Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο αριθμός των ασθενών με καρκίνο του ενδομητρίου (EMCA) βρίσκονται σε προχωρημένο στάδιο ή υψηλό ιστολογικό βαθμό αυξάνεται και πρόγνωση δεν έχει βελτιωθεί για την τελευταία δεκαετία. Υπάρχει επείγουσα ανάγκη για την ανακάλυψη νέων μοριακών στόχων για τη διάγνωση, την πρόγνωση και τη θεραπεία της EMCA, η οποία θα έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει την κλινική στρατηγική και το αποτέλεσμα αυτής της ασθένειας.

μεθοδολογία και τα αποτελέσματα

Χρησιμοποιήσαμε ένα «τρυπάνι-κάτω» προσέγγιση πρωτεωμικής προκειμένου να διευκολυνθεί η ταυτοποίηση νέων μοριακών στόχων για τη διάγνωση, πρόγνωση και /ή θεραπευτική παρέμβαση για EMCA. Με βάση τα ιόντα πεπτιδίου εντοπίζονται και οι χρόνοι κατακράτησης τους στο πρώτο ανάλυση LC-MS /MS, ένας κατάλογος αποκλεισμού δημιουργήθηκε για μετέπειτα επαναλήψεις. Ένα σύνολο των 1529 πρωτεϊνών έχουν εντοπιστεί κάτω από το 5% το όριο σφάλματος Proteinpilot® από τις επτά σειρές πειραμάτων iTRAQ εκτελούνται. Κατά μέσο όρο, η δεύτερη επανάληψη πρόσθεσε 78% νέων πεπτιδίων σε εκείνες που προσδιορίζονται μετά την πρώτη εκτέλεση, ενώ η τρίτη επανάληψη πρόσθεσε 36% επιπλέον πεπτίδια. Από τις 1.529 πρωτεΐνες εντοπίστηκαν, μόνο 40 πληρούσαν τα κριτήριά μας για τη σημαντική διαφορική έκφραση σε EMCA σε σύγκριση με την κανονική πολλαπλασιαστική ιστούς. Αυτές οι πρωτεΐνες περιλαμβάνονται μεταβολικά ένζυμα (πυροσταφυλική κινάση Μ2 και γαλακτικής αφυδρογονάσης Α)? πρωτεΐνες δέσμευσης ασβεστίου (S100A6, calcyphosine και calumenin), και πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην ρύθμιση της φλεγμονής, πολλαπλασιασμό και εισβολή (Αννεξίνη Α1, ιντερλευκίνη παράγοντας ενισχυτή δέσμευσης 3, άλφα-1-αντιθρυψίνης, μακροφάγων πωματισμό πρωτεΐνη και καθεψίνη Β). Οι αναλύσεις αποκάλυψαν Δίκτυο ρύθμιση αυτών των μοριακών στόχων από το c-myc, Her2 /neu και TNF άλφα, υποδηλώνοντας παρέμβαση με αυτά τα μονοπάτια μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την ανάπτυξη νέων μοριακών στοχευμένων θεραπειών για EMCA.

Συμπεράσματα

οι αναλύσεις μας αποκάλυψε τη σημασία της πρωτεομική προσέγγιση τρυπάνι-κάτω σε συνδυασμό με iTRAQ να ξεπεραστούν ορισμένα από τα όρια των σημερινών πρωτεομική στρατηγικές. Αυτή η μελέτη οδήγησε στην ταυτοποίηση ενός αριθμού νέων μοριακών στόχων που έχουν θεραπευτικές δυνατότητες για στοχευμένες μοριακές θεραπείες για καρκίνο του ενδομητρίου

Παράθεση:. Voisin SN, Krakovska O, Matta Α, Ντεσόζα LV, Romaschin μ.Χ., Colgan TJ, et al. (2011) Ταυτοποίηση νέων μοριακών στόχων για καρκίνο του ενδομητρίου Χρησιμοποιώντας ένα τρυπάνι-κάτω LC-MS /MS Προσέγγιση με iTRAQ. PLoS ONE 6 (1): e16352. doi: 10.1371 /journal.pone.0016352

Επιμέλεια: Γιανγκ Cai, Το Ινστιτούτο Έρευνας για τα παιδιά, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 Αυγούστου του 2010? Αποδεκτές: 20 Δεκ του 2010? Δημοσιεύθηκε: 31 Ιαν 2011

Copyright: © 2011 Voisin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η στήριξη του καναδικού Αντικαρκινικής Εταιρείας Ίδρυμα Ερευνών (πρώην National Cancer Institute of Canada) αναγνωρίζεται με ευγνωμοσύνη. AB SCIEX παρέχονται υποδομής και αντιδραστηρίου υποστήριξη αυτής της έρευνας? Ajay Matta είναι ο αποδέκτης μιας MITACS Επιτάχυνση Fellowship, Οντάριο, Καναδάς. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα. AB SCIEX παρέχει υποδομές και αντιδραστηρίου υποστήριξη αυτής της έρευνας, αλλά δεν έχει καμία συντακτική εισόδου σε αυτό το χειρόγραφο. Περαιτέρω, αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

ενδομητρίου καρκινώματος (EMCA) είναι η τέταρτη πιο-συχνότερος καρκίνος στις γυναίκες στην Βόρεια Αμερική, με 42.160 νέα κρούσματα και 7780 θάνατοι αναμένονται φέτος μόνο στις ΗΠΑ [1]. Υπάρχουν δύο κύριοι τύποι καρκίνου του ενδομητρίου: Τύπος Ι EMCA του ενδομητριοειδές ιστολογίας και Τύπου II EMCA οποία είναι ορώδες ή σαφής κυττάρου σε μορφολογία, ο τελευταίος τύπος είναι τυπικά την πιο επιθετική από τα δύο. Ο τύπος Ι EMCA είναι η κοινή μορφή καρκίνου του ενδομητρίου, αποτελώντας περίπου το 70-80% του συνόλου των περιπτώσεων [2], [3]. Η διάγνωση βασίζεται κυρίως σε ιστολογική εξέταση των ιστών που λαμβάνονται μετά από μια βιοψία, μια επεμβατική διαδικασία που συνήθως πραγματοποιείται ως αποτέλεσμα των ερευνών διάγνωσης κατά την ανώμαλη αιμορραγία της μήτρας στην παρουσίαση. Ενδομήτρια καρκινώματα έχουν πρωτίστως σε επεξεργασία με τη βοήθεια της χειρουργικής επέμβασης με επιπλέον ακτινοβολία και /ή χημειοθεραπεία, και σχετικά ευνοϊκές εκβάσεις έχουν επιτευχθεί εφόσον πληρούνται οι καρκίνοι ανιχνεύονται νωρίς. Ωστόσο, ο αριθμός των ασθενών με EMCA σε προχωρημένο στάδιο ή υψηλή ιστολογική ποιότητα, η οποία είναι ενδεικτική μιας κακής πρόγνωσης, αυξάνεται [2], [4]. Υπάρχει επείγουσα ανάγκη για την ανακάλυψη νέων μοριακών στόχων για τη διάγνωση, την πρόγνωση και τη θεραπεία της EMCA, η οποία θα έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει την κλινική στρατηγική και το αποτέλεσμα αυτής της ασθένειας.

