Αφηρημένο

Ιστορικό & amp? Στόχοι

Αν και ηπατοκυτταρικό καρκίνους (HCC) παρουσιάζονται συχνά στη ρύθμιση της ίνωσης και ηπατική αναγεννητική ανταπόκριση που απαιτούν την ανάπτυξη νέων κυττάρων, θεραπευτικές στρατηγικές για τους καρκίνους αυτούς δεν έχουν βάλει στο στόχαστρο την πρωτεϊνική σύνθεση. Silvestrol, ένα rocaglate απομονωθεί από

Αγλαΐα

foveolata

, μπορεί να αναστέλλουν τη σύνθεση των πρωτεϊνών διαμορφώνοντας την έναρξη της μετάφρασης μέσω της ευκαρυωτικό παράγοντα έναρξης 4Α. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την θεραπευτική αποτελεσματικότητα των silvestrol για HCC.

Μέθοδοι

Η αποτελεσματικότητα της silvestrol εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ανθρώπινα κύτταρα HCC

στο

vitro

χρησιμοποιώντας ένα ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκινικών κυττάρων σε ένα ινωτική ήπαρ. Ο αντίκτυπος της silvestrol στο ήπαρ αξιολογήθηκε

σε

vivo

σε ποντίκια άγριου τύπου.

Αποτελέσματα

Silvestrol ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων με IC50 12,5 έως 86 nM σε τέσσερις διαφορετικές κυτταρικές σειρές HCC.

Σε

vitro

, silvestrol αυξημένη απόπτωση και κασπάσης 3/7 δραστηριότητα συνοδεύεται από απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυνατότητες και μειωμένη έκφραση των Mcl-1 και Bcl-XL. Ένα συνεργιστικό αποτέλεσμα παρατηρήθηκε όταν silvestrol συνδυάστηκε με άλλους θεραπευτικούς παράγοντες, με δείκτη ελάττωση της δόσης του 3,42-φορές με sorafenib και 1.75 φορές με ραπαμυκίνη σε μια κλασματική επίδραση του 0,5.

Σε

vivo

, ένα αντικαρκινικό αποτέλεσμα παρατηρήθηκε με 0,4 mg /kg silvestrol σύγκριση με τους μάρτυρες μετά από μία εβδομάδα, και η επιβίωση των ποντικών που φέρουν όγκο βελτιώθηκε με μέσο χρόνο επιβίωσης των 42 και 28 ημέρες σε ομάδες silvestrol και ελέγχου, αντίστοιχα. Η επίδραση στην επιβίωση δεν παρατηρήθηκε σε ορθοτοπική ξενομοσχεύματα σε μη ινωτικών ήπατα. επεξεργασία Silvestrol

στο

vivo

δεν μεταβάλλει τη δομή του ήπατος.

Συμπεράσματα

Τα στοιχεία αυτά προσδιορίζουν silvestrol ως μυθιστόρημα, δομικά μοναδικό φάρμακο με ισχυρή αντικαρκινική δράση για HCC και να υποστηρίξει την πιθανή αξία της στόχευσης έναρξη της μετάφρασης στη θεραπεία του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος

Παράθεση:. Kogure Τ, Kinghorn μ.Χ., Yan μου, Bolon Β, Lucas DM, Grever MR, et al. (2013) θεραπευτικές δυνατότητες του Μεταφραστικού αναστολέα Silvestrol σε ηπατοκυτταρικό καρκίνο. PLoS ONE 8 (9): e76136. doi: 10.1371 /journal.pone.0076136

Επιμέλεια: Manlio Vinciguerra, University College London, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 1 Ιουνίου, 2013? Αποδεκτές: 23 Αύγ. 2013? Δημοσιεύθηκε: 26 Σεπτέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Kogure et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, DK069370 (TP) και το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, P01 CA125066 (ΑΔΚ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η υψηλή παγκόσμια επίπτωση και τη θνησιμότητα του ηπατοκυτταρικού καρκίνου (ΗΚΚ) τονίζει την ανάγκη για θεραπείες που είναι αποτελεσματικές στην βελτίωση της επιβίωσης [1]. HCC είναι ιδιαίτερα ανθεκτική σε συμβατικές θεραπευτικές προσεγγίσεις, και υπάρχει ανάγκη για πιο αποτελεσματικές θεραπευτικές ουσίες για τον έλεγχο αυτών των καρκίνων. Θεραπεία είναι δυνατή μόνο με χειρουργική εκτομή ή μεταμόσχευση, αλλά αυτά δεν είναι δυνατόν για την πλειοψηφία των ασθενών με αυτόν τον καρκίνο, πολλοί από τους οποίους παρουσιάζουν πιο προχωρημένη νόσο. Πρόσφατες μελέτες έχουν εμπλέξει αρκετές μηχανισμούς ποικίλες σηματοδότησης στην μοριακή παθογένεση αυτού του καρκίνου [2]. Αυτές αντιπροσωπεύουν την ετερογένεια των απαντήσεων και περιορίζουν την χρησιμότητα των θεραπευτικών παρεμβάσεων χρησιμοποιώντας συμβατικές στρατηγικές που επιδιώκουν να διαμορφώνουν ειδικών μοριακών στόχων [3,4]. Προς το παρόν μόνο ένας παράγοντας, sorafenib, είναι διαθέσιμη για συστηματική θεραπεία με μέτρια αποτελέσματα στη βελτίωση της επιβίωσης [5].

Η ανάπτυξη του όγκου απαιτεί νέα σύνθεση των πρωτεϊνών και κατά συνέπεια σχετίζεται με την αύξηση της μετάφραση πρωτεΐνης. Άμεσα με στόχο τη μετάφραση θα μπορούσε να είναι μια χρήσιμη θεραπευτική στρατηγική, και ΔΑΜ αντάλλαγμα για HCC [6,7]. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ογκογόνο επιδράσεις που προκύπτουν από την έκτοπη έκφραση του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης eIF-4E, η οποία είναι ένας περιοριστικός παράγοντας ρυθμού για την αναστολή της μετάφρασης [6]. Επιπλέον, ένα αποτέλεσμα κατά του όγκου της στοχευμένης κάτω ρύθμιση των eIF-4E έχει αποδειχθεί σε διάφορες μελέτες με τη χρήση μοντέλων ξενομοσχεύματος ποικίλες όγκου. Στόχευση άλλα συστατικά του μηχανισμού μετάφρασης πρωτεΐνης ήταν επίσης αποτελεσματικές στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης του όγκου. Συγκρατημένη αντικαρκινική αποτελεσματικότητα για HCC έχει αποδειχθεί με τη χρήση αναστολέων του στόχου της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) μονοπάτι που εμπλέκονται στη σύνθεση των πρωτεϊνών [8-10].

Η silvestrol rocaglate είναι μια κυκλοπεντα [b] βενζοφουράνιο flavagline από το

Αγλαΐα

γένος της οικογένειας Meliacae [11-13]. Ως μέλος μιας νέας κατηγορίας φαρμάκων με μια μοναδική δομή, silvestrol είναι μια ελκυστική ένωση για τη στόχευση HCC [14]. Silvestrol έχει την ιδιότητα της διαμόρφωσης της μετάφρασης με την πρόληψη του ριβοσώματος φόρτωση σε μήτρες mRNA με στόχο την ευκαρυωτικό παράγοντα έναρξης, το ΕΤΕ-4A [15,16].

In vivo

κατά του όγκου δραστικότητα έχει αποδειχθεί για silvestrol σε αιματολογικές κακοήθειες όπως χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία, οξεία λεμφοκυτταρική λευχαιμία και λέμφωμα κυττάρων μανδύα [16-18], πιθανώς μέσω της εξάντλησης των βραχείας προ ημίσειας ζωής πρωτεΐνες αύξηση ή προ-επιβίωσης, συμπεριλαμβανομένων κυκλίνης D και Mcl-1. Σε μελέτες σε ζώα χρησιμοποιώντας το μοντέλο Εμ-myc, silvestrol μπορεί να ενισχύσει την ευαισθησία σε τυπικούς παράγοντες όπως δοξορουβικίνη [15]. Έτσι, πραγματοποιήθηκε προ-κλινικές μελέτες για να αξιολογηθεί ο ρόλος του μοναδικού αυτού ένωσης για την θεραπεία του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι silvestrol είναι ένα αποτελεσματικό κυτταροστατική και κυτταροτοξικό παράγοντα για κύτταρα HCC τόσο

in vitro

και σε ορθοτοπική κυττάρου όγκου ξενομοσχεύματα

in vivo

, και να υποστηρίξει την περαιτέρω ανάπτυξη αυτού του παράγοντα σαν ένα θεραπευτικό για HCC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Όλες οι μελέτες σε ζώα πραγματοποιήθηκαν εξής θεσμικές Animal Care και της Επιτροπής Χρήση διαδικασίες και κατευθυντήριες γραμμές στο Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο στο πλαίσιο εγκεκριμένου πρωτοκόλλου.

κυτταρικές γραμμές

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου HCC, PLC /PRF /5 (PLC), HepG2, Hep3B και Huh7 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και 1% αντιμυκητικό /αντιβιοτικό μίγμα. Λουσιφεράσης που εκφράζουν PLC (PLC-Luc), τα οποία παράγονται από σταθερή επιμόλυνση με λουσιφεράσης που εκφράζουν πλασμίδιο pHCMV που περιέχει cDNA που κωδικοποιεί την πυρκαγιά fl y γονίδιο της λουσιφεράσης, ευγενικά από τον Dr Ching-Shih Chen (College of Pharmacy, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο, Κολόμπους, ΟΗ). ταυτότητας γραμμή κυττάρων διεξήχθη με Genetica εργαστήρια DNA (Cincinnati, ΟΗ).

κυτταροτοξικότητας Δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το CellTiter 96 Υδατικό κιτ δοκιμασίας (Promega, Madison, WI). Κύτταρα (5000 /φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (Βϋ Biosciences, Rockville, MD) και επωάζεται στους 37 ° C επί μία νύκτα προ της προσθήκης των πειραματικών παραγόντων. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε μετά από 72 ώρες. IC

50 τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό XLfit (ΙϋΒδ, Burlington, ΜΑ). αλληλεπιδράσεις φαρμάκου-φαρμάκου αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μία σταθερή αναλογία των συγκεντρώσεων. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το διάμεσο ανάλυση αποτελεσμάτων και τον δείκτη συνδυασμού (CI) προέρχονται από την χρησιμοποίηση του προγράμματος λογισμικού CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο).

Η απόπτωση Δοκιμασίες

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 4 -Καλά πλακίδια θαλάμου (5 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο) σε 500 μL του μέσου και επωάζονται στους 37 ° C με 5% CO

2. 100 ηΜ silvestrol προστέθηκε και η έκταση της κυτταρικής απόπτωσης αξιολογήθηκε μετά από 24 ώρες. Τα κύτταρα με μορφολογικές αλλαγές του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού μετά από χρώση με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ). Για κασπάσης-3/7 προσδιορισμούς, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων (5 χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο) και ήταν 100 ηΜ silvestrol για μέχρι 24 ώρες). Caspase-3/7 Δράση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία λουμινομετρικές (κασπάση-Glo 3/7 δοκιμασίας, Promega Corp., Madison, WI).

Μέτρηση της μιτοχονδριακής μεμβράνης Δυνητικές

Η διακοπή του μιτοχονδριακού δυναμικό της μεμβράνης ανιχνεύθηκε με τη χρήση JC-1 (APO Logix ™ JC-1, Peninsula Laboratories Inc., San Carlos, CA). Για μικροσκοπία φθορισμού, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μια διαφάνεια θάλαμο 4-φρεατίων (5 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο) για μικροσκοπία φθορισμού, ή σε πλάκες 96-φρεατίων (5 χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο) για φθορομετρική ανίχνευση. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 100 ηΜ silvestrol για 24 ώρες, στη συνέχεια με 5 mg /mL του JC-1 στους 37 ° C για 15 λεπτά. Ακέραια μιτοχόνδρια ανιχνεύεται ως κόκκινο συσσωματώματα με εκπομπή στα 590 nm και μιτοχονδριακή αποπόλωση της μεμβράνης ανιχνεύθηκε ως πράσινος φθορισμός με εκπομπή στα 530 nm.

Western Blotting

Τα κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων πλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και λύθηκαν με επώαση για 30 λεπτά σε 600 μL ρυθμιστικού λύσης κυττάρου με αναστολείς πρωτεάσης (Complete λύσης-Μ EDTA-free, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης Lysate μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας bicinchoninic οξύ (Κιτ Δοκιμασίας Πρωτεΐνης, Pierce Biotechnology, Rockford, IL). ~ 25 mg πρωτεϊνών αναμείχθηκαν με NuPAGE LDS Sample Buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA) και οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με δωδεκυλικού νατρίου ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου-(SDS-PAGE) με τη χρήση NuPAGE 4-12% Νονβχ Bis-Tris Gels (Invitrogen). Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες στις πηκτές μεταφέρθηκαν σε ένα διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) σε Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα και IRDye700- και IRDye800-επισημασμένο δευτερεύοντα αντισώματα (Rockland, Gilbertsville, ΡΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος οπτικοποιήθηκε και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το LI-COR Odyssey Infrared System Imaging (LI-COR Bioscience, Lincoln, ΝΕ).

Επαγωγή της ηπατικής ίνωσης σε γυμνούς ποντικούς

Έξι εβδομάδες , παλιά αρσενικά ποντίκια imunodeficient (NCr γυμνό) λήφθηκαν από Taconic (Hudson, Νέα Υόρκη) και τρέφονται με τροφή και νερό

κατά βούληση

. Τα ποντίκια συντηρούνται σύμφωνα με τις διαδικασίες φροντίδας ζώων και την Επιτροπή Χρήσης και τις κατευθυντήριες γραμμές στο πλαίσιο εγκεκριμένου πρωτοκόλλου. Ηπατική ίνωση που προκαλείται σε γυμνά ποντίκια με υποδόρια ένεση 0,4 g /kg του τετραχλωριούχου σωματικού βάρους άνθρακα (CCl

4) (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) δύο φορές την εβδομάδα. CCl

4 αραιώθηκε σε ελαιόλαδο (CCl

4: ελαιόλαδο = 1: 7) και αποστειρώνονται με 0,22 MM-φίλτρο πριν από τη χρήση. Για τις μελέτες επικύρωσης για την επαλήθευση και την ποσοτικοποίηση ηπατική ίνωση, CCI

4 χορηγήθηκε σε γυμνούς ποντικούς δύο φορές την εβδομάδα. Μετά από 6, 9, ή 12 εβδομάδες, το συκώτι εκχυλίστηκαν και σταθεροποιήθηκαν με φορμαλίνη για παθολογική εξέταση. Μετά από χρώση του ιστού του ήπατος με τριχρωμία Masson, τουλάχιστον πέντε τυχαία επιλεγμένα μικροσκοπικές εικόνες των τμημάτων ιστού από κάθε ποντικό φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ψηφιακό λογισμικό απεικόνισης (NIS-Elements, NIKON, Tokyo, Japan) και το ποσοστό εμβαδού της ίνωσης του ήπατος ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ΝΙΗ ImageJ (Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, Bethesda, MD).

ορθοτοπική HCC μοντέλο ξενομοσχεύματος κυττάρου

CCl

4 ή αραιωτικό χορηγήθηκαν υποδορίως δύο φορές την εβδομάδα για 10 εβδομάδες ως ανωτέρω, που ακολουθείται από άμεση ενδοηπατική ένεση ΡΕΟ-

Luc

κύτταρα για τη δημιουργία ορθοτοπική ξενομοσχεύματα κυττάρων όγκου σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια ως εξής. Λαπαροτομία χρησιμοποιώντας αναισθησία με ισοφλουράνιο και το αριστερό συκώτι λοβού εκτέθηκε. PLC-luc κύτταρα (10

6), εναιωρήθηκαν σε 20 ml μέσου χωρίς ορό που περιέχει 50% του Matrigel (BD Bioscience, San Jose, CA), και σιγά-σιγά εγχύεται στο αριστερό συκώτι λοβού χρησιμοποιώντας μια βελόνα 28-gauge . Μετά την απομάκρυνση της βελόνας, συμπίεση εφαρμόστηκε στη θέση της ένεσης, χρησιμοποιώντας μια μπατονέτα για να αποφευχθεί η αιμορραγία. Κοιλιακών μυών τοίχο και το δέρμα έκλεισαν με συνεχή ραφή με απορροφήσιμο υλικό ράμματος. Δέκα ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου, βιοφωτισμός απεικόνισης χρησιμοποιώντας το σύστημα απεικόνισης IVIS (Xenogen Corp., Alameda, CA) άρχισε να παρακολουθεί την εγκατάσταση και την ανάπτυξη των όγκων. Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνη και D-λουσιφερίνης (Gold Biotechnology, St. Louis, ΜΟ) διαλυμένη σε PBS χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά (150 mg /kg βάρους σώματος ποντικού). Μετά από 10 λεπτά, οι ποντικοί απεικονίστηκαν με ένα εξαιρετικά ευαίσθητο, ψύχεται κάμερα CCD σε ένα ελαφρύ-σφιχτό θάλαμο δείγματος (IVIS200, Xenogen). Απόκτηση και ποσοτικοί fi κατιόντων των σημάτων βιοφωταύγεια πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Ζώντας λογισμικό εικόνας (Xenogen). Για ένα προκαταρκτικά μελετήσει, πέντε ποντίκια θυσιάστηκαν μετά από τουλάχιστον τέσσερις εβδομάδες παρακολούθησης. απεικόνισης βιοφωταύγεια συσχετίστηκε με όγκους του ήπατος όγκου υπολογίζεται χρησιμοποιώντας μετρήσεις δαγκάνα και ένα πρότυπο τύπο: 6.1 * πλάτος * μήκος * βάθος. Για

in vitro

βιοφωταύγεια απεικόνισης, τα κύτταρα μετρήθηκαν και τοποθετήθηκαν (40-10240 κύτταρα) σε μαύρη πλάκα 96 φρεατίων. D-λουσιφερίνη (150 μg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και απεικόνισης εκτελέστηκε μετά από 10 λεπτά χρησιμοποιώντας IVIS.

μελέτη επεξεργασίας σε μοντέλο ξενομοσχεύματος

Μια μελέτη θεραπεία διεξήχθη σε ορθοτοπική ξενομοσχεύματα σε γυμνά ποντίκια με ή χωρίς επαγωγή της ηπατικής ίνωσης. Μετά ενδοηπατική PLC-Ιυο εμφύτευση κυττάρων, βιοφωταύγεια παρακολουθήθηκε για την παρακολούθηση της ανάπτυξης των όγκων. Μόλις ένταση βιοφωταύγεια υπερέβη τα 10 εκατομμύρια φωτονίων /sec, τα ποντίκια με ορθοτοπικό ξενομοσχεύματα τυχαιοποιήθηκαν να λάβουν silvestrol (0,4 ή 1 mg /kg σωματικού ip βάρους) ή ελέγχου (0.5 ml /kg σωματικού βάρους 0.1% DMSO σε αλατούχο) για 5 διαδοχικές ημέρες την εβδομάδα για τέσσερις εβδομάδες. Μια θεραπευτική ανταπόκριση ορίστηκε ως & gt? 30% μείωση στην ένταση βιοφωταύγεια από την αρχική τιμή. Οι ποντικοί απεικονίστηκαν εβδομαδιαίως για 10 εβδομάδες από την έναρξη της θεραπείας.

έρευνα ηπατοτοξικότητα σε ποντικούς άγριου τύπου

Έξι εβδομάδων, θηλυκό, C57BL /6 ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0 (όχημα έλεγχος) ή 1.5 mg /kg silvestrol (η = 7 ανά ομάδα) κάθε 48 ώρες για 28 ημέρες από την ενδοπεριτοναϊκή οδό. Κατά την νεκροψία, το αίμα συλλέχθηκε για να μετρηθεί αλανίνης του ορού (ALT) και ασπαρτικού (AST) αμινοτρανσφερασών, ενώ το ήπαρ σταθεροποιήθηκε με εμβάπτιση σε ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη 10%. Ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις σε πάγια, παραφίνη-ενσωματωμένες, αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η & amp? Ε) -stained τμήματα ιστού βαθμολογήθηκαν από μια πίνακας-επικυρωμένο κτηνιατρική παθολόγος χρησιμοποιώντας ένα 5-κλιμακωτή, ημι-ποσοτική κλίμακα: εντός των φυσιολογικών ορίων, ή ελάχιστη, ήπια, μέτρια, ή σημαντικές αλλαγές.

Χημικά και Αντιδραστήρια

Silvestrol, {6-Ο-δεμεθυλο-6- [6- (1,2-διυδροξυαιθυλο) -3-μεθοξυ-1,4 διοξαν-2-υλο] -aglafolin}, απομονώθηκε από το φλοιό και κλαδάκια του Αγλαΐα foveolata Πάνελ (Meliaceae), όπως περιγράφηκε προηγουμένως από AD Kinghorn. Silvestrol επαναιωρήθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C. Sorafenib ελήφθη από LC Laboratories (Woburn, ΜΑ) και αραιώνεται σε DMSO. Η ραπαμυκίνη ελήφθη από την Calbiochem (San Diego, CA) και αραιώνεται σε DMSO. Συγκέντρωση του DMSO ήταν & lt? 0,1% για όλες τις μελέτες. Z-VAD-FMK ελήφθη από την Promega (Madison, WI)

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από post hoc διαδικασία. Για την ανάλυση της επιβίωσης, καμπυλών επιβίωσης δημιουργήθηκαν με τη μέθοδο Kaplan-Meier και συγκρίθηκαν με μία δοκιμασία log-ψιλόλιγνος. Πολυπαραγοντική ανάλυση έγινε με Cox παλινδρόμησης αναλογικών κινδύνων. Η στατιστική σημαντικότητα έγινε δεκτή σε τιμή

σ

& lt? 0.05.

Ηθική δήλωση

Όλες οι μελέτες σε ζώα πραγματοποιήθηκαν εξής θεσμικές Animal Care και της Επιτροπής Χρήση διαδικασίες και κατευθυντήριες γραμμές στο Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο στο πλαίσιο εγκεκριμένου πρωτοκόλλου.

Αποτελέσματα

silvestrol αναστέλλει την ανάπτυξη ανθρώπινου HCC κυττάρων

in vitro

η

για να εξετάσει την πιθανή επίδραση κατά των όγκων των silvestrol, αρχίσαμε εξετάζοντας την επίδραση της silvestrol στην ανάπτυξη των κυττάρων

in vitro

χρησιμοποιώντας ένα πάνελ ποικίλων κακοηθών ηπατοκυττάρων ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Η επώαση με silvestrol οδήγησε σε εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση επίδραση στην αναστολή ανάπτυξης κυττάρου σε όλες τις κυτταρικές γραμμές όγκου που εξετάστηκαν, με IC50 23,9 ηΜ σε PLC /PRF /5, 12.5 ηΜ σε Hep3B, 14.6 ηΜ σε Huh 7 και 86 ηΜ σε κύτταρα HepG2 (Φιγούρα 1). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι silvestrol είχε έναν πολύ ισχυρό αντικαρκινικό αποτέλεσμα σε ανθρώπινα κύτταρα HCC.

Ανθρώπινα κύτταρα HCC σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες 96 φρεατίων (5000 κύτταρα /φρεάτιο) και επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις silvestrol ή ελέγχου ( διαλύτη). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε μετά από 72 ώρες χρησιμοποιώντας ένα μεταβολικό προσδιορισμό ζωντανών κυττάρων (CellTiter 96 AQ, Promega Corp., Madison, WI). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση και SD των πέντε ξεχωριστών προσδιορισμών.

Η

Η επαγωγή του κυτταρικού θανάτου με απόπτωση στα κύτταρα HCC από silvestrol

Υποθέσαμε ότι η κυτταροτοξικότητα της silvestrol συνέβη ως αποτέλεσμα της επαγωγή της απόπτωσης που διαμεσολαβείται από διαταραγμένη σύνθεση βραχύβια απόπτωση ρυθμιστικά μόρια όπως Mcl-1 [16,17]. Έτσι, εξετάσαμε την επαγωγή της απόπτωσης σε κύτταρα PLC /PRF /5 ανθρώπινο HCC μετά από επώαση με 100 ηΜ silvestrol. Caspase 3/7 ενεργοποίηση ανιχνεύθηκε με λουμινομετρικές δοκιμασία, με μια αύξηση στην δραστηριότητα σημειώνεται μέσα σε 30 λεπτά και διαρκεί μέχρι και 6 ώρες (Εικόνα 2Α). Ομοίως, μια αυξημένη διάσπαση της πολυριβοζυλίωσης-ριβόζη πολυμεράση (PARP), ένα υπόστρωμα για δραστικότητα κασπάσης, παρατηρήθηκε επίσης μαζί με τη διάσπαση των άλλων κασπασών, όπως κασπασών 8 και 9 (Σχήμα 2Β). Η προ-επώαση των κυττάρων για 30 λεπτά με την κασπάση αναστολέα 50 μΜ-ίτηκ ελαττωμένη κυτταροτοξικότητα από επακόλουθη επώαση με 50 ηΜ silvestrol από 36,4 ± 3,5% έως 17,6 ± 2,9% μετά από 24 ώρες. Συνεπής με τις αλλαγές αυτές, το 19,3% των PLC /PRF /5 κύτταρα έδειξαν μορφολογικά χαρακτηριστικά των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση μετά από 24 ώρες (Σχήμα 2C). Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι οι μορφολογικές και βιοχημικές λειτουργίες της απόπτωσης εμφανίζονται νωρίς κατά τη διάρκεια της επώασης των κυττάρων HCC με silvetrol.

PLC /PRF /5 κύτταρα HCC σπάρθηκαν σε 4-καλά slide θάλαμο (25,000 κύτταρα /φρεάτιο) και επωάστηκαν με 100 ηΜ silvestrol για 24 ώρες. Τα αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού μετά από χρώση ϋΑΡΙ. Η αναλογία των κυττάρων που παρουσιάζουν μορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης μετρήθηκαν. *,

σ

& lt? 0,05, t-test.

Η

Silvestrol μεταβάλλει έκφραση των Mcl-1

υποτεθεί ότι η επίδραση της silvestrol μπορούσε να διαμεσολαβείται από τις επιπτώσεις στην διαμόρφωση της σύνθεσης του μικρού χρόνου ημίσειας ζωής ρυθμιστές της απόπτωσης, όπως Mcl-1 και Bcl-X

L. Ως εκ τούτου, αξιολόγησε την επίδραση των silvestrol επί Mcl-1 πρωτεΐνη και mRNA έκφραση. Μια μείωση στην έκφραση πρωτεΐνης Mcl-1 που διαρκεί έως και 24 ώρες παρατηρήθηκε σε απάντηση silvestrol σε PLC /PRF /5 κύτταρα (Σχήμα 3). Αντίθετα, η έκφραση των Mcl-1 mRNA αυξήθηκε σημαντικά. Παρόμοιες μεταβολές παρατηρήθηκαν σε κύτταρα HepG2. Όπως Mcl-1 μπορεί να δρα ως ένα αντι-αποπτωτικό παράγοντα για να εμποδίσει την απελευθέρωση του κυτοχρώματος Ο από τα μιτοχόνδρια, εξετάσαμε την επίδραση της silvestrol στη μιτοχονδριακή ακεραιότητα. Η επώαση με 100 ηΜ silvestrol για 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης αξιολογήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού μετά από χρώση με JC-1 σε PLC /PRF /5 κύτταρα (Σχήμα 4Α). αναλογία φθορισμού JC-1 (κόκκινο σε πράσινο) αυξήθηκε σε 141% του ελέγχου σε PLC /PRF /5 κύτταρα επωάζονται με silvestrol (Σχήμα 4Β). Έτσι, οι μηχανιστικές επιπτώσεις της silvestrol στην κυτταρική ανάπτυξη HCC θα μπορούσε να προκύψει από την ενισχυμένη απόπτωση που προκύπτει από τη μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης που σχετίζεται με την απώλεια της Mcl-1 παρά ενισχυμένη μεταγραφή mRNA Mcl-1 όπως περιγράφεται στα κύτταρα CLL [17].

