπτιδίων κατά του καρκίνου δεν έχει καλά καθορισθεί. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι PGPIPN, ένα εξαπεπτίδιο που προέρχεται από βοοειδή β-καζεΐνη, ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών SKOV ταιριάστε

3, καθώς και τα πρωτογενή καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

in vitro

. Σταθερά, PGPIPIN μειώθηκε επίσης ρυθμός ανάπτυξης όγκου σε ποντικούς ξενομοσχεύματος μοντέλο καρκίνου των ωοθηκών σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Περαιτέρω μελέτη έδειξε ότι η δράση κατά των όγκων του PGPIPN είναι μερικώς μέσω της προώθησης κυτταρικής απόπτωσης με την αναστολή της οδού BCL2. Έτσι, η μελέτη μας δείχνει ότι PGPIPN είναι ένας πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών ή άλλους τύπους καρκίνου

Παράθεση:. Wang W, Gu F, Wei C, Tang Υ, Zheng Χ, Ren Μ, et al. (2013) PGPIPN, ένα Θεραπευτικό Hexapeptide, κατέστειλε τα Ανθρώπινα ωοθηκών ανάπτυξη του καρκίνου από Στόχευση BCL2. PLoS ONE 8 (4): e60701. doi: 10.1371 /journal.pone.0060701

Συντάκτης: Robert W. Sobol, Πανεπιστήμιο του Pittsburgh, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 του Νοεμβρίου, 2012? Δεκτές: 1, Μαρτίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 του Απρίλη, 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30872992) και το Ίδρυμα επαρχία Φυσικών Επιστημών του Anhui (03043802). Το 300000 RMB χορηγήθηκε για την έρευνα αυτή από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας, η διεύθυνση URL της οποίας είναι https://www.nsfc.gov.cn. Το Ίδρυμα επαρχία Φυσικών Επιστημών του Anhui χρηματοδοτείται 100000 RMB για τη μελέτη. Οι χρηματοδότες είχαν ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τα πειράματα, συλλογή και ανάλυση δεδομένων, την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια. Η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου των ωοθηκών είναι το τρίτο σε γυναικολογικό καρκίνο, μετά τον καρκίνο του μαστού και του τραχήλου της μήτρας στις γυναίκες, αλλά είναι το πιο διόδια θάνατο σε γυναικολογικό καρκίνο. Η συμβατική διάρκεια της θεραπείας για τον καρκίνο των ωοθηκών περιλαμβάνει χειρουργική debulking της μάζας του όγκου που ακολουθείται από επικουρική χημειοθεραπεία. Παρά το γεγονός ότι μεγάλη πρόοδος έχει επιτευχθεί όσον αφορά την ανάπτυξη των θεραπειών του καρκίνου τα τελευταία χρόνια, τα προβλήματα εξακολουθούν να προκύπτουν ιδιαίτερα σε σχέση με τη χημειοθεραπεία, λόγω παρενεργειών, αντοχή και χαμηλή εξειδίκευση των επί του παρόντος διαθέσιμων φαρμάκων [1]. Ως εκ τούτου, υπάρχει ανάγκη να αναπτυχθούν ασφαλή και αποτελεσματικά αντικαρκινικά μέσα. [2]

Peptide θεραπευτικά είναι ένα πολλά υποσχόμενο πεδίο για τις αναδυόμενες αντικαρκινικούς παράγοντες, κυρίως λόγω ότι αυτά τα πεπτίδια μπορούν εύκολα να λάβουν είτε από τη φύση πόρων ή ορθολογικό σχεδιασμό που βασίζεται στην δομή της πρωτεΐνης-στόχου. Πράγματι, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι ένας αριθμός βιοενεργών πεπτιδίων ανάπτυξης ανέστειλε κύτταρο όγκου σε προκλινικές μονοπάτια [3] – [5]. Συγκεκριμένα, αυτά τα θεραπευτικά πεπτίδια συνήθως έχουν μηδενική ή περιορισμένη τοξικότητα [2]. Για παράδειγμα, ένα αντικαρκινικό βιοενεργό πεπτίδιο (ACBP) εξάγεται από σπλήνες κατσίκα ανέστειλε δραματικά την ανθρώπινη ανάπτυξη γαστρικού όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος χωρίς εμφανή κυτταροτοξικότητα για να φιλοξενήσει [3]. Μεταγενέστερες μελέτες πρότειναν ότι τα αντικαρκινικά αποτελέσματα μερικών βιοδραστικών πεπτιδίων θα μπορούσε να αποδοθεί με τις ικανότητές τους σε επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης και κυτταρικού κύκλου σύλληψης [3], [6] – [7]. Πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει ορισμένα πεπτίδια μπορεί να βλάψει μια συγκεκριμένη οδό σηματοδότησης και στη συνέχεια ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου ή μετάστασης. Όπως, ένα πεπτίδιο της δΑΗ-BCL9 (σταθεροποιημένο άλφα έλικα του Β κυτταρικού λεμφώματος 9) που στοχεύουν βήτα-κατενίνης ανέστειλε ογκογόνο Wnt δραστηριότητα, κατέστειλε την ανάπτυξη και μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου και ξενομοσχεύματος πολλαπλό μυέλωμα, και προώθησε την απόπτωση κυττάρων όγκου [8] . Το πεπτίδιο υδρογονάνθρακα συρραμμένα SAHM1 εμπόδισε τη συναρμολόγηση του ενεργού μεταγραφικού συμπλόκου του Notch, και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, κατά συνέπεια, ανέστειλε

in vitro

και ογκογένεση σε ένα μοντέλο ποντικού της Notch 1 καθοδηγείται Τ-κυττάρων οξείας λευχαιμίας και του λεμφώματος [9].

Εκτός από την πρωτογενή θρεπτική τους αξία, οι πρωτεΐνες του γάλακτος αποτελούν σημαντικές πηγές των βιολογικά ενεργών πεπτιδίων [10] – [11]. Οι πρωτεΐνες του γάλακτος είναι οι πρόδρομοι των πολλών βιολογικώς δραστικών πεπτιδίων που είναι ανενεργοί προδρόμων πρωτεϊνών, αλλά μπορεί να απελευθερωθεί και να ενεργοποιηθεί με ενζυμική πρωτεόλυση [12]. Ορισμένα πεπτίδια που προέρχονται από πρωτεΐνη γάλακτος είναι καλοί υποψήφιοι για την κλινική αντικαρκινικούς παράγοντες ή πρόσθετο δεδομένου ότι απορροφάται εύκολα με λιγότερη πιθανή τοξικότητα. Επιπλέον, εδώ αυξάνονται μελέτες δείχνουν ότι βιοενεργά πεπτίδια γάλα μπορεί να απορροφηθεί άθικτο από τον εντερικό αυλό στην κυκλοφορία του αίματος – αυτά μπορεί έτσι να χρησιμεύσουν ως νέες φαρμακευτικές ουσίες, οι οποίες δεν προκαλούν σημαντικές παρενέργειες σε υγιείς ανθρώπους [13]. Στην πραγματικότητα, η εξερεύνηση των αντικαρκινικές επιδράσεις των βιοδραστικών πεπτιδίων από πρωτεΐνες γάλακτος αναδύεται ως ένα από τα πιο hot περιοχές πρόσφατα. Για παράδειγμα, talactoferrin (TLF), μια ανασυνδυασμένη ανθρώπινη λακτοφερρίνη (LF), είναι ένα νέο αναπτυγμένο αντικαρκινικό παράγοντα που έχει εισέλθει κλινικές μελέτες φάσης ΙΙΙ [14] – [15].

PGPIPN (Pro-Gly-Pro -Ile-Pro-Asn, υπολείμματα 63-68 του β-καζεΐνη), ένα πεπτίδιο ανοσορυθμιστική, ήταν η ανακαλύφθηκε ενεργό πεπτίδιο από πρωτεΐνη βόειου γάλακτος [16] – [18]. Οι προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι αυτό το πεπτίδιο παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ανοσολογική άμυνα απόκριση. Για παράδειγμα, το πεπτίδιο ενισχυμένη φαγοκυτταρικής δράσης των μακροφάγων

in vitro

κατά ερυθρών αιμοσφαιρίων προβάτου (SRBCs) και προστατευμένων ποντικών έναντι μόλυνσης με Klebsiella pneumoniae

in vivo

. Τα τελευταία χρόνια, το εργαστήριο μας αφιερωμένο να διερευνήσει τις φυσιολογικές λειτουργίες του PGPIPN. Σε σύγκριση με άλλα ανοσορυθμιστικά πεπτίδια, PGPIPN είναι πιο ανθεκτικό στο σύστημα εξευτελιστική-ενζύμου λόγω πλούσια περιεκτικότητα σε προλίνη της [19]. Επιπλέον, ένα αμινοξύ διακλαδισμένης αλυσίδας (BCAA) αυτού του πεπτιδίου βοηθά στην κάποιο βαθμό να αντισταθούν μικροοργανισμούς. προηγούμενες μελέτες μας πρότειναν ότι PGPIPN προώθησε σημαντικά την περιτοναϊκή μακροφάγων φαγοκυττάρωση και το κόκκινο ασυλία αιμοσφαιρίων σε αρουραίους. Μπορεί επίσης να διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των λεμφοκυττάρων σε αρουραίους και ποντικούς [20] – [21]. Επιπλέον, μεταγενέστερη μελέτη μας έδειξε ότι αυτό το πεπτίδιο έχει καλή αντιοξειδωτική δράση

in vivo

[22].

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η PGPIPN εξαπεπτίδιο μπορεί να εμποδίσει αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, επάγουν απόπτωση των κυττάρων του καρκίνου και να μειώσει την ανάπτυξη του όγκου σε μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου των ωοθηκών. Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης παρέχουν την απόδειξη της έννοιας για τη χρήση PGPIPN ως πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Η PGPIPN (η καθαρότητα επιβεβαιώθηκε με RP-HPLC για να είναι & gt? 99,5%) παρέχεται από τη Σαγκάη Sangon Βιολογική Μηχανική Τεχνολογία. κιτ Tunel αγοράστηκε από την Roche. Gene Έκλουση θηλαστικών Γονιδιωματικό DNA Miniprep Kit αγοράστηκε από τη Sigma. Ποντίκι μονοκλωνικά αντισώματα της BCL2, Bax, και β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, Inc.

