Αφηρημένο

Η γενιστεΐνη (GEN) είναι ένα φυτό που προέρχεται από ισοφλαβόνες και μπορεί να εμποδίσει την ανεξέλεγκτη ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου μέσω της αναστολής της οδού σηματοδότησης WNT. Αυτή η μελέτη προσπάθησε να ελεγχθεί η υπόθεση ότι η αυξημένη έκφραση του γονιδίου του σηματοδότηση Wnt ανταγωνιστής μονοπάτι, DKK1 με γενιστεΐνη θεραπεία σχετίζεται με επιγενετικές τροποποιήσεις του γονιδίου σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. θεραπεία γενιστεΐνη προκάλεσε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση διακοπή φάσης G2 στην κυτταρική σειρά ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου SW480 και μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τα αποτελέσματα από διάφορες άλλες ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου του κόλου επιβεβαίωσε τα ανασταλτικά αποτελέσματα αύξησης του genistein. Η υπερέκφραση του DKK1 επιβεβαίωσε τη συμμετοχή της στην αναστολή της ανάπτυξης. Knockdown έκφρασης DKK1 με siRNA ελαφρώς προκαλούμενη κυτταρική ανάπτυξη. γονιδιακή έκφραση DKK1 αυξήθηκε με genistein σε SW480 και HCT15 κύτταρα. DNA μεθυλίωση στον υποκινητή DKK1 δεν επηρεάστηκε από genistein θεραπεία σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Από την άλλη πλευρά, προκάλεσε genistein ιστόνης Η3 ακετυλίωση της περιοχής προαγωγού DKK1 σε κύτταρα SW480 και HCT15. Αυτό δείχνει ότι η αυξημένη ακετυλίωση ιστόνης συνδυάζεται με την έκφραση DKK1 genistein που προκαλείται. Η συσχέτιση μεταξύ ακετυλίωση των ιστονών και γονιδιακή έκφραση DKK1 επιβεβαιώνεται από τον αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης τριχοστατίνη Α θεραπεία (TSA). Εν κατακλείδι, η genistein θεραπεία μειώνει την κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. Η επίδραση αυτή σχετίζεται με την αυξημένη έκφραση DKK1 μέσω της επαγωγής της ιστόνης ακετυλίωση στην περιοχή DKK1 υποκινητή

Παράθεση:. Wang Η, Li Q, ο Τσεν H (2012) Γενιστεΐνη Επηρεάζει ιστόνης Τροποποιήσεις στο Dickkopf-σχετική Πρωτεΐνη 1 (DKK1) Gene σε SW480 ανθρώπινου κόλον Γραμμή καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 7 (7): e40955. doi: 10.1371 /journal.pone.0040955

Επιμέλεια: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Μαρτίου 2012? Αποδεκτές: 15 Ιούνη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 του Ιούλη 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση ΝΙΗ /NCI να HC (CA135262) ​​και η Σόγια Συλλόγου Ιλλινόις. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η σόγια περιέχει διάφορα βιοενεργά συστατικά, τα οποία έχουν λάβει μεγάλη προσοχή στο δυναμικό ικανότητά τους να μειώνουν τον κίνδυνο καρκίνου [1], [2]. Επιδημιολογικές μελέτες έδειξαν ότι η κατανάλωση υψηλότερα επίπεδα διαιτητικών προϊόντων σόγιας συμβάλλει στην χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης ορθοκολικού καρκίνου σε ασιατικές χώρες [3], [4], [5]. Συγκεκριμένα, γενιστεΐνη (4, 5, 7-τριυδροξυ-ισοφλαβόνη), ένα φυσικό ισοφλαβόνη άφθονα σε σόγια, έχει αποδειχθεί ότι μειώνει τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος [6], [7]. Αυτές οι μελέτες παρέχουν ισχυρές ενδείξεις για την ανάγκη να διερευνηθούν περαιτέρω οι μηχανισμοί πίσω από αντικαρκινικά δυναμικό genistein του.

Σε μελέτες κυτταρικής καλλιέργειας, genistein έχει αναφερθεί να αλλάξει κυτταρική φυσιολογία σε διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. Μια πρόσφατη μελέτη που πραγματοποιήθηκε από το Fan et al. διαπίστωσε ότι τα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου είχαν αλλάξει μορφολογία, που περιλαμβάνουν συμπύκνωση χρωματίνης και πυρηνική κατάτμηση μετά genistein θεραπεία [8]. Επιπλέον, υψηλότερες συγκεντρώσεις genistein του & gt? 10 μmol /L που επάγεται σημαντικά αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κατάτμησης του DNA σε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά παχέος εντέρου [9]. Επιπλέον, σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου Caco-2 και SW620, ο κυτταρικός θάνατος που επάγεται με αγωγή εκχυλίσματος σόγιας [10]. Ως εκ τούτου, η γενιστεΐνη γίνεται μια πολλά υποσχόμενη ένωση για την πρόληψη και θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε περαιτέρω τους κατά των όγκων ιδιότητες της γενιστεΐνης δοκιμάζοντας πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε διάφορες ορθοκολικό καρκίνο κυττάρων σε απόκριση σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις genistein.

Διάφοροι οδοί και οι μηχανισμοί έχουν προταθεί να είναι υπεύθυνος για την ικανότητα genistein να μειώσει τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου. σηματοδότηση του IGF-IR, ο κανονισμός ΑΚΤ οδού και την ανάπτυξη των κυττάρων που συνδέονται με τις κατά του όγκου αποτελέσματα της γενιστεΐνης [9], [11]. Επιπλέον, η γενιστεΐνη έχει επίσης αντιοξειδωτικές ιδιότητες που μιμούνται τα οιστρογόνα μέσω μεσολάβηση υποδοχέα οιστρογόνου φωσφορυλίωση του ERK1 /2 και την ενεργοποίηση του ΝΡκΒ μονοπάτι [12] σηματοδότησης. Περαιτέρω αναφορές από πρόσφατες μελέτες σε ζώα έδειξαν ότι η genistein ανέστειλε ορμονοεξαρτώμενου ή ανεξάρτητη από τα καρκινικά κύτταρα με τη ρύθμιση αλληλεπιδράσεων μεταξύ της βιταμίνης D και του υποδοχέα οιστρογόνου [13], [14], [15]. Η γενιστεΐνη ρυθμίζει γονιδιακή μεταγραφή σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές με επιγενετικές κανονισμούς, π.χ. μεθυλίωσης του DNA και των ιστονών τροποποιήσεις [16], [17], [18]. Η γενιστεΐνη αλλάζει το DNA μεθυλίωση διαφόρων γονιδίων σε μοντέλα αρουραίου και ποντικού [19], [20]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί πίσω από το ρόλο της γενιστεΐνης στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή απόπτωση κατά τη διάρκεια καρκινογένεση παραμένει λίγο κατανοητή.

Ο Άπτερος-int (WNT) μονοπατιού σηματοδότησης περιλαμβάνει ένα μεγάλο αριθμό αυξητικών παραγόντων που εμπλέκονται στην οργανογένεση, τον πολλαπλασιασμό, την αναγέννηση, προσδιορισμός των κυττάρων μοίρα και προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου [21], [22]. WNT πρωτεΐνες δεσμεύονται σε υποδοχείς Frizzled (FRZ) και χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη υποδοχέα που σχετίζονται με πρωτεΐνη (LRP) συν-υποδοχείς, προκαλώντας κυτοσολίου σταθεροποίηση β-κατενίνης και τη συσσώρευση. Κατά συνέπεια, η πυρηνική αυξήσεις β-κατενίνης και σύμπλοκα με παράγοντες μεταγραφής TCF /LEF, που οδηγεί στην αυξημένη μεταγραφή των γονιδίων στόχων, συμπεριλαμβανομένων κυκλίνης D1 [23]. Η παρεκκλίνουσα σηματοδότηση WNT είναι ένας από τους συντελεστές για τη μετάβαση από την κανονική επιθήλιο του κόλου σε κακοήθη κύτταρα όγκου [24], [25]. Η γενιστεΐνη αναφέρθηκε πρόσφατα για την καταστολή σηματοδότηση Wnt σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου [26], [27], το οποίο παρέχει ένα δυναμικό μηχανισμό για την αντικαρκινική ικανότητα της γενιστεΐνης.

Ένα από τα βασικά ρυθμιστές του WNT οδού σηματοδότησης είναι ανταγωνιστής του Dickkopf 1 (DKK1). DKK1 αποτρέπει β-κατενίνης μεσολάβηση της μεταγωγής σήματος μέσω σύνδεσης σε LRP και πρωτεΐνες Kremen, προωθώντας κύτταρα διαφοροποίησης και απόπτωσης [28], [29], [30], [31], [32]. Η σίγαση ή απώλεια DKK1 έχει τεκμηριωθεί σε διάφορες ασθένειες. Σε καρκίνο του παχέος εντέρου σιγήσει

DKK1

έκφραση είναι στενά συνδέεται με αστάθεια μικροδορυφόρου των υποτύπων του όγκου [33]. Έχει αναφερθεί ότι η ικανότητα καταστολής του όγκου του DKK1 καταστέλλεται από την υπερμεθυλίωση προαγωγέα της στα προχωρημένα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου [34]. Σε κύτταρα ανθρώπινου νεφρικού καρκινώματος, χημικά που επάγουν ακετυλίωση ιστονών στον υποκινητή DKK1 ως αποτέλεσμα την εκ νέου ενεργοποίηση της έκφρασης DKK1, αποδεικνύοντας ότι εκτός από την DNA μεθυλίωση, τροποποιήσεις των ιστονών ουρά θα μπορούσε επίσης να συμβάλλει στην μεταγραφικό έλεγχο των κρίσιμων γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο ανάπτυξη [ ,,,0],35].

στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τις αντικαρκινικές ιδιότητες της γενιστεΐνης προσδιορίζοντας τα αποτελέσματά της για τον καρκίνο κυτταρική φυσιολογία και την εξέταση της μηχανιστική βάση της

DKK1

ενεργοποίηση. Ειδικότερα, η μελέτη αυτή είναι μεταξύ των πρώτων να συνδέσει genistein μεσολάβηση επιγενετικές τροποποιήσεις του

DKK1

τις αντικαρκινικές ιδιότητες της γενιστεΐνης σε καρκίνο του παχέος εντέρου.

Αποτελέσματα

Γενιστεΐνη Θεραπεία Επιλεκτικά που προκαλείται DKK1 Gene Expression, αλλά δεν μετέβαλε DKK1 υποστηρικτής μοτίβα μεθυλίωσης

για να διερευνηθεί η συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης του DNA στο

DKK1

υποστηρικτής νησί CpG και την επίδραση της genistein θεραπεία για

DKK1

έκφρασης, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR πραγματοποιήθηκε για τη μέτρηση της

έκφραση DKK1

mRNA και μεθυλίωσης συγκεκριμένων αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (MSP) και όξινο θειώδες αλληλουχίας (BSF) του

DKK1 περιοχή του υποκινητή

πραγματοποιήθηκαν για να εξετάσει την κατάσταση μεθυλίωσης προαγωγό (Εικ. 1). Πρώτον,

έκφραση DKK1

γονίδιο αναλύθηκε σε διαθέσιμα καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές για να διερευνηθούν οι επιδράσεις από τη θεραπεία genistein. Μεταξύ των κυτταρικών σειρών που ελέγχθηκαν, SW480 και HCT15 κύτταρα παρουσίασαν επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου DKK1 με γενιστεΐνη (Εικ. 1Α). Ανάλυση της μεθυλίωσης του DNA στο

