Αφηρημένο

Η θεραπεία του προχωρημένου καρκίνου των ωοθηκών περιλαμβάνει βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία. Ωστόσο, χημειοαντίσταση είναι ένα σημαντικό εμπόδιο. Τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) πιστεύεται ότι είναι μία από τις αιτίες του χημειοαντίσταση, αλλά ο υποκείμενος μηχανισμός παραμένει αόριστη. Πρόσφατα, ανάστροφης μεταγραφάσης ανθρώπινης τελομεράσης (hTERT) έχει αναφερθεί για την προώθηση της CSC-όπως χαρακτηριστικά. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι ένα μιτωτικό αναστολέα, eribulin mesylate (eribulin), ανέστειλαν αποτελεσματικά την ανάπτυξη της πλατίνας ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών. Eribulin-ευαίσθητα κύτταρα παρουσίασαν μεγαλύτερη απόδοση για το σχηματισμό σφαίρας, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα κύτταρα έχουν μια ενισχυμένη CSC-φαινότυπο. Επιπλέον, αυτά τα κύτταρα εξέφρασαν ένα υψηλότερο επίπεδο hTERT, και η καταστολή της έκφρασης hTERT με siRNA είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη ευαισθησία στο eribulin, υποδηλώνοντας ότι hTERT μπορεί να είναι ένας στόχος για eribulin. Πράγματι, διαπιστώσαμε ότι eribulin απευθείας ανέστειλε ΚΝΑ-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση (RdRp) δραστηριότητα, αλλά όχι τελομεράση δραστηριότητα του hTERT

σε

vitro

. Προτείνουμε ότι εριβουλίνη στοχεύει τη δραστηριότητα RDRP των hTERT και μπορεί να είναι μια αποτελεσματική θεραπευτική επιλογή για ΚΕΠ. Επιπλέον, hTERT μπορεί να είναι ένα χρήσιμο βιοδείκτη για την πρόγνωση κλινικών απαντήσεις σε εριβουλίνη

Παράθεση:. Yamaguchi S, Maida Υ, Yasukawa Μ, Κάτω Τ, Yoshida Μ, Masutomi Κ (2014) Eribulin Mesylate Στόχοι ανθρώπινης τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 9 (11): e112438. doi: 10.1371 /journal.pone.0112438

Επιμέλεια: Taro Yamashita, Πανεπιστήμιο Καναζάβα, Ιαπωνία

Ελήφθη: 19 Αυγούστου του 2014? Αποδεκτές: 6 Οκτωβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Νοεμβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Yamaguchi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Grant στο Ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (26462544) (για να SY) από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (http: //www.jsps.go.jp/english/e-grants/), το πρόγραμμα χρηματοδότησης για την επόμενη γενιά World-κορυφαίους ερευνητές (πρόγραμμα NEXT) (σε χλμ) από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (http: //www .jsps.go.jp /english /e-jisedai /), το Ίδρυμα Mitsubishi (KM) (https://www.mitsubishi-zaidan.jp/en/), το Ίδρυμα Uehara Memorial (KM) (http: //www.ueharazaidan.or.jp/), και το Εθνικό Κέντρο Καρκίνου Έρευνας και Ανάπτυξης ταμεία (26-Α-5) (KM) (https://www.ncc.go.jp/jp/about/rinri/Kaihatsu /). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πιο θανατηφόρα όλων των γυναικολογικών κακοηθειών, υποστηρίζοντας περίπου 150.000 ζωές κάθε χρόνο σε όλο τον κόσμο. Η πλειοψηφία των καρκίνων των ωοθηκών διαγιγνώσκονται σε προχωρημένο στάδιο, και με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία είναι η τυπική θεραπεία πρώτης γραμμής για ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο των ωοθηκών. Ωστόσο, χημειοαντίσταση αποτελεί μείζον εμπόδιο στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών.

υδαρής αδενοκαρκίνωμα (SAC), ο πιο κοινός τύπος καρκίνου των ωοθηκών, συνήθως ανταποκρίνεται καλά στην αρχική βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία, αν και αυτό θα επαναληφθεί και τελικά να αναπτύξουν τα ναρκωτικά αντίσταση. καρκίνωμα σαφές κυττάρων (CCC), ο δεύτερος πιο κοινός τύπος στην Ιαπωνία, είναι συχνά ανθεκτικά στην αρχική βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία [1]. Ανεξάρτητα από το αν η αντίσταση αποκτάται ή πρωτογενή, περισσότερο υποσχόμενες θεραπευτικές στρατηγικές είναι αναγκαία για την αντιμετώπιση χημειοαντίσταση και να βελτιώσει την πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών.

Πρόσφατες μελέτες έχουν υποδείξει ότι καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) είναι, τουλάχιστον σε μέρος, υπεύθυνες για χημειοαντίσταση σε πολλούς τύπους καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών [επισκοπείται στο [2]]. ΚΕΠ είναι ένας υποπληθυσμός των καρκινικών κυττάρων, τα οποία χαρακτηρίζονται από μία ικανότητα αυτοανανέωσης και την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε διακριτούς τύπους κυττάρων. Η εμφάνιση των ΚΕΠ συμβαίνει τουλάχιστον εν μέρει ως αποτέλεσμα επιθηλιακών-μεσεγχυματικών μετάβαση (ΕΜΤ), μια διαδικασία απαραίτητη για την εμβρυϊκή ανάπτυξη, η οποία επάγεται κατά την διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου και ζωτικής σημασίας για την μετάσταση του καρκίνου. ΚΕΠ διαθέτουν το χαρακτηριστικό αυτο-ανανέωσης των φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων, και παρόμοια μονοπάτια σηματοδότησης ρυθμίζουν αυτο-ανανέωση των ΚΕΠ και φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων [3]. Μια τέτοια οδός περιλαμβάνει τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης (TERT), το περιοριστικό του ρυθμού καταλυτικής υπομονάδας τελομεράσης, η οποία εκφράζεται στην πλειοψηφία των καρκίνων. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι TERT ρυθμίζει βλαστικών κυττάρων γνωρίσματα σε ένα τελομερών μήκος-ανεξάρτητο τρόπο. Για παράδειγμα, το τριτο ενεργοποιεί εν ηρεμία επιδερμικά βλαστοκύτταρα

σε

vivo

κατά τρόπο ανεξάρτητο από την εγγενή συνιστώσα RNA του ενζύμου τελομεράση TERC [4]. Επιπλέον, μαζί με το διακόπτη-σακχαρόζης NonFermentable (SWI-SNF) σύνθετη πρωτεΐνη του γονιδίου Brahma που σχετίζονται 1 (BRG1), τ δρα ως μεταγραφικός ρυθμιστής του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης, συμβάλλοντας στην αυτο-ανανέωση και τον πολλαπλασιασμό κατά τη διάρκεια της ανάπτυξη [5]. Πιο πρόσφατα, συσσωρεύοντας στοιχεία δείχνουν ότι TERT λειτουργεί επίσης στο ΚΕΠ και προωθεί EMT και CSC-όπως χαρακτηριστικά. Συγκεκριμένα, η υπερέκφραση του ανθρώπινου TERT (hTERT) έχει ως αποτέλεσμα μια ενισχυμένη ικανότητα σχηματισμού σφαίρας, αυξημένη έκφραση δεικτών ΕΜΤ /CSC, και αυξημένη

σε

vivo

ογκογένεση που προκαλείται από την αλληλεπίδραση με hTERT β- κατενίνης και την ενίσχυση της μεταγραφικής δραστηριότητας του [6]. Αντιστρόφως, η καταστολή των αποτελεσμάτων έκφρασης hTERT σε μια μειωμένη ικανότητα σχηματισμού σφαίρας και μειωμένη έκφραση του δείκτη CSC CD44 [7]. Αυτή η λειτουργία του hTERT σε προώθηση της ΕΜΤ και CSC-όπως χαρακτηριστικά φαίνεται να είναι ανεξάρτητη από τελομεράσης δραστηριότητα της [6]. Πράγματι, έχουμε αναφέρει ότι hTERT σε ένα σύμπλοκο με BRG1 και πυρηνισκική GTP πρωτεΐνης δέσμευσης nucleostemin (NS) (ΤΒΝ σύμπλεγμα) συμμετέχει στην διατήρηση του ΚΕΠ. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του συμπλόκου ΤΒΝ ενισχύει ογκογονικότητα και έκφραση δεικτών ΕΜΤ /CSC σε ένα hTERT-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά σε μια τελομερών μήκος-ανεξάρτητο τρόπο [8]. Οι ακριβείς μηχανισμοί της τελομεράσης-ανεξάρτητο, με την οποία το συγκρότημα TBN ρυθμίζει ΚΕΠ παραμένουν ασαφείς. Ένας πιθανός μηχανισμός είναι μέσω του ΚΝΑ-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση (RdRp) δραστηριότητα του hTERT [9]. RdRp επάγει παρεμβολή RNA μέσω παραγωγής δίκλωνου RNAs από RNAs μονόκλωνο εκμαγείο και ρυθμίζει τη συναρμολόγηση και ετεροχρωματίνη μιτωτικής εξέλιξη [10]. Παρόμοια με RdRPs στο μοντέλο οργανισμούς, βρήκαμε ότι οι δραστηριότητες RdRp του συγκροτήματος ΤΒΝ είναι πλούσια σε μιτωτικά κύτταρα, και καταστολή των ΤΒΝ συγκρότημα αποτελέσματα σε μιτωτική σύλληψη [11].

Για την αντιμετώπιση χημειοαντίσταση, θεραπευτικές στρατηγικές που στοχεύουν EMT και ΚΕΠ προσελκύουν όλο και περισσότερο την προσοχή. Πρόσφατα, γιατί mesylate εριβουλίνη (εριβουλίνη) αναφέρθηκε ότι αναστέλλει μετάσταση αντιστρέφοντας EMT [12], θα σκεφτεί ότι εριβουλίνη θα μπορούσε να στοχεύσει ΚΕΠ. Eribulin είναι ένας αναστολέας μη ταξάνης της δυναμικής μικροσωληνίσκων [13], η οποία επάγει μη αναστρέψιμη μιτωτική αποκλεισμός, οδηγώντας σε επίμονη αδρανοποίηση των Bcl-2 και η επακόλουθη απόπτωση [14]. Στις Ηνωμένες Πολιτείες, eribulin έχει εγκριθεί για τη θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου του μαστού μετά από τουλάχιστον δύο θεραπευτικά σχήματα που συμπεριλαμβάνουν ανθρακυκλίνη και ταξανίου. Επιπλέον, eribulin έχει εγκριθεί για τη θεραπεία του μη λειτουργική ή υποτροπιάζοντα καρκίνο του μαστού στην Ιαπωνία.

Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι eribulin αποτελεσματικά ανέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών πλατίνα ανθεκτικά. Eribulin-ευαίσθητα κύτταρα έδειξαν αυξημένη CSC-όπως χαρακτηριστικά και υψηλή έκφραση hTERT. Η καταστολή της έκφρασης hTERT οδήγησε σε μειωμένη ευαισθησία στην εριβουλίνη. Επιπλέον, eribulin ανέστειλε την δραστηριότητα RDRP της hTERT

στο

vitro

, αποδεικνύοντας ότι η hTERT είναι ένας άμεσος στόχος του eribulin.

