Αφηρημένο

Micro RNAs (miRNAs) είναι σημαντικοί ρυθμιστές εμπλέκονται σε διάφορες φυσικές και παθολογικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Η οικογένεια miRNA-302 έχει τεκμηριωθεί ότι παίζουν κρίσιμο ρόλο στην καρκινογένεση. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο των miRNA-302A στον καρκίνο του παχέος εντέρου. έκφραση miRNA-302A ανιχνεύθηκε σε 44 παχέος εντέρου καρκινικούς ιστούς και 10 φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου, και κλινικοπαθολογοανατομικές σημασία τους αναλύθηκε. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου πραγματοποιήθηκαν σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα που εξέφραζαν σταθερά miRNA-302A. Το γονίδιο στόχος των miRNA-302A και κατάντη της οδού ερευνήθηκαν περαιτέρω. Σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς κόλου, η έκφραση miRNA-302A ήταν κατιούσα ρύθμιση σε ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου. Η υπερέκφραση του miRNA-302A που επάγεται G1 /S διακοπή του κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα κόλου, και κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου και τα δύο

in vitro

και

in vivo

. Επιπλέον, miRNA-302A ανέστειλε

ΑΚΤ

έκφραση με απευθείας σύνδεση με 3 ‘αμετάφραστη περιοχή του, με αποτέλεσμα μεταγενέστερες τροποποιήσεις του

ΑΚΤ-ΟδΚ3β-κυκλίνης D1

οδού. Αυτά τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν miRNA-302A ως καταστολέας όγκων σε καρκίνο του παχέος εντέρου, γεγονός που υποδηλώνει ότι miRNA-302A μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένας πιθανός στόχος για θεραπευτική παρέμβαση σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Sun S, Zhang G, Wu Ζ, Shi W, Γιανγκ Β, Li Υ (2014)

microRNA-302a

Λειτουργεί ως ένα Ογκοκατασταλτικής Υποθετικά στον καρκίνο του παχέος εντέρου από Στόχευση

Akt

. PLoS ONE 9 (12): e115980. doi: 10.1371 /journal.pone.0115980

Επιμέλεια: Chun-Ming Wong, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 15 Σεπτεμβρίου, 2014? Αποδεκτές: 2 του Δεκέμβρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 26 Δεκ 2014

Copyright: © 2014 Sun et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Οι κλινικοπαθολογοανατομικών λειτουργίες δεν είναι διαθέσιμες στο κοινό, αλλά μπορούν να διατεθούν κατόπιν αιτήματος, στην Αντίστοιχες συγγραφέα. Όλα τα δεδομένα που απαιτούνται για την αναπαραγωγή της μελέτης είναι παρόντες στο χαρτί

Χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία χρηματοδότηση ή υποστήριξη στην έκθεση

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Σύμφωνα με το Αρχείο καρκίνου Ετήσια Έκθεση Κινέζικα (2012), του παχέος εντέρου /ορθού καρκίνος έχει γίνει η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η δεύτερη και η τέταρτη κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο στις γυναίκες και των ανδρών, αντίστοιχα, στην Κίνα [1]. Στην πραγματικότητα, ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ένας από τους συχνότερους καρκίνους παγκοσμίως, αντιπροσωπεύοντας περίπου το 9% των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο [2], ως επί το πλείστον οφείλεται σε μεταστατική εξέλιξη [3]. Αυτό απαιτεί τον εντοπισμό advanced μοριακών δεικτών για τη διάγνωση η οποία θα βοηθήσει στη έγκαιρη διάγνωση και πρόληψη του μεταστατική εξέλιξη σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Χειρουργική επέμβαση παραμένει η θεραπεία επιλογής για τον καρκίνο του παχέος εντέρου? αλλά από αργά, μια πιο πολυδιάστατη προσέγγιση που ενσωματώνει εισαγωγική χημειοθεραπεία έχει γίνει το σήμα κατατεθέν της θεραπείας [4]. Αυτό ίσως να μην μπορεί να τονιστεί αρκετά αν και η ανάγκη να παρακολουθείται η ανταπόκριση του όγκου στη θεραπεία, προκειμένου για την επιλογή των καλύτερων υποψηφίων για τη χειρουργική επέμβαση για να εξασφαλίσει θετικά αποτελέσματα, και εκεί έγκειται η ανάγκη να κατανοήσουμε την υποκείμενη παθολογική μηχανισμό της εμφάνισης και εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα κρίσιμα γεγονότα που ελέγχουν την όλη διαδικασία του παχέος εντέρου μετάστασης του καρκίνου είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστη.

Growing στοιχεία δείχνουν ότι η microRNAs (miRNAs), ένα είδος ενδογενών, μικρά RNAs μη κωδικοποιητική, συμμετέχουν σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες. Μέσα από συγκεκριμένα δεσμευτικά και διάσπαση mRNAs ή αναστέλλοντας τη μετάφρασή τους [5], miRNAs λειτουργία είτε ως ογκογονίδια ή καταστολείς των όγκων [6].

Η οικογένεια miRNA-302 εντοπίστηκε για πρώτη φορά σε ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (βλαστοκύτταρα) και της ανθρώπινης εμβρυϊκά κύτταρα καρκινώματος το 2004. Από τότε, διάφορες μελέτες για την οικογένεια miRNA-302 έχουν επικεντρωθεί σε δυνητικό ρόλο της στην reprograming σωματικά κύτταρα σε πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα, καθώς και εμβρυϊκών αυτο-ανανέωση [7]. Διάφοροι παράγοντες μεταγραφής που εκφράζονται νωρίς στην ανάπτυξη του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων και τη συντήρηση, όπως

Oct4

,

Sox2

, και

Nanog

, βρέθηκαν απαραίτητα για την μεταγραφική ρύθμιση του η οικογένεια miRNA-302 [8]. Είναι ενδιαφέρον, Fareh et al. έδειξαν ότι σταθερή έκφραση των miRNA-302 ήταν σε θέση να προκαλέσουν απώλεια

Oct4

,

Sox2

, και

Nanog

[9]. Ο ρόλος των miRNA-302 στην ογκογένεση έχει συζητηθεί πρόσφατα, όπως έχουν αντικρουόμενα συμπεράσματα έχουν συνταχθεί από διαφορετικές ερευνητικές ομάδες. Για παράδειγμα, ενδογενείς miRNA-302 δεν ανιχνεύθηκε σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα, και η εκτοπική έκφραση του miRNA-302 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και το σχηματισμό όγκων [10]. Σε αντίθεση, η διαμόλυνση του miRNA-302b σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου ως αποτέλεσμα μια αύξηση στην βλαστική ικανότητα του CD133 + ΗΤ 29 κυττάρων

in vitro

[11]. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν μελέτες που έχουν διεξαχθεί για να διερευνηθεί ο πιθανός ρόλος των miRNA-302 σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου ή /και στην παθογένεια του καρκίνου του παχέος εντέρου σε μοντέλα ξένου μοσχεύματος, η οποία ήταν ο κύριος στόχος της παρούσας μελέτης.

υλικά και Μέθοδοι

τα δείγματα ασθενών

ιστό καρκίνου του παχέος εντέρου και καλοήθη ιστό του παχέος εντέρου ελήφθησαν από την τράπεζα ιστού στο Γενικό Νοσοκομείο του Απελευθερωτικού Στρατού του Λαού. Κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά αυτών των ασθενών είχαν ανακτηθεί από τη βάση δεδομένων του Τμήματος Ογκολογίας. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Έρευνας κριτική Θεσμικών στο Γενικό Νοσοκομείο της Λαϊκός Απελευθερωτικός Στρατός και υπέγραψε πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη. Όλες οι διαδικασίες έγιναν σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι και τις σχετικές πολιτικές στην Κίνα.

καλλιέργειας κυττάρων

Ανθρώπινο κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου, HCT8 και HCT116 και τα ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα 293Τ ( ΗΕΚ293Τ) αγοράστηκαν από την Σαγκάη Bioleaf Biotech Co., Ltd (Σαγκάη, Κίνα). HCT8, HCT116, και ΗΕΚ293Τ κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2.

RNA, εκχύλιση miRNA, και ποσοτική πραγματικού χρόνου

αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Ολικό RNA απομονώθηκε από καλλιεργημένα κύτταρα και καρκινικά ιστούς χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ. Ο πρώτος κλάδος cDNA συντίθεται χρησιμοποιώντας τη σύνθεση RevertAid First Strand cDNA Kit (Technology Life, Carlsbad, CA), το οποίο στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), μαζί με προς τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές και το Power SYBR Green PCR κύριο Μείγμα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για το

ΑΚΤ

επίπεδα μεταγραφής. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής:

ΑΚΤ

-forward: GGGTTTCTCCCAGGAGGTTT, αντίστροφη: GTCCATGGTGTTCCTACCCA? β-ακτίνης προς τα εμπρός: ACCGAGCGCGGCTACAG, αντίστροφη: CTTAATGTCACGCACGATTTCC. Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, miRNA από ιστούς και κύτταρα εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης mirVana miRNA (Technology Life, Carlsbad, CA), και τα επίπεδα έκφρασης του miRNA-302A ανιχνεύθηκαν με προσδιορισμούς TaqMan miRNA (τεχνολογία Life, Carlsbad, CA) , με τη χρήση U6 μικρού πυρηνικού RNA ως ένας εσωτερικός έλεγχος.

Vector κατασκευή, φακοϊό παραγωγή, και σταθερή επιμόλυνση

Η ώριμη αλληλουχία HSA-miRNA-302A συντέθηκε και εισήχθη εντός του φορέα PLKO.3G για την παραγωγή PLKO.3G-miR-302a. Ο φορέας αναφοράς λουσιφεράσης-3 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR) παρήχθη μέσω υποκλωνοποίηση του

ΑΚΤ

3’UTR, το οποίο φέρει μία υποθετική θέση δέσμευσης miRNA-302A σε φορέα MT01. Όλες οι κατασκευασμένοι φορείς επαληθεύτηκαν με ανάλυση αλληλουχίας. PLKO.3G-miR-302A αναμιγνύεται με psPAX2 και PMD2-G διαμολύνθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, φακοϊό συλλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει HCT8 και HCT116 κύτταρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα κατατάσσονται σύμφωνα με κυτταρομετρία ροής (Beckman Coulter, Brea, CA) για τη δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών που εκφράζουν ιδιοσυστατικά miRNA-302A (HCT8-302a και HCT116-302a κύτταρα).

δοκιμασίες λουσιφεράσης

Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας 50 μι ρυθμιστικού διαλύματος λύσης παθητική. Στη συνέχεια, ένας προσδιορισμός διπλής λουσιφεράσης εκτελέστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega, Madison, WI). Η αναλογία πυγολαμπίδας να Renilla δραστικότητα λουσιφεράσης χρησιμοποιήθηκε για να εκφράσει λουσιφεράση δραστηριότητες. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD).

συγκομιδή πρωτεϊνών και δυτική

κηλίδα

Σύνολο πρωτεΐνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ CelLytic εκχύλισης (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης και, στη συνέχεια, ποσοτικοποιείται με τη χρήση του BCA Protein Assay Reagent kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά το διαχωρισμό πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλο θειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου, η πρωτεΐνη μεταφέρθηκε σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο και στη συνέχεια δεσμεύθηκαν σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα. Χρησιμοποιώντας τα πρωτογενή αντισώματα και αντι-κουνελιού συνδεδεμένη με υπεροξειδάση (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, ΤΧ) ως δεύτερο αντίσωμα, οι πρωτεΐνες-στόχους ανιχνεύθηκαν και, στη συνέχεια, οπτικοποιούνται χρησιμοποιώντας το ECL Plus System Blotting Western (Thermo Fisher Scientific , Waltham, ΜΑ). Τα στυπώματα απογυμνώνεται και διερευνήθηκαν με αντίσωμα α-β-ακτίνης για να επιβεβαιώσει ισοδύναμη φόρτωση. Τα πρωτογενή αντισώματα περιλαμβάνονται τα εξής: AKT (1:1000), ΟδΚ3β (1:500), κυκλίνη D1 (1:1000), PI3K (1:1000), PTEN (1:500) (Cell Signaling Technology, Boston, MA ) και β-ακτίνη (1:2000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, ΤΧ).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου δοκιμασίες

CCK-8 και Edu προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν για την ανίχνευση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων . Εν συντομία, CCK-8 δοκιμασίες διεξήχθησαν ως ακολούθως: κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα σε μια συγκέντρωση 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά προσκόλληση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο αναμιγνύεται με CCK-8 (10:01) (Dojindo, Σαγκάη, Κίνα) για 2 ώρες, πριν από την απορρόφηση μετρήθηκε με μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών στα 450 nm. Για τις δοκιμασίες edu, τα κύτταρα επωάστηκαν σε διάλυμα edu (1:5000) για 2 ώρες, στη συνέχεια συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το κινητό-Light edu Apollo 643 In vitro Kit Flow Cytometry (Ribobio, Guangzhou, Κίνα), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής

Μια δοκιμασία κυτταρικού κύκλου εκτελέστηκε επίσης χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής:. Συντομία, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 75% ψυχρά αιθανόλη όλη τη νύκτα, και στη συνέχεια πλένονται με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό. Στη συνέχεια, ιωδιούχο προπίδιο (50 μg /mL) προστέθηκε στα κύτταρα για χρώση ΟΝΑ πριν την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Απομονωμένα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκες 60 mm σε μία συγκέντρωση 500 κύτταρα /φρεάτιο και στη συνέχεια επωάστηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C. Είκοσι ημέρες αργότερα, τα κύτταρα βάφτηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες επί 30 λεπτά. Οι αριθμοί των αποικιών σε κάθε πλάκα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο.

In vivo

ογκογονικότητα

Ο PLKO.3G-SCR-επιμολυσμένα κύτταρα HCT8 (κύτταρα HCT-8-Scr ) και τα κύτταρα HCT116-302a εγχύθηκαν υποδορίως σε πλευρό είτε οπίσθιο του ίδιου 4-6 εβδομάδων αρσενικών γυμνών ποντικών. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε και το βάρος όγκου μετρήθηκε μετά τη θυσία την ημέρα 40. Οι όγκοι στη συνέχεια χωρίζεται σε δύο μέρη, κάθε μέρος σταθεροποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη ή διατηρημένα σε -80 ° C. Τα πειράματα σε ζώα έγιναν με την έγκριση της Επιτροπής Δεοντολογίας Ζώων Σπουδών του Γενικού Νοσοκομείου Λαϊκός Απελευθερωτικός Στρατός.

Η ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC) χρώση των δειγμάτων σε παραφίνη ενσωματωμένο διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Εν συντομία, κουνελιού αντι-ΑΚΤ και αντισώματος αντι-ποντικού /κουνελιού υπεροξειδάσης αρμορακίας-επισημασμένου αντισώματος (Santa Cruz Biotechnology Co, Ltd, Shanghai, China) χρησιμοποιήθηκαν ως το πρωτεύον και το δεύτερο αντίσωμα, αντιστοίχως.

Στατιστική αναλύει

Η διαφορά μεταξύ συνεχείς μεταβλητές αναλύθηκαν με τη χρήση t-test ή ανάλυση διασποράς του φοιτητή. Δύο όψεων P-τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS έκδοση 20.0 (IBM Corporation, Νέα Υόρκη).

Αποτελέσματα

έκφραση miRNA-302A καταστέλλεται στο παχύ έντερο καρκινικούς ιστούς

καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου αποκτήθηκαν από συνολικά 44 άνδρες ασθενείς με μέσο όρο ηλικίας 67 έτη (εύρος, 49 έως 77 ετών) με νεοδιαγνωσμένο, παθολογικά επιβεβαίωσε τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Όλοι οι ασθενείς είχαν λάβει χειρουργική εκτομή. Παθολογικά επιβεβαίωσε φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου αποκτήθηκαν από 10 άνδρες ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης που είχαν λάβει ριζική κυστεκτομή.

Διαπιστώσαμε επίπεδα έκφρασης miRNA-302A σε 44 ιστούς του παχέος εντέρου και 10 φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου και διαπίστωσε ότι, σε σύγκριση με την κανονική του παχέος εντέρου ιστούς, καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου εξέφρασαν χαμηλότερα επίπεδα miRNA-302A (Εικ. 1Α). Επίσης, αναλύσαμε τη σχέση μεταξύ των επιπέδων miRNA-302A και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ επιπέδων miRNA-302A και την ηλικία ή το κλινικό στάδιο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

έκφραση (Α) miRNA-302A ήταν μειωτικά σε ιστό καρκίνου του κόλου σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό κόλου. (Β) Χαμηλά επίπεδα έκφρασης miRNA-302A ανιχνεύθηκαν σε τέσσερεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, HCT8, HCT116, ΗΤ29, και Caco2. (Γ) Υψηλά επίπεδα έκφρασης miRNA-302A ανιχνεύθηκαν σε HCT8 και καρκινικά κύτταρα HCT116 του κόλου που εκφράζουν σταθερά miRNA-302A (* Ρ & lt? 0,05)

Η

Η υπερέκφραση του miRNA-302A αναστέλλει κόλου ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. in vitro και in vivo

Για να διερευνηθεί η λειτουργία του miRNA-302A στον καρκίνο του παχέος εντέρου, μετρήσαμε την έκφραση του miRNA-302A σε τέσσερις ανθρώπινου καρκίνου κόλου κυτταρικές γραμμές (HCT8, HCT116, ΗΤ29, και Caco2) με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, υπήρξε χαμηλή έκφραση του miRNA-302A και στις τέσσερις κυτταρικές γραμμές. Επειδή Πιθανολογείται ότι η υπερέκφραση του miRNA-302A μπορεί να αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου, εμείς σταθερώς υπερεκφράζεται miRNA-302A σε HCT8 και HCT116 κύτταρα (όπως ονομάζεται HCT8-302a και κυττάρων HCT116-302a), γεγονός που επιβεβαιώθηκε με ποσοτική αντίστροφης μεταγραφάσης (qRT ) -PCR (Εικ. 1 C).

Οι CCK-8, edu, και προσδιορισμούς σχηματισμού αποικιών διεξήχθησαν για να εξεταστεί αν miRNA-302A υπερέκφραση επηρεάζονται πολλαπλασιασμό κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου

in vitro

. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, υπήρχε ένα σημαντικά χαμηλότερο (Ρ & lt? 0,05) ρυθμός ανάπτυξης στην HCT8-302a και HCT116-302a κύτταρα σε σύγκριση με τους ελέγχους. Οι αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι τα ποσοστά edu-θετικών κυττάρων στις δύο κύτταρα HCT8-302a και HCT116-302a ήταν χαμηλότερες σε σχέση με τους μάρτυρες. Επιπλέον, σε σύγκριση με τους μάρτυρες, οι δύο κύτταρα HCT8-302a και HCT116-302a αναπτύξει λιγότερες αποικίες στις 20 και 15 ημέρες, αντίστοιχα. Ως εκ τούτου,

in vitro

πειράματα έδειξαν ότι miRNA-302A άσκησαν κατασταλτική ρόλο στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου.

δοκιμασία CCK-8 διεξήχθη για να μετρηθεί ο πολλαπλασιασμός στο (Α) HCT8 και (Β) κύτταρα HCT116. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν την μέση ± τυπική απόκλιση της τιμής οπτικής πυκνότητας (OD) ανιχνεύονται στα 450 nm από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ανιχνεύθηκε σε (C) και τα κύτταρα HCT8 HCT116 (D) χρησιμοποιώντας ΕΠΑ δοκιμασία αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Ε, F) δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας υποδεικνύεται λιγότερες αποικίες σε miRNA-302A που υπερεκφράζουν HCT8 κύτταρα. (* P & lt? 0,05).

Η

Για να επικυρώσετε περαιτέρω παρατηρήσεις μας

in vivo

, κύτταρα HCT8-SCR και κύτταρα HCT8-302a εγχύθηκαν μέσα στην αριστερή και δεξιά πλευρά του οπίσθιου γυμνών ποντίκια, αντίστοιχα. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας καλίμπρες σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά τον εμβολιασμό, και τα βάρη των όγκων μετρήθηκαν μετά τη θυσία. Τόσο ο όγκος και η μάζα ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε όγκους HCT8-302a ό, τι σε HCT8-Scr όγκους (Ρ & lt? 0,05? Εικ. 3). Στο σύνολό τους, προφανής η αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού παρατηρήθηκε μετά από υπερέκφραση του miRNA-302A σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

Κύτταρα

HCT8-GFP και τα κύτταρα HCT8-302a εγχύθηκαν μέσα στην αριστερή και δεξιά πλευρά του οπίσθιου γυμνών ποντικών, αντίστοιχα ( Α, Β). Ο όγκος του όγκου (Γ) και της μάζας (D) στην ομάδα HCT8-302a ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι στην ομάδα HCT8-GFP. (* Ρ & lt? 0,05).

Η

Η υπερέκφραση του miRNA-302A επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

Τώρα που η αναστολή της ανάπτυξης παρατηρήθηκε σε καρκινικά κύτταρα κόλου, εκτελέσαμε κυτταρικού κύκλου ανάλυση για να διερευνηθεί κατά πόσο η υπερέκφραση των miRNA-302A οδήγησε σε μεταβολές του κυτταρικού κύκλου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, η αναλογία των κυττάρων σε G1-φάση αυξήθηκε αξιοσημείωτα σε κύτταρα HCT8-302a, ενώ το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S ήταν σημαντικά λιγότερο σε σχέση με το μάρτυρα. Ανάλογα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα HCT16-302a, υποδηλώνοντας ότι miRNA-302A επάγουν αποτελεσματικά G1 /s διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου.

Η αναλογία των κυττάρων σε G1-φάση αυξήθηκε σημαντικά στα κύτταρα HCT8-302a ( A, C) και τα κύτταρα HCT116-302a (Β, D) σε σχέση με τους ελέγχους, ενώ η αναλογία των κυττάρων στη φάση S ήταν σημαντικά λιγότερο από τους ελέγχους. (* P & lt? 0,05).

Η

miRNA-302A καταστέλλει την έκφραση της ΑΚΤ με απευθείας στόχευση 3’UTR της

Για την ανίχνευση των μοριακών μηχανισμών με τους οποίους miRNA-302A ασκεί μεταγραφικούς ρυθμιστικές λειτουργίες του , χρησιμοποιήσαμε βιοπληροφορική αλγορίθμους (https://www.targetscan.org) προκειμένου να αναζητηθούν πιθανές γονίδια-στόχους, και διαπίστωσε ότι η 3’UTR του

ΑΚΤ

mRNA φιλοξενεί μια συντηρημένη θέση δέσμευσης για miRNA-302A. Στη συνέχεια, εξετάσαμε την έκφραση του ΑΚΤ στο επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης σε HCT8-302a και κυττάρων HCT116-302a και τους ελέγχους. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α και 6, σε σύγκριση με τους ελέγχους, οι εκφράσεις ΑΚΤ μειώθηκαν σημαντικά σε HCT8-302a και HCT116-302a κύτταρα, τόσο σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης. Επιπλέον, η έκφραση της ΑΚΤ σε όγκους HCT8-302a ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι σε όγκους HCT8-Scr, όπως προσδιορίζεται με PCR πραγματικού χρόνου και χρώση IHC (Εικ. 5Β, C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση της ΑΚΤ ρυθμίζεται προς τα κάτω από το miRNA-302A στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

ΑΚΤ

έκφραση του mRNA ήταν αξιοσημείωτα κατέστειλε το (Α) HCT8-302a και HCT116-302a κύτταρα, και (Β ) όγκους HCT8-302a. χρώση (Γ) Η ανοσοϊστοχημεία έδειξε χαμηλότερη έκφραση της ΑΚΤ σε όγκους HCT8-302a. (D) Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης κυρίως καταστέλλεται σε άγριου τύπου ΑΚΤ-3 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR) επιμολυσμένων κυττάρων. (Ε) Σχηματική αναπαράσταση της αναφοράς της λουσιφεράσης, η οποία έφερε το άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο

ΑΚΤ

-3 ‘UTR. (* P & lt? 0,05).

Η

κηλίδας Western αναλύσεις έδειξαν μειωτικά ΑΚΤ και κυκλίνης D1 επίπεδα, και ρυθμίζεται προς τα πάνω τα επίπεδα της ΟδΚ3β σε miRNA-302A κύτταρα που υπερεκφράζουν HCT8. επίπεδα PTEN και PI3K δεν επηρεάστηκαν.

Η

Για να ελέγξετε αν ρυθμίζει miRNA-302A

ΑΚΤ

με απευθείας σύνδεση με 3’ΙΙΤΡ του, ένα διάνυσμα αναφοράς της λουσιφεράσης που περιέχει το ανθρώπινο

ΑΚΤ

3’ΙΙΤΡ που πραγματοποιήθηκε την άγριου τύπου αλληλουχία δέσμευσης miRNA-302A ήταν υπο κλωνοποιηθεί. Ένας φορέας λουσιφεράσης φέρει το μεταλλαγμένο 7-bp περιοχή συμπληρωματική προς την περιοχή 5 ‘του σπόρου miRNA-302A παρήχθη ως ρεπόρτερ ελέγχου (Σχ. 5Ε). Σε σύγκριση με τον έλεγχο, η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης καταστάλθηκε κατά 36% (Ρ & lt? 0,05) σε άγριου-τύπου

ΑΚΤ

3’UTR επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ 5D.). Ως εκ τούτου, miRNA-302A αναστέλλει καρκινικά κύτταρα κόλου μέσω απευθείας στόχευση

ΑΚΤ

.

επάγεται miRNA-302A μεταβολές του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου μέσω αναστολής της ΑΚΤ ΟδΚ3β-κυκλίνης D1 μονοπάτι

για την περαιτέρω αξιολόγηση της επίδρασης των miRNA-302A στο σηματοδοτικό μονοπάτι AKT, ανιχνεύσαμε την έκφραση των ανάντη (PI3K και PTEN) και κατάντη (ΟδΚ3β και κυκλίνη D1) ΑΚΤ δράστες με κηλίδα western. Σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου, τα επίπεδα της ΟδΚ3β ήταν ιδιαίτερα αυξημένα, ενώ η κυκλίνη D1 ήταν ιδιαίτερα μειωμένη σε miRNA-302A επιμολυσμένα κύτταρα HCT8 andHCT116. Ωστόσο, η έκφραση των δύο μεγάλων ανάντη τελεστές της ΑΚΤ, PI3K και PTEN, δεν επηρεάστηκαν από miRNA-302A επιμόλυνση (Εικ. 6). Δεδομένου του καθοριστικού ρόλου του ΑΚΤ ΟδΚ3β-κυκλίνη οδό σηματοδότησης D1 σε μεταβατικό στάδιο του κυτταρικού κύκλου, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι miRNA-302A ενδέχεται να προξενήσει G1 /S διακοπή του κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου μέσω αναστολής της ΑΚΤ ΟδΚ3β-κυκλίνης οδό D1, με τον τρόπο αυτό καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου.

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε ότι miRNA-302A ήταν προς τα κάτω σε ιστούς του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η υπερέκφραση του miRNA-302A που επάγεται G1 /S σύλληψης σε καρκινικά κύτταρα κόλου, και αξιοσημείωτα κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του κόλου

in vitro

και

in vivo

. Επιπλέον,

ΑΚΤ

αποκαλύφθηκε ως άμεσο και λειτουργικό γονίδιο στόχος των miRNA-302A.

Κατά την τελευταία δεκαετία, οι περισσότερες έρευνες που αφορούν miRNA-302 έχει εστιάσει στον ρόλο της στην hESCs, τα οποία είναι χαρακτηρίζεται από την αυτο-ανανέωση και pluripotency. Μελέτες ανάλυσης miRNA-302 Λειτουργία στην καρκινογένεση είναι περιορισμένη και ασυνεπής. Lin et al. Βρέθηκε ότι miRNA-302 θα μπορούσε να αναστείλει την ογκογονικότητα και διεγείρουν απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα MCF7 καρκίνου του μαστού, τα εμβρυϊκά κύτταρα τερατοκαρκινώματος Tera-2, και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα κυττάρων HepG2 [13]. Ομοίως, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός κατεστάλη σε καρκίνο του τραχήλου HeLa και SiHa κύτταρα, καθώς επίσης και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα SMMC-7721 κύτταρα, μέσω της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου [10], [14]. Ωστόσο, Zhu et al. παρατηρείται μια αντίστροφη φαινόμενο σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου, όπου η υπερέκφραση του miRNA-302b οδήγησε σε αυξημένη ικανότητα σχηματισμού αποικιών

in vitro

[11]. Η επαυξημένη ικανότητα σχηματισμού αποικίας παρομοίως επικυρωθεί σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα από καρκίνωμα κεφαλής και λαιμού πλακωδών κυττάρων [15]. Για πρώτη φορά, αποκαλύπτουμε κατασταλεί η έκφραση miRNA-302A σε ιστούς του καρκίνου του παχέος εντέρου σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου. Ως εκ τούτου, εμείς εικάζουν ότι miRNA-302A θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου και την πρόοδο.

Στη μελέτη μας, μία ανασταλτική δράση των miRNA-302A στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρατηρήθηκε σε HCT8 καρκίνο και HCT116 κύτταρα του παχέος εντέρου, μέσω εμποδίζουν την G1 στην S φάση μετάβασης, η οποία θεωρείται ως ένα βασικό γεγονός κατά τη διάρκεια του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [8], [10], [14], βρήκαμε επίσης αξιοσημείωτη αρνητική ρύθμιση της κυκλίνης D1 σε miRNA-302A που υπερεκφράζουν τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον, miRNA-302 αναμένεται να στοχεύσει πολλούς ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου. Για παράδειγμα, Lin et al. απέδειξαν ότι miRNA-302 ταυτοχρόνως καταστέλλεται τόσο κυκλίνης Ε-CDK2 και κυκλίνης D CDK4-/6 μονοπατιών σηματοδότησης [13], και αυτό το μπλοκάρισμα στόχος ρυθμίζεται από διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες, όπως Oct4 και Sox28. Ωστόσο, κάρτα et al. ανέφεραν ότι miRNA-302A προώθησε μια αύξηση στην φάση S και μια μείωση στην φάση G1 σε hESCs, αν και η κυκλίνη D1, επίσης καταστέλλεται [8]. Σαφώς, η περαιτέρω έρευνα διαλεύκανση τους ακριβείς μηχανισμούς των miRNA-302 λειτουργία είναι δικαιολογημένη.