DKK1

περιοχή υποκινητή επιβεβαίωσε ότι η γονιδιακή έκφραση DKK1 γενικά είναι αντιστρόφως ανάλογη με το επίπεδο μεθυλίωσης της περιοχής που δοκιμάστηκε (-159 /+ 109, Σχ. 1Β, 1C, και 1D) . Συγκεκριμένα, RKO, SW48, και DLD-1 κύτταρα παρουσίασαν πολύ υψηλή, αν όχι πλήρης, μεθυλίωση της περιοχής (Εικ. 1 C, και 1 D). Αυτή η υπερμεθυλίωση είναι αντιστρόφως ανάλογη με το επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης DKK1 όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α. Για τους DKK1-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν HCT15, ΗΤ29, και SW480, υπάρχει ελάχιστη μεθυλίωση του DNA που παρατηρήθηκε (Σχ. 1C και 1D). Το πιο σημαντικό, genistein θεραπεία δεν μετέβαλλε την μεθυλίωση του DNA του

DKK1

περιοχή προαγωγού σε οποιεσδήποτε κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, ανεξάρτητα από το επίπεδο της μεθυλίωσης του DNA στην περιοχή (Σχ. 1C και 1D).

SW480, DLD-1, HCT15, ΗΤ29, RKO και SW48 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με genistein για 2 ημέρες πριν από τη συλλογή του δείγματος για περαιτέρω ανάλυση. Α) Η σχετική έκφραση DKK1 mRNA. έκφραση mRNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας RT-PCR. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με τον εσωτερικό έλεγχο L7A. Τρία ανεξάρτητα δείγματα κυττάρων αναλύθηκαν και παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± SEM. Οι αστερίσκοι (*) υποδεικνύουν στατιστική σημασία σε σύγκριση με τον έλεγχο κατά την ίδια κυτταρική γραμμή (ρ & lt? 0,05). Β) Σχηματικό διάγραμμα της περιοχής DKK1 υποκινητή. Οριζόντια μπάρα αντιπροσωπεύει το CpG νησίδα μέσα στην περιοχή υποκινητή. Οι κάθετες μπάρες δείχνουν επιμέρους τόπους CpG. Μαύρα βέλη υποδεικνύουν τις θέσεις των εκκινητών που χρησιμοποιούνται στην PCR ενισχύσεις για Bisulfite αλληλουχίας (-159 να 109). Τα βέλη αντιπροσωπεύουν τις θέσεις των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για PCR ενισχύσεις σε MSP (-60~ + 73). Γ) MSP της περιοχής του υποκινητή DKK1 στο HCT15, ΗΤ29, RKO και SW48. Υ-άξονας αντιπροσωπεύει το επίπεδο μεθυλίωσης και οι τιμές υπολογίζονται ως ποσοστό των Μ /(Μ + UM). Όταν δεν φαίνεται, οι ράβδοι σφάλματος είναι μέσα στις στήλες. Δ) Bisulfite αλληλούχιση της περιοχής προαγωγού DKK1 σε SW480 και κύτταρα DLD-1. Κάθε ανοικτός κύκλος αντιπροσωπεύει μια μη μεθυλιωμένη C εντός CpG ενώ ένα γεμάτο κύκλος αντιπροσωπεύει μια μεθυλιωμένη C μέσα σε ένα CpG. Κάθε σειρά από κύκλους αντιπροσωπεύει ένα άτομο κλώνος που χρησιμοποιείται για αλληλούχιση.

Η

Γενιστεΐνη δόση και το χρόνο εξαρτώμενο από την έκφραση που προκαλείται DKK1 Gene

Σε πραγματικό χρόνο εκτελέστηκε RT-PCR για τη μέτρηση

επίπεδα έκφρασης του mRNA DKK1

σε απόκριση σε διαφορετικές δόσεις γενιστεΐνης και χρόνους έκθεσης. Συνολικά,

DKK1

έκφραση αυξήθηκε με genistein με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 2Α). Μετά από 2 d γενιστεΐνης θεραπεία,

έκφραση DKK1

mRNA ήταν 3-φορές και 8-φορές υψηλότερη μετά τις επεξεργασίες 50 και 75 μmol /L γενιστεΐνη αντίστοιχα, σε σύγκριση με την μη-genistein ελέγχου (ρ & lt? 0,05, Σχ. 2Α). Το επίπεδο του mRNA της

DKK1

σε κύτταρα SW480 αυξήθηκε επίσης με γενιστεΐνη κατεργασία (75 μmol /L) σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Β). Και έφθασε σε & gt? 10-πλάσια επαγωγή στα d 4 σε σύγκριση στο επίπεδο του ελέγχου DMSO.

Α) κύτταρα SW480 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διάφορες συγκεντρώσεις genistein για 2 d. έκφραση mRNA αναλύθηκε με RT-PCR. Χ-άξονας δείχνει συγκεντρώσεις genistein και γ-άξονας δείχνει το σχετικό επίπεδο έκφρασης του mRNA. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με τον εσωτερικό έλεγχο L7A. Οι αστερίσκοι (*) υποδεικνύουν στατιστική σημασία σε σύγκριση με 0 μmol /L γενιστεΐνη (

ρ

& lt? 0,05). Β) Χρονική πορεία της

DKK1

έκφραση σε SW480 παρακάτω genistein θεραπεία. SW480 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 75 μmol /L της γενιστεΐνης και δειγματοληψία κατά την ημέρα 1, 2, 3 και 4 της θεραπείας. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με τον εσωτερικό έλεγχο L7A. Τρία ανεξάρτητα πειράματα και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. Όταν αόρατα, οι ράβδοι σφάλματος που περιέχονται εντός των ράβδων. Οι αστερίσκοι (*) υποδεικνύουν στατιστική σημασία σε σύγκριση με d 1 75 μmol /L γενιστεΐνη (

ρ

& lt? 0,05). Γ) έκφραση της πρωτεΐνης DKK1. Ολόκληρο εκχυλίσματα κυτταρικής πρωτεΐνης συλλέχθηκαν από κύτταρα SW480 και ανάλυση κηλίδας Western των DKK1 διεξήχθη όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Μια κηλίδα από ανάλυση Western δείχνεται και η ποσοτικοποίηση αντιπροσωπεύει το μέσο ± SEM από 3 ανεξάρτητα δείγματα. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι αστερίσκοι (*) δηλώνουν στατιστική σημαντικότητα σε σχέση με τον έλεγχο 0 μmol /L γενιστεΐνη (

σ

& lt? 0,05).

Η

Η επαγωγή του

DKK1

επιβεβαιώθηκε από μετρώντας το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης σε SW480 κύτταρα (Σχ. 2C). DKK1 έκφραση πρωτεΐνης έδειξε μια 3-πλάσια επαγωγή κατά 75 μmol /L της γενιστεΐνης θεραπείας σε SW480 κύτταρα μετά από μια 4-d θεραπεία σε σύγκριση με το μάρτυρα.

γενιστεΐνη Σαθεροποιημένο κυτταρικού κύκλου Πρόοδος σε SW480 κύτταρα

για να διερευνηθεί η επίδραση της γενιστεΐνης στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων SW480, η περιεκτικότητα σε DNA των κυττάρων SW480 μετρήθηκε με κατάλληλο ανάλυση περιοχή μετά την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Ιστογράμματα έδειξε ότι ο πληθυσμός των κυττάρων στο G1 ήταν σημαντικά μειώθηκε κατά 75 μmol /L της γενιστεΐνης θεραπεία σε σύγκριση με την μη-genistein ελέγχου, με μείωση των κυττάρων στη φάση S (Σχ. 3Α). Από την άλλη πλευρά, η genistein θεραπεία οδήγησε σε συσσώρευση κυττάρων σε G2 φάση /M σε κύτταρα SW480.

SW480 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις genistein για 2 ημέρες πριν από τη συλλογή του δείγματος. Α) Αντιπροσωπευτική ιστογράμματα DNA του genistein μεταχείριση των 0 και 75 μmol /L με κυτταρομετρία ροής. Υ-άξονας αντιπροσωπεύει το σχετικό περιεχόμενο σε DNA και χ-άξονας δείχνει τα στάδια του κυτταρικού κύκλου. Β) Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου γενιστεΐνης κατεργασμένων κυττάρων. Το ποσοστό των κυττάρων σε G1 (•), S (▴) ή G2 /M (▪) παρουσιάζεται. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Γ) WST-1 δοκιμασία πολλαπλασιασμού. WST-1 σήματα από κάθε φρεάτιο μετρήθηκαν στα 450 nm για απορρόφηση σε σχέση με το μήκος κύματος αναφοράς 630 nm. Η απορρόφηση μετατράπηκε σε πραγματικό αριθμό των κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο δημιουργείται από σειριακές αραιώσεις ενός γνωστού αριθμού των κυττάρων. Τρία ανεξάρτητα δείγματα κυττάρων αναλύθηκαν και παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± SEM. Οι αστερίσκοι (*) υποδεικνύουν στατιστική σημασία σε σύγκριση με 0 μmol /L της γενιστεΐνης (

ρ

& lt? 0,05).

Η

Οι επιδράσεις της γενιστεΐνης στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν περαιτέρω με κατεργασία των κυττάρων με γενιστεΐνη σε συγκεντρώσεις από 1 έως 75 μmol /L. Ποσοστό κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις υπολογίστηκε ως ο λόγος των gated κυττάρων με το συνολικό πληθυσμό κυττάρων. Οι συγκεντρώσεις γενιστεΐνη πάνω από 5 μmol /L αύξησε το ποσοστό των κυττάρων στη G2 /M φάση σημαντικά (ρ & lt? 0,05) με την υψηλότερη συσσώρευση παρατηρήθηκε σε 75 μmol /L της γενιστεΐνης (ρ & lt? 0,05, Σχήμα 3Β.). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το ποσοστό των κυττάρων στη φάση G1 καταργήθηκε ακόλουθες 75 μmol /L της θεραπείας γενιστεΐνης (Σχ. 3Β). Το ποσοστό των κυττάρων S φάσης ήταν σημαντικά μειωμένη (ρ & lt? 0,05) μετά 50 και 75 μmol /L γενιστεΐνης θεραπείες μετά από μια παροδική αύξηση κατά 25 μmol /L γενιστεΐνης σε σύγκριση με το μη-genistein ελέγχου. Στο σύνολό τους, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα SW480 ρυθμιζόταν από genistein με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο.

γενιστεΐνη ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε SW480 και ορισμένων άλλων γραμμών κυττάρων καρκίνου κόλου

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εξετάσθηκε με η δοκιμασία WST-1, η οποία έδειξε ότι η γενιστεΐνη θεραπείες μειώθηκε στους αριθμούς των κυττάρων των κυττάρων SW480 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 3C). Σε genistein συγκεντρώσεις πάνω από τους αριθμούς κυττάρων /L 15 μmol ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με το μη-genistein ελέγχου (p & lt? 0,05). Αυτή η αντι-πολλαπλασιαστική δράση της γενιστεΐνης επιβεβαιώθηκε σε διάφορες καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές (Σχήμα S1). Η δοκιμασία ιωδιούχο προπίδιο Αηηβχίην-δεν έδειξε μεταβολή από οποιαδήποτε από τις θεραπείες genistein, υποδεικνύοντας ότι η genistein δεν επηρεάζει το ρυθμό απόπτωσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αύξηση της καταστολής επίδραση της γενιστεΐνης είναι γενικευθούν σε κοινές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου.

κυκλίνης D1 mRNA έκφραση Μειώθηκε παρακάτω Γενιστεΐνη Θεραπεία σε SW480 κύτταρα

γονίδια ελέγχου κυτταρικού κύκλου

p21

,

κυκλίνης D1

και

c-myc

συσχετίζονται σε μεγάλο βαθμό με τη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης. Με βάση τα στοιχεία που παρουσιάζονται παραπάνω, διακοπή του κυτταρικού κύκλου εμφανίστηκαν σε G2 σε κύτταρα SW480 με γενιστεΐνη θεραπεία. Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις επιπτώσεις της genistein για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, η έκφραση του mRNA των γονιδίων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου

p21

,

κυκλίνης D1

και

c-myc

μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση του

Κυκλίνη D1

μειώθηκε σημαντικά (ρ & lt? 0,05) κατά 50 και 75 μmol /L της γενιστεΐνης σύγκριση με τον έλεγχο (Σχήμα 4, ρ & lt?. 0.05). Η έκφραση του

p21

και

c-myc

δεν επηρεάστηκε από οποιαδήποτε από τις θεραπείες genistein. Η μειωμένη έκφραση του

Κυκλίνη D1

είναι σε συμφωνία με τα δεδομένα κυτταρικού κύκλου από κυτταρομετρία ροής που δείχνουν ότι η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου ανεστάλη με γενιστεΐνη θεραπεία.

SW480 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 1, 5 , 15, 25, 50 ή 75 μmol /L της γενιστεΐνης για 2 ημέρες. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της

p21, Κυκλίνη D1

και

c-MYC

μετρήθηκαν με RT-PCR. L7A χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Τρία ανεξάρτητα πειράματα αναλύθηκε και παρουσιάστηκε ως η μέση τιμή ± SEM. Οι αστερίσκοι (*) δηλώνουν στατιστική σημαντικότητα σε σχέση με τον έλεγχο, 0 μmol /L γενιστεΐνη (

σ

& lt? 0,05).

Η

Η υπερέκφραση του DKK1 Αναστολή κυτταρικού κύκλου Εξέλιξη και κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε SW480 κύτταρα

Για να διερευνήσουν τον πιθανό ρόλο του

DKK1

στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, SW480 κύτταρα επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο pCMV-XL5 που περιέχουν ανθρώπινο

DKK1

. Η υπερέκφραση του

DKK1

επιβεβαιώθηκε με ανάλυση RT-PCR του mRNA και η ανάλυση στυπώματος Western των πρωτεϊνών (Σχ. 5Α και 5Β). Ανάλυση των

Κυκλίνη D1

έκφραση έδειξε ότι η υπερέκφραση του DKK1 προκάλεσε παρόμοιες καταστολή της έκφρασης του γονιδίου ως την αγωγή γενιστεΐνη (Εικ. 5Α). Η υπερέκφραση του

DKK1

αύξησε σημαντικά το ποσοστό των κυττάρων στη G2 /M φάση σε σύγκριση με τον φορέα ελέγχου (ρ & lt?. 0.05, Σχήμα 5C), αν και σε μικρότερο βαθμό σε σύγκριση με τη θεραπεία γενιστεΐνη. Εν τω μεταξύ, το ποσοστό των κυττάρων στην G1 φάση μειώθηκε σημαντικά σε κύτταρα που υπερεκφράζουν DKK1 (ρ & lt? 0,05), και δεν υπήρχε σημαντική μεταβολή στον αριθμό των κυττάρων στην S φάση. Τα αποτελέσματα από την δοκιμασία WST-1 έδειξε ότι η υπερέκφραση του

DKK1

μείωσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SW480, αν και σε πολύ μικρότερη έκταση σε σύγκριση με τη θεραπεία γενιστεΐνη (ρ & lt? 0,05, Σχήμα 5D).. Συνολικά, η υπερέκφραση του

DKK1

παράγονται παρόμοια αποτελέσματα επί την αναστολή της εξελίξεως των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων όπως και η θεραπεία genistein, υποδηλώνοντας ένα ρόλο DKK1 σε αυτά τα κυτταρικά γεγονότα.

διάνυσμα pCMV περιέχει ανθρώπινο

DKK1

γονίδιο χρησιμοποιήθηκε για να διαμολύνει κύτταρα πριν από τη συλλογή του δείγματος για ανάλυση. Κενό φορέα ρΟΜν χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για τα πειράματα υπερέκφραση. Τρία ανεξάρτητα δείγματα κυττάρων αναλύθηκαν και παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± SEM. Α) η έκφραση του mRNA της

DKK1

και

κυκλίνης D1

στην τακτική και

DKK1

επιμολυσμένα SW480 κύτταρα. Η έκφραση mRNA αναλύθηκε με RT-PCR. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με τον εσωτερικό έλεγχο L7A. Β) έκφραση πρωτεΐνης DKK1 σε τακτική κύτταρα και επιμολυσμένα SW480 κύτταρα. Ολόκληρο εκχυλίσματα κυτταρικής πρωτεΐνης συλλέχθηκαν από επιμολυσμένα κύτταρα SW480 και ανάλυση κηλίδας Western των DKK1 διεξήχθη όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Ένα αντιπροσωπευτικό κηλίδα εμφανίζεται και ο ποσοτικός προσδιορισμός αντιπροσωπεύει την μέση τιμή ± SEM από 3 ανεξάρτητες πιάτα. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Γ) Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου των τακτικών και

DKK1

επιμολυσμένα SW480 κύτταρα. Αποτέλεσμα ελήφθη με κυτταρομετρία ροής. Υ-άξονας αντιπροσωπεύει% των κυττάρων και περιφραγμένο χ-άξονας δείχνει διάφορα στάδια του κυτταρικού κύκλου, περιλαμβανομένων των G1, S και G2 /M. Δ) WST-1 δοκιμασία πολλαπλασιασμού σε οργανισμούς φορείς και

DKK1

επιμολυσμένα SW480 κύτταρα. σήματα WST-1 μετατράπηκαν σε πραγματικό αριθμό των κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο δημιουργείται από σειριακές αραιώσεις ενός γνωστού αριθμού των κυττάρων. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν για να ελεγχθεί genistein θεραπεία και φορέα για DKK1 επιμόλυνση, αντίστοιχα. Οι αστερίσκοι (*) δηλώνουν στατιστική σημαντικότητα σε σύγκριση με την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου (genistein για τον έλεγχο? DKK1 στο φορέα?