Αποτελέσματα

Eribulin αναστέλλει την ανάπτυξη σισπλατίνης-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος ωοθηκών

Δεκατέσσερις κυτταρικές σειρές αδενοκαρκινώματος ωοθηκών διερευνήθηκαν για ευαισθησία σε σισπλατίνη [cis-διαμμινοδιχλωρολευκόχρυσος (II)], συμπεριλαμβανομένων έξι κυτταρικές σειρές SAC (PEO1, PEO4, PEO14, PEO23, OVKATE, και OVSAHO), έξι κυτταρικές γραμμές CCC (RMG-Ι, ES-2, OVISE, OVMANA, OVTOKO, και TOV21G) και δύο μη διαφοροποιημένα /αταξινόμητη αδενοκαρκινώματος κυτταρικές σειρές (OVCAR-3 και Α2780) (Πίνακας S1). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, OVKATE, RMG-Ι, PEO4, και τα κύτταρα PEO23 ήταν ιδιαίτερα ανθεκτικά σε σισπλατίνη, πιθανώς μέσω διαφορετικών μηχανισμών. Οι OVKATE κύτταρα έχουν προηγουμένως αναφερθεί ως ανθεκτικά σε παράγοντες πλατίνας με αυξημένη έκφραση της γλουταθειόνης-δ-τρανσφεράσης, ένας δείκτης ανθεκτικότητας σε φάρμακα [15]. κύτταρα RMG-Ι είναι επίσης ανθεκτικά σε σισπλατίνη, η οποία περιλαμβάνει την εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάσης (ERK) μονοπατιού [16]. PEO4 και PEO23 κύτταρα που προέρχονται από τους ίδιους ασθενείς όπως PEO1 και PEO14 κύτταρα, αντίστοιχα, μετά την ανάπτυξη των κλινικών χημειοαντίσταση, και συνεπώς είναι ανθεκτικά λευκόχρυσος [17]. μετάλλαξη BRCA2 έχει βρεθεί να συμβάλλει στην αντίσταση λευκόχρυσου σε κύτταρα PEO4 [18].

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με σισπλατίνη ή eribulin για 72 ώρες, και στη συνέχεια η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασίες ΜΤΤ. (Α) Μέση IC

50 τιμές για σισπλατίνη (μΜ). (Β) Μέση IC

50 τιμές για εριβουλίνη (nM). Οι Eribulin ευαίσθητα (Eribulin S) κυτταρικές σειρές εμφανίζονται ως ανοιχτό μπαρ, και εριβουλίνη ανθεκτικά (Eribulin R) κυτταρικές σειρές εμφανίζονται ως κλειστά μπαρ. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SD τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

διαλογή μία σειρά από γνωστές ενώσεις κατά του καρκίνου για την αναστολή της ανάπτυξης του λευκόχρυσου ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών. Βρήκαμε ότι η eribulin, ένα μιτωτικό αναστολέα που καταστέλλει τη δυναμική των μικροσωληνίσκων [13], ανέστειλε την ανάπτυξη του RMG-Ι, PEO23 και κύτταρα PEO4 (Σχήμα 1Β). Εντυπωσιακά, eribulin δεν ήταν τόσο αποτελεσματική σε ορισμένες από τις cisplatin ευαίσθητα κυτταρικές γραμμές όπως OVTOKO, PEO14, και TOV21G (Σχήμα 1Α και 1Β). Για περαιτέρω χαρακτηρισμό, ορίσαμε οκτώ κυτταρικές σειρές με ένα IC

50 & lt? 100 nM για εριβουλίνη ως «εριβουλίνη-ευαίσθητα» (Eribulin S) και έξι κυτταρικές σειρές με ένα IC

50 & gt? 100 nM για eribulin ως «εριβουλίνη ανθεκτική» (eribulin R).

eribulin ευαίσθητες κυτταρικές σειρές δείχνουν μια υψηλότερη σφαίρα που σχηματίζει

ικανότητα είναι

ΚΕΠ πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για χημειοαντίσταση, και έχουν ΚΕΠ έχουν αναφερθεί να συμβάλει στην αντοχή σισπλατίνη σε αρκετούς τύπους καρκίνου [19]. Επιπλέον, αναφέρθηκε πρόσφατα ότι εριβουλίνη αντιστρέφει EMT [12], ένα φαινότυπο που είναι ιδιαίτερα σχετικές με τα ΚΕΠ. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε αν εριβουλίνη-ευαίσθητα κύτταρα έχουν μια ενισχυμένη CSC-φαινότυπο. Επειδή ένα ικανότητα σχηματισμού σφαίρας είναι ένα CSC-σαν χαρακτηριστικό, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς σχηματισμού σφαίρας κάτω από συνθήκες χωρίς ορό, και βρήκαν ότι eribulin-ευαίσθητες κυτταρικές σειρές παρουσίασαν απόδοση σχηματισμός υψηλή σφαίρα (Σχήμα 2Α και 2Β). Η αποτελεσματικότητα σχηματισμού σφαίρα των κυτταρικών σειρών Eribulin S ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των κυτταρικών σειρών Eribulin R (Σχήμα 2C, ρ = 0,0013), υποδεικνύοντας ότι eribulin-ευαίσθητες κυτταρικές σειρές έχουν αυξημένη CSC-όπως χαρακτηριστικά.