Πρόσφατα, έχει υπάρξει έντονο ενδιαφέρον για τη μελέτη της παγκόσμιας έκφρασης πρωτεΐνης, και πρωτεομική προσεγγίσεις φαίνεται να παρουσιάσει μια νέα στρατηγική για την έρευνα για τον καρκίνο και τον εντοπισμό νέων βιοδεικτών για την κλινική εφαρμογή. Πολυάριθμες πρωτεομική μελέτες που πραγματοποιήθηκαν τα τελευταία χρόνια έχουν προσπαθήσει να ανακαλύψουν τις δυνατότητές βιοδείκτες του καρκίνου μέσω διαφορικού πρωτεΐνη διαλογή χρησιμοποιώντας τον καρκίνο και μη-καρκινικούς ιστούς [5] – [9]. Μία από τις πιο διαδεδομένες τεχνολογίες για βιοδείκτη ανακάλυψη είναι μια εκ των κάτω προσέγγιση που περιλαμβάνει χημική σήμανση των πεπτιδίων που προκύπτουν από την ενζυματική πέψη των πρωτεϊνών του δείγματος, που ακολουθείται από ανάμιξη των δειγμάτων ελέγχου και δοκιμής πριν από την υγρή χρωματογραφία-διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC- MS /MS) ανάλυση για να διασφαλιστεί πανομοιότυπη μεταχείριση των δειγμάτων [6], [7], [9]. Μεταξύ των πιο κοινών αυτών των αντιδραστηρίων επισήμανσης σε χρήση σήμερα είναι οι ισοβαρή ετικέτες για τη σχετική και απόλυτη ποσοτικοποίηση (iTRAQ) [10]. Tagging επιτρέπει τη διάκριση των κατά τα άλλα πανομοιότυπων πεπτιδίων που προέρχονται από μεμονωμένα δείγματα του μείγματος μέσω ιόντων ρεπόρτερ που σχηματίζονται από αυτές τις ετικέτες, οι οποίες επιτρέπουν τη σχετική ποσοτικοποίηση του δεδομένου πεπτιδίου στα δείγματα, και έτσι την αντίστοιχη πρωτεΐνη. Λόγω της πολυπλοκότητας των δειγμάτων ιστού, ένα προ-κλασμάτωση των δειγμάτων χρησιμοποιώντας ισχυρή κατιονανταλλακτική (SCX) εκτελείται τυπικά, πριν από την αναλυτική διαχωρισμό επί στήλης νανοκλίμακα αντίστροφης φάσης (RP), η οποία συνδέεται απευθείας με το φασματόμετρο μάζας. Παρά την δισδιάστατο χρωματογραφικό διαχωρισμό, εξακολουθεί να υπάρχει μία τάση για έναν μεγάλο αριθμό πεπτιδίων να συν-εκλούονται κατά το διαχωρισμό RP λόγω της πολυπλοκότητας του δείγματος. Ως αποτέλεσμα, η μάζα φασματόμετρο είναι τυπικά σε θέση να εξετάσει ένα κλάσμα των πεπτιδίων λόγω χρονικών περιορισμών μόνο. Σε ένα αυτοματοποιημένο απόκτηση δεδομένων, το λογισμικό MS τείνει να ευνοεί ανάλυση από τα πιο άφθονα πεπτίδια εις βάρος του συν-έκλουση πεπτιδίων χαμηλότερης αφθονίας. Όπως πολλοί καρκίνο σχετικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένης της σηματοδότησης και των ρυθμιστικών πρωτεϊνών, συνήθως εκφράζονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις, αυτή η bottom-up προσέγγιση καραμπίνα τείνει να χάσετε για την απόκτηση του πλέον πολύτιμες πληροφορίες [11]. Μια πιθανή λύση σε αυτό το ζήτημα είναι μια επαναληπτική ανάλυση του ίδιου δείγματος, σε συνδυασμό με μια λίστα αποκλεισμού των ταυτοποιημένων πεπτιδίων που δημιουργείται μετά από κάθε ανάλυση και χρησιμοποιούνται για την ενημέρωση της επιλογής των ιόντων που στοχεύουν για ανάλυση MS /MS κατά τη διάρκεια της μετέπειτα τρεξίματα. Η στρατηγική αυτή αναγκάζει το φασματόμετρο μάζας να στοχεύσει νέες, λιγότερο άφθονα πεπτίδια για ανάλυση MS /MS κατά τη διάρκεια κάθε διαδοχικής επανάληψης. Οι παραλλαγές αυτής της προσέγγισης έχουν αναφερθεί για τη μήτρα με τη βοήθεια λέιζερ εκρόφησης /ιονισμού (MALDI) MS /MS και ESI-MS /MS [12], [13].

Στη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μια επαναληπτική ανάλυση , αναφέρεται εδώ ως «μέθοδος τρυπάνι κάτω», για να διευκολυνθεί η ταυτοποίηση νέων μοριακών στόχων για τη διάγνωση, πρόγνωση και /ή θεραπευτική παρέμβαση για καρκίνο του ενδομητρίου. Ο κύριος στόχος αυτής της τρυπάνι-κάτω μέθοδος είναι να ξεθάψει περισσότερα πεπτίδια. Μετά την πρώτη ανάλυση LC-MS /MS, οι προσδιορίζονται ιόντα πεπτιδίου και χρόνος κατακράτησης τους προστέθηκαν για να δημιουργήσει έναν κατάλογο αποκλεισμού για περαιτέρω επαναλήψεις σε ανάλυση LC-MS /MS. Η προσέγγισή μας είναι εννοιολογικά παρόμοιο με το «επιλεκτικό αποκλεισμό πρόδρομου ιόντος» μέθοδο (SEL-PIE) περιγράφηκε νωρίτερα από τον Wang

et al.

[11]. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη φορά που ένας τέτοιος συνδυασμός της πρωτεΐνης ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας επισήμανση iTRAQ και επαναληπτική προσέγγιση ανάλυση έχει χρησιμοποιηθεί για την ανακάλυψη βιοδεικτών του καρκίνου.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των πρωτεϊνών με χρήση επαναληπτικής ανάλυσης με iTRAQ

ένα σύνολο των 1529 πρωτεϊνών έχουν ταυτοποιηθεί από Proteinpilot® σε επίπεδο εμπιστοσύνης 95% από τα επτά σύνολα iTRAQ πειραμάτων που διεξάγονται σε αυτή τη μελέτη. Η πρώτη εκτέλεση όλων των κλασμάτων εντόπισε συνολικά 1137 μη περιττές πρωτεΐνες, με το δεύτερο και τρίτο επαναλήψεις συμβάλλουν τα υπόλοιπα 392 μη-περιττές πρωτεΐνες. Κατά μέσο όρο, η δεύτερη επανάληψη πρόσθεσε 78% νέων πεπτιδίων με εκείνες που προσδιορίζονται μετά την πρώτη εκτέλεση, ενώ η τρίτη επανάληψη προστίθεται 36% περισσότερα πεπτίδια, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 και στον Πίνακα 1. Εντός ένα δεδομένο σύνολο, περίπου το 12% των πεπτιδίων ήταν κοινά σε οποιεσδήποτε δύο διαδοχικές επαναλήψεις? Ωστόσο, μόνο 3 έως 6% των πεπτιδίων ταυτοποιήθηκαν σε όλες τις τρεις επαναλήψεις. Όπως ήταν αναμενόμενο, αυτές οι επιπλέον πεπτίδια βελτίωσε την κάλυψη των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών. Πράγματι, η δεύτερη επανάληψη πρόσθεσε 34% νέες πρωτεΐνες, κατά μέσο όρο, ενώ η τρίτη επανάληψη προστίθεται μόνο το 14% της συνδυασμένης λίστας από επαναλήψεις 1 και 2? έτσι δεν είχαν κίνητρο να εκτελέσει περαιτέρω επαναλήψεις. 40% των πρωτεϊνών που εντοπίστηκαν κατά την πρώτη εκτέλεση εντοπίστηκαν επίσης στα επόμενα δύο επαναλήψεις (Πίνακας 1). Των πρωτεϊνών 1529, 623 ταυτοποιήθηκαν με ένα μόνο πεπτίδιο? 423 εκ των οποίων έδειξε ≥99% στην εμπιστοσύνη. Τα υπόλοιπα 906 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν κατά μέσο όρο με έξι πεπτίδια ανά πρωτεΐνη, λαμβάνοντας υπόψη μόνο τα πεπτίδια με τα αποτελέσματα εμπιστοσύνη ≥95%. Από τις 1.529 πρωτεΐνες που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη, 1.260 πρωτεΐνες (δηλαδή 82%) είχαν αναλογίες iTRAQ αναφέρθηκαν για δείγματα ιστού EMCA. Ένας πλήρης κατάλογος των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών και μέσοι λόγοι τους iTRAQ είναι διαθέσιμη στον πίνακα S1. Ένα γράφημα πίτας που δείχνει την κατανομή σε κυτταρικές λειτουργίες των πρωτεϊνών αυτών φαίνεται στο Σχήμα 2.

Κατά μέσο όρο, η δεύτερη επανάληψη πρόσθεσε 78% νέων πεπτιδίων σε εκείνες που προσδιορίζονται μετά την πρώτη εκτέλεση, ενώ η τρίτη επανάληψη πρόσθεσε 36% περισσότερα πεπτίδια. Μέσα σε ένα δεδομένο σύνολο, περίπου το 12% των πεπτιδίων ήταν κοινά σε οποιεσδήποτε δύο διαδοχικές επαναλήψεις? Ωστόσο, μόνο 3 έως 6% των πεπτιδίων εντοπίστηκαν και στις τρεις επαναλήψεις.

Η

Η

Αναγνώριση των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών σε EMCA

Για να προσδιορίσετε διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών ότι μπορούν να χρησιμεύσουν ως πιθανοί μοριακοί στόχοι για την αξιολόγηση της διάγνωσης ή /και πρόγνωση EMCA, όλες τις πρωτεΐνες (n = 1.529) που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη αξιολογήθηκαν με βάση τα κριτήρια που περιγράφονται στο Υλικά & amp? Μέθοδοι. Ένας κατάλογος των 40 πρωτεϊνών που μπορούν να χρησιμεύσουν ως πιθανοί βιοδείκτες για EMCA παρουσιάζεται στον Πίνακα 2. Από αυτά τα 40 υποψηφίων βιοδεικτών, 38 προσδιορίστηκαν με τουλάχιστον δύο πεπτίδια. (S100 ασβεστίου-δεσμευτική πρωτεΐνη Α6 και βήτα-2-γλυκοπρωτεΐνη 1) συμπεριλήφθηκαν οι δύο εξαιρέσεις όπως αυτές προσδιορίζονται από ένα πεπτίδιο με ≥99% της εμπιστοσύνης, και το εγχειρίδιο ελέγχου έδειξε εξαιρετική ποιότητα φασματική MS /MS (σχήματα S1 και S2) . Οι επιμέρους τιμές iTRAQ για ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών που αναφέρονται στον πίνακα S2a? κατάλογο όλων των εντοπιστεί πεπτίδια με επίπεδο εμπιστοσύνης Proteinpilot ≥95% είναι διαθέσιμο στον Πίνακα S3. Πίνακας S4 απαριθμεί τις επαναλήψεις στην ανάλυση δείγμα, όπου προσδιορίστηκαν ποσοτικά οι πρωτεΐνες στον πίνακα 2. Όπως ελήφθησαν το EMCA και κανονική πολλαπλασιαστικές ιστούς από διαφορετικά άτομα και ήταν, ως εκ τούτου, δεν είναι ταυτόσημα (δηλαδή, οι αναλύσεις δεν αντιγράφεται), η χαρακτηριστική έννοια της τυπικής απόκλισης στην ποσοτική ανάλυση μπορεί να είναι παραπλανητικά ως μέτρο της αναλυτικής ποιότητας. Έχουμε, λοιπόν, επέλεξε να εκφράσει τις κατανομές των συνδυασμένων αναλυτικών και ατομική μεταβλητότητα με τον ακόλουθο τρόπο: στις αναλύσεις μας, το 28% των μεμονωμένων τιμών iTRAQ αποκλίνουν κατά ± 10% από τα μέσα τους, το 54% με απόκλιση ± 20%, και 88% εντός του ± 50% (βλέπε πίνακα S2B για λεπτομέρειες). Αυτές οι κατανομές είναι για την υποστήριξη της υπόθεσή μας ότι μια αλλαγή 50% σε αναλογίες iTRAQ είναι ενδεικτική της διαφορικής έκφρασης. Πράγματι, εντοπίσαμε μια ομάδα 16 επιπλέον πρωτεϊνών που μόλις έχασε την αποκοπή των κριτηρίων μας για διαφορική έκφραση και που μπορεί ακόμα να πληρούν τις προϋποθέσεις μετά την ένταξη πρόσθετων δειγμάτων (Πίνακας 3).

Η

Αξιολόγηση διαγνωστικές δυνατότητες της διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών σε EMCA

Άλλες παράμετροι που σχετίζονται με διαγνωστικούς δυναμικά αξιολογήθηκαν επίσης. Αυτές περιλαμβάνουν θετική προγνωστική αξία (PPVs) και οι περιοχές κάτω από την καμπύλη (καμπύλη AUC) που διατίθεται από τον δέκτη λειτουργικά χαρακτηριστικά (ROC) ανάλυση. Οι τιμές για τους μεμονωμένους υποψήφιους βιοδείκτη που παρατίθενται στον Πίνακα 2.

Η επαλήθευση της διαφορικής έκφρασης των πρωτεϊνών στους ιστούς EMCA

Η υπερέκφραση των επιλεγέντων υποψηφίων βιοδεικτών: καθεψίνη Β, calumenin, S100A6, γαλακτικής αφυδρογονάσης Α (LDHA), και HNRNPA1 σε ιστούς EMCA ελέγχθηκαν με κηλίδα Western αναλύσεις σε ένα υποσύνολο των ίδιων δειγμάτων ιστού που χρησιμοποιείται για iTRAQ LC-MS /MS. Το Σχήμα 3 δείχνει μια σύγκριση των τεσσάρων ιστών EMCA (Τ) με τέσσερις κανονικές endometria (Ν) για τις πέντε υποψήφιους βιοδεικτών με β-ακτίνη χρησιμεύει ως έλεγχος φόρτωσης. Επιπλέον, ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις σε ένα ανεξάρτητο σύνολο δειγμάτων ιστού (η = 5 καθεμία) αποκάλυψε έντονη κυτταροπλασματική ή /και πυρηνική ανοσοχρώση S100A6 πρωτεΐνης σε κύτταρα όγκου του ενδομητριοειδές τομές ιστού EMCA (Τυπικά αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 4), ενώ καμία σημαντική ανοσοχρώση παρατηρήθηκε στα επιθηλιακά κύτταρα των φυσιολογικών πολλαπλασιαστικών endometria.

Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών (50 μg /λωρίδα) διαχωρίστηκαν επί 10% δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS) -πολυακρυλαμιδίου γέλη και στη συνέχεια ηλεκτρο-μεταφέρθηκαν πάνω πολυβινυλιδένιο-διφθορίδιο (PVDF). Μετά τον αποκλεισμό, οι κηλίδες επωάστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού σε αντίστοιχες κατάλληλες αραιώσεις σε 4 ° C Ο /Ν. Οι μεμβράνες επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με δευτερεύον αντίσωμα. Οι ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη μέθοδο χημειοφωταύγειας (GE Health Care) σχετικά με Kodak Hyperfilm. ανάλυση κηλίδας Western έδειξε υπερέκφραση του (i) S100A6, (ii) calumenin, (iii) καθεψίνης Β, (iv) γαλακτικής αφυδρογονάσης Α (LDHA), και (v) ετερογενής πρωτεΐνη Α1 (HNRNPA1) σε ενδομητρίου καρκινικούς ιστούς (Τ1, Τ2, Τ3 και Τ4) σε σύγκριση με την κανονική του ενδομητρίου (Ν1, Ν2, Ν3 και Ν4). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης που δείχνει ίσες ποσότητες πρωτεΐνης σε κάθε λωρίδα.

Η

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση S100A6 πρωτεΐνης διεξήχθη σε ανεξάρτητα τμήματα ιστού ενσωματωμένα σε παραφίνη καρκίνου του ενδομητρίου και φυσιολογικό ενδομήτριο (η = 5 το καθένα) όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. δείχνει πίνακα (α) δεν ανοσοχρώση της S100A6 πρωτεΐνης σε φυσιολογικό ενδομήτριο? (Β) καρκίνος του ενδομητρίου που δείχνει κυτταροπλασματική έκφραση του S100A6 πρωτεΐνης? και (γ) αρνητικού ελέγχου δεν δείχνει έκφραση S100A6 πρωτεΐνης.

Η

Δίκτυο Ανάλυσης

Πραγματοποιήσαμε Ingenuity Ανάλυση Pathway (IPA) για τη δημιουργία δικτύων που δείχνουν άμεσες και έμμεσες κανονισμούς /αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη. Τα δίκτυα αυτά δείχνουν τη συμμετοχή των βασικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων TNF άλφα, ΝΡκΒ, c-myc, Her2 /Neu, β-κατενίνης, και πρωτεΐνες Erk1 /2, οι οποίες ρυθμίζουν την φλεγμονή, και την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του όγκου (Σχήμα 5). Οι περισσότεροι από τους μοριακούς στόχους που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη ρυθμίζονται από c-myc, Her2 /neu, και TNF α, υποδηλώνοντας έτσι παρέμβαση αυτών των οδών μπορεί να παρέχει ένα μέσο για την ανάπτυξη της μοριακής στοχευμένες θεραπείες για τον καρκίνο του ενδομητρίου.

Οι πιθανές νέων μοριακών στόχων που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη υποβλήθηκαν σε μονοπάτι αναλύσεις χρησιμοποιώντας Ingenuity Pathways Ανάλυση (ΜΠΒ), το λογισμικό, Έκδοση 7.5. Η εικόνα δείχνει την άμεση (τολμηρές γραμμές) και έμμεσες (διακεκομμένες γραμμές) οι κανονισμοί (→) /αλληλεπιδράσεων (-) μεταξύ των βιοδεικτών που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη και άλλα σημαντικά σχετίζονται πρωτεΐνες. Τα δίκτυα αυτά αποκαλύπτουν τη συμμετοχή των βασικών πρωτεϊνών συμπεριλαμβανομένου του TNFa, ΝΡκΒ, c-myc, Her2 /Neu, β-κατενίνης, JNK και Erk1 /2 πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τη φλεγμονή, την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό.

Η

Συζήτηση

υπήρξε σημαντική πρόσφατο ενδιαφέρον στην ταυτοποίηση των πιθανών δεικτών καρκίνου για τη διάγνωση και την πρόγνωση μέσω διαφορικής πρωτεομική ανάλυση. Τα διάφορα θέματα, παγίδες, και τις επιτυχίες του αυτές τις μελέτες βιοδεικτών πρωτεομική-based συζητήθηκε και μελετήθηκε [14] – [17]. Η μελέτη μας οδήγησε στην ταυτοποίηση 40 πρωτεϊνών που δείχνουν σημαντική διαφορική έκφραση σε EMCA σε σύγκριση με την κανονική πολλαπλασιαστική ιστούς. Αυτές οι πρωτεΐνες περιλαμβάνουν μεταβολικά ένζυμα [πυροσταφυλική κινάση Μ2 (PKM2) και γαλακτικής αφυδρογονάσης Α (LDHA)]? πρωτεΐνες που δεσμεύουν το ασβέστιο (S100A6, calcyphosine και calumenin)? και πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην ρύθμιση της φλεγμονής, πολλαπλασιασμό και εισβολή [ανεξίνη Α1 (ANXA1), ιντερλευκίνη παράγοντας ενισχυτή δέσμευσης 3 (ILF3), άλφα-1-αντιθρυψίνης (ΑΑΤ), καλύπτοντας πρωτεΐνη μακροφάγων (CapG) και καθεψίνης Β]. Πολλές αναφορές έχουν δείξει την επίδραση του υποδοχέα οιστρογόνου (ER) και p53 στην έκφραση αυτών των πρωτεϊνών, η οποία δικαιολογεί την επαλήθευση αυτών των παρατηρήσεων σε ιστούς EMCA σε μεγαλύτερη κλίμακα. Μεταξύ των πρωτεϊνών που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη, έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν αλλοιωμένη έκφραση ΑΑΤ, CapG, πυροσταφυλική κινάση Μ1 /Μ2, και creatinase κινάση Β Δύο από αυτές τις πρωτεΐνες (πυροσταφυλική κινάση Μ2 και creatinase κινάσης Β) έχουν περιληφθεί εδώ για εξέταση, ως πρόσθετη χειροκίνητη διερεύνηση των δεδομένων αποκάλυψε ότι ενώ ο δείκτης έκφρασης αλλαγές για τις δύο αυτές πρωτεΐνες ήταν μόλις κάτω από 50% (πυροσταφυλική κινάση M1 /​​M2, 1,43? και creatinase κινάση Β, 0,69), έκαναν πληρούν τα άλλα δύο κριτήρια (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Επιπλέον, μια ανεξάρτητη μελέτη με χρήση ανοσοϊστοχημείας σε μια μικροσυστοιχία ιστού (n = 148 ασθενείς) που μεταφέρονται από την ομάδα μας απέδειξε το σημαντικό δυναμικό της ΑΑΤ και PKM2 ως διαγνωστικοί βιοδείκτες για EMCA [18] – [20]. Είναι αξιοσημείωτο ότι αυξημένη ποσότητα PKM2 όγκου έχει επίσης αναφερθεί στα κύτταρα όγκου και EDTA πλάσμα των ασθενών με καρκίνο του νεφρού, του πνεύμονα, του μαστού, του τραχήλου της μήτρας και του γαστρεντερικού σωλήνα, καθώς επίσης και σε δείγματα κοπράνων των ασθενών με ορθοκολικό και του καρκίνου του στομάχου [21]. Έτσι PKM2 μπορεί να δρα ως ένα γενικό δείκτη κακοήθειας, αντί να είναι ειδικά για EMCA. Αυτή η συνεργασία με την ογκογένεση σε γενικές γραμμές είναι, ίσως, κατανοητή υπό το φως της λειτουργίας PKM2 του [21]. Η στροφή προς την ισομορφή M2 της πυροσταφυλική κινάση στα κύτταρα του όγκου είναι απαραίτητο για να προκαλέσει το αποτέλεσμα Warburg. Αυξημένη έκφραση του PKM2 συμβάλλει σε ένα μεταβολικό περιβάλλον που είναι δεκτικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων κάτω από συνθήκες υποξίας και προωθεί την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων [22], [23]. Έτσι, PKM2 δρα ως μεταβολικό αισθητήρα, το οποίο επιτρέπει το κύτταρο όγκου να προσαρμόσει το μεταβολισμό του στις διακυμάνσεις στην παροχή θρεπτικών ουσιών. Είναι ενδιαφέρον, LDHA έδειξε επίσης υπερέκφραση σε ιστούς EMCA σε αυτή τη μελέτη, και PKM2 είναι γνωστό ότι λεωφορεία προτίμηση πυροσταφυλικού σε γαλακτικής αφυδρογονάσης [24]. Η φωσφορυλίωση της τυροσίνης του γαλακτικής αφυδρογονάσης διευκολύνει δέσμευση με PKM2, διοχετεύοντας έτσι το προϊόν της πυροσταφυλικής κινάσης σε γαλακτικό [25] πρωτεΐνη. Αυτό βοηθά στη δημιουργία δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου αδενίνης (NAD

+) που απαιτείται για τη διατήρηση υψηλών γλυκολυτικής ροής σε κύτταρα όγκου. Αυτή η μεταβολική μετατροπή καθιστά γλυκόλυση αυτάρκης, όσο αυξημένα πρόσληψη γλυκόζης είναι εφικτή. Ένα υψηλό γλυκολυτικό ρυθμό παρέχει συνθετικά ενδιάμεσα για ταχέως πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα όγκου, που απαιτείται για να αναπαράγουν κύτταρο βιομάζας και γονιδιώματος σε κάθε κυτταρική διαίρεση [24], [26].

Μια άλλη σημαντική ομάδα πρωτεϊνών βρέθηκε να απελευθερωθεί σε ιστούς EMCA περιλαμβάνει τέσσερις δέσμευσης ασβεστίου πρωτεΐνες: S100A6, calcyphosine (CAPS), calumenin (CALU) και αννεξίνη Α1 (Πίνακας 2). S100A6 είναι κατά κύριο λόγο μια κυτταροπλασματική πρωτεΐνη, αλλά με την παρουσία του Ca

2+, μπορεί να συνδεθεί με τη μεμβράνη του πλάσματος και το πυρηνικό φάκελο. ανοσοϊστοχημική ανάλυση μας έδειξε κυτταροπλασματική ή /και πυρηνική χρώση των S100A6, κυρίως σε καρκινικά κύτταρα του ενδομητριοειδές EMCA. Αυτό υποστηρίζεται περαιτέρω από την παρουσία S100A6 πρωτεΐνης στο κυτταρόπλασμα και πυρήνες του πνεύμονα, του δέρματος, και παγκρεατικού πόρου κύτταρα αδενοκαρκινώματος [27] – [29]. S100A6 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταροσκελετική αναδιοργάνωση, εισβολή, την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό με τη ρύθμιση λειτουργιών πολλών μοριακών στόχων, συμπεριλαμβανομένων των ρ53, β-κατενίνης, αννεξίνες, τροπομυοσίνη, calponin, calcyclin πρωτεΐνης δέσμευσης /Siah-1-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης (CacyBP /SIP ), και Hsp90 /Hsp70-οργάνωση πρωτεΐνη (Hop) [30] – [33]. Η υπερέκφραση του S100A6 έχει συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση σε πνεύμονα, του στομάχου και του καρκίνου του παγκρέατος [27], [31], [33]. Από τις τέσσερις Ca

2+ ρυθμιστικών πρωτεϊνών βρέθηκε να εκφράζεται διαφορικά σε αυτή τη μελέτη, μόνο calcyphosine έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε ασθενείς EMCA [34]. Αννεξίνη Α1 (ANXA1), βρέθηκε να υπερεκφράζεται σε ιστούς EMCA σε αυτή τη μελέτη, είναι ένα ενδογενές αντι-φλεγμονώδη πρωτεΐνη. Αννεξίνες είναι μια οικογένεια Ca

2 πρωτεΐνες + /λιπιδίου πρόσδεσης που εμπλέκονται σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες, όπως συσσωμάτωση μεμβράνη, φλεγμονή, φαγοκυττάρωση, πολλαπλασιασμό και την απόπτωση [35]. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το ασβέστιο-φωσφατιδυλινοσιτόλη και κυκλικές καταρράκτες ΑΜΡ μπορούν να παίξουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής λειτουργίας, του πολλαπλασιασμού, και διαφοροποίησης ενδομητρίου καρκινογένεση.

Αξίζει να σημειωθεί ότι η μελέτη μας δείχνει επίσης ένα σημαντικό ρόλο του φλεγμονή ρυθμιστικών και RNA πρωτεΐνες δέσμευσης σε υψηλής ποιότητας EMCA. Προς τα πάνω ρύθμιση της προαναφερθείσας αννεξίνης Α1 μαζί με ρύθμιση προς τα κάτω του απολιποπρωτεϊνών, ινωδογόνα και απτοσφαιρίνης προτείνει καταστολή της φλεγμονώδους διαδικασίας σε ιστούς που περιβάλλουν τον όγκο. Η ιντερλευκίνη ενισχυτή δέσμευσης παράγοντα 3 (ILF3 ή NF90) και ετερογενείς ριβονουκλεοπρωτεΐνης Α1 (hnRNP Α1) είναι πρωτεΐνες δέσμευσης RNA που ρυθμίζουν την έκφραση αρκετών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [36] – [38]. Μεταξύ άλλων, η υπερέκφραση του σερπίνης Η1, F-ακτίνης κάλυψης υπομονάδα πρωτεΐνης βήτα (CAPZB), μακροφάγων κάλυψης πρωτεΐνη (CapG), βιλλίνης 2 (EZR) και καθεψίνη Β (CTSB) είναι γνωστό ότι προάγουν την κυτταρική κινητικότητα και εισβολή σε ιστούς όγκων [ ,,,0],39] – [42]. Μεταξύ των πιθανών μοριακών δεικτών που θα μπορούσαν να βοηθήσουν στη διάγνωση ή την πρόγνωση του EMCA, μερικοί όπως PKM2, LDHA και καθεψίνη Β έχουν ήδη διερευνηθεί για το θεραπευτικό δυναμικό τους σε άλλους καρκίνους. Αναστολή της PKM2 και LDHA, χρησιμοποιώντας σύντομης παρεμβολής RNA (siRNA) ή αναστολείς, έδειξαν μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων οφείλεται στην επαγωγή του οξειδωτικού στρες οδηγεί σε απόπτωση [43] – [47]. Επιπλέον, siRNA μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση του PKM2 ευαισθητοποιημένων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα σε σισπλατίνη και δοξορουβικίνη. Το δυναμικό αυτών των πρωτεϊνών για να χρησιμεύσουν ως στόχοι για νέες θεραπείες στοχοθετημένες μοριακών, ως εκ τούτου, πρέπει να προσδιοριστεί στο πλαίσιο του καρκίνου του ενδομητρίου, καθώς και.

Σε αυτή τη μελέτη, η προσέγγιση τρυπάνι-κάτω βελτίωσε τον αριθμό πρωτεϊνών εντοπίζονται, αν και ένα βασικό σύνολο πεπτιδίων ανιχνεύθηκε σε όλα τα πειράματα οποιουδήποτε δεδομένου δείγματος. Αυτές οι περιπτώσεις επανειλημμένων ανίχνευσης οφείλονται σε μεταβολές στο χρόνο κατακράτησης, κορυφή ουράς, πολλαπλές επιβαρύνσεις, καθώς και οι τροποποιήσεις (π.χ., απαμίδωσης και οξείδωσης μεθειονίνης). Μετά την ανάλυση του πρώτου σετ iTRAQ, βελτιώσαμε την ακρίβεια της ένεσης κλάσματος και διευρύνθηκαν τα παράθυρα αποκλεισμού για χρόνο και

m /z

, από ± 5 έως ± 7 λεπτά, και από 100 έως 120 mDa ppm , αντίστοιχα, για να μετριάσουν κάποιες από αυτές τις προκλήσεις. Εμείς επιλέξαμε να μην αποκλείει τα ιόντα με βάση τις διαφορές του φορτίου ή της τροποποίησης, καθώς αυτό θα μπορούσε να αυξηθεί ο κατάλογος αποκλεισμού πέρα ​​από ένα πρακτικό μέγεθος, και επιπλέον εμείς αιτιολογημένη ότι ορισμένα απολύσεων με βάση τις διαφορές του φορτίου ή τροποποίηση μπορεί να χρησιμεύσει για την αύξηση της εμπιστοσύνης των ταυτοποίηση. Έτσι, η επαναληπτική ανάλυση χρησιμοποιήσαμε μια ισορροπία μεταξύ του βάθους της ανάλυσης και ευπείθεια. Ωστόσο, αυτή η ταύτιση μέσω πολλαπλών πεπτιδίων σήμαινε ότι ο αριθμός των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών κατά πάσα πιθανότητα αυξήθηκαν με βραδύτερο ρυθμό από ό, τι θα ήταν δυνατόν αν είχαμε εφαρμόσει την εξαίρεση των διαφορετικών καταστάσεων φορτίου και τροποποιήσεις. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο συνολικός αριθμός των πρωτεϊνών που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη ήταν συγκρίσιμες με εκείνες που προσδιορίζονται στην προηγούμενη μελέτη μας (1,529 έναντι 1,388 πρωτεΐνες, αντίστοιχα), παρά εργάζονται εδώ με μόνο το μισό της ποσότητας του υλικού έναρξης (100 έναντι 200 ​​μg /δείγμα χρησιμοποιηθεί νωρίτερα ) [18].

Εν κατακλείδι, η ανάλυση μας αποκαλύπτει με σαφήνεια τη σημασία της τρυπάνι-κάτω πρωτεομική προσέγγιση σε συνδυασμό με iTRAQ στον εντοπισμό των υποψηφίων βιοδεικτών για καρκίνο του ενδομητρίου. Αυτή η μελέτη αποκαλύπτει επιτυχώς νέα διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών που θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως μοριακοί στόχοι στην διάγνωση ή /και πρόγνωση ενδομητριοειδές EMCA ιστών. Ορισμένες από αυτές τις πρωτεΐνες εμφανίζουν δυναμικά ως μοριακοί στόχοι για θεραπευτικά μέσα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

ενδομητρίου ιστοί ανακτήθηκαν από in-house, αφιερωμένη έρευνα ενδομητρίου ιστού τράπεζα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Η συλλογή και η χρήση των υλικών αυτών εγκρίθηκαν από την ερευνητική δεοντολογία Συμβούλια του πανεπιστημίου της Υόρκης, Mount Sinai Hospital, Πανεπιστήμιο Δίκτυο Υγείας και Γενικό Νοσοκομείο North York. Τα δείγματα προέρχονταν από ασθενείς που υποβάλλονται σε υστερεκτομή ή άλλες κλινικές διαδικασίες που περιλαμβάνουν βιοψίες. Όλα αυτά τα δείγματα ελήφθησαν μετά από έγγραφη συγκατάθεση από όλους τους συμμετέχοντες που εμπλέκονται σε αυτή τη μελέτη.

δείγματα και αντιδραστήρια

Εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά, όλα τα αντιδραστήρια ήταν διαθέσιμα από Sigma-Aldrich (St-Louis, MO ). Για τη μελέτη αυτή, οι περιπτώσεις καρκινώματος ενδομητριοειδές (Τύπου Ι EMCA, n = 10) και την κανονική του ενδομητρίου πολλαπλασιαστική (n = 10) επιλέχθηκαν. Πέντε από τα δείγματα ιστού τύπου I EMCA ήταν από βιοψίες που είχαν εξεταστεί προηγούμενη μελέτη μας. Για πρωτεομική ανάλυση, δείγματα ιστού ελήφθησαν από τον καθρέφτη πρόσωπο του μπλοκ υπόλοιπου χρησιμοποιείται για ιστοπαθολογική αξιολόγηση από τον παθολογοανατόμο. Τα δείγματα ιστού πλύθηκαν τρεις φορές σε ~ 1 κ.εκ. αλατόνερου ρυθμισμένου με φωσφορικό (PBS) με ένα μίγμα αναστολέων πρωτεάσης (1 mM 4- (2-αμινοαιθυλο) βενζολοσουλφονυλο φθορίδιο, 10 μΜ λευπεπτίνη, 1 μg /mL απροτινίνη, και 1 μΜ πεπστατίνη) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Το πλυμένο δείγμα στη συνέχεια ομογενοποιήθηκε σε 0.5 mL PBS με αναστολείς της πρωτεάσης χρησιμοποιώντας μία χειρός ομογενοποιητή, φλας-καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση [18]. Μετά ανάκτηση από την αποθήκευση στους -80 ° C, τα δείγματα αποψύχθηκαν, διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση, και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία Bradford (Bio-Rad, CA). Για όλα τα σύνολα iTRAQ, χρησιμοποιήθηκε ένα δείγμα αναφοράς που περιλαμβάνει μία δεξαμενή των δέκα κανονική πολλαπλασιαστική δείγματα (100 μg κυτταρολύματος από κάθε ιστό). Για κάθε πείραμα, 100 μα πρωτεϊνών υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη και επισημαίνονται ατομικά με την κατάλληλη ετικέτα iTRAQ. Οι αναθέσεις των ετικετών στο δείγμα τύπους τυχαιοποιήθηκαν για να ελαχιστοποιηθεί οποιαδήποτε πιθανή προκατάληψη στην απόδοση επισήμανση μεταξύ των επιμέρους εκδόσεων των ετικετών iTRAQ. Εξετάστηκαν συνολικά επτά σύνολα iTRAQ, η κάθε μία περιλαμβάνει τρία από τα συνολικά 20 μεμονωμένα δείγματα – δέκα EMCA και δέκα κανονική endometria – και την πισίνα αναφοράς. Ποντίκι μονοκλωνικά αντισώματα έναντι calumenin και HNRNPA1 ήταν διαθέσιμα από Abcam, καθεψίνη Β από την Calbiochem, και S100A6 από Santa Cruz Biotech. Πολυκλωνικός γαλακτικής αφυδρογονάσης Α (LDHA) επίσης ελήφθη από την Santa Cruz Biotech.