σ

& lt? 0,05). Για την knockdown του DKK1, siRNA διπόλων έναντι ανθρώπινου γονιδίου DKK1 επιμολύνθηκαν σε κύτταρα SW480. Κωδικοποιημένα ακολουθίες χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος siRNA. Ε) η έκφραση του mRNA της

DKK1

και

κυκλίνης D1

στον έλεγχο siRNA (N /S si) και

DKK1

siRNA (DKK1 si) επεξεργασμένων με SW480 κύτταρα από τον έλεγχο και την γενιστεΐνη θεραπείες. Η έκφραση mRNA αναλύθηκε με RT-PCR. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με τον εσωτερικό έλεγχο L7A. F) WST-1 δοκιμασία πολλαπλασιασμού στον έλεγχο siRNA και κυττάρων

DKK1

siRNA SW480. σήματα WST-1 μετατράπηκαν σε πραγματικό αριθμό των κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο δημιουργείται από σειριακές αραιώσεις ενός γνωστού αριθμού των κυττάρων. Οι αστερίσκοι (*) υποδεικνύουν στατιστική σημασία σε σύγκριση με τον έλεγχο 0 μmol /L γενιστεΐνη (

ρ

& lt? 0,05). Ο βραχίονας δείχνει στατιστική διαφορά μεταξύ των ομάδων N /S si και DKK1 si αντιμετωπίζονται με genistein (p = 0,002).

Η

Νοκ ντάουν της DKK1 σε SW480 κύτταρα αντιστράφηκε εν μέρει τις αλλαγές της Κυτταρικής Προφίλ Προκαλείται από Γενιστεΐνη Θεραπεία

για να διερευνήσουν κατά πόσον η μεταβολή της κυτταρικής ιδιότητες των SW480 που προκαλείται από genistein εξαρτάται από το

DKK1 έκφραση

γονιδίου, siRNA DKK1 στόχευση μετασκευάστηκε σε κύτταρα SW480 που ακολουθείται από genistein θεραπεία. Real-time RT-PCR έδειξε ότι siRNA μείωσε αποτελεσματικά την έκφραση DKK1 στο SW480 και στις δύο θεραπείες ελέγχου και genistein (p & lt?. 0.05, Σχήμα 5Ε). Επιπλέον, η μείωση του

κυκλίνης D1

έκφραση του mRNA από genistein θεραπείας όπως παρατηρήθηκε σε μη-ειδικά κύτταρα siRNA-αγωγή (N /S si) καταργήθηκε από το νοκ ντάουν της DKK1 (DKK1 si, σχ. 5Ε). Εν τω μεταξύ, αν και παρατηρείται η ανάπτυξη ανασταλτική επίδραση από γενιστεΐνη τόσο N /S siRNA και

ομάδες DKK1

siRNA, knockdown του DKK1 αύξησε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SW480 σε σύγκριση με εκείνη του ελέγχου siRNA σε genistein θεραπεία (ρ & lt ?.. 0.05, DKK1 siRNA vs N /S siRNA σε θεραπείες genistein, Σχήμα 5F)

γενιστεΐνη Induced ακετυλίωση των ιστονών εντός της DKK1 Gene στο SW480 και HCT15 κύτταρα

ChIP έγινε για να αναλυθεί η δομή χρωματίνης στον υποκινητή (-96 /-28), που κωδικοποιεί (+ 635 /+ 742), και 5 ‘ανάντη περιοχές ελέγχου (-2781 /-2713) του

DKK1

γονίδιο (Εικ. 6Α) . ανοδική περιοχή ελέγχου 5 ‘χρησιμοποιήθηκε ως ένας αρνητικός έλεγχος για να δείξει τη σχετική ανενεργή περιοχή κατά τη διάρκεια της μεταγραφής. κυττάρων DLD-1 χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός μάρτυρας για να δείξει την κατάσταση της χρωματίνης, όταν το

έκφραση DKK1

γονίδιο σιωπήσει και να μην ανταποκρίνεται στη θεραπεία genistein. Κανονική IgG κουνελιού χρησιμοποιήθηκε ως ένα αντίσωμα εσωτερικού ελέγχου και δέσμευσης κάθε DNA που είναι παρόμοια με την πρόσδεση στο IgG ελέγχου θεωρήθηκε μη ειδική. Αυξημένη RNA πολυμεράση ΙΙ (PolII) σύνδεση στο

DKK1

περιοχή του υποκινητή ενδεικνυόμενη αυξημένη μεταγραφή του

DKK1

γονιδίου στα κύτταρα SW480 σε απάντηση genistein (p & lt? 0.05, Σχήμα 6Β.). Σε αντίθεση, υπήρξε ελάχιστη PolII δεσμευτική εντός των

DKK1

γονιδίων σε κύτταρα DLD-1, επιβεβαιώνοντας την σιγήσει μεταγραφή του γονιδίου σε DLD-1 κύτταρα (Σχ. 6Β).

Α) Ένα σχηματικό διάγραμμα του

DKK1

γονίδιο. Μαύρα βέλη αντιπροσωπεύουν εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την PCR για τη δοκιμή τρεις περιοχές στη δοκιμασία Chip: υποκινητή, κωδικοποίηση και ανάντη ελέγχου 5 ‘. Γεμιστά κουτιά αντιπροσωπεύουν εξόνια του

DKK1

γονίδιο, ενώ το ανοιχτό παράθυρο αντιπροσωπεύει το

DKK1

υποκινητή. Μαύρες γραμμές αντιπροσωπεύουν εσώνια. Β) Ανάλυση μάρκα της σχετικής αφθονίας της πρωτεΐνης μέσα σε διάφορες περιοχές του

DKK1

γονιδίου σε SW480 και κύτταρα DLD-1. Ανοσοκαταβυθισμένες DNA αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Ειδικά αντισώματα χρησιμοποιούνται για ανοσοκαθίζηση επισημαίνονται στον χ-άξονα. Ένα μη ειδικό IgG κουνελιού χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Τα δεδομένα σχεδιάστηκαν ως η αναλογία με την τιμή από το 25% του DNA εισόδου. Τρία ανεξάρτητα πειράματα αναλύθηκαν και παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± SEM. Οι αστερίσκοι (*) δηλώνουν στατιστική σημαντικότητα σε σχέση με τον έλεγχο χρησιμοποιώντας το ίδιο αντίσωμα εντός της κυτταρικής σειράς (p & lt? 0,05).

Η

Για να προσδιορίσετε αν το αυξημένο επίπεδο μεταγραφής του

DKK1

γονιδίου σε απόκριση προς genistein διαμορφωνόταν από αλλαγές της χρωματίνης δομή, αντισώματα κατά ακετυλιωμένη, μεθυλιωμένες, ή φωσφορυλιωμένη ιστόνες χρησιμοποιήθηκαν στη δοκιμασία chip. τροποποιήσεις ιστόνης στις τρεις αντιπροσωπευτικές περιοχές του

DKK1

γονίδιο εξετάστηκαν πρώτα σε SW480 κύτταρα μετά την επεξεργασία genistein, χρησιμοποιώντας κύτταρα DLD-1 ως αρνητικός έλεγχος. Αυξήσεις στην ακετυλιωμένη ιστόνη Η3 στον υποκινητή και περιοχές κωδικοποίησης του

DKK1

παρατηρήθηκαν σε κύτταρα SW480 μετά την επεξεργασία genistein (ρ & lt?. 0.05, Σχήμα 6Β, H3Ac), χωρίς σημαντική ακετυλίωση των ιστονών σε DLD-1 κύτταρα πριν ή μετά τη θεραπεία genistein (Εικ. 6Β). Η αφθονία του άλλου ακετυλιωμένης ιστόνης που δοκιμάστηκαν, ακετυλιωμένης ιστόνης Η4, δεν επηρεάστηκε από τη θεραπεία genistein είτε κυτταρικές γραμμές (H4Ac). Αν και υπήρχε ένα πολύ υψηλότερο επίπεδο διμεθυλο ιστόνης Η3 λυσίνης 4 σε κύτταρα SW480 συγκριτικά με κύτταρα DLD-1, genistein αγωγή δεν επηρέασε την κατάσταση μεθυλίωσης αυτού του υπολείμματος ιστόνης Η3 (Σχ. 6Β, H3K4Me2). Η φωσφορυλίωση ιστόνης Η3 στη σερίνη 10 διερευνήθηκε επίσης και το αποτέλεσμα έδειξε ότι υπήρχε μια μέτρια μείωση σε διάφορες περιοχές του

DKK1

γονιδίου με genistein θεραπεία σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (ρ & lt?. 0.05, Σχ 6Β, H3S10p). Εν ολίγοις, η ενεργός μεταγραφή του

DKK1

γονίδιο που συνδέεται με την αύξηση της ιστόνης Η3 ακετυλίωση σε γονιδιακή περιοχή, η οποία πιθανότατα είχε ως αποτέλεσμα την πρόσληψη PolII υποστηρικτής του.

DKK1 mRNA Έκφραση προκλήθηκε με δεακετυλάσης ιστόνης (HDAC) αναστολέα σε SW480 κύτταρα

TSA είναι ένα αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC) αναστολέα που αλληλεπιδρά με τα περισσότερα από τα μέλη της οικογένειας HDAC και επάγει την ακετυλίωση των ιστονών. Για την επιβεβαίωση των επιδράσεων της γενιστεΐνης επαγόμενης ακετυλίωση ιστονών στο

DKK1

μεταγραφή, υποβάλλαμε σε αγωγή SW480 κύτταρα με μία σειρά συγκεντρώσεων TSA και συγκρίθηκαν τα αποτελέσματα σε γενιστεΐνη θεραπεία. Η έκφραση του mRNA του

DKK1

αυξήθηκε σημαντικά με την κατεργασία TSA με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, παρόμοιο με το αποτέλεσμα που παρατηρείται από γενιστεΐνη θεραπεία (ρ & lt?. 0.05, Σχήμα 7).

επίπεδο DKK1

mRNA αναλύθηκε σε κύτταρα SW480 σε επεξεργασία με 50, 100 ή 200 nmol /L TSA (TSA50, TSA100, και TSA200, αντίστοιχα) για 1 d. θεραπεία γενιστεΐνη έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως. επίπεδο έκφρασης mRNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας RT-PCR. Τρία ανεξάρτητα δείγματα κυττάρων αναλύθηκαν και παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± SEM. Τιμές με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν (

σ

& lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη αποσκοπεί να εντοπίσει τους πιθανούς μηχανισμούς των αντικαρκινικών επιπτώσεων της genistein. Παρατηρήσαμε ότι τα επίπεδα τόσο του mRNA και της πρωτεΐνης του DKK1 ήταν προς τα πάνω ρυθμισμένη με γενιστεΐνη θεραπεία. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η genistein θεραπεία επάγεται αναστολή του κυτταρικού κύκλου και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ανέστειλαν SW480 καρκινικά κύτταρα κόλου. Αυτό επιβεβαιώθηκε αργότερα σε διάφορες άλλες καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές. Τόσο υπερέκφραση και knockdown του