(Α) PLC /PRF /5 κύτταρα HCC σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων (5000 κύτταρα /φρεάτιο) και επωάστηκαν με 100 ηΜ silvestrol για μέχρι 24 ώρες. Caspase-3/7 ενεργοποίησης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα λουμινομετρικές δοκιμασία (κασπάση-Glo 3/7 Assay, Promega Corp., Madison WI). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή και SD τριών χωριστών προσδιορισμών. (Β) PLC /PRF /5 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (20,000 κύτταρα /φρεάτιο) και επωάστηκαν με 100 ηΜ silvestrol (100 ηΜ) για έως 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στους χρόνους που υποδεικνύονται, και ανάλυση ανοσοστυπώματος για πρωτεΐνες που σχετίζονται με την απόπτωση διεξήχθη. *,

σ

& lt? 0.05, ANOVA, PLSD του Fisher (C) PLC /PRF /5 κύτταρα και HepG2 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επωάστηκαν με 100 ηΜ silvestrol για μέχρι 24 ώρες. Η έκφραση της πρωτεΐνης Mcl-1 αξιολογήθηκε με ανοσοκηλίδωση. (D) RNA εκχυλίστηκε σε κάθε χρονικό σημείο και το επίπεδο έκφρασης Mcl-1 mRNA εκτιμήθηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. Οι τιμές εκφράζονται σε σχέση με την έκφραση στον έλεγχο χωρίς θεραπεία μετά από κανονικοποίηση χρησιμοποιώντας ΟΑΡϋΗ ως εσωτερικός έλεγχος. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή και SD. *,

σ

& lt? 0.05, ANOVA, PLSD του Fisher.

Η

Α, PLC /PRF /5 κύτταρα σπάρθηκαν επί 4 φρεατίων slide θαλάμου (25,000 κύτταρα /φρεάτιο) και επωάστηκαν με 100 ηΜ silvestrol για 24 ώρες. Τα κύτταρα βάφτηκαν με JC-1 και μιτοχονδριακής διαπερατότητας ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού. Κύτταρα εμφανίζουν κόκκινου φθορισμού υπό βασικές συνθήκες, αλλά πράσινο φθορισμό εξής μεταβολή στο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης. Β, PLC /PRF /5 κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων (5000 κύτταρα /φρεάτιο) και επωάστηκαν με 100 ηΜ silvestrol για 24 ώρες. Τα κύτταρα βάφτηκαν με JC-1 και η αναλογία πράσινο σε κόκκινο φθορισμού προσδιορίστηκε φθορομετρικά (μέση ± SD). *,

σ

& lt? 0,05, t-test.

Η

Silvestrol ρυθμίζει την ευαισθησία στη χημειοθεραπεία

Με δεδομένο το έντονο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παραγόντων για HCC, είναι πιθανό ότι η κλινική χρήση των silvestrol θα μπορούσε να περιλαμβάνει τους χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλους θεραπευτικούς παράγοντες. Sorafenib είναι ένας από του στόματος αναστολέας πολλαπλών κινασών που έχει πρόσφατα έχουν αξιολογηθεί και εγκριθεί για χρήση σε προχωρημένο HCC. Αν και έχει ισχυρή δραστικότητα έναντι της οδού Raf /MEK /ERK, η θεραπευτική αποτελεσματικότητα για HCC μπορεί να περιλαμβάνει άλλες οδούς. σηματοδότηση mTOR συχνά υπερδραστηριοποιημένο στο HCC, και στόχευση mTOR είναι μια ελκυστική θεραπευτική στρατηγική [19]. Εξετάσαμε τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ silvestrol και είτε sorafenib ή τη ραπαμυκίνη αναστολέας mTOR. PLC /PRF /5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις silvestrol σε συνδυασμό με sorafenib ή ραπαμυκίνη, και κυτταροτοξικότητα εκτιμήθηκε μετά από 72 ώρες. Ο συνδυασμός είτε sorafenib ή ραπαμυκίνης με silvestrol αυξημένο κυτταρικό θάνατο που επάγεται από την τελευταία (Σχήμα 5Α και 5Β). αλληλεπίδραση φαρμάκων αξιολογήθηκε με διάμεση ανάλυση επίδραση των Chou και Talalay ήταν συνεπή με μια συνεργιστική αλληλεπίδραση σε αναστολή της ανάπτυξης με αυτούς τους συνδυασμούς (Σχήμα 5C) [20]. Επιπλέον, ο συνδυασμός με silvestrol οδήγησε σε ευνοϊκό δείκτη για μείωση της δόσεως και για τις δύο sorafenib (μείωση 3,42 φορές) και η ραπαμυκίνη (1,75 φορές μείωση) (Σχήμα 5D). Έτσι, silvestrol μπορούν να δράσουν συνεργικά με άλλους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για HCC.

PLC /PRF /5 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (5000 κύτταρα /φρεάτιο) και επωάστηκαν για 72 ώρες με διάφορες Οι συγκεντρώσεις του silvestrol (SVL) και (Α) sorafenib (SRF) σε σταθερή αναλογία SVL: SRF από 1: 250 ή (Β) ραπαμυκίνης (RPM) σε σταθερή αναλογία SVL: RPM 1: 2,5. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μεταβολικό προσδιορισμό (CellTiter 96 AQ, Promega Corp., Madison, WI). Πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ silvestrol και sorafenib ή ραπαμυκίνη αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την ανάλυση μέση αποτελέσματα των Chou και Talalay να αντλήσει το (C) δείκτη συνδυασμό και (Δ) Η μείωση της δόσης του δείκτη των συνδυασμών.