Ισχυρή ανταλλαγής κατιόντων (SCX) Διαχωρισμός

Κάθε σετ iTRAQ διαχωρίστηκε με SCX χρησιμοποιώντας ένα όργανο ΗΡ1050 HPLC (Agilent, Palo Alto, CA) με 2,1-mm εσωτερική διάμετρος χ 100 mm μήκος ΡοΙγΙΟ πολυσουλφοαιθυλ μια στήλη γεμισμένη με 5-μm σφαιριδίων με 300-Α πόρους (The Nest Group, Southborough, ΜΑ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Εν συντομία, το σύνολο iTRAQ αραιώθηκε με το ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (ταυτόσημη σε σύνθεση με ρυθμιστικό διάλυμα Α: 15 mM ΚΗ

2 ΡΟ

4 σε 25% ακετονιτρίλιο, ρΗ 3.0) σε συνολικό όγκο 1,8 ml, και το ρΗ ρυθμίστηκε σε 3,0 με φωσφορικό οξύ. Το διάλυμα στη συνέχεια διηθήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο σύριγγας 0,45 μm-(Millipore, Cambridge, ΟΝ, Canada) πριν από τη φόρτωση επί της στήλης. Ο διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια γραμμική κλίση δυαδικό σε 1 ώρα, συν 30 λεπτά της στήλης εκ νέου εξισορρόπησης (Πίνακας 4). Όπως περιγράφηκε νωρίτερα, ρυθμιστικό Α ήταν ταυτόσημη προς τη σύνθεση με το ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης? Ρυθμιστικό διάλυμα Β ήταν Buffer Α που περιέχει 350 mM χλωριούχο κάλιο? και Ρυθμιστικό Ο ήταν ρυθμιστικό Α που περιέχει 1 Μ χλωριούχο κάλιο. Κλάσματα συλλέχθηκαν κάθε 2 λεπτά χρησιμοποιώντας ένα SF-2120 Σούπερ κλάσμα συλλέκτη (Advantec MFS, Dublin, CA) μετά από μια αρχική αναμονή των 2 λεπτών για να φιλοξενήσει το κενό όγκο. Αυτό οδήγησε σε συνολικά 30 κλάσματα SCX ανά σετ iTRAQ. Αυτά τα κλάσματα ξηραίνονται χρησιμοποιώντας Speed-Vac (Savant Thermo SC110 Α, Holbrook, ΝΥ) και επανα-διαλύθηκε σε ένα ελάχιστο όγκο 5% ακετονιτρίλιο σε 0.1% μυρμηκικό οξύ: τυπικά 8 μL για κάθε κλάσμα Νο 6-9, 12 μί για Νο 10-13, 16 μL για Νο 14-16, 20 μL για Νο 17-19, 25 μL για Νο 20-21, και 30 μι για τα τελευταία κλάσματα, Νο 22-30. Μεγαλύτεροι όγκοι στα μετέπειτα κλάσματα που επιβάλλεται από την ανάγκη να διαλυθεί πλήρως τα μεγαλύτερα σφαιρίδια άλατος που προκύπτει από το περιεχόμενο αντίστοιχα υψηλότερη άλας τους. Τα κλάσματα Νο 1-5 δεν αναλύθηκαν ήδη κλάσματα ως επί το πλείστον περιείχε iTRAQ υποπροϊόντων.

Η

ανάστροφης φάσης (RP) LC-MS /MS

Τα κλάσματα SCX No. 6-30 από κάθε σετ iTRAQ αναλύθηκαν με απευθείας σύνδεση νανο LC-MS /MS χρησιμοποιώντας το LC Συσκευασίες Ultimate όργανο (Άμστερνταμ, Κάτω Χώρες) εφοδιασμένο με ένα βρόχο δείγματος 10 μL. Ο αυτόματος δειγματολήπτης χρησιμοποιήθηκε στον τρόπο λειτουργίας pick-up μικρολίτρου. Για κάθε δείγμα, 1 μL διαλύματος φορτώθηκε σε μια 5-mm ανάστροφης φάσης (RP) C 18 προστήλη (LC Packings) στους 25 μL /min και πλένεται επί 4 λεπτά πριν από τη μετάβαση του προστήλη σύμφωνα με την στήλη διαχωρισμού. Η στήλη διαχωρισμού που χρησιμοποιήθηκε ήταν ένα 75-μπι-εσωτερική διάμετρο x 150 mm μήκος τριχοειδή στήλη (Integrafrit τριχοειδή από τη Νέα Στόχος, Woburn, ΜΑ) συσκευασμένα σε-σπίτι με χάντρες C18 3,5 μm με 100-Α πόρους από Kromasil (Akzo Nobel /EKA Chemicals Inc, NY). Ο ρυθμός ροής που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό στη στήλη RP ήταν 200 ηΙ /λεπτό. Ο διαλύτης Α ήταν 5% ακετονιτρίλιο σε 0.1% μυρμηκικό οξύ? Διαλύτης Β ήταν 95% ακετονιτρίλιο σε 0.1% μυρμηκικό οξύ. Η κλίση διαλύτης αναλυτικά στον Πίνακα 5. Μια νέα στήλη που χρησιμοποιείται για κάθε σετ iTRAQ.

Η

Online MS /MS πραγματοποιήθηκε σε QSTAR Pulsar υβριδικό τετραπόλου /χρόνου πτήσης (QqTOF) tandem