Κυτταροκαλλιεργειών

Ανθρώπινο ωοθηκών κυτταρική σειρά SKOV

3 και ανθρώπινη φυσιολογική ηπατική κυττάρων γραμμή LO2 είχαν αρχικά αγοραστεί από την ATCC. κύτταρα εμβρύου ποντικού ινοβλάστες (ΠΜΑ) αρχικά από το Harvard Medical School στις Ηνωμένες Πολιτείες,

σ

53 γονίδιο του οποίου είχε νοκ άουτ, παρουσιάστηκε από τον καθηγητή Hongbing Zhang στην Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών & amp? Πεκίνο Ένωση Medical College, Κίνα. Αυτές οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 10% FBS σε 5% CO

2 στους 37 ° C. Για πρωτογενή ωοθηκική κύτταρα καλλιέργειας, φρέσκα πρωτογενή καρκινικό ιστό των ωοθηκών, η οποία αξιολογείται και ταξινομείται ως ορώδες αδενοκαρκίνωμα ωοθηκών (βαθμός Ι-ΙΙ) σύμφωνα με τα κριτήρια της ΠΟΥ, ελήφθησαν από 5 ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών κατά την αρχική χειρουργική επέμβαση debulking στο πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο του Anhui Medical University. Όλοι οι ασθενείς που υπογράφηκε γραπτές συγκαταθέσεις που τεκμηριώνουν δωρεά ιστών τους για ερευνητικούς σκοπούς, σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι πριν από την εναπόθεση ιστού. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο αναθεώρηση του Πανεπιστημίου Anhui Medical. Οι ιστοί όγκου κόπηκαν σε μικρά κομμάτια περίπου 1,0 mm

3, και ξεπλένονται με PBS δύο φορές και υποβάλλεται σε πέψη με 0,25% θρυψίνη σε αποστειρωμένο φυγοκεντρικό σωλήνα στους 37 ° C για 30 λεπτά. Για να ληφθούν τα απλά κύτταρα αναστολής, τα ανωτέρω πέψη ιστοί διηθούνται με 100 um κελί σουρωτήρι. Μετά από φυγοκέντρηση στους 1000 rpm για πέντε λεπτά, το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωματικά με 10% ανθρώπινο ορό. Όταν τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70-80% συρροή, το μέσο καλλιέργειας σε φιάλη αποστραγγίστηκε? τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πέψη με 0,25% κολλαγενάση II. Όταν περίπου 1/3 κύτταρα πέφτουν κάτω από την παρατήρηση κάτω από ένα μικροσκόπιο, πέψη σταμάτησε αμέσως και το μέσο καλλιέργειας σε φιάλη αποστραγγίστηκε πάλι. Λόγω τους ρίχνοντας πρώτα, η πιο των ινοβλαστών εξαλείφθηκαν με πέψη κολλαγενάσης. Τα παρέμειναν κύτταρα καλλιεργήθηκαν συνεχώς για προσδιορισμό πολλαπλασιασμού κυττάρων. Το τμήμα αυτών των κυττάρων έγιναν στη διαφάνεια των κυττάρων και προσδιορίζονται από τη χρήση ανοσοφθορισμού της κυτοκερατίνης 7 για να προσδιοριστεί η καθαρότητα τους.

Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

SKOV

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε 96- φρεατίων σε octuplicate σε πυκνότητα έναρξης των 5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από ολονύκτια καλλιέργεια, PGPIPN προστέθηκε στις τελικές συγκεντρώσεις των 0 (ως μάρτυρας), 3 × 10

-8, 3 × 10

-7, 3 × 10

-6, 3 × 10

-5, 3 × 10

-4, 3 × 10

-3 και 3 × 10

-2 g /L, αντίστοιχα. 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) σε 3 × 10

-3 g /L προστέθηκε στην ίδια πλάκα ως θετικός έλεγχος. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε σε διαφορετικά χρονικό σημείο με τη μέθοδο ΜΤΤ όπως περιγράφεται [23]. Ο ακόλουθος τύπος χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί η αναλογία κυτταρικής ανάπτυξης αναστολής (IR): IR (%) = (1 – την πειραματική ομάδα Α

490 nm τιμή /ομάδα ελέγχου Α

490 nm αξία) × 100%. Κάθε πείραμα εις τριπλούν ανεξάρτητα.

Χρησιμοποιώντας την ίδια διαδικασία, η αναστολή αύξησης του PGPIPN σε πρωτογενή καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών προσδιορίστηκαν επίσης, εκτός από τις τελικές συγκεντρώσεις του PGPIPN στους 0 (ως μάρτυρας), 3 × 10

-6, 3 × 10

-5, 3 × 10

-4, 3 × 10

-3 και 3 × 10

-2 g /L, αντίστοιχα. Τα πειράματα επαναλαμβάνονται με πρωτοπαθή καρκίνο κυττάρων των ωοθηκών από πέντε ασθενείς, αντίστοιχα.

Για την ανίχνευση της τοξικότητας των PGPIPN οι αναστολές ανάπτυξη του PGPIPN επί μη μετασχηματισμένων κυτταρικών γραμμών LO2 και ΠΜΑ αναλύθηκαν με την ίδια διαδικασία όπως εκείνη του SKOV

3 κύτταρα, εκτός από τις τελικές συγκεντρώσεις των PGPIPN σε 0 (ως μάρτυρας), 3 × 10

-4, 3 × 10

-3, 3 × 10

-2, 3 × 10

-1 και 3 g /L, αντίστοιχα. Κάθε πείραμα εις τριπλούν ανεξάρτητα.

μορφολογική παρατήρηση του κύτταρα επεξεργασμένα με PGPIPN

Η δυναμική μορφολογικές αλλαγές του SKOV

3 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με PGPIPN παρατηρήθηκαν με οπτικό μικροσκόπιο. Το γυάλινο κάλυμμα του crawling κυττάρων ήταν έτοιμη. Το γυάλινο κάλυμμα σχεδόν γεμάτο κυττάρου επί της επιφανείας του ελήφθη για Η &? Χρώση Ε, με διαδικασία σύμφωνα με την αναφορά [24] – [25]. Η μέθοδος που χρησιμοποιείται για να παρατηρήσει την απόπτωση των SKOV

3 κύτταρα με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο έχει περιγραφεί προηγουμένως [26].