Η

Ποντικού ορθοτοπική HCC μοντέλο ξενομοσχεύματος

Για να αξιολογηθεί η θεραπευτική χρήση των silvestrol

in vivo

, έχουμε δημιουργήσει μια νέα ασθένεια σχετικό υπόδειγμα του HCC από ορθοτοπική όγκο εμφύτευση των κυττάρων ξενομοσχεύματος σε ινωτική ή μη-ινωτικά ήπατα σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια . Το κύριο πλεονέκτημα αυτής της προσέγγισης έναντι συμβατικών προ-κλινικά μοντέλα όπως ξενομοσχεύματα υποδόριου ιστού είναι ότι μιμείται στενότερα την εγγενή μικροπεριβάλλον του όγκου. Αυτό επιτρέπει την αξιολόγηση της νόσου σχετικών μικροπεριβάλλον επιρροές στην ευαισθησία των ναρκωτικών

in vivo

. Ηπατική ίνωση που προκαλείται πειραματικά από CCl

4 διοίκησης, και η παρουσία ίνωσης επαληθεύονται και ποσοτικοποιείται με ανάλυση ψηφιακής εικόνας μετά από χρώση τριχρωματική μέθοδος του Masson. Παθολογική εξέταση έδειξε τυπικές ινωτικές αλλαγές στο ήπαρ των ποντικών με πύκνωση των πυλαία ίνωση και γεφυροποιό ίνωση (Σχήμα 6Α). Το ποσοστό της περιοχής της ίνωσης αυξήθηκε σε δόση CCl

4 εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 6Β). Στη συνέχεια, PLC /PRF /5 κύτταρα που εκφράζουν συντακτικά λουσιφεράσης (ΡΕΟ-

Luc

) καθορίστηκαν με σταθερή επιμόλυνση χρησιμοποιώντας ένα κατασκεύασμα GFP-λουσιφεράσης. Η βιοφωταύγεια αυτών λουσιφεράσης που εκφράζουν PCL /PRF /5 σταθερά επιμολυσμένα (PLC-luc κύτταρα) επαληθεύτηκε

in vitro

, με μια ισχυρή θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ ένταση βιοφωταύγειας και τον αριθμό των κυττάρων

in vitro

(Εικόνα 7Α) (

r

2 = 0.973). Στη συνέχεια, ορθοτοπικό ξενομοσχεύματα καθορίστηκαν με ενδοηπατική ένεση PLC-Luc κύτταρα (10

6 κύτταρα) εντός του αριστερού λοβού του ήπατος γυμνών ποντικών (ηλικίας 8 εβδομάδων, αρσενικά, η = 5) και βιοφωταύγεια απεικόνιση εκτελείται για να παρακολουθεί την εγκατάσταση και την ανάπτυξη του όγκου του ήπατος που ξεκινούν από 10 ημέρες μετά την εμφύτευση (Σχήμα 7Β). Η βιοφωταύγεια εντός του ήπατος παρατηρήθηκε να αυξάνεται με το χρόνο. Μετά από τουλάχιστον 4 εβδομάδες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και ο όγκος των όγκων εκχυλίζεται ελήφθη με μέτρηση με παχύμετρο. Υπήρξε θετική συσχέτιση μεταξύ της έντασης βιοφωταύγεια πριν από την εκχύλιση των όγκων του ήπατος in vivo, και ο όγκος του όγκου (

r

2 = 0,638) (Εικόνα 7C). Αυτές οι μελέτες επικυρωθεί η χρήση των PLC-Luc κύτταρα και απεικόνισης βιοφωταύγεια για τη μέτρηση της ανάπτυξης του όγκου

in vivo

.

ηπατικής ίνωσης προκλήθηκε σε γυμνά ποντίκια με εβδομαδιαία ένεση δύο φορές από τετραχλωράνθρακα (CCl

4) σε δοσολογία 0,4 g /kg σωματικού βάρους για 6, 9, και 12 εβδομάδες.

Μια

και

Β

, τυπικό φωτογραφίες από ιστοπαθολογία ήπατος με τρίχρωμης χρώση (Α, ελέγχου? Β, CCl4 12 εβδομάδων). Το ήπαρ σταθεροποιήθηκε με φορμαλίνη και χρωματίζονται με trichome του Masson.

C

, τουλάχιστον πέντε εικόνες επιλέχθηκαν τυχαία συλλαμβάνονται από κάθε τμήμα του ήπατος και το ποσοστό της έκτασης της ίνωσης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ΝΙΗ ImageJ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το ποσοστό της συνολικής έκτασης με ίνωση εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. *,

σ

& lt? 0.05, PLSD ANOVA, Fisher.

Η

Μια

,

Σε

vitro

βιοφωτισμός απεικόνιση της ΡΕΟ-

Luc

κύτταρα. Τα κύτταρα μετρήθηκαν και σπάρθηκαν σε μαύρες πλάκες 96 φρεατίων. D-λουσιφερίνη (150 μg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και απεικόνιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας IVIS. Η βιοφωταύγεια σχεδιάζεται ως προς τον αριθμό των κυττάρων.

Β

,

Σε

vivo

βιοφωταύγεια απεικόνισης. Ορθοτοπική όγκοι ιδρύθηκε με άμεση ενδο-ηπατική ένεση ΡΕΟ-

Luc

κύτταρα. Ένα εκατομμύριο ΡΙΧ-γ

luc

κύτταρα εγχύθηκαν εντός του αριστερού λοβού του ήπατος. Η ανάπτυξη των όγκων παρακολουθήθηκαν με απεικόνιση βιοφωταύγειας χρησιμοποιώντας την IVIS. C, Η σχέση μεταξύ του όγκου του όγκου και βιοφωταύγεια. Μετά από τουλάχιστον 4 εβδομάδες ποντικών παρακολούθησης θυσιάστηκαν και οι όγκοι του ήπατος όγκου ελήφθησαν χρησιμοποιώντας μέτρηση δαγκάνας. Ο εκτιμώμενος όγκος του όγκου μετά από εκτομή σχεδιάζεται κατά βιοφωταύγεια καθορίζεται επί τόπου.