(Α ) αποδοτικότητα σχηματισμός Sphere (SFE) του κάθε κυτταρική σειρά δείχθηκε ανά 1.000 κύτταρα. Οι S κυτταρικές σειρές Eribulin εμφανίζεται ως ανοιχτό μπαρ, και Eribulin R κύτταρα εμφανίζονται ως κλειστά μπαρ. Κάθε πείραμα διεξήχθη τουλάχιστον τρεις φορές, και οι μέσες τιμές ± SD υποδεικνύονται. (Β) Μορφολογία των tumorspheres υπό συνθήκες χωρίς ορό. Αντιπροσωπευτικά εικόνες των σφαιρών που σχηματίζεται από Α2780, RMG-Ι, ES-2, OVSAHO, TOV21G, και τα κύτταρα OVTOKO εμφανίζονται. μπαρ κλίμακας = 50 μm. (Γ) Η μέση SFE κυτταρικών σειρών Eribulin S (n = 8) και Eribulin R κυτταρικές γραμμές (n = 6) που φαίνεται στο (Α). Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν SD. (Δ) Το επίπεδο της έκφρασης BRG1 και πρωτεϊνών NS ανιχνεύθηκε με ανοσοκηλίδωση. έκφραση GAPDH φάνηκε σαν έλεγχος φόρτωσης. (Ε) Σήματα σε (D) ποσοτικά με το λογισμικό ImageJ και κανονικοποιημένο στο σήμα GAPDH. Οι μέσες τιμές του σχετικού επιπέδου έκφρασης ± SD υποδεικνύονται.

Η

Δεδομένου ότι έχουμε δείξει πρόσφατα ότι NS μαζί με hTERT και BRG1 διατηρεί ΚΕΠ [8] και εμείς και άλλοι έδειξαν επίσης ότι η NS είναι ένα χρήσιμο CSC δείκτη [20] – [22], μελετήσαμε την έκφραση της BRG1 και NS σε Eribulin S και κυτταρικές σειρές Eribulin R. Το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης του BRG1 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κυτταρικές σειρές Eribulin S (Εικόνα 2D και 2Ε, p = 0,0189), ενώ παρατηρήθηκε μόνο μια μέτρια τάση του υψηλότερου επιπέδου NS σε κυτταρικές γραμμές Eribulin S (Εικόνα 2D και 2Ε, ρ = 0.1216). Δεν εντοπίσαμε μια διαφορά στο επίπεδο έκφρασης του CD133 ή CD44 (Σχήμα S1), οι δείκτες κυτταρικής επιφάνειας που συνεπάγεται σε ορισμένες ΚΕΠ [23].

κύτταρα Eribulin S εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα της πρωτεΐνης hTERT

Η υπερέκφραση των αποτελεσμάτων hTERT σε μια ενισχυμένη ικανότητα σχηματισμού σφαίρας σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα [6]. Αντιστρόφως, η καταστολή της έκφρασης hTERT ως αποτέλεσμα μια μειωμένη ικανότητα σχηματισμού σφαίρας σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [7]. Επομένως, προσδιορίσαμε το εάν τα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών με μεγαλύτερη χωρητικότητα σχηματισμού σφαίρας εκφράζουν ένα υψηλότερο επίπεδο hTERT. Παρατηρήσαμε μια τάση σε κυτταρικές σειρές με υψηλή απόδοση σχηματισμού σφαίρας, όπως RMG-Ι, PEO23, και Α2780, για να εκφράσουν σχετικά υψηλά επίπεδα hTERT πρωτεΐνης, ενώ κυτταρικές γραμμές με χαμηλή αποτελεσματικότητα σχηματισμού σφαίρας, όπως TOV21G, OVTOKO, και OVMANA, εξέφρασαν χαμηλά επίπεδα πρωτεΐνης hTERT, όπως αποδεικνύεται από ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) (Σχήμα 3Α). Το υψηλό επίπεδο της έκφρασης hTERT σε κύτταρα RMG-I μπορεί να εξηγηθεί από ένα κέρδος-of-λειτουργίας μετάλλαξη (-124 G & gt? Α) στην περιοχή hTERT υποκινητή (Πίνακας S1 και S2 Σχήμα). Αυτή η ειδική για τον καρκίνο μετάλλαξη αναφέρθηκε πρόσφατα στο μελάνωμα και διάφορες άλλες μορφές καρκίνου [24] – [27], η οποία δημιουργεί νέα δεσμευτική μοτίβα για το E-εικοσιέξι /τριμερές σύμπλοκο παράγοντες (ETS /TCF) και ως εκ τούτου συμβάλλει στην απορυθμίζεται μεταγραφής hTERT [24], [25].

(Α) Το επίπεδο της έκφρασης πρωτεΐνης hTERT προσδιορίστηκε με ELISA (υποδεικνύεται ως ng /ml). Οι S κυτταρικές σειρές Eribulin εμφανίζεται ως ανοιχτό μπαρ, και Eribulin R κύτταρα εμφανίζονται ως κλειστά μπαρ. Κάθε πείραμα διεξήχθη τουλάχιστον τρεις φορές, και οι μέσες τιμές ± SD υποδεικνύονται. (Β) Η μέση στάθμη hTERT κυτταρικών γραμμών Eribulin S (n = 8) και κυτταρικές γραμμές Eribulin R (n = 6) που φαίνεται στο (Α). Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν SD.

Η

Βρήκαμε ότι κυτταρικές σειρές Eribulin S εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα της πρωτεΐνης hTERT από εκείνες στις κυτταρικές σειρές Eribulin R (Σχήμα 3Β, p = 0,008).