Ανίχνευση απόπτωσης σε καλλιεργημένα κύτταρα με FCM

κύτταρα ανιχνεύθηκαν αποπτωτικά χρησιμοποιώντας συζευγμένη με FITC Annexin-V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) από την Sigma. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης αννεξίνης-ν (10 mM HEPES, 140 mM NaCl και 5 mM ΟαΟ

2) σε μια συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα /mL. Τότε και μόνο εναιώρημα 1 × 10

6 SKOV

3 κύτταρα παρασκευάζεται σε μία mL σωλήνα καλλιέργειας 5 σύμφωνα με την αναφορά [23], στο οποίο 5μL Annexin-V-FITC στα 10 μg /mL και 10 μL προπίδιο ιωδιούχο στα 10 μg /mL προστέθηκαν. Στη συνέχεια, ο σωλήνας στροβιλίζεται ήπια και επωάστηκε για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. ρυθμιστικό σύνδεσης (400 μL) προστέθηκε στη συνέχεια σε κάθε σωλήνα και τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Animal Θεραπεία

Είκοσι τέσσερις υγιείς γυναίκες γυμνούς ποντικούς χρησιμοποιήθηκαν στις έρευνες. Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Anhui Medical University. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων σε ζώα, όσο το δυνατόν περισσότερο τα ζώα υποφέρουν είχε βελτιωθεί. Όλα γυμνά ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία στο τέλος των πειραμάτων. Τα γυμνά ποντίκια σε αμιγές στέλεχος (BALB /Cann-ηυ /ηυ), ηλικίας 8-10 εβδομάδων, αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Slac Εργαστήριο Ζώων & ΣΙΑ ΕΠΕ Όλα τα ποντίκια διατηρήθηκαν σε SPF-class αποστειρωμένο δωμάτιο στο Anhui Provincial Κέντρο Ιατρικής Πειραματόζωα.

Κάθε γυμνός ποντικός εμβολιάστηκε υποδορίως στο δεξί μασχάλη του με 0,2 ml SKOV

εναιώρημα 3 κύτταρα σε (1 × 10

7) κύτταρα /ml. Την δεύτερη ημέρα μετά τον εμβολιασμό, οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες: NS (φυσιολογικό ορό), χαμηλή δόση PGPIPN, υψηλή δόση PGPIPN και 5-FU (ως θετικός μάρτυρας) ομάδες. NS, χαμηλή δόση PGPIPN, υψηλή δόση PGPIPN και 5-FU ομάδες ενδοπεριτοναϊκή ένεση με 0,2 mL φυσιολογικού ορού, 0,2 mL PGPIPN στα 0,25 gL

-1, 0,2 mL PGPIPN σε 0,50 gL

-1 και 0.2 ml 5- FU στα 30 mg /kg βάρους σώματος, αντίστοιχα. Τα φάρμακα δόθηκαν μία φορά κάθε δεύτερη ημέρα επί 4 εβδομάδες

Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο με βερνιέρο σε εβδομαδιαία βάση, και υπολογίζεται σύμφωνα με τον τύπο ως εξής:. V = (1/2) ab

2 , όπου ο όγκος V = όγκος? α = η μεγαλύτερη διάμετρος του όγκου? b = το πλέον μονοπάτια του όγκου. Κατά την τέταρτη σαββατοκύριακο μετά τη φύτευση, όλοι οι γυμνοί ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία, και ξενομοσχεύματος όγκοι ζυγίστηκαν. Οι όγκοι ξενομοσχεύματος καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο για μετέπειτα πειράματα.

TUNEL (TdT μεσολάβηση dUTP Nick-End επισήμανση) Δοκιμασία

Τα δείγματα όγκου μονιμοποιήθηκαν και ενσωματωμένα με παραφίνη. Η δοκιμασία TUNEL διεξήχθη ως εγχειρίδιο του κατασκευαστή (Roche). Τέλος, οι τομές με αιματοξυλίνη. Τα αποπτωτικά κύτταρα ποσοτικοποιούνται με μικροσκοπία φωτός για αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ) χρωματισμένο τμήματα με μέσο όρο του αριθμού των κυττάρων με ομοιογενώς πυκνή χρωματίνη ή πυρηνορρηκτικών πυρηνικών θραύσματα σε φωτογραφίες των πέντε τυχαία επιλεγμένα × 40 πεδία. Οι περιπτώσεις αξιολογήθηκαν από δύο ανεξάρτητους εξεταστές. δείκτης απόπτωσης (ΑΙ) υπολογίστηκε ως εξής τύπο: AI = (ο αριθμός αποπτωτικών κυττάρων /ο συνολικός αριθμός των κυττάρων) × 100%

Ο κατακερματισμός Δοκιμασία DNA με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης

DNA. θραύσματα στους ιστούς του όγκου προσδιορίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης, σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Sambrook & amp? Russell (2001) [27]. DNA στους ιστούς του όγκου εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας Gene Elute Mammalian Γονιδιωματικό DNA Miniprep κιτ (Sigma), και υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε 1.5% πηκτή αγαρόζης (που περιέχει 0,25 μg /ml βρωμιούχο αιθίδιο). Οι ηλεκτροφορητικές ζώνες οπτικοποιήθηκαν και φωτογραφήθηκαν υπό μεταδίδεται το υπεριώδες φως.

