Αφηρημένο

Η υποξία αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, και την έκφραση του γονιδίου υποξία που σχετίζονται μπορούσε να είναι ένα ισχυρό βιοδείκτη για την αναγνώριση των επιθετικών υποξικών όγκων. Αντίστροφη μεταγραφή ποσοτική PCR (RT-qPCR) είναι μια πολύτιμη μέθοδος για μελέτες γονιδιακής έκφρασης, αλλά είναι κατάλληλα γονίδια αναφοράς για κανονικοποίηση δεδομένων που είναι ανεξάρτητα από την κατάσταση υποξίας και κλινικές παραμέτρους της αυχενικής όγκων λείπουν. Στην παρούσα εργασία, με στόχο να εντοπίσει τα γονίδια αναφοράς για τις μελέτες RT-qPCR της υποξίας σε πλακώδους καρκίνου του τραχήλου. Από 422 υποψήφια γονίδια αναφοράς που επιλέγεται από την βιβλιογραφία, χρησιμοποιήσαμε προφίλ έκφρασης συστοιχία που βασίζεται Illumina για τον εντοπισμό 182 γονίδια δεν επηρεάζονται από υποξία στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, δηλαδή γονίδια που ρυθμίζονται από υποξία σε οκτώ τραχήλου καρκινικές κυτταρικές γραμμές ή συσχέτιση με την υποξία που σχετίζεται δυναμικής αντίθεσης -Βελτιωμένη παράμετρος μαγνητική τομογραφία A

Brix σε 42 ασθενείς, αποκλείστηκαν. Μεταξύ των 182 γονιδίων, εννέα υποψήφιοι (

CHCHD1

,

GNB2L1

,

IPO8

,

lasp1

,

RPL27A

,

RPS12

,

SOD1

,

SRSF9

,

TMBIM6

) που δεν συνδέονται με τον όγκο του όγκου, το στάδιο, η συμμετοχή των λεμφαδένων ή εξέλιξη της νόσου στα δεδομένα συστοιχία 150 ασθενείς, επιλέχθηκαν για περαιτέρω δοκιμές με RT-qPCR. geNorm και NormFinder αναλύσεις των δεδομένων RT-qPCR των 74 ασθενών που εντοπίστηκαν

CHCHD1

,

SRSF9

και

TMBIM6

ως το βέλτιστο σύνολο γονιδίων αναφοράς, με σταθερή έκφραση τόσο συνολικά όσο και σε όλες τις υποομάδες ασθενών με διαφορετικό καθεστώς υποξία (Α

Brix) και κλινικές παραμέτρους. Η καταλληλότητα των τριών γονιδίων αναφοράς που επικυρώθηκαν στις μελέτες των γονιδίων που προκαλείται από υποξία

DDIT3

,

ERO1A

, και

STC2

. Μετά την κανονικοποίηση, τα δεδομένα RT-qPCR αυτών των γονιδίων έδειξε σημαντική συσχέτιση με την έκφραση Illumina (Ρ & lt? 0,001, η = 74) και Α

Brix (Ρ & lt? 0,05, n = 32), και το

STC2

δεδομένα συσχετίστηκαν με την κλινική έκβαση, σύμφωνα με τα δεδομένα Illumina. Έτσι,

CHCHD1

,

SRSF9

και

TMBIM6

φαίνεται να είναι κατάλληλα γονίδια αναφοράς για τη μελέτη γονιδιακής έκφρασης υποξία που σχετίζονται με πλακώδους δείγματα καρκίνου του τραχήλου με RT-qPCR. Επιπλέον,

STC2

είναι μια πολλά υποσχόμενη προγνωστικό υποξία βιοδείκτη για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Fjeldbo CS, Aarnes EK, Malinen Ε, Kristensen GB, Lyng Η (2016) Αναγνώριση και επικύρωση των γονιδίων αναφοράς για RT-qPCR Σπουδών της υποξίας σε πλακωδών του τραχήλου της μήτρας ασθενείς με καρκίνο. PLoS ONE 11 (5): e0156259. doi: 10.1371 /journal.pone.0156259

Επιμέλεια: Christian Schönbach, Πανεπιστήμιο Ναζαρμπάγιεφ, ΚΑΖΑΚΣΤΑΝ

Ελήφθη: 23 Νοέμ, 2015? Αποδεκτές: 11 του Μαΐου, 2016? Δημοσιεύθηκε: May 31, 2016

Copyright: © 2016 Fjeldbo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και. Όλα τα αρχεία γονιδιακής έκφρασης Illumina είναι διαθέσιμες από τη βάση δεδομένων GEO (GSE75034)

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από το Συμβούλιο Ερευνών της Νορβηγίας, τον αριθμό επιχορήγησης 226120 /Ø30, (https://www.forskningsradet.no /en /Home_page /1177315753906). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

όγκων υποξία είναι ένας σημαντικός παράγοντας που οδηγεί στην ακτινοθεραπεία αντίσταση, μετάσταση και φτωχή πρόγνωση για πολλές κακοήθεις παθήσεις, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του τραχήλου της μήτρας [1-5]. Για τη μέτρηση των μεταβολών γονιδιακής έκφρασης υποξία που σχετίζονται με δείγματα ασθενών, η αντίστροφη μεταγραφή ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-qPCR) είναι μια πολύτιμη μέθοδος λόγω της υψηλής ευαισθησίας, την ευελιξία, χαμηλό κόστος και η ευκολία χρήσης [6-8] του. Στην ανάλυση RT-qPCR, είναι σημαντικό να επιλέξει τη βέλτιστη γονίδια αναφοράς για κανονικοποίηση των δεδομένων για την απομάκρυνση μη βιολογικές, πειραματικά επαγόμενη μεταβολή από τα δεδομένα. Για την ακριβή και αξιόπιστη εξομάλυνση, τα πολλαπλά γονίδια αναφοράς που συνιστώνται [6,7,9]. Προσδιορισμός των γονιδίων αναφοράς για κλινικές μελέτες είναι ιδιαίτερα δύσκολη, επειδή η σταθερότητα των γονιδίων που πρέπει να επαληθεύονται στους ιστούς υπό έρευνα και σε όλη φαινοτύπων όγκου και κλινικές παραμέτρους.