Καταστολή του hTERT αποτελέσματα έκφρασης σε μειωμένη ευαισθησία στην eribulin

Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης hTERT και η ευαισθησία eribulin μας οδήγησε να υποθέσουμε ότι eribulin αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών μέσω αναστολής της hTERT. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, εξετάσαμε αν η καταστολή της έκφρασης hTERT σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών οδηγεί σε μειωμένη ευαισθησία στην eribulin. Δύο ανεξάρτητες siRNAs hTERT-ειδικά εισήχθησαν σε Α2780 κύτταρα και ευαισθησία σε eribulin συγκρίθηκε με κύτταρα που εκφράζουν siRNA ελέγχου. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα που εκφράζουν hTERT siRNAs έδειξαν μειωμένη ευαισθησία στην eribulin (Σχήμα 4Α). TERT siRNA1 έδειξε μια τάση ισχυρότερη καταστολή της έκφρασης hTERT από TERT siRNA2 όπως καταδεικνύεται με ELISA (Σχήμα 4Β). Το εύρημα αυτό μπορεί να εξηγήσει γιατί τα κύτταρα που εκφράζουν TERT siRNA1 έτειναν να είναι λιγότερο ευαίσθητη σε eribulin από εκείνα που εκφράζουν TERT siRNA2 (Σχήμα 4Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε ES-2 κύτταρα (Σχήμα 4C και 4D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι hTERT θα μπορούσε να είναι ένας άμεσος στόχος για eribulin.

(Α) κύτταρα Α2780 που εκφράζουν ελέγχου siRNA (ανοικτές μπάρες), TERT siRNA1 (κλειστές ράβδοι), ή τριτ siRNA2 (σκιασμένες ράβδοι) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με eribulin για 72 ώρες, και στη συνέχεια η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασίες ΜΤΤ. * P & lt? 0,05 έναντι κυττάρων που εκφράζουν ελέγχου siRNA. (Β) Το επίπεδο της έκφρασης πρωτεΐνης hTERT σε κύτταρα Α2780 που εκφράζουν ελέγχου siRNA (ανοικτές μπάρες), TERT siRNA1 (κλειστές ράβδοι), ή τριτ siRNA2 (σκιασμένες μπάρες) προσδιορίστηκε με ELISA (υποδεικνύεται ως ng /ml). (Γ και Δ) Τα πειράματα που περιγράφονται στο (Α και Β) εκτελέστηκαν με τον ίδιο τρόπο με τη χρήση κυττάρων ES-2 που εκφράζουν ελέγχου siRNA (ανοικτές μπάρες), TERT siRNA1 (κλειστές ράβδοι), ή τριτ siRNA2 (σκιασμένες ράβδοι). * P & lt?. 0,05 έναντι κυττάρων που εκφράζουν τον έλεγχο siRNA

Η

Eribulin αναστέλλει τη δράση RDRP της hTERT

στο

vitro

Η

Είναι ευρέως πιστεύεται ότι οποιαδήποτε επίδραση της καταστολής hTERT διαμεσολαβείται από βράχυνσης των τελομερών. Ωστόσο, επειδή παρατηρήσαμε μειωμένη ευαισθησία στην eribulin σε σχετικά σύντομο χρονικό διάστημα (σχήμα 4, 96 ώρες μετά την επιμόλυνση του siRNA κατά hTERT), υποθέσαμε ότι αυτή η επίδραση είναι ανεξάρτητη από τη λειτουργία συντήρησης τελομερούς του hTERT. Επιπλέον, η λειτουργία της hTERT σε προώθηση της ΕΜΤ και CSC-όπως χαρακτηριστικά είναι ανεξάρτητη από τελομεράσης δραστηριότητα της [6]. Μαζί με την πρόσφατη έκθεσή μας δείχνει ότι hTERT έχει μια δραστηριότητα RDRP ανεξάρτητη από τη συντήρηση των τελομερών [9], ερευνήσαμε αν εριβουλίνη στοχεύει άμεσα δραστηριότητα hTERT-RdRp. Παρακολουθήσαμε την ανασταλτική επίδραση του eribulin στη δραστηριότητα hTERT-RDRP χρησιμοποιώντας ένα

στο

vitro

RDRP δοκιμασία [11], και διαπίστωσε ότι eribulin αναστέλλει τη δράση της hTERT-RDRP

σε

vitro

σε συγκέντρωση 50 μΜ (Σχήμα 5Α). Η ίδια συγκέντρωση του eribulin δεν ανέστειλε την δραστικότητα τελομεράσης της hTERT, όπως φαίνεται από το πρωτόκολλο τελομερή επαναλαμβανόμενη ενίσχυση (TRAP) δοκιμασίας (Σχήμα 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι επιδράσεις της eribulin επί hTERT δεν διαμεσολαβείται μέσω δράσης της τελομεράσης, αλλά μέσω δραστικότητα RdRp. Είναι ενδιαφέρον ότι, μια άλλη μιτωτικό αναστολέα, πακλιταξέλη, ένας εκπρόσωπος ταξάνιο, δεν αναστέλλουν την δραστικότητα RdRp (Σχήμα 5C), γεγονός που υποδηλώνει ότι eribulin έχει ειδική ανασταλτική επίδραση στην δραστικότητα hTERT-RdRp.

(Α) RdRp ενεργότητα του ανοσοποιητικού hTERT σύμπλοκα που παρασκευάζονται από κύτταρα HeLa συνελήφθησαν στη μιτωτική φάση αναλύθηκε χωρίς ή με 10 και 50 μΜ eribulin. (Β) Δράση της τελομεράσης σε εκχυλίσματα κυττάρων HeLa δοκιμάστηκε χωρίς ή με 10 και 50 μΜ eribulin. (C) δραστηριότητα RDRP της hTERT ανοσοσυμπλεγμάτων αναλύθηκε χωρίς ή με 10 και 100 μΜ πακλιταξέλη (ΡΤΧ).