Ανάλυση Western Blot των BCL2 και Bax πρωτεΐνες στο καρκινικούς ιστούς

Οι πρωτεΐνες απομονώθηκαν από τα xengrafted δείγματα όγκου και διαχωρίστηκαν με SDS -PAGE χρησιμοποιώντας το πρότυπο πρωτόκολλο. Μετά δεσμεύτηκαν με 5% (w /v) ξηρό αποβουτυρωμένο γάλα, οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (μονοκλωνικά ποντικού Βαχ, BCL2 και β-ακτίνης αντισώματα, 1:1000 αραίωση) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Santa Cruz Biotechnology) και στη συνέχεια επωάστηκαν με ραφανιδική υπεροξειδάση συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (αίγας αντι-ποντικού IgG, 1:8000 αραίωση). Οι πρωτείνες ανιχνεύθηκαν με το σύστημα ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) (Pierce, Rockford, IL) που ακολουθείται από έκθεση σε φιλμ ακτίνων Χ. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Ψηφιακές εικόνες συλλήφθηκαν με Gel Doc ™ σύστημα τεκμηρίωσης γέλης (Bio-Rad, USA) και εντάσεις μετρήθηκαν με την έκδοση Ποσότητα-One 4.62 (Bio-Rad, USA).

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα στοιχεία μετρήσεων παρουσιάζονται ως μέση τιμή ±

SD

. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την μονόδρομη ANOVA με SPSS12.0 στατιστικό λογισμικό. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

PGPIPN θεραπεία οδήγησε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης των SKOV

3 Τα κύτταρα του καρκίνου των ωοθηκών

στο vitro

η

PGPIPN έχει δειχθεί ότι παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στη θεραπεία ανοσορυθμιστική και άλλες επιδράσεις σε πολλές έρευνες [19] – [22], [28] – [29]. Αυτό μας ίντριγκες να διερευνήσει αν PGPIPN μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αντικαρκινικός παράγοντας. Για το σκοπό αυτό ερευνήσαμε πρώτα την επίδραση του PGPIPN στον πολλαπλασιασμό των SKOV

3 κύτταρα. Προς έκπληξή μας, PGPIPN μπορεί να καταστείλει αποτελεσματικά την SKOV

3 ανάπτυξης των κυττάρων, ακόμη και σε χαμηλή δοσολογία των 3 × 10

8 g ​​/L (Εικόνα 1Α). Αυτή η ικανότητα αναστολής της PGPIPN συγκρίθηκε με θεραπεία 5-FU όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν σε υψηλή συγκέντρωση 3 × 10

3 g /L. Η επίδραση της αναστολής της PGPIPN έδειξε επίσης χρόνο και δοσο-εξαρτώμενο αρχοντικό. Επιπλέον, σε σύγκριση με τον έλεγχο, θεραπεία PGPIPN οδήγησε σε προφανείς μορφολογικές αλλαγές σε SKOV

3 κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων συρρικνώνεται, καρυοπυκνώσεως, και την εμφάνιση των κυτταροπλασματικά κενοτόπια σε μερικά κύτταρα (ημερομηνία δεν παρουσιάζεται). Υπάρχει επίσης έδειξε μια βαθιά βάφονται στην πυρηνική τμήμα και ένα μεγάλο ποσό της κυτταροπλασματικής φορείς ή μικρά κομμάτια στα PGPIPN επεξεργασμένα κύτταρα, τα οποία είναι τα τυπικά χαρακτηριστικά του αποπτωτικού κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για την επικύρωση αυτή την παρατήρηση, πραγματοποιήσαμε τη δοκιμασία απόπτωσης με Annexin V-TITC και τη μέθοδο διπλής χρώσης ΡΙ. θεραπεία PFPIPN επαγόμενη σαφώς SKOV

3 κύτταρα υπέστησαν απόπτωση μετά από έκθεση 48 ώρες φάρμακο σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (Σχήμα 1Β).

(Α) PGPIPN σε διαφορετικές συγκεντρώσεις αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των SKOV

3 κύτταρα, που μετράται σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Τα δεδομένα που δεικνύονται είναι μέση τιμή ±

SD

από τρία ανεξάρτητα πειράματα, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο (η ομάδα οχήματος). (Β) κυτταρομετρία ροής ανάλυση δείχνει ότι η θεραπεία PGPIPN που προκαλείται SKOV

3 κύτταρα απόπτωση μετά από έκθεση στο φάρμακο 48 ώρες. Η μέτρηση έγινε βιολογικά εις τριπλούν.

Η

PGPIPN μπορεί αποτελεσματικά να αναστέλλει την ανθρώπινη Πρωτοβάθμια καρκίνου των ωοθηκών ανάπτυξη κυττάρων

in vitro

Η

Στη συνέχεια, περαιτέρω ελέγξετε αν PGPIPN μπορεί επίσης να αναστείλει την ανθρώπινη ανάπτυξη κυττάρων πρωτοπαθή καρκίνο. Έχουμε επιτυχώς έκθεση στον ήλιο και δημιούργησε 5 πρωτογενή καρκινικά κύτταρα από 5 ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών κατά την αρχική χειρουργική επέμβαση debulking στο πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο του ιατρικού πανεπιστημίου Anhui. Αυτά τα πρωτογενή κύτταρα καλλιέργεια στο εργαστήριο μας. Αυτά κυττάρων είναι μορφολογικά παρουσιάζονται ως τυπικά κύτταρα επιθηλίου (Εικόνα 2Α αριστερά και μεσαίο πλαίσιο). Αυτά τα πρωτογενή καρκινικά κύτταρα ωοθηκών υπέστησαν περαιτέρω προσδιορίζονται με δοκιμασία ανοσοκυτταροχημεία με χρώση αντι-κυτοκερατίνης 7 (Σχήμα 2Α δεξιό πλαίσιο). Η μέση καθαρότητα των κυττάρων καρκινώματος των ωοθηκών ήταν περίπου 85% με βάση την χρώση κυτοκερατίνης 7. Για να διερευνηθεί αν PGPIPN μπορεί να μειώσει την ανάπτυξη των πρωτογενών καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, θα εμβολιάζονται αυτά τα κύτταρα σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά από όλη τη νύχτα ανάπτυξη αυτά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PGPIPN σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 24, 48 και 72 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, η αγωγή με διαφορετικές συγκεντρώσεις PGPIPN οδήγησε σε σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκινώματος των ωοθηκών, και η επίδραση της αναστολής έδειξε χρόνου και δοσο-εξαρτώμενη Manor. Όλα αυτά δείχνουν ότι τα πρωτογενή καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών είναι επίσης ευαίσθητα σε θεραπεία PGPIPN.