Προηγούμενη εργασία σε γονίδια αναφοράς στον τράχηλο της μήτρας έχει επικεντρώθηκε σε διαφορετικά στάδια της αυχενικής καρκινογένεσης αξιολογώντας υποψήφια γονίδια απέναντι ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) αρνητικές και θετικές βλάβες [10], και σε κανονική, προκαρκινικές και καρκινικές δείγματα [11-13]. Για τις γνώσεις μας, κατάλληλα γονίδια αναφοράς για τη μελέτη γονιδιακής έκφρασης από υποξία σχετίζεται σε βιοψίες καρκίνου του τραχήλου δεν έχουν αναφερθεί. Πολλές υποψήφιοι έχουν προταθεί για το σκοπό αυτό από πειραματικές μελέτες όπου οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν υπό χαμηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου [9,14-17], αλλά μόνο μία μελέτη για καρκίνο κεφαλής και λαιμού έχουν χρησιμοποιήσει την ιδιότητα της υποξίας των κλινικών δειγμάτων στην επικύρωση του εν λόγω οι υποψήφιοι [18]. Όγκου-site specific αξιολόγηση απαιτείται [9,15] και θα πρέπει να περιλαμβάνει τις ενώσεις με κλινικά χαρακτηριστικά και την έκβαση εκτός από την κατάσταση υποξίας.

Οι περισσότερες μελέτες που ψάχνουν για τα γονίδια αναφοράς που ξεκινούν με ένα περιορισμένο πάνελ περίπου 8-25 υποψηφίων επιλέγονται με βάση των γονιδίων που χρησιμοποιούνται συνήθως στη βιβλιογραφία, οι οποίες δεν είναι αναγκαστικά τα πλέον σταθερά εκφραζόμενα γονίδια. Αξιοποιώντας τα δεδομένα της έκφρασης του γονιδιώματος συνολικά για μια πρώτη αξιολόγηση των υποψηφίων μπορεί να είναι χρήσιμη για τον προσδιορισμό της πιο ελπιδοφόρα ομάδα γονιδίων για τη δοκιμή σε μια δοκιμασία RT-qPCR [19-24]. Στην παρούσα μελέτη, η προσέγγιση αυτή χρησιμοποιείται για την αναγνώριση κατάλληλων γονιδίων αναφοράς για μελέτες υποξαιμία εις βιοψίες καρκίνου του τραχήλου. Μια εμπεριστατωμένη ανασκόπηση της βιβλιογραφίας εντοπίστηκαν 422 πιθανά γονίδια αναφοράς, εκ των οποίων 410 υποψήφιοι ήταν παρόντες σε σύνολα δεδομένων μας και υποβλήθηκαν σε μια αρχική αξιολόγηση, με τη χρήση της έκφρασης των γονιδίων των 150 ασθενών καρκίνο του τραχήλου και οκτώ καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές. Εννέα γονίδια, που δεν συνδέονται με υποξία ή κλινικές παραμέτρους, περαιτέρω αξιολογήθηκαν με RT-qPCR, και τρεις από αυτούς επιλέχθηκαν ως το βέλτιστο σύνολο των γονιδίων αναφοράς. Η καταλληλότητα των γονιδίων αναφοράς για την κανονικοποίηση των δεδομένων επιβεβαιώθηκε σε μελέτες των τριών γνωστών γονιδίων υποξία που προκαλείται σε σχέση με την κατάσταση υποξίας όγκου και κλινική έκβαση.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Η μελέτη εγκρίθηκε από την περιφερειακή επιτροπή για την ιατρική και την υγεία δεοντολογία της Νοτιοανατολικής της Νορβηγίας (REC S-01129), και γραπτή συγκατάθεση επιτεύχθηκε από όλους τους ασθενείς.

ομάδες ασθενών και δείγματα όγκων

Απόλυτα 160 ασθενείς με τοπικά προχωρημένο πλακώδες καρκίνωμα του τραχήλου της μήτρας, προοπτικά προσληφθεί με το πρωτόκολλο χημειοραδιοθεραπεία μας στο νορβηγικό ράδιο Νοσοκομείο 2001-2012, περιελήφθησαν (Πίνακας 1). προφίλ γονιδιακής έκφρασης Illumina υπήρχε για 150 ασθενείς (Illumina κοόρτη, Πίνακας 1) και χρησιμοποιήθηκαν για την επιλογή γονιδίων υποψήφιος αναφοράς για τη δοκιμή με RT-qPCR (Σχήμα 1). Για 42 από αυτούς τους ασθενείς, η υποξία σχετίζεται δυναμικής αντίθεσης ενισχυμένης (DCE) Μαγνητικά συντονισμού (MR) παράμετρος απεικόνισης A

Brix [25] ήταν διαθέσιμο και χρησιμοποιήθηκε ως μέτρο της κατάστασης υποξίας όγκου. Δέκα ανεξάρτητοι ασθενείς (RT-qPCR ομάδα 1) χρησιμοποιήθηκαν για προ-αξιολόγηση των εννέα υποψηφίων γονιδίων. Επιπλέον, 74 από τους 150 ασθενείς στην ομάδα Illumina (RT-qPCR ομάδα 2) χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω αξιολόγηση και την επικύρωση των υποψηφίων. Επιπλέον, 22 βιοψίες από οκτώ ανεξάρτητους ασθενείς (2-4 βιοψίες από κάθε ασθενή) χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η ετερογένεια ενδο-όγκου (ετερογένεια κοόρτη).

Η

Ο όγκος του όγκου και η παρουσία παθολογικών λέμφου κόμβοι αξιολογήθηκαν από την προ-επεξεργασία εικόνων MR. Ένα έως τέσσερα βιοψίες όγκων (περίπου 5 × 5 × 5 mm) ελήφθησαν κατά τη διάγνωση, αμέσως καταψύχθηκαν, και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Όλοι οι ασθενείς έλαβαν εξωτερική ακτινοβολία 50 Gy στον πρωτογενή όγκο και κατ ‘επιλογήν περιοχών, 45 Gy στα υπόλοιπα λεκάνη, και επιπλέον 14 Gy σε παθολογικές λεμφαδένες. Αυτό ακολουθήθηκε από βραχυθεραπεία του 25 Gy. Ταυτόχρονη σισπλατίνη (40 mg /m

2) δόθηκε σε εβδομαδιαία βάση σε μέγιστο 6 μαθήματα ανάλογα με την ανοχή. Οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν σύμφωνα με τυποποιημένη διαδικασία, όπως περιγράφεται [25].

Κυτταροκαλλιέργεια

Οκτώ ανθρώπινου κολπικού καρκινικές κυτταρικές γραμμές από την American Type Culture Collection χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση υποξαιμία γονιδίων που αποκρίνονται ? HeLa, SW756, C-33 Α, C-4I, ME-180, ΗΤ-3, SiHa και CaSki. Οι κυτταρικές γραμμές επικυρώνονται από προφίλ STR /DNA χρησιμοποιώντας PowerPlex 21 (Promega, Madison, WI) με Eurofins Genomics (Ebersberg, Γερμανία). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 επωαστήρα σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) με Glutamax (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 100 U /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Sigma , St. Louis, ΜΟ) και 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Gibco). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε εξετάσεις ρουτίνας για

Mycoplasma

λοίμωξη. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 24 ώρες σε 10 cm πλαστικούς δίσκους (1-1.8 χ 10

6 κύτταρα να αποκτήσουν ~ 4 χ 10

6 κυττάρων μετά από 48 ώρες επώασης) πριν από την έκθεση σε υποξικό (0,2% O

2, 5% CO

2) ή ορθοξικές (95% αέρα, 5% συνθήκες για 24 ώρες στους 37 ° C CO

2). Ένας θάλαμος Invivo2200 (Ruskinn Technology Ltd., Bridgend, Ηνωμένο Βασίλειο) χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία της υποξίας.

Ανάλυση

Η γονιδιακή έκφραση

απομόνωση RNA.

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από το κελί γραμμές χρησιμοποιώντας RNeasy MINIKIT (Qiagen, Germantown, MD) και από τα κατεψυγμένα δείγματα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Life Technologies) (Illumina κοόρτη, RT-qPCR κοόρτη 2) ή miRNeasy MINIKIT (Qiagen) (RT-qPCR κοόρτης 1, ετερογένεια κοόρτη). Όλα τα κλινικά δείγματα είχαν καρκινικά κύτταρα περισσότερο από 50% σε αιματοξυλίνη και ηωσίνη τομές-χρωματισμένο, που προέρχεται από το κεντρικό τμήμα της βιοψίας. Εκτός από την ομάδα ετερογένεια, RNA από διαφορετικές βιοψίες του ίδιου όγκου ομαδοποιήθηκαν και η συγκέντρωση του RNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ). ακεραιότητα του RNA επιβεβαιώθηκε με Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Όλα τα δείγματα είχε αριθμό ακεραιότητα RNA (RIN) στο εύρος 3,6 έως 9,0 με μία μέση RIN 7,1.

Η γονιδιακή έκφραση με συστοιχίες χάντρα Illumina.

Για ολόκληρο το γονιδίωμα προφίλ γονιδιακής έκφρασης, Illumina χρησιμοποιήθηκαν συστοιχίες χάντρα 48K με περίπου 48000 μεταγραφές? HumanWG-6 v3 (ασθενείς, κυτταρικές σειρές) και HumanHT-12 V4 (κυτταρικές γραμμές) (Illumina Inc., San Diego, CA). Τα δεδομένα των ασθενών αποτελούν μέρος των συνόλων δεδομένων που χρησιμοποιούνται σε προηγούμενες εργασίες [25]. cRNA συνετέθη, επισημασμένα, και υβριδοποιήθηκε στους πίνακες. εκχύλιση σήματος και ποσοστημόριο ομαλοποίηση πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό που παρέχεται από τον κατασκευαστή (Illumina Inc.), και τα δεδομένα log2-μετασχηματισμένα χρησιμοποιήθηκαν στις αναλύσεις. Τα στοιχεία που κατατέθηκαν στο συλλογικό γονιδιακής έκφρασης (GEO) βάση δεδομένων (GSE75034).

Γονιδιακή έκφραση με RT-qPCR.

Για τις αναλύσεις RT-qPCR, η 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) εφαρμόστηκε, και οι καμπύλες ενίσχυσης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό v2.3 SDS (Applied Biosystems). Το

™ Kit δωρεάν-DNA (# AM1906, Ambion, Austin, TX) χρησιμοποιήθηκε για την αφαίρεση γονιδιακό DNA, σύμφωνα με την περιγραφή του κατασκευαστή. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με τη μεγάλης χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), η οποία περιλαμβάνει τυχαία εναύσματα, χρησιμοποιώντας 2,000 ng ϋΝάση RNA σε μία αντίδραση 20 μλ. 1 cDNA μl ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τον TaqMan Fast καθολική PCR Master Mix (2χ) και Custom TaqMan Array 96-Well Fast Πλάκες με ξηρά κάτω Δοκιμασίες TaqMan Gene Expression (Applied Biosystems) ή προσδιορισμούς TaqMan μονού σωλήνα και 96 φρεατίων Fast πλακών . Θερμοκυκλώσεως παράμετροι ήταν όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο συνήθειας Array, ή για δοκιμασίες μονού σωλήνα: 20 s στους 95 ° C (ενεργοποίηση ενζύμου), 40 θερμικούς κύκλους των 1 s στους 95 ° C (μετουσίωση) και 20 s στους 60 ° C ( ανόπτηση και επέκταση). Οι δοκιμασίες TaqMan για τα γονίδια αναφοράς υποψήφιες και τρία γονίδια υποξία που προκαλείται αξιολογηθεί σε αυτή τη μελέτη παρέχονται στον Πίνακα επιλέχθηκαν 2. Μόνο προ-αναπτυχθεί προσδιορισμοί απογεγραμμένων TaqMan. Για την αξιολόγηση των δοκιμασιών TaqMan, τα μεγέθη των προϊόντων PCR προσδιορίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα, χρησιμοποιώντας ένα ScreenTape D1000

® Station (Agilent Technologies). Για τα τρία επιλεγέντα γονίδια αναφοράς (βλέπε παρακάτω) και τα τρία γονίδια που προκαλείται από υποξία, οι PCR αποτελεσματικότητες προσδιορίσθηκαν από καμπύλες αραίωσης cDNA και εμφάνισε γραμμική αποδόσεις αντίδρασης (S1 Σχήμα).

Η

Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις διπλούν, και του κύκλου μέση ποσοτικοποίησης (C

q) για κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε στις αναλύσεις. Δείγματα με μέση C

Q & gt? 37 ή τυπική απόκλιση & gt? 0.4 αποκλείστηκαν. Μείον αντίστροφης μεταγραφάσης έλεγχοι ελέγχθηκαν για υπολειμματική γενωμικού DNA για όλες τις δοκιμασίες TaqMan και μόλυνση αξιολογήθηκε με μάρτυρες μη πρότυπο χωρίς RNA σε σύνθεση cDNA. Όλες οι αρνητικοί μάρτυρες είχαν απροσδιόριστο C

q. Το επίπεδο έκφρασης ενός γονιδίου στόχου αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική C

q-μέθοδο [26], ομαλοποιώντας τις

τιμές Q C του γονιδίου στόχου σε έναν παράγοντα κανονικοποίησης που υπολογίζεται ως ο μέσος όρος C

Q- τιμές των γονιδίων αναφοράς? ΔΟ

q, γονίδιο = C

q, γονίδιο- (C

q,

CHCHD1

+ C

q,

SRSF9

+ C

q ,

TMBIM6

) /3 για τα γονίδια αναφοράς που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη (βλέπε παρακάτω). & στατιστικές

Η geNorm [6] και NormFinder [7] χρησιμοποιήθηκαν

αλγορίθμων για να αξιολογηθεί η σταθερότητα των γονιδίων υποψήφιων αναφοράς. Ο αλγόριθμος geNorm βασίζεται στην αρχή ότι η αναλογία έκφραση δύο γονιδίων ιδανικό αναφοράς είναι ταυτόσημη σε όλα τα δείγματα. Για κάθε υποψήφιο, ένα μέτρο της σταθερότητας Μ υπολογίζεται ως ο μέσος όρος κατά ζεύγη παραλλαγή του γονιδίου με όλα τα άλλα υποψηφίους? δηλαδή η μέση τυπική απόκλιση των λόγων έκφρασης log2 μετασχηματισμένη μεταξύ των γονιδίων. Τα γονίδια με τα χαμηλότερα M-τιμές θεωρούνται ότι είναι πιο σταθερή. Τα γονίδια ανάλογα με τη σταδιακή αποκλεισμός των λιγότερο σταθερών υποψήφιος και νέος υπολογισμός των Μ-τιμές για τα υπόλοιπα γονίδια εκτελείται μέχρι να απομείνει τα δύο πιο σταθερές γονίδια. Για τον καθορισμό του αριθμού των γονιδίων αναφοράς να περιλαμβάνει για αξιόπιστη κανονικοποίηση, ανά ζεύγη διακύμανση μεταξύ δύο διαδοχικών παράγοντες κανονικοποίησης (V

n /n + 1) υπολογίστηκε για όλα τα δείγματα, και η τιμή αποκοπής για την ένταξη ενός επιπλέον γονιδίου ήταν ρυθμιστεί σε 0.15 [6]. NormFinder είναι ένα μοντέλο που βασίζεται σε προσέγγιση ANOVA, και χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της συνολικής μεταβολής του κάθε υποψηφίου γονιδίου και η διακύμανσή της σε όλες τις υποομάδες ασθενών, λαμβάνοντας υπόψη τόσο την ενδο- και διαφοροποιήσεις μεταξύ ομάδων. Οι εκτιμώμενες μεταβολές συνδυάζονται σε μια τιμή σταθερότητα για κάθε γονίδιο, όπου η χαμηλή τιμή δείχνει πιο σταθερή έκφραση [7].

Κατάταξη συσχέτισης Spearman χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση των ενώσεων μεταξύ συνεχείς μεταβλητές, χρησιμοποιήθηκε Mann-Whitney U test να συγκρίνει τις διαφορές στα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των ομάδων, και COX αναλογικών κινδύνων (PH) μονοπαραγοντική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η σχέση των γονιδίων υποψήφιος αναφορά στην κλινική έκβαση. Η κλινική καταληκτικό σημείο ήταν η ελεύθερη εξέλιξης επιβίωση (PFS) για την παρακολούθηση μέχρι πέντε χρόνια. PFS ορίστηκε ως ο χρόνος από τη διάγνωση έως το θάνατο από ασθένειες που σχετίζονται με ή πρώτη περίπτωση υποτροπής. Οι θάνατοι μέσα σε 2 χρόνια μετά την ένταξη θεωρήθηκαν ως σχετιζόμενες με τη νόσο, εκτός εάν είχε τεκμηριωθεί μια άλλη αιτία. Οι ασθενείς είχαν λογοκριθεί στο τελευταίο ραντεβού τους ή στα 5 χρόνια, και την κατάσταση εκτιμήθηκε σε 3 Οκτωβρίου 2014. Ένα μοντέλο που ανταγωνίζονται κινδύνου χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό αθροιστική επίπτωση της εξέλιξης της νόσου, με τον θάνατο από άλλα αίτια από τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ως ανταγωνιστικές εκδήλωση. Ένδεκα από τους 160 ασθενείς που συμπεριλήφθηκαν πέθαναν από άλλα αίτια, χωρίς να βιώνει υποτροπή κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης. Δεδομένου ότι το 1/3 περίπου των ασθενών εμφάνισαν υποτροπή, αθροιστικές καμπύλες συχνότητα συγκρίθηκαν μεταξύ 1/3 της κλάσης με την υψηλότερη έκφραση του γονιδίου και 2/3 με τη χαμηλότερη έκφραση. δοκιμή του Gray χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθούν οι διαφορές μεταξύ των καμπυλών. επίπεδο σημαντικότητας ήταν 5%, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά, και όλες οι τιμές P ήταν δύο όψεων.

Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση R [27] έκδοση 3.1.1. Για τις αναλύσεις geNorm, [28] εφαρμόστηκαν οι λειτουργίες στα πακέτα ReadqPCR και NormqPCR read.qPCR () και selectHKs (). Για το NormFinder αναλύει τη λειτουργία Normfinder () που παρέχονται από Μοριακής Διαγνωστικό Εργαστήριο, Τμήμα Μοριακής Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Aarhus Νοσοκομείο Skejby, η Δανία είχε χρησιμοποιηθεί, και οι αναλύσεις ανταγωνιστικών κινδύνων έγιναν με τη λειτουργία cuminc () στο πακέτο cmprsk [29].

Αποτελέσματα και Συζήτηση

η επιλογή των γονιδίων υποψηφίου αναφοράς από προφίλ έκφρασης σειρά που βασίζεται

για την αναγνώριση σταθερά εκφραζόμενα γονίδια σε δείγματα καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, η επιλογή των υποψηφίων περιορίστηκε σε γονίδια τα οποία έχουν προηγουμένως αναφερθεί ως γονίδια αναφοράς στη βιβλιογραφία [10,11,13,18,30-35], ως νέων υποψηφίων αναφοράς με βάση την μετα-ανάλυση των μεγάλης κλίμακας συνόλων μικροσυστοιχιών ή αλληλούχιση RNA δεδομένα [19-23], ή ευρίσκεται επί του TaqMan Express Plate Ανθρώπινα ενδογενή μάρτυρα (Applied Biosystems). Αυτό οδήγησε σε μια λίστα με 422 διαφορετικά γονίδια, για τις οποίες 410 ήταν παρόντες στη συστοιχία Illumina που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη (Σχήμα 1, S1 πίνακα), εκπροσωπούμενη από τους 631 διαφορετικούς ανιχνευτές.

Οι πιο πιθανοί υποψήφιοι μεταξύ των 410 γονίδια ταυτοποιήθηκαν με τη χρήση προφίλ έκφρασης array-based Illumina των 150 ασθενείς τραχηλικού καρκίνου και του τραχήλου της μήτρας οκτώ κυτταρικές γραμμές καρκίνου αναπτύσσονται υπό φυσιολογική οξυγόνωση και υποξία. Κατ ‘αρχάς, οι υποψήφιοι αποκλείστηκαν με βάση την ένωσή τους με απόκριση υποξίας στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ή με κλινικές παραμέτρους στην ομάδα των ασθενών. Γονίδια για τα οποία η έκφραση τουλάχιστον ενός ιχνηλάτη στην κλινική σύνολο δεδομένων συσχετίζεται με την υποξία σχετιζόμενη παράμετρο DCE-MRI A

Brix (n = 42) απομακρύνθηκαν, καθώς και γονίδια που ήταν περισσότερο από 1,5 φορές στα ανάντη ή μειωτικά υπό υποξία σε τουλάχιστον μία από τις κυτταρικές σειρές (S1 πίνακα). Επιπλέον, αποκλείστηκαν οι υποψήφιοι που δείχνουν μια συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης τους και ο όγκος του όγκου, το στάδιο, την κατάσταση των λεμφαδένων ή κλινική έκβαση σε 150 ασθενείς (S1 πίνακα). Οι αφαιρεθεί γονίδια που περιλαμβάνονται

GAPDH

,

HMBS

,

EEF1A1

,

ACTB

,

PGK1

,

RPLP0

και

TBP

, οι οποίες έχουν αναγνωριστεί ως κατάλληλα γονίδια αναφοράς σε προηγούμενες μελέτες του τραχήλου της μήτρας καρκινογένεσης [10-13,36,37], και

B2M

,

HPRT1

,

RPL11

,

RPL37A

,

ACTR3

, και

NDFIP1

, που έχουν βρεθεί να είναι κατάλληλο για μελέτες υποξίας με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου [18,30]. Εντελώς, 99 διαφορετικά γονίδια αντιπροσωπεύονται από 117 ανιχνευτές παρέμεινε ως υποψήφιοι αναφορά σε αυτό το στάδιο. Για να εξασφαλιστεί η ανίχνευση των γονιδίων αναφοράς σε δοκιμασίες RT-qPCR, μια περαιτέρω αποκλεισμός γονιδίων με βάση ένα πολύ χαμηλό επίπεδο έκφρασης (μέση έκφραση log2 των 150 ασθενείς & lt? 7) πραγματοποιήθηκε, μειώνοντας τον αριθμό αυτό σε 89 υποψηφίους που αντιπροσωπεύεται από 101 ανιχνευτές.

Εκτός από σταθερή έκφραση, το γονίδιο αναφοράς θα πρέπει ιδανικά να έχει μεταγραφής αφθονία παρόμοιο με τα γονίδια υπό έρευνα για την αύξηση της ευαισθησίας για την ανίχνευση μικρών αλλαγών γονιδιακή έκφραση [24]. Βρήκαμε ότι οι υποψήφιοι με το χαμηλότερο συντελεστή μεταβλητότητας (CV) ήταν γενικά εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα, μια παρατήρηση φαίνεται και από άλλους [24], ενώ οι περισσότεροι υποξία γονιδίων που ρυθμίζονται από την προηγούμενη εργασία μας [25] είχε ένα σχετικά χαμηλό επίπεδο έκφρασης ( τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μια τελική ομάδα γονιδίων που θα αξιολογηθούν από RT-qPCR επομένως επιλέγονται για να αντιπροσωπεύουν διαφορετικά επίπεδα έκφρασης εκτός από τη διατήρηση του CV όσο το δυνατόν χαμηλότερα. Οι υποψήφιοι έχουν επίσης επιλεγεί κατά τέτοιο τρόπο ώστε να εκπροσωπούνται διαφορετικές οδούς ή λειτουργικές κατηγορίες, προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί ο κίνδυνος της επιλογής συν-ρυθμιζόμενων γονιδίων [6]. Τέλος, η διαθεσιμότητα ενός κατάλληλου προσχεδιασμένη και επικυρωμένες TaqMan-δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε ως κριτήριο επιλογής. Το πάνελ των εννέα υποψηφίων που θα δοκιμαστεί σε προσδιορισμούς RT-qPCR παρατίθεται στον Πίνακα 1, και είχε CVs στην περιοχή από 0,01 έως 0,09 και η μέση επίπεδα έκφρασης log2 στην περιοχή από 7,4 έως 14,0 στις κλινικές σύνολο στοιχείων. Μεταξύ αυτών των γονιδίων,

GNB2L1

έχει χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν ως γονίδιο αναφοράς σε μελέτες υποξία του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου [18].

Προ-αξιολόγηση των 9 γονιδίων αναφοράς υποψήφιος με RT-qPCR

Για να διασφαλιστεί ότι οι υποψήφιοι μπορούσαν να ανιχνευθούν σωστά σε μία δοκιμασία TaqMan και ενδεχομένως περαιτέρω περιορισμό του πίνακα, ένα προ-αξιολόγηση των εννέα γονιδίων διεξήχθη σε 10 ασθενείς (RT-qPCR κοόρτης 1, Πίνακας 1, Σχήμα 1) . Οι δοκιμασίες TaqMan αξιολογήθηκαν πρώτα με ηλεκτροφόρηση πηκτής των PCR-προϊόντων από έναν ασθενή (σχήμα 2Α). Για όλους τους προσδιορισμούς, μια ισχυρή ζώνη του αναμενόμενου μεγέθους παρατηρήθηκε. Ωστόσο, για

SOD1

πρόσθετη ασθενέστερη ζώνη μικρότερου μεγέθους που μπορεί να αντιπροσωπεύουν εκκινητή διμερή εμφανίστηκε επίσης, υποδεικνύοντας ότι η δοκιμασία δεν λειτουργούσε βέλτιστο τρόπο.

SOD1

, επομένως, αποκλείστηκε στις περαιτέρω αναλύσεις.

ηλεκτροφόρηση (Α) Γέλη των προϊόντων της PCR για γονίδια αναφοράς εννέα υποψήφιες σε έναν ασθενή. Κάτω (25 bp) και άνω είναι (1500 bp) των δεικτών εμφανίζονται σε κάθε λωρίδα. σύμβολα γονίδιο υποδεικνύονται. Το σχήμα είναι μια σύνθετη εικόνα όπου

CHCHD1

είναι από μια ξεχωριστή εικόνα και τη σκάλα από κάθε εικόνα εμφανίζεται. Οι κάθετες γραμμές δείχνουν περικοπή της εικόνας ή διαφορετικές εικόνες. (Β) Κουτί οικόπεδα της αριθμητικής μέσα διπλούν C

q-τιμές για τα γονίδια αναφοράς οκτώ υποψήφια σε 10 ασθενείς. Κουτιά δείχνουν το διατεταρτημοριακό εύρος (IQR) με διάμεση τιμή ως το μαύρο κέντρο μπαρ. Επέκταση κάθετες μπάρες αντιπροσωπεύει 1,5 x IQR κάτω από το πρώτο τεταρτημόριο και 1,5 x IQR πάνω από το τρίτο τεταρτημόριο, και οι κύκλοι σηματοδοτούν υποψία ακραίες τιμές. (Γ) geNorm ανάλυση οκτώ υποψήφια γονίδια αναφοράς. σταθερότητας μέση έκφραση (Μ) των υπόλοιπων υποψηφίων μετά την σταδιακή απομάκρυνση των λιγότερο σταθερό γονίδιο φαίνεται. Το λιγότερο σταθερό γονίδιο σε κάθε βήμα υποδεικνύεται παρακάτω. (D) αξία Σταθερότητα καθένα από τα οκτώ γονίδια υποψήφια αναφοράς από την ανάλυση NormFinder, όπου μια χαμηλή τιμή υποδεικνύει πιο σταθερή έκφραση.

Η

Οι οκτώ υπόλοιπα υποψήφιοι ανιχνεύθηκαν με C

τιμές Q που κυμαίνονται 19,1 έως 31,1, όπου

GNB2L1

και

TMBIM6

ήταν το πιο άφθονο και

RPL27A

λιγότερο άφθονα μεταγραφή (Σχήμα 2Β). geNorm και NormFinder αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν για την κατάταξη των γονιδίων, σύμφωνα με τη συνολική σταθερότητα στα δέκα ασθενείς (Σχήμα 2C και 2D). Το μέσο M σταθερότητα έκφραση από την ανάλυση geNorm κυμαίνονταν από 0,72 χρησιμοποιώντας όλα τα οκτώ γονίδια έως 0,4 για τις δύο πιο σταθερές υποψήφιοι (Σχ 2C). Η κατάταξη των γονιδίων στην ανάλυση NormFinder ήταν σχεδόν ταυτόσημη με την κατάταξη geNorm (Σχήμα 2D). Για μια πιο λεπτομερή ανάλυση της σταθερότητας, συμπεριλαμβανομένης της αξιολόγησης της σταθερότητας σε όλες τις υποομάδες ασθενών, και ο προσδιορισμός του βέλτιστου αριθμού των γονιδίων αναφοράς να περιλαμβάνει για εξομάλυνση, οι πέντε πιο σταθερά εκφραζόμενα γονίδια, όπως καθορίζεται από τις δύο μεθόδους, δηλαδή

CHCHD1

,

GNB2L1

,

IPO8

,

SRSF9

και

TMBIM6

, εξετάστηκαν περαιτέρω.

Προσδιορισμός μιας RT-qPCR παράγοντα κανονικοποίησης

Οι υπόλοιπες πέντε υποψήφιοι αξιολογήθηκαν με ανάλυση RT-qPCR σε 74 ασθενείς (RT-qPCR ομάδα 2, Πίνακας 1, Σχήμα 1), με αποτέλεσμα C

q-τιμές μεταξύ 17,9 και 25,4 ( Σχήμα 3Α). geNorm και αναλύει NormFinder έδειξαν παρόμοια κατάταξη των γονιδίων σύμφωνα με την σταθερότητα κατά μήκος των ασθενών (Σχήμα 3Β και 3C). Από την ανάλυση geNorm, το μέσο σταθερότητας έκφραση Μ κυμαίνονταν από 0,57 χρησιμοποιώντας όλα τα πέντε γονίδια στο 0,45 με τη χρήση των δύο πιο σταθερές υποψηφίων.

(Α) Κουτί οικόπεδα της αριθμητικής μέσα διπλούν C

q-τιμές για πέντε υποψήφια γονίδια αναφοράς σε 74 ασθενείς. Κουτιά δείχνουν το διατεταρτημοριακό εύρος (IQR) με διάμεση τιμή ως το μαύρο κέντρο μπαρ. Επέκταση κάθετες μπάρες αντιπροσωπεύουν 1,5 x IQR κάτω από το πρώτο τεταρτημόριο και 1,5 x IQR πάνω από το τρίτο τεταρτημόριο, και οι κύκλοι σηματοδοτούν υποψία ακραίες τιμές. (Β) Ανάλυση geNorm πέντε υποψήφια γονίδια αναφοράς. σταθερότητας μέση έκφραση (Μ) των υπόλοιπων υποψηφίων μετά την σταδιακή απομάκρυνση των λιγότερο σταθερό γονίδιο φαίνεται. Το λιγότερο σταθερό γονίδιο σε κάθε βήμα υποδεικνύεται παρακάτω. τιμή (C) Σταθερότητα του καθενός από τα πέντε γονίδια υποψήφια αναφοράς από την ανάλυση NormFinder, όπου μια χαμηλή τιμή υποδεικνύει πιο σταθερή έκφραση. ανάλυση (Δ) geNorm ζεύγη παραλλαγή (V) για να προσδιοριστεί η επαρκής αριθμός γονιδίων αναφοράς στον παράγοντα κανονικοποίησης. Κατά ζεύγη παραλλαγή για δύο διαδοχικές παράγοντες ομαλοποίηση (V

n /n + 1) από τα δύο πιο σταθερές γονίδια σε όλους τους πέντε γονίδια. Η οριζόντια γραμμή δείχνει την τιμή αποκοπής (V = 0,15), για την οποία η υπαγωγή των περισσότερων γονιδίων δεν έχει σημαντική επίδραση στον παράγοντα κανονικοποίησης.

Η

Για να αξιολογηθεί η επαρκής αριθμός των γονιδίων που απαιτούνται για την αξιόπιστη εξομάλυνση , μια κλιμακωτή διαδικασία χρησιμοποιήθηκε με τη συμπερίληψη των γονιδίων διαδοχικά εντός του παράγοντα κανονικοποίησης σύμφωνα με την αύξηση της M-τιμές τους μέχρι να επιτευχθεί σημαντική συνεισφορά. Η ζεύγη διακύμανση μεταξύ των παραγόντων που την ομαλοποίηση με τρία και τέσσερα γονίδια ήταν κάτω από την τιμή αποκοπής (V

3/4 & lt? 0.15), υποδεικνύοντας ότι οι τρεις υποψήφιοι με χαμηλότερη Μ-αξίας,

CHCHD1

,

SRSF9

και

TMBIM6

, είναι επαρκή για την κανονικοποίηση (Σχήμα 3D). Οι υποψήφιοι βρέθηκαν επίσης να είναι οι τρεις πιο σταθερές γονίδια στην ανάλυση NormFinder (Σχήμα 3C). Επιπλέον, το μέσο Μ-αξία τους ήταν 0,49 (Σχήμα 3Β), και κάτω από το εύρος των 0,5-1 που θα πρέπει να απαιτείται κατά την αξιολόγηση των γονιδίων αναφοράς σε βιοψίες καρκίνου [38].

Εμείς αξιολογηθεί περαιτέρω η σταθερότητα των πέντε υποψήφιοι σε όλες τις υποομάδες ασθενών χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο NormFinder (Σχήμα 4). Σε αυτή την ανάλυση,

CHCHD1

,

SRSF9

και

TMBIM6

εμφανίστηκε επίσης ως βέλτιστη γονίδια αναφοράς. Αυτοί ήταν οι πιο σταθερές υποψηφίους σε όλη ασθενείς με σταδίου χαμηλή και υψηλή όγκου ή όγκου και με και χωρίς υποτροπή, καθώς και για τους ασθενείς με και χωρίς τη συμμετοχή λεμφαδένων κατά τη διάγνωση οι τρεις υποψήφιοι ήταν μεταξύ των τεσσάρων πιο σταθερή γονίδια. Επιπλέον, στην ανάλυση της κατάστασης υποξίας όγκου,

CHCHD1

,

SRSF9

και

TMBIM6

ήταν οι πιο σταθεροί υποψήφιοι σε όλη ασθενείς με υψηλές και χαμηλές A

Brix ( Σχήμα 4). Για την επικύρωση περαιτέρω τη σταθερότητα αυτών των τριών γονιδίων, ανάλυση geNorm σε δεδομένα RT-qPCR από νορμοξικές και υποξικές δείγματα από οκτώ τραχήλου κυτταρικές γραμμές καρκίνου εκτελέσθηκε. Η μέση M-τιμής για τα τρία γονίδια ήταν 0,79, υποδεικνύοντας σταθερή έκφραση σε όλη ορθοξικές και συνθήκες υποξίας πολιτισμού [38]. Έτσι,

CHCHD1

,

SRSF9

και

TMBIM6

φάνηκε να είναι καλά προσαρμοσμένη για τον υπολογισμό ενός παράγοντα κανονικοποίησης και επιλέχθηκαν για επικύρωση σε μελέτες της γονιδιακής έκφρασης που προκαλείται από υποξία (σχ 1).

NormFinder αναλύσεις της σταθερότητας των πέντε υποψήφια γονίδια αναφοράς σε όλες τις υποομάδες ασθενών. Οι υποομάδες που αξιολογήθηκαν ήταν: χαμηλή (n = 49) και υψηλό (n = 25) το στάδιο του όγκου (FIGO 1Β-2Β έναντι 3Α-4Α), με (n = 32) και χωρίς (n = 42) λεμφαδένας (LN) εμπλοκή κατά τη διάγνωση, παρακάτω (n = 36) και άνω (n = 36) διάμεση όγκο του όγκου του 44,6 cm

3, με (n = 32) ή χωρίς (n = 42) επανάληψη της θεραπείας σε πέντε χρόνια, και διαφορετικές κατάσταση υποξίας αντιπροσωπεύεται από κάτω (n = 16) και άνω (n = 16), ένα μεσαίο A

Brix.