Η

ήπατος ίνωση ρυθμίζει την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου

Η παρουσία της ίνωσης του ήπατος είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της ανάπτυξης HCC (Σχήμα 8). Ερευνήσαμε πρώτα τις επιπτώσεις της ίνωσης κατά την έναρξη του όγκου και την ανάπτυξη του όγκου. Δεκαεννέα ποντικοί υποβλήθηκαν υποδορίως χορηγούμενη 0,4 mg /kg σωματικού βάρους είτε CCl

4 (19 ποντίκια) ή φορέα (18 ποντικοί) δύο φορές την εβδομάδα για 10 εβδομάδες. Ενδοηπατική εμφύτευση των κυττάρων του όγκου πραγματοποιήθηκε μετά από 10 εβδομάδες, στην οποία είναι εγκατεστημένος χρόνος ίνωση σε όλους τους ποντικούς που έλαβαν CCl

4. Ένα ποντίκια στην ομάδα οχήματος πέθανε αμέσως μετά τη χειρουργική επέμβαση όγκου εμφύτευση κυττάρων. Τέσσερα ποντίκια, ένα στο

4 ομάδα CCl και τρία στην ομάδα χορηγήθηκε φορέας, δεν ανέπτυξαν όγκο ήπατος μετά τουλάχιστον 12 εβδομάδες μετά την εμφύτευση. Ένα CCl

4 αντιμετωπίζεται ποντίκι που αναπτύχθηκε μετρήσιμος όγκος πέθανε πριν από την έναρξη της θεραπείας. Το υπόλοιπο του όγκου 32 του ήπατος ποντικών που φέρουν που αποτελείται από 17 CCl

4 ποντίκια που έλαβαν αγωγή (ινωτική συκώτι ομάδα), και 15 ποντίκια που έλαβαν φορέα (μη ινωτικών ήπαρ). Μόλις σχηματισμό όγκου ανιχνεύθηκε, με ένταση βιοφωταύγειας & gt? 10 εκατομμύρια φωτονίων /sec, κάθε ποντικός σε κάθε ομάδα (ινωτική /μη ινωτικών ήπατος) ήταν τυχαιοποιήθηκαν να λάβουν είτε silvestrol (0,5 mg /kg ή 1 mg /kg σωματικού βάρους) ή DMSO 0,1% (έλεγχος) από ίρ ένεση πέντε συνεχόμενες ημέρες την εβδομάδα για τέσσερις εβδομάδες. Ένας ποντικός ήταν τυχαία αλλά πέθανε πριν από την παραλαβή τυχόν ενέσεις και δεν συμπεριελήφθη στην ανάλυση. Η μέση διάρκεια από την ένεση των κυττάρων του όγκου από την τυχαιοποίηση ήταν σημαντικά μειωμένη σε ποντίκια με ηπατική ίνωση σε σύγκριση με μη ινωτικών ποντικούς (14,2 ημέρες

vs

21,5 ημέρες, ρ = 0,0011, (Σχήμα 8Α). Η συχνότητα της αποτυχίας του ανάπτυξη του όγκου ήταν χαμηλότερη στις ινωτικές ποντικούς (1 από 19 ποντικούς, 5,26%) από ό, τι σε μη ινωτικών ποντίκια (3 18 ποντικούς, 16,7%) (Σχήμα 8Β). δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στην σωρευτική επιβίωση μεταξύ των μη ινωτικών ποντίκια και ινωτικών ποντίκια στην ομάδα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα (ρ = 0.59) και οι μέσοι χρόνοι επιβίωσης υπολογίζεται με τη μέθοδο Kaplan-Meier ήταν 25 ημέρες για τα μη ινωτικών ποντικούς, και 28 ημέρες για τις ινωτικές ποντικούς.

οι ποντικοί έλαβαν 0.4 g /kg τετραχλωράνθρακος να επάγουν ίνωση του ήπατος (n = 19) ή ενέσεις όχημα (n = 18) για δέκα εβδομάδες. ορθοτοπική όγκοι στη συνέχεια προσδιορίζονται απευθείας ενδο-ηπατική έγχυση 10

6 ΡΙΧ-γ

Luc

κύτταρα. ανάπτυξης ξενομοσχευμάτων όγκου των κυττάρων παρακολουθήθηκε με απεικόνιση βιοφωταύγεια και ανιχνεύθηκε σε 18 ποντίκια με ινωτικά ήπατα και σε 15 ποντίκια χωρίς ηπατική ίνωση. (Α) Ο χρόνος σε ημέρες (μέση τιμή ± SE) για την ανάπτυξη ηπατικών όγκων από την έγχυση των κυττάρων του όγκου σε ένταση βιοφωτισμός 10

7 φωτόνιο /sec εμφανίζεται. (Β) Συχνότητα αποτυχία σχηματισμού όγκου (%). (C) Επίδραση της ίνωσης στην ανάπτυξη του όγκου. Η αλλαγή στην ένταση βιοφωταύγεια ως ποσοστό της βασικής γραμμής (μέση ± SE) παριστάνεται γραφικώς έναντι του χρόνου. Μόλις βιοφωταύγεια υπερέβη το 10

7 φωτονίου /sec, κάθε ποντικός τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδα θεραπείας και να λαμβάνετε silvestrol ή διαλυτικό μέσο (έλεγχος). Α, καμπύλη επιβίωσης των

έλεγχο

ομάδα. Η παρουσία της ίνωσης του ήπατος δεν επηρέασε την επιβίωση των ποντικών με ξενομοσχεύματα όγκου τα οποία δεν έλαβαν καμία αγωγή. *,

σ

& lt? 0.05.

Η

Silvestrol δεν βλάπτει κανονικό ηπατοκύτταρα

in vivo

Η

διοίκησης Silvestrol σε 1,5 mg /kg κάθε ημέρα για 28 ημέρες δεν προκάλεσε ορατές βλάβες στο ηπατικό παρέγχυμα κάθε ποντίκι. Συγκεκριμένα, ούτε νέκρωση ούτε απόπτωση ήταν εμφανής μέσα σε ηπατοκύτταρα, χοληδόχου πόρου επιθήλιο, ή κάτοικος ημιτονοειδή μακροφάγα (δηλαδή, κύτταρα Kupffer). Σε σχέση με τα ζώα ελέγχου, η θεραπεία με silvestrol σχετίστηκε με μέτρια αυξήσεις στις δραστηριότητες ορό ALT και AST σε 3 από 7 ποντικούς. *,

σ

& lt?