(Α) Α αντιπροσωπεύουν μορφολογία των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών από έναν ασθενή αναπτύσσονται σε μέσο πρωτογενή καλλιέργεια (χ 100, αριστερό πάνελ), Η & ? Ε χρώση (μεσαίο πλαίσιο) και αντι-κυτοκερατίνης 7-FITC χρώση (δεξί πάνελ). δοκιμασίας (Β) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δείχνει ότι PGPIPN σε διαφορετικές συγκεντρώσεις κατέστειλε πρωτογενή ανάπτυξη των ωοθηκών κύτταρα. Τα δεδομένα υπολογίζονται από 5 πρωτογενείς μετρήσεις κυττάρων του καρκίνου και παρουσιάζονται ως μέσος όρος, και οι ράβδοι σφάλματος αναφέρονται σε SD της decuplicate αναλύσεις, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με το ελέγχου (η ομάδα του οχήματος).

η

PGPIPN είχε μικρή ή καθόλου επίδραση στις μη μετασχηματισμένα ανάπτυξη κυττάρων

in vitro

η

Οι κυτταροτοξικότητες της PGPIPN προς τα μη μετασχηματισμένα κυτταρικές σειρές ερευνήθηκαν . δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη για να προσδιοριστεί τις επιδράσεις των PGPIPN στις πολλαπλασιασμούς ανθρώπινης φυσιολογικής LO2 ηπατική κυτταρική σειρά ποντικού και κύτταρα ινοβλαστών εμβρύου (ΠΜΑ). Το πεπτίδιο βρέθηκε να έχει καμία επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων LO2 (Σχήμα 3Α). Ο πολλαπλασιασμός των ΠΜΑ επηρεάστηκε ελαφρά από PGPIPN, η οποία ανεστάλη σημαντικά μόνο σε υψηλή δόση (0.3 g /L) του πεπτιδίου για 72 ώρες, αλλά η επιρροή ήταν πολύ μικρότερη σε σύγκριση με ομάδα θετικού ελέγχου (ομάδα 5-FU) ( Σχήμα 3Β). Κατά συνέπεια, PGPIPN εμφάνισαν μικρή ή καθόλου κυτταροτοξικότητα προς μη μετασχηματισμένο κύτταρο, σε σύγκριση με τις παραδοσιακές αντικαρκινικά φάρμακα (5-FU).

(Α) PGPIPN δεν είχε επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων LO2. (Β) PGPIPN επηρεάζεται ελαφρώς τον πολλαπλασιασμό των ΠΜΑ που ανεστάλη σημαντικά μόνο σε υψηλή δόση (0.3 g /L) του πεπτιδίου για 72 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ±

SD

από τρία ανεξάρτητα πειράματα, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο (η ομάδα οχήματος) .

η

PGPIPN σημαντικά μειωμένη ανάπτυξη ξενομοσχεύτηκε όγκου

in vivo

η

Για να προσδιορίσετε αν PGPIPN έχει αντικαρκινική δράση

in vivo

, εμείς εμφυτεύτηκαν SKOV

3 κύτταρα υποδορίως σε γυμνά ποντίκια. Είκοσι τέσσερα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες: NS (φυσιολογικό ορό), χαμηλή δόση PGPIPN, υψηλή δόση PGPIPN και 5-FU (ως θετικός μάρτυρας) ομάδες όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. PGPIPN χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά κάθε δεύτερη ημέρα αρχίζοντας από τη δεύτερη ημέρα μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων. Saline χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος, και 5-φθοριοουρακίλη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Αυτά τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή για 4 εβδομάδες. Στην τέταρτη σαββατοκύριακο, οι όγκοι αφαιρέθηκαν και μετρήθηκαν. Και οι δύο δόσεις του PGPIPN μπορεί να αναστέλλουν σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με την ομάδα NS (Σχήμα 4Α). Οι όγκοι στην ομάδα NS αυξήθηκαν κατά μέσο όρο σε όγκο (1370,25 ± 303,12) χιλ

3. Αντίθετα, οι όγκοι στην ομάδα χαμηλής δόσης PGPIPN, PGPIPN ομάδα υψηλής δόσης και την ομάδα 5-FU αυξήθηκαν κατά μέσο όρο σε όγκο (845,43 ± 205,09) χιλ

3, (346.78 ± 97.16) mm

3 και (705,82 ± 124,47) mm

3, αντίστοιχα (Σχήμα 4Α). Σε σύγκριση με την ομάδα NS, οι ανασταλτικές τιμές στην ομάδα χαμηλής δόσης PGPIPN, ομάδα υψηλής δόσης PGPIPN και ομάδα 5-FU ήταν 36,92%, 68,46% και 41,54% αντίστοιχα. Σταθερά, τα μεγέθη του όγκου (Σχήμα 4Β) ή βάρη (Σχήμα 4C) έχουν σημαντικά μειωμένα σε όλες τις ομάδες θεραπείας φαρμάκων σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Μαζί αυτά τα δεδομένα δεικνύουν ότι PGPIPN μπορεί να εμποδίσει αποτελεσματικά την ανάπτυξη του όγκου ξενομοσχεύτηκε

in vivo

, η οποία είναι σε σύγκριση με το παραδοσιακό αντι-ωοθηκών φάρμακο, 5-φθοροουρακίλη.