η

Επικύρωση

CHCHD1

,

SRSF9

και

TMBIM6

ως γονίδια αναφοράς σε μελέτες υποξία

RT-qPCR αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν για τρία γονίδια που έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν να επάγεται από υποξία σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές γραμμές και συνδέεται με ένα

Brix στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [25], δηλαδή

DDIT3

,

ERO1A

και

STC2

. Η ομάδα RT-qPCR 2 από 74 ασθενείς, για τους οποίους είχαμε δεδομένα έκφρασης Illumina, χρησιμοποιήθηκε. ηλεκτροφόρηση πηκτής των PCR προϊόντων έδειξε ότι οι προσδιορισμοί TaqMan λειτούργησε σωστά, δημιουργώντας ένα ενιαίο ειδικό προϊόν του αναμενόμενου μεγέθους για καθένα από τα τρία γονίδια (Σχήμα 5Α). Τα επίπεδα έκφρασης του

DDIT3

,

ERO1A

και

STC2

υπολογίστηκαν με ομαλοποίηση των

q τιμές C με το μέσο όρο C

q-αξίας

CHCHD1

,

SRSF9

και

TMBIM

6. Το

τιμή Q -ΔC δείχθηκε ότι σχετίζεται ισχυρά με τα δεδομένα Illumina και για τα τρία γονίδια (Ρ & lt? 0,001? Ρ από 0,78 έως 0,83). Περαιτέρω, σημαντικές αρνητικές συσχετίσεις μεταξύ -ΔC

q και Α

Brix βρέθηκαν, σε συμφωνία με τις συσχετίσεις που λαμβάνονται με δεδομένα Illumina (Πίνακας 3). Κατά συνέπεια, οι ταυτοποιημένα γονίδια αναφοράς φαίνεται κατάλληλο για τη μέτρηση της υποξίας που επάγεται αλλαγές στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

(Α) Gel ηλεκτροφόρηση των προϊόντων PCR για τα τρία γονίδια που προκαλείται από υποξία

DDIT3

,

ERO1A

, και

STC2

. Κάτω (25 bp) και άνω είναι (1500 bp) των δεικτών εμφανίζονται σε κάθε λωρίδα. Η εικόνα προέρχεται από μία εικόνα, και κάθετες γραμμές δείχνουν την περικοπή της εικόνας. Αθροιστική επίπτωση της εξέλιξης της νόσου για 74 ασθενείς χωρίζονται σε χαμηλά επίπεδα (& lt? 67% εκατοστημόριο) και υψηλά (≥ 67% εκατοστημόριο)

STC2

έκφρασης με βάση τα δεδομένα της έκφρασης Illumina (Β) και (Γ) δεδομένα RT-qPCR κανονικοποιημένη με

CHCHD1

,

SRSF9

και

TMBIM

6 (-ΔC

q). 60 μήνες υποτροπή πιθανότητα, οι Ρ-τιμές από δοκιμή και τον αριθμό των ασθενών που διατρέχουν κίνδυνο Γκρέι ανέφερε. Θάνατος από άλλες αιτίες από καρκίνο του τραχήλου συμπεριλήφθηκε ως ένα ανταγωνιστικό γεγονός (η = 5). (D) μεταβλητότητα εντός του όγκου σε

STC2

επίπεδα έκφρασης μετρήθηκαν με RT-qPCR σε οκτώ ανεξάρτητους όγκους με 2-4 βιοψίες ανά όγκο, δηλαδή συνολικά 22 βιοψίες. Μέτρηση της

STC2

ήταν ανεπιτυχής για μία από τις βιοψίες για όγκο 4.

STC2

δεδομένα κανονικοποιούνται με

CHCHD1

,

SRSF9

και

TMBIM

6. Τα δείγματα ταξινομήθηκαν σε μία ομάδα έκφραση υψηλού και χαμηλού χρησιμοποιώντας το ίδιο cut-off, όπως στο Σχ 5C (δηλ -ΔC

q = -4,46). Διαφορετικές βιοψίες από τον ίδιο όγκο έχουν απεικονίζονται με το ίδιο χρώμα για να διευκολύνει την ερμηνεία του σχήματος.

Η

Δεδομένου ότι η υποξία είναι γνωστό ότι σχετίζονται με την επιθετικότητα του καρκίνου του τραχήλου [3-5] , αξιολογήσαμε την προγνωστική αξία του

DDIT3

,

ERO1A

και

STC2

έκφραση στα σύνολα δεδομένων Illumina και RT-qPCR. Με βάση τα στοιχεία Illumina των 150 ασθενών, μια στατιστικά σημαντική αύξηση του κινδύνου εξέλιξης της νόσου βρέθηκε για τους ασθενείς με την υψηλότερη έκφραση του

DDIT3

ή

STC2

σε σύγκριση με τους άλλους (P = 0,047 και Ρ = 0.015, αντίστοιχα, του Gray δοκιμή? δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), ενώ

ERO1A

έκφρασης που δεν συνδέονται με το αποτέλεσμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στην ομάδα RT-qPCR 2 από 74 ασθενείς, η ισχυρότερη συσχέτιση με αποτέλεσμα βρέθηκε για

STC2

και στα δύο σύνολα δεδομένων, καθώς και για τα δεδομένα RT-qPCR η σχέση ήταν στατιστικά σημαντική (Σχήμα 5Β και 5Γ). Αυτή η περαιτέρω επικυρωθεί η καταλληλότητα του

CHCHD1

,

SRSF9

και

TMBIM

6 ως γονίδια αναφορά σε μελέτες υποξίας, και πρότεινε ότι οι υψηλές

STC2

έκφραση είναι που συνδέονται με την αποτυχία χημειοραδιοθεραπεία, σύμφωνα με μια προηγούμενη μελέτη για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [39].