DKK1

επιβεβαίωσε την εμπλοκή του DKK1 στην αναστολή της προόδου του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Το αποτέλεσμά μας έδειξαν ότι η αυξημένη έκφραση DKK1 μπορεί να είναι ένας από τους λόγους που προκάλεσαν την διακοπή του κυτταρικού κύκλου και η αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με γενιστεΐνη θεραπεία. Επιπλέον, η σύγκριση μεταξύ των

DKK1

εκφράζοντα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων HCT15, ΗΤ29 και SW480, και τις

DKK1

-repressed κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων RKO, SW48 και DLD-1 έδειξε ότι το γονίδιο μεταγραφή του

DKK1

είναι αντιστρόφως ανάλογη προς την κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή. Genistein δεν επηρεάζει την μεθυλίωση του DNA του

DKK1

υποκινητή. Από την άλλη πλευρά και το πιο σημαντικό, έχουμε κάνει την παρατήρηση ότι η genistein επάγει ακετυλίωσης ιστόνης εντός του

DKK1

γονίδιο και αυτό συσχετίζεται με την ενεργοποίηση της μεταγραφής του γονιδίου της.

Η αντικαρκινική ρόλους genistein, συμπεριλαμβανομένης της προαγωγής της απόπτωσης, η αναστολή της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και εισβολή, ο αποκλεισμός της αγγειογένεσης και της μετάστασης σε διάφορους τύπους καρκίνων έχουν τεκμηριωθεί καλώς [7], [36], [37], [38]. Οι μοριακοί μηχανισμοί πίσω από αυτές τις αντικαρκινικές λειτουργίες της γενιστεΐνης περιλαμβάνουν διαμορφώσεων των αναστολέων του κυτταρικού κύκλου, η ρύθμιση των γονιδίων απόπτωσης συνδέονται, όπως επίσης και η αναστολή της IGF-IR και ΡΙ3Κ /ΑΚΤ σηματοδότηση [11], [39], [40], [41]. Εργασία από την ομάδα μας έχει δείξει ότι η genistein αναστέλλεται άλλη κρίσιμη οδό για την ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου, μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης, παρεμβαίνοντας στη μεθυλίωση προαγωγού ειδικών γονιδίων. Συγκεκριμένα, γενιστεΐνη επαγόμενη

WNT5a

έκφραση μειώνοντας την μεθυλίωση εντός περιοχής του υποκινητή του γονιδίου [27]. Η genistein επίσης ανέστειλε την οδό /β-κατενίνης WNT ενεργοποιώντας ένα άλλο ανταγωνιστή WNT,

sFRP2

, με απομεθυλίωση νησίδια CpG εντός του γονιδίου [26]. Η παρούσα μελέτη επεκτείνει τη γνώση για να συμπεριλάβει DKK1 ως ένας άλλος παράγοντας στη σηματοδότηση Wnt που διαμεσολαβεί την απάντηση από τη θεραπεία genistein. Ως καταστολέας της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων, DKK1 είναι μια κύρια ανταγωνιστής που παρεμβαίνει μονοπάτι Wnt και ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση των γονιδίων στόχων κατάντη συμπεριλαμβανομένων Κυκλίνη D1 [28], [42], [43].

Η έκφραση DKK1 σίγησε από υπερμεθυλίωση προαγωγού σε προχωρημένο στάδιο του καρκίνου του παχέος εντέρου (C κατά Dukes και Δ) [34]. Σε DLD-1 κυτταρική γραμμή από Dukes ‘C, ένα πιο προχωρημένο στάδιο του καρκίνου του παχέος εντέρου, η απομεθυλίωση του γονιδίου DKK1 με 5-αζα-2’-δεοξυκυτιδίνη, ένας αναστολέας DNMT, επανεργοποίησε έκφραση DKK1 [34], [44] . Δεδομένου ότι η γενιστεΐνη έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιούν γονίδια μέσω CpG απομεθυλίωση [19], ελέγξαμε πρώτα η δυνατότητα απομεθυλίωσης υποκινητή DKK1 με genistein. Το αποτέλεσμά μας επιβεβαίωσαν ότι το επίπεδο μεθυλίωσης στον υποκινητή νησί CpG είναι αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση γονιδίου του DKK1. Στις κυτταρικές γραμμές με την περιοχή υπερμεθυλιωμένων υποκινητή, συμπεριλαμβανομένων DLD-1, RKO, και SW48, υπήρχε ελάχιστη, αν όχι σιγήσει γονιδιακή έκφραση DKK1. Επιπλέον, γενιστεΐνη θεραπεία δεν αλλάζει την υπερμεθυλίωση της περιοχής σε αυτά τα κύτταρα, ούτε διεγείρει οποιαδήποτε γονιδιακή έκφραση. Από την άλλη πλευρά, DKK1 ήταν μη μεθυλιωμένες στο πρώιμο στάδιο του καρκίνου του παχέος εντέρου (Dukes ‘Β) και συναφείς κυτταρικές σειρές που περιλαμβάνουν SW480 [34] και HCT15. Τόσο MSP και όξινο θειώδες αλληλούχιση επιβεβαίωσε ότι η μεθυλίωση του DNA ήταν πολύ λίγο, εάν υπάρχει, στις κυτταρικές γραμμές. Επιπλέον, η υπομεθυλίωση δεν αλλάζει με γενιστεΐνη θεραπεία. Ως εκ τούτου, το DNA απομεθυλίωση αποκλείστηκε ως μηχανισμός για την επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου DKK1 με genistein σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές.

Έχει αναφερθεί ότι η genistein ρυθμίζει επίσης και άλλα επιγενετικών δεικτών σε επίπεδο χρωματίνης [16], [45 ], [46].