Η

Συζήτηση

Μεταξύ των γυναικολογικών καρκίνων, καρκίνο των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία της θάνατος. Ειδικότερα, η αντίσταση σε συμβατικά με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία έχει ένα εμπόδιο στη βελτίωση της προγνώσεις για ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών, και νέες θεραπευτικές στρατηγικές απαιτούνται επειγόντως. Εδώ, βρήκαμε ότι eribulin ήταν αποτελεσματική για την αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών πλατίνα ανθεκτικά. Επιδράσεις της eribulin συσχετίσθηκαν με επίπεδα έκφρασης hTERT (Σχήμα 3), και η καταστολή της έκφρασης hTERT οδήγησε σε μειωμένη ευαισθησία στην eribulin (Σχήμα 4), γεγονός που υποδηλώνει ότι hTERT θα μπορούσε να είναι ένας στόχος της eribulin σε αυτά τα κύτταρα. Πράγματι, eribulin ανέστειλε την δραστηριότητα RDRP αλλά όχι την ενεργότητα αντίστροφης μεταγραφάσης hTERT

στο

vitro

(Σχήμα 5).

ΚΕΠ και hTERT

ΚΕΠ πιστεύεται ότι εμπλέκονται στην χημειοαντίσταση, και έχουν πολλές οδοί έχουν βρεθεί να συμβάλλουν στην προώθηση ή τη διατήρηση των ΚΕΠ. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι hTERT παίζει σημαντικό ρόλο στην προαγωγή και διατήρηση της ΚΕΠ σε τελομερούς τρόπους συντήρησης ανεξάρτητη [6] – [8]. Eribulin ανέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη του λευκόχρυσου-ανθεκτικών κυττάρων (Σχήμα 1). Eribulin-ευαίσθητα κύτταρα εμφάνισαν υψηλότερη έκφραση hTERT (Σχήμα 3) και ένα υψηλότερο σχηματισμού σφαίρας ικανότητα (Σχήμα 2), υποδηλώνοντας ότι αυτά τα κύτταρα έχουν ενισχυμένη CSC-όπως χαρακτηριστικά, πιθανώς λόγω των υψηλών επιπέδων πρωτεΐνης hTERT. Σταθερά, eribulin-ευαίσθητα κύτταρα εμφάνισαν υψηλότερη έκφραση BRG1 (Σχήμα 2), ένα άλλο συστατικό του συμπλόκου ΤΒΝ που διατηρεί ΚΕΠ. Εμείς δεν ανίχνευσε μια σημαντική διαφορά στην έκφραση του CD133 ή CD44 (Σχήμα S1). Αν και CD133 και CD44 πιστεύεται ότι είναι ενδεικτικές των ΚΕΠ σε ορισμένους τύπους καρκίνου, μένει να διευκρινιστεί ποια δείκτες είναι κατάλληλοι για ΚΕΠ σε καρκίνους των ωοθηκών [23].

Επειδή διατήρηση των τελομερών από τελομεράση είναι απαραίτητη για την άπειρη πολλαπλασιασμό των κακοήθων κυττάρων, έχουν γίνει προσπάθειες για την ανάπτυξη αντικαρκινικών θεραπευτικών στόχευση της τελομεράσης. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι TERT παίζει λειτουργικό ρόλο πέρα ​​από τη συντήρηση των τελομερών. Πράγματι, η λειτουργία της TERT για την ενεργοποίηση κανονική εν ηρεμία βλαστικά κύτταρα ή CSC-όπως χαρακτηριστικά έχει δειχθεί ότι είναι ανεξάρτητη από τη δράση της τελομεράσης του [4], [6], [28]. Βρήκαμε επίσης ότι το σύμπλοκο ΤΒΝ διατηρεί CSCs σε τελομερών μήκος-ανεξάρτητο τρόπο [8]. Είναι πιθανό ότι αυτή η τελομεράση ανεξάρτητος μηχανισμός διαμεσολαβείται από τη δραστικότητα του RdRp TERT, επειδή το ίδιο το συγκρότημα ΤΒΝ είναι υπεύθυνη για τη δραστικότητα RdRp και εμπλέκεται στην ρύθμιση ετεροχρωματίνη και μιτωτική εξέλιξη [11]. Υποθέτουμε ότι η δραστηριότητα του RdRp hTERT εμπλέκεται στην γονιδιακή έκφραση μέσω ρύθμισης ετεροχρωματίνης σε καρκινικά κύτταρα, και θα μπορούσε να είναι ένα νέο αντικαρκινικό θεραπευτικό στόχο. Είτε δραστηριότητα RDRP είναι απαραίτητη προϋπόθεση για τη λειτουργία hTERT στην προώθηση των ΚΕΠ μένει να καθοριστεί.

Eribulin και hTERT

Eribulin συνδέεται με μικροσωληνίσκους συν άκρα και αναστέλλει τη φάση ανάπτυξης της δυναμικής των μικροσωληνίσκων [29] . Πρόσφατα, eribulin δείχθηκε να αντιστρέψει ΕΜΤ με προς τα κάτω ρύθμιση μετασχηματισμού αυξητικού παράγοντα-β (ΤΟΡ-β) προκληθείσα Smad φωσφορυλίωσης [12]. Smad πρωτεΐνες δεσμεύονται με μικροσωληνίσκους εν απουσία TGF-β και ΤΟΡ-β ενεργοποιεί διάστασης από μικροσωληνίσκους και φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Smad [30]. Yoshida

et al.

Εικάζουν ότι eribulin αναστέλλει τη φωσφορυλίωση Smad ενδεχομένως με την καταστολή Smad αποσύνδεση από μικροσωληνίσκους [12]. Επειδή έχουμε δείξει πρόσφατα ότι hTERT εντοπίζεται μιτωτικών ατράκτων και κεντρομεριδίων κατά τη διάρκεια της μίτωσης [11], είναι επίσης πιθανό ότι eribulin αναστέλλει τις λειτουργίες hTERT παρεμβαίνοντας με την αλληλεπίδραση μεταξύ hTERT και μικροσωληνίσκων. Eribulin βελτιώνει τη συνολική επιβίωση των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του μαστού, ο οποίος είχε πριν ανθρακυκλίνη και ταξάνης χημειοθεραπεία με βάση [31]. Ένα φάρμακο ταξάνιο, η πακλιταξέλη, δεν ανέστειλε την δραστικότητα του RdRp hTERT (Σχήμα 5C), παρέχει ένα από τα εν δυνάμει μοριακές βάσεις για τα διάφορα κλινικά αποτελέσματα των ταξανίων και eribulin. Ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο eribulin αναστέλλει τη λειτουργία hTERT είναι ακόμη να γίνει κατανοητό.

hTERT ως βιοδείκτη

Είναι σημαντικό να εντοπίσει βιοδείκτες για την πρόβλεψη απαντήσεις σε αντικαρκινικών θεραπειών. Με τον προσδιορισμό των επιπέδων hTERT σε κλινικά δείγματα, οι ασθενείς οι οποίοι είναι πιθανόν να ανταποκρίνονται καλά σε eribulin μπορεί να διαπιστωθεί πριν λάβουν χημειοθεραπεία. Ειδικότερα, ένα ELISA θα είναι σε θέση να μετρήσει τα επίπεδα hTERT στην κλινική πράξη.

Περιληπτικά, βρήκαμε ότι eribulin αναστέλλει τη δράση RdRp του hTERT, το οποίο μπορεί να συμβάλει στην χημειοαντίσταση στον καρκίνο των ωοθηκών διατηρώντας ΚΕΠ. Eribulin ανέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών με υψηλή έκφραση hTERT και ισχυρή αντίσταση λευκόχρυσου, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να είναι ένας ελπιδοφόρος θεραπευτικός παράγοντας για χημειοθεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Επιπλέον, hTERT μπορεί να είναι ένα χρήσιμο βιοδείκτη για την πρόγνωση κλινικών απαντήσεις σε εριβουλίνη.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

RMG-Ι [32], OVMANA [33], OVTOKO [34], OVISE [34], OVSAHO [33], και OVKATE [33] κύτταρα ελήφθησαν από την ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources Τράπεζας κυττάρων. OVCAR-3 κύτταρα [35] ελήφθησαν από το Bioresource Κέντρο RIKEN. PEO1, PEO4, PEO14, PEO23 [17], και Α2780 [36] κύτταρα αγοράστηκαν από την Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών Κυττάρων, και TOV21G [37] και ES-2 [38] κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection. κύτταρα RMG-I καλλιεργήθηκαν σε μέσο Ham F12 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, ES-2 κύτταρα σε μέσο McCoy 5Α συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, τα κύτταρα TOV21G σε MCDB105 /Medium 199 (1:01) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, και HeLa κύτταρα σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Όλες οι άλλες κυτταρικές γραμμές (Α2780, OVCAR-3, OVMANA, OVTOKO, OVISE, OVSAHO, OVKATE, PEO1, PEO4, PEO14, και PEO23) καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο ( Gibco, Grand Island, NY, USA).

Ενώσεις

η σισπλατίνη αγοράστηκε από τη Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA), η πακλιταξέλη αγοράστηκε από Wako (Osaka, Japan), και eribulin (Halaven) αγοράστηκε από την Eisai Co., Ltd (Tsukuba, Japan).

ΜΤΤ δοκιμασία

Cells (5.000-10.000 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και στη συνέχεια υποβάλλεται σε επεξεργασία με σισπλατίνη ή eribulin μετά από 24 ώρες. Στις 72 ώρες της θεραπείας, μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού ΜΤΤ (Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Kit Ι ΜΤΤ, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 10 μΐ αντιδραστηρίου σήμανσης ΜΤΤ προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, που ακολουθείται από 4 ώρες επώασης. Στη συνέχεια, 100 μΐ διαλύματος διαλυτοποίησης προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, ακολουθούμενα από ολονύκτια επώαση. Το προϊόν της αντίδρασης ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 570 και 690 nm χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών (Viento 808, BioTek, Winooski, VT, USA). Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με συγκρίσεις με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα.

Σφαίρα σχηματισμός δοκιμασία

Ενιαία κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στερεώσεως (Corning Inc, Corning, ΝΥ, USA) σε 100- 1000 κύτταρα /100 μΙ μέσου σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο DMEM /F12 άνευ ορού (Gibco) συμπληρωμένο με 20 ng /ml βασικό αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (Wako), 20 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Wako) και Β27 συμπλήρωμα (Gibco). Οι καλλιέργειες συμπληρώθηκαν με 25 μΐ φρέσκου μέσου κάθε 3-4 ημέρες, και ο αριθμός των σφαιρών μετρήθηκε τις ημέρες 7 και 14. Μικροσκοπική εικόνες ελήφθησαν με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο CKX41 και DP21 ψηφιακή κάμερα (Olympus, Tokyo, Japan).

ανοσοαποτύπωσης

τα κύτταρα λύθηκαν σε δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης ρυθμιστικό (RIPA) που περιέχει 1% ΝΡ-40, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.4) και 150 mM NaCl. Μετά κατεργασία με υπερήχους και φυγοκέντρηση των προϊόντων λύσης, πρωτεΐνες (20 μg) υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE σε 7,5% πηκτές πολυ-ακρυλαμιδίου, που ακολουθείται από ανάλυση ανοσοστυπώματος. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-BRG1 (ένα δώρο από τον Dr. Tsutomu Ohta, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Japan), αντι-NS (A300-600A? Bethyl Laboratories, Montgomery, ΤΧ, USA), αντι-GAPDH (3H12? Medical & amp? Biological Laboratories (MBL), Ναγκόγια, Ιαπωνία), αντι-CD133 (W6B3C1? Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία) και αντι-CD44 (2C5? R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA). Σήματα ανιχνεύθηκαν από ΣΕΝ-3000 (Fujifilm, Τόκιο, Ιαπωνία), ποσοτικά με το λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health, USA) και ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον έλεγχο GAPDH φόρτωσης.