PGPIPN ανάπτυξη αξιοσημείωτα ανέστειλε όγκου μετά από 4 θεραπεία -weeks (Α) και μείωσε το μέγεθος του όγκου (Β) και το βάρος του όγκου (Γ) στο τέλος της θεραπείας. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ±

SD

από 6 ποντίκια, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με την ομάδα NS

αναστολή της ανάπτυξης των όγκων που δημιουργήθηκαν από PGPIPN συνδέεται με την κυτταρική απόπτωση

in vivo

η

η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι PGPIPN που προκαλείται SKOV

3 κύτταρα υπέστησαν απόπτωση

στο vitro

(Εικόνα 1Β). Για να ελέγξετε αν PGPIPN μπορεί επίσης να προκαλέσει κυτταρική απόπτωση στη θεραπεία όγκων

in vivo

, πραγματοποιήσαμε δοκιμασία TUNEL στα δείγματα των όγκων που εξάγονται από μεταμοσχευμένα άτριχων ποντικών. Ο αριθμός των TUNEL θετικών κυττάρων σε δείγματα όγκων που εξάγονται από τις ομάδες θεραπείας PGPIPN ήταν σημαντικά αυξημένη (Σχήμα 5 Α και Β). Σε σύμφωνο με την παρατήρηση αυτή, δοκιμασία θραύσμα DNA κατέδειξε επίσης την αξιοσημείωτη αποδόμηση του DNA σε PGPIPN-επεξεργασμένα δείγματα όγκων, που δείχνει το υψηλό ποσοστό αποπτωτικών κυττάρων σε αυτά τα δείγματα (Σχήμα 5 C). Σε αντίθεση, NS επεξεργασμένα δείγματα όγκου δεν έδειξε αυτό το τυπικό πρότυπο σκάλα DNA σε ηλεκτροφόρηση (Εικόνα 5 C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι PGPIPN αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου μέσω της επαγωγής των κυττάρων του όγκου που υφίστανται απόπτωση. Δοκιμασία

(Α) TUNEL δείχνει τα αποπτωτικά κύτταρα όγκου σε PGPIPN-επεξεργασμένα δείγματα που προέρχονται από το ξενομόσχευμα ποντικούς (× 400). δείκτης (Β) Τα αποπτωτικά υπολογίστηκε ως εξής τύπο: AI = (ο αριθμός αποπτωτικών κυττάρων /ο συνολικός αριθμός των κυττάρων) × 100% (μέση τιμή ±

SD

, n = 6), **

P

& lt? 0,01. δοκιμασίας (C) θραύσμα DNA δείχνει ότι PGPIPN επαγόμενη όγκου DNA σε αποικοδόμηση ομάδα PGPIPN υψηλή δόση (υψηλή) και χαμηλή ομάδα PGPIPN δόσης (χαμηλή), αλλά όχι σε φυσιολογικά ομάδα με φυσιολογικό ορό (NS). επίπεδα (D) Πρωτεΐνη της BCL2 και Bax εξετάστηκαν με κηλίδα western σε δείγματα όγκων που προέρχονται από ξενομοσχεύτηκε ποντίκια (πάνω πίνακα). Οι εντάσεις μπάντα μετρήθηκαν με Imaging J λογισμικού και συνοψίζονται (κάτω πίνακας). Τα στοιχεία είναι από 6 όγκων της κάθε ομάδας, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με την ομάδα NS

Η

Για την περαιτέρω επιβεβαιώνουν ότι η επαγωγή της απόπτωσης εμπλέκεται στην υποχώρηση της ανάπτυξης του όγκου μετά από αγωγή PGPIPN, δύο γονίδια που σχετίζονται με απόπτωση,

BCL2

και

bax

, αξιολογήθηκαν μέσω western blotting ανάλυση. ανοσολογική ανάλυση με αντισώματα BCL2 και Bax έδειξαν ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης BCL2 μειώθηκαν σημαντικά σε ομάδες PGPIPN αγωγή (

P

& lt? 0,05 ή

P

& lt? 0,01) σε σύγκριση με εκείνη από την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 5D). Σε αντίθεση, οι εκφράσεις του Βαχ ήταν δραματικά πάνω ρυθμισμένα σε ομάδες PGPIPN-θεραπεία, σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικόνα 5D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν σαφώς ότι PGPIPN ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου τουλάχιστον εν μέρει μέσω επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης.

Συζήτηση

Πολλοί βιοδραστικά πεπτίδια που προέρχονται από πρωτεΐνη γάλακτος είναι ανενεργά εντός των πρωτεϊνών τους μητρική γάλα, και κατόπιν απελευθερώνονται κατά τη διάρκεια πέψη ή μεταποίηση τροφίμων, μπορούν να δρουν ως ρυθμιστικές ενώσεις με βιολογικές δραστηριότητες. Στην παρούσα μελέτη, είμαστε η πρώτη που δείχνει ότι PGPIPN μπορεί βαθιά αναστέλλει την ανθρώπινη ωοθηκών καρκινικά κύτταρα τόσο στο μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος καθώς και στα πρωτογενή καρκινικά κύτταρα χωρίς μη ειδική τοξικές επιδράσεις, γεγονός που υποδηλώνει PGPIPN μπορεί να είναι ένα νέο αντικαρκινικό παράγοντα και θα πρέπει να ληφθούν υπόψη για την περαιτέρω προκλινικές δίκη σε άλλους τύπους καρκίνου.

τα θεραπευτικά πεπτίδια μπορεί μέσω διαφόρων μηχανισμών υφίστανται τις αντικαρκινικές επιδράσεις εξαρτώνται από τα χαρακτηριστικά τους. Ορισμένα πεπτίδια αλληλεπιδρούν πολύ ειδικά με κυκλίνες ή /και εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάσες ή με μέλη των αποπτωτικών καταρρακτών [30] – [31]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι τα πεπτίδια μπορούν να βλάψουν τα συγκεκριμένα μονοπάτια σηματοδότησης και στη συνέχεια ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου ή μετάστασης [8] – [9], [32]. Στη μελέτη μας, ο καρκίνος του antiovarian PGPIPN ήταν κυρίως μέσω της επαγωγής της απόπτωσης που διαμεσολαβείται από τα κάτω ρύθμιση BCL2 (Σχήμα 5). Σε συνεπής με αυτή την παρατήρηση, βρήκαμε επίσης πολλές μορφολογικές αλλαγές που σχετίζονται με την κυτταρική απόπτωση, όπως κυττάρων αιχμές, φουσκάλες επιφάνεια, φλύκταινες και την κυτταρική στρογγυλοποίηση και την πυρηνική διάσπαση (η ημερομηνία δεν φαίνεται).

Το πώς ακριβώς PGPIPN κατάντη οργανωμένη έκφραση BCL2 είναι ακόμα να προσδιοριστεί. Προγενέστερες έρευνες έδειξαν ότι τα δύο πεπτίδια που προέρχονται από την ανθρώπινη β-καζεΐνη (GLF και VEPIPY), μπορεί να δεσμεύεται με την κυτταρική μεμβράνη [33] – [34]. Πρόσφατες Ορισμένες έρευνες έδειξαν ότι βιοδραστικά πεπτίδια που προέρχονται από βοοειδή πρωτεΐνες γάλακτος ήταν ικανό να δεσμεύει και επηρεάζουν τα κύτταρα [13], [35] – [38]. Για παράδειγμα, Kreider RB et al. [13] ανέφεραν ότι ένα νέο μίγμα πεπτιδίων γάλα ανέστειλε τη δραστικότητα της τυροσίνης κινάσης του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα του υποδοχέα 2 (VEGFR2), και υποδοχέα ινσουλίνης (IR), αντίστοιχα. Αυτός ο αναστολέας πολλαπλών κινασών που προκαλείται απόπτωση σε ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου

in vitro

, ενώ το μίγμα πεπτιδίων γάλακτος ήταν ασφαλές να καταναλώνουν από το στόμα για υγιείς εθελοντές και κλινικά σημαντικές ανεπιθύμητες ενέργειες που έχουν αναφερθεί [13]. Fiedorowicz Ε, et al. ανέφερε ο βιοενεργά πεπτίδια-καζομορφίνη-7 (YPFPGPI), casoxin-D (YVPFPPF) και casoxin-6 (SRYPSY) από καζεΐνες βοοειδών μπορούσε να δεσμεύσει τον υποδοχέα μ-οπιοειδών σε cytomembrane να επηρεάσει τον πολλαπλασιασμό και την έκκριση κυτοκίνης από ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος ( PBMCs) [35]. Almansour NM et al. [2], [39] ανέφεραν ότι το πεπτίδιο ιός μυξώματος αναλόγου μπορούν να στοχεύσουν την οδό σηματοδότησης Akt ως πιθανό μονοπάτι κυτταρικού θανάτου σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του δέρματος.

Στη συνεχή πείραμά μας, παρατηρήσαμε ότι PGPIPN επισημασμένο με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) προέκυψε σε SKOV

3 κυτταρικής μεμβράνης υπό συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (CLSM) (ημερομηνία δεν φαίνεται), υποδεικνύοντας αυτό το πεπτίδιο θα μπορούσε να συνδεθεί με κυτταρική μεμβράνη, όπως και μερικά άλλα πεπτίδια από πρωτεΐνη γάλακτος. Εμείς αιτιολογημένη ότι PGPIPN μπορεί να δεσμεύεται με ειδικό υποδοχέα (ων) κυττάρου και dysregulate μονοπάτια μεταγωγής κυτταρικού σήματος, και μείωσε το BCL έκφραση, τότε επάγεται κυτταρικής απόπτωσης. Όλα αυτά πρέπει να διερευνηθεί σε μελλοντικές εργασίες. Φυσικά, μπορεί να PGPIPN μέσω μέσω άλλων μηχανισμών να επηρεάσει την ανάπτυξη των κυττάρων.

Εν περιλήψει, το εξαπεπτίδιο PGPIPN μπορεί αποτελεσματικά ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών τόσο in vitro όσο και in vivo. Αυτή η επίδραση αναστολή είναι κυρίως μέσω PGPIPN απόπτωση που επάγεται καρκινικών κυττάρων. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι PGPIPN είναι ένα ισχυρό θεραπευτικό πεπτίδιο για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών, και να παρέχει μια λογική για περαιτέρω αξιολόγηση σε κλινική.

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Lianfang Zhang και Liyu Cao από το πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο της Anhui Medical University, για τη βοήθειά τους στο μαζεύοντας, την αξιολόγηση και την κατάταξη των νωπών πρωτογενή ιστό του όγκου των ωοθηκών, από 5 ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών κατά την αρχική χειρουργική επέμβαση debulking στο πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο της Anhui Medical University.