Οι παρατηρήσεις μας ότι η υπερέκφραση του miRNA-302A στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου που προκαλείται από την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων

in vitro

και

in vivo

υποδηλώνουν ότι miRNA-302A μπορούσε μετα-μεταγραφικά ρυθμίζουν κεντρικό γονίδιο που εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Ως ένα σημαντικό ογκογονίδιο,

ΑΚΤ

επηρεάζει ένα ευρύ φάσμα φυσιολογικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένων του μεταβολισμού, τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, αγγειογένεση, μετανάστευση, και εισβολή [16]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι miRNA-302A κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό και ογκογονικότητα των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου μέσω της οδού D1 ΑΚΤ ΟδΚ3β-κυκλίνης, και με την άμεση δέσμευση του 3’UTR του

ΑΚΤ

. Επιπλέον, η έκφραση της PI3K και PTEN, που είναι τα κύρια ανάντη τελεστές της ΑΚΤ και έχουν επίσης αποδειχθεί σημαντική στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου, δεν επηρεάστηκαν από miRNA-302. Ο ρυθμιστικός ρόλος του miRNA-302 σε AKT δείχθηκε επίσης με Cai et al: μετά miRNA-302s επιμόλυνση σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα, παρατήρησαν αυξημένη έκφραση του εξαρτώμενης από κυκλίνη αναστολείς κινάσης p27kip1 και p21Cip1, μαζί με μειωτικά επίπεδα ΑΚΤ [10]. Ως εκ τούτου, ως στόχο της miRNA-302,

ΑΚΤ

ήταν κυρίως καταστέλλεται και προκάλεσε αλλαγές σε πολλούς μεταγενέστερους μονοπάτια σηματοδότησης.

Τα ευρήματα μας δίνουν επίσης ορισμένες ενδείξεις όσον αφορά τη θεραπεία του καρκίνου miRNAs στοχευμένες. Προηγούμενες μελέτες αποκάλυψαν ότι ορισμένες ειδικές miRNAs συχνά υπερεκφράζεται σε όγκους, ενώ τα περισσότερα miRNAs ήταν.

μειωτικά [17], [18]. καταστολή παγκόσμια miRNA βρέθηκε να ενισχύσει την καρκινογένεση και στα δύο

in vitro

και

in vivo

μοντέλα [19], τονίζοντας τα pro ογκογόνο δράση μετά από miRNA απώλεια-του-λειτουργία. Liang et al. παρατήρησαν μια ευαισθητοποίηση ρόλος της θεραπείας αντικατάστασης miRNA-302 σε κύτταρα καρκίνου του μαστού σε ιοντίζουσα ακτινοβολία [20]. Μια άλλη πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι η ιική παράδοση ας-7 miRNA θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο αδενοκαρκινώματος πνεύμονα ποντικού [21]. Παρομοίως, τα αποτελέσματα μας επικύρωσε την ανασταλτική επίδραση της αντικατάστασης miRNA-302A σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Στο σύνολό τους, αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η υπερέκφραση του έστω και ενός miRNA σε καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να προσδώσει σημαντική θεραπευτικό όφελος.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας δείχνει ότι miRNA-302A είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων με τη ρύθμιση G1-S μετάπτωσης φάσης. έκφραση miRNA-302A καταστέλλεται σε ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου. Επιπλέον, μέσω της άμεσης σύνδεσης με 3’ΙΙΤΡ, αναστέλλει miRNA-302A

ΑΚΤ

έκφρασή του, με αποτέλεσμα την εκ των υστέρων τροποποιήσεις στην AKT-ΟδΚ3β-κυκλίνης D1 μονοπάτια. Αν και είναι σαφές ότι miRNA-302A συμμετέχει σε καρκίνο του παχέος εντέρου, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να εξηγήσει τους ακριβείς μηχανισμούς στους οποίους ο ρόλος του στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου, και έτσι καθορίζουν πιθανή αξία της ως βιοδείκτη και /ή θεραπευτικό στόχο.