hTERT ELISA

Η hTERT ELISA χρησιμοποίησε ένα αντι-hTERT πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού ως το αντίσωμα σύλληψης (MBL), και ένα αντι-hTERT μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (mAb) (κλώνος 2E4-5) ως το αντίσωμα ανίχνευσης (κωδικός MBL αρ. 5340, Ab-Match Συνέλευση Ανθρώπου Kit TERT). Το αντίσωμα 2E4-5 δημιουργήθηκε έναντι ανασυνδυασμένου hTERT ως ανοσογόνο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA. Μετά κατεργασία με υπερήχους και φυγοκέντρηση των προϊόντων λύσης, 100 μα ολικής πρωτεΐνης (100 μΐ σε όγκο) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96-φρεατίων (κωδικός MBL αρ. 5310, Ab-Match καθολική Kit). Η ELISA διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι απορροφήσεις στα 450 και 630 nm μετρήθηκαν με έναν αναγνώστη μικροπλάκας. Κάθε πείραμα διεξήχθη τουλάχιστον τρεις φορές, και υπολογίστηκαν οι μέσες τιμές.

TERT μετάλλαξη υποκινητή ανάλυση

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών χρησιμοποιώντας ένα Blood and Cell Culture DNA Kit (Qiagen , Hilden, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η

TERT

περιοχή υποκινητή (-146 να -124-bp ανοδικά από το κωδικόνιο έναρξης) ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ΚΩΔ FX (Toyobo, Osaka, Japan) και τα ακόλουθα εναρκτήρια: 5′-GTCCTGCCCCTTCACCTT-3 ‘ και 5’-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3 ‘[25]. PCR διεξήχθη υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 40 κύκλοι των 98 ° C για 10 s, 55 ° C για 30 s, και 68 ° C για 60 s. Τα καθαρισμένα προϊόντα PCR αλληλουχήθηκαν με αλληλούχηση Sanger.

Η επιμόλυνση του siRNA

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA με Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) και στη συνέχεια σπάρθηκαν σε 5.000-10.000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων . Στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με eribulin, και μια δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη μετά από 72 ώρες της θεραπείας. Για την ELISA, 2 έως 5,0 × 10

6 κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA απλώθηκαν σε μια 10-cm τριβλίο petri, και στη συνέχεια συλλέγεται μετά από 48 ώρες επώασης. hTERT siRNA1 και hTERT siRNA2 έχουν περιγραφεί προηγουμένως [8]. Η αρνητική siRNA ελέγχου (ΑΠΟΣΤΟΛΗ siRNA Οικουμενική Negative Control? Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκε επίσης

IP-RDRP δοκιμασία

Για την ανίχνευση δραστηριότητα RDRP

στο

vitro

, το ανοσοποιητικό σύμπλοκο hTERT απομονώθηκε από το mAb κατά της hTERT. Μια δοκιμασία IP-RDRP έχει καθιερωθεί στη μίτωση συνελήφθη κύτταρα HeLa [11]. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα HeLa χρησιμοποιήθηκαν για την δοκιμασία αυτή. Για το συγχρονισμό κύτταρα HeLa που υποβάλλονται σε μίτωση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει 2.5 mM θυμιδίνης (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) για 24 ώρες. Στις 6 ώρες μετά την απελευθέρωση, τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο που περιείχε 0.1 μg /ml nocodazole (Sigma-Aldrich) για 14 ώρες. Μετά από ήπια ανακίνηση, μιτωτικά κύτταρα ανακτήθηκαν. Η δοκιμασία ΙΡ-RdRp διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11].

ποσοτικό προσδιορισμό TRAP

Μια δοκιμασία TRAP χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των τελομερών ειδική δραστικότητα της αντίστροφης μεταγραφάσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [39].

Στατιστική ανάλυση

οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). χρησιμοποιήθηκε t-test του Student ή δοκιμασία Mann Whitney. Δύο όψεων p-τιμές των & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1..

CD133 και έκφραση CD44 σε Eribulin S και Eribulin R καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα. (Α) Το επίπεδο της έκφρασης πρωτεΐνης CD133 και CD44 ανιχνεύθηκε με ανοσοκηλίδωση. Δεδομένου ότι τα στοιχεία αποκτήθηκαν με τον ίδιο πείραμα όπως στο Σχήμα 2 πάνελ D, GAPDH γέλη ήταν πανομοιότυπη με το σχήμα 2 του πίνακα D. (Β) Σήματα στο (Α) ποσοτικοποιήθηκαν με το λογισμικό ImageJ και ομαλοποιήθηκε ως προς το σήμα GAPDH. Οι μέσες τιμές του σχετικού επιπέδου έκφρασης ± SD αναφέρεται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0112438.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

ES-2 και RMG-Ι κύτταρα έχουν μεταλλάξεις hTERT υποκινητή. Ο υποκινητής hTERT αλληλουχήθηκε σε κάθε κυτταρική σειρά. κύτταρα ES-2 φιλοξενούν μια -138 /-139 GG & gt? AA μετάλλαξη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27], και τα κύτταρα RMG-τρέφω μια -124 G & gt? Μια μετάλλαξη. Οι αλληλουχίες άγριου τύπου από τις αντίστοιχες περιοχές από τα κύτταρα OVKATE και OVSAHO εμφανίζονται ως μάρτυρες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0112438.s002

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1.

ωοθηκών κυτταρικές σειρές καρκίνου που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0112438.s003

(DOCX)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Tsutomu Ohta για το δώρο του αντισώματος αντι-BRG1, Dr. Koichi Ichimura για την τεχνική βοήθεια με την ανάλυση μετάλλαξη υποκινητή, και MBL για τη βοήθειά τους στην ίδρυση του κιτ ELISA για την ανίχνευση hTERT.