Αφηρημένο

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου από γυναικολογικό κακοήθεια. Απορρύθμιση της ρ53 και /ή ρ73-συνδέονται αποπτωτικών οδών συμβάλλουν στην αντοχή με βάση την πλατίνα στον καρκίνο των ωοθηκών. NOXA, ένα προ-αποπτωτικό ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνη, ταυτοποιείται ως στόχος της μεταγραφής του ρ53 και /ή ρ73. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι υπάρχουν γενετικές παραλλαγές των πρωτεϊνών Bcl-2 μεταξύ cisplatin-ευαίσθητο και ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, και οι απαντήσεις των NOXA και Bax να σισπλατίνη ρυθμίζεται κυρίως από ρ53. Αξιολογήσαμε περαιτέρω την επίδραση της NOXA στην σισπλατίνη. NOXA επαγόμενη απόπτωση και ευαισθητοποιημένων τα A2780S και SKOV3 κυττάρων με σισπλατίνη

in vitro

και

in vivo

. Οι επιδράσεις που προκαλούνται από αυξημένη έκφραση Bax, ενισχυμένη ενεργοποίηση της κασπάσης, η απελευθέρωση του Cyt C και Smac στο κυτταρόπλασμα. Επιπλέον, γονιδιακή σίγηση του Βαχ ή Smac εξασθενημένα σημαντικά NOXA ή /και σισπλατίνη επαγόμενη απόπτωση σε νόσο ευαίσθητη τα A2780S κύτταρα, ενώ η υπερέκφραση του Βαχ ή προσθήκη του πεπτιδίου Smac-N7 αυξήθηκε σημαντικά NOXA ή /και σισπλατίνη επαγόμενη απόπτωση σε χημειοθεραπεία κύτταρα SKOV3. Για τις γνώσεις μας, τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο NOXA chemosensitized ωοθηκών καρκινικά κύτταρα σε σισπλατίνη με διέγερση μεταβολές στον άξονα Βαχ /Smac. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι NOXA είναι δυνητικά χρήσιμο ως χημειοευαισθητοποιητή στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Lin C, Zhao Χ-Υ, Li L, Liu H-y, Cao Κ, Wan Y, et al. (2012) NOXA-Induced Μεταβολές στην Άξονα Bax /Smac Ενίσχυση ευαισθησία των κυττάρων του καρκίνου των ωοθηκών σε σισπλατίνη. PLoS ONE 7 (5): e36722. doi: 10.1371 /journal.pone.0036722

Επιμέλεια: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Μαρτίου του 2012? Αποδεκτές: 10 του Απριλίου 2012? Δημοσιεύθηκε: May 9, 2012 |

Copyright: © 2012 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Key πρόγραμμα βασικής έρευνας της Κίνας (2010CB529900) και Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30.900.744? 81071817 /H1609? 81001010). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου από γυναικολογικό κακοήθειας [1]. Αν και υπάρχουν κάποιες βελτιώσεις, η μακροπρόθεσμη επιβίωση παραμένει φτωχή λόγω τοξικότητας δοσοεξαρτώμενη, ενδεχόμενη επανεμφάνιση του όγκου και της εμφάνισης της νόσου ανθεκτικών στα φάρμακα. Για να ξεπεραστούν αυτά τα εμπόδια, οι έρευνες έχουν επικεντρώνεται όλο και περισσότερο στις νέες θεραπευτικές στρατηγικές: ρύθμιση της κυτταρικής χημειοευαισθησία, αντιστρέφοντας την αντίσταση του όγκου, και την αύξηση θεραπευτικά αποτελέσματα της χημειοθεραπείας [2]. Αναδυόμενες αποδείξεις δείχνουν ότι η απελευθερωμένη μονοπάτι της απόπτωσης είναι μια σημαντική συμβολή στην έναρξη του όγκου, την πρόοδο και την ανάπτυξη της επίκτητης αντοχής σε αντικαρκινικές θεραπείες [3], [4].

Ως κοινή γενετική εκδήλωση στο καρκίνωμα των ωοθηκών, ρ53 μετάλλαξη συνδέεται με την αντίσταση στην πλατίνα χημειοθεραπεία με βάση [5]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το p73, ένα μέλος της οικογένειας p53 πρωτεϊνών, αποτελεί βασικό ρυθμιστή της ευαισθησίας απόπτωση σε cisplatin (Cis) σε Α2780 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα [6], [7], και ότι η p73-εξαρτώμενη πρόγραμμα της μεταγραφής είναι ένας σημαντικός συνεισφέρων προς την οδό χημειοευαισθησία σε κύτταρα καρκινώματος ωοθήκης BRCA1 με έλλειψη [8], που δείχνει κάποιες μηχανισμοί που επηρεάζουν τις εκφράσεις ρ73 και τις λειτουργίες μπορεί να συνεισφέρουν στην ανάπτυξη αντοχής στη σισπλατίνη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [7]. Όλες αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η απορρύθμιση των οδών αποπτωτικών ρ53-εξαρτώμενη και /ή ρ73-συνδέονται μπορεί να συνεισφέρει στην αντίσταση με βάση την πλατίνα στον καρκίνο των ωοθηκών. Έτσι, αποκατάσταση του ρ53 και /ή ρ73 μονοπάτι ενεργοποιώντας τον εαυτό τους ή κατάντη τους στόχους μπορεί να είναι μια ελκυστική λεωφόρος για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας των αντικαρκινικών θεραπειών.

NOXA αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως μεταγραφικός στόχος της ρ53 [9], και πρόσφατα δείχθηκε επίσης ότι ρυθμίζεται μεταγραφικά από ρ73 [8]. Όπως πολλές πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl-2, που μετατοπίζονται στα μιτοχόνδρια και ρυθμίζουν τη μιτοχονδριακή λειτουργία, NOXA μετατοπίζεται στα μιτοχόνδρια και στη συνέχεια οδηγεί σε κυτόχρωμα C (Cyt C) ενεργοποίηση απελευθέρωσης και της κασπάσης-9, και, τελικά, οδηγώντας σε κυτταρικό θάνατο [10], [ ,,,0],11]. λειτουργίες NOXA μέσω Βαχ και /ή Bak να επάγει απόπτωση σε μερικά καρκινικά κύτταρα όπως Hela του τραχήλου της μήτρας ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα [9], κύτταρα μελανώματος [11], MCF-7 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού [12], κλπ Επιπλέον, μια πρόσφατη έκθεση έδειξε ένα θεραπευτικό δυναμικό της NOXA στη θεραπεία ανθρώπινου καρκίνου του μαστού [12]. Ωστόσο, ο ρόλος των NOXA στις θεραπευτικές αντιδράσεις των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα με βάση την πλατίνα αντικαρκινικά φάρμακα παραμένει ασαφής.

Σε αυτήν την εργασία, πρέπει πρώτα να επιλεγεί η σισπλατίνη-ευαίσθητα (τα A2780S, IGROV1 και OAW42) και ανθεκτικών ( A2780cp, ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών OVCAR-3 και SKOV3) για να δοκιμαστούν οι παραλλαγές έκφραση prosurvival και προαποπτωτικών οικογένεια πρωτεϊνών Bcl-2. Στη συνέχεια, εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης σισπλατίνη που προκαλείται από ρ53, ρ73, ρ21

WAF1 /Cip1, NOXA και Bax σε διάφορες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών με διαφορετικό καθεστώς ρ53 περιλαμβανομένων τα A2780S (άγριου τύπου ρ53, ρ53 WT), SKOV3 ( p53 διπλό μετάλλαγμα εξάλειψης, ρ53 – /-), OVCAR-3 (που φιλοξενεί μεταλλαγμένο R248Q p53) και A2780cp (που περιέχει αλληλουχία γονιδίου άγριου τύπου ρ53, αλλά που δείχνει την απώλεια της λειτουργίας ρ53) [13], [14]. Βρήκαμε ότι η ρ53, ρ73, ρ21

WAF1 /Cip1, NOXA και Βαχ σημαντικά επάγεται από σισπλατίνη σε ρ53-άγριου τύπου τα A2780S κυτταρική γραμμή, αλλά σε άλλες τρεις ρ53 μεταλλαγμένη κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών, οι εκφράσεις του p73, p21

WAF1 /Cip1, NOXA και Bax παρέμειναν αμετάβλητες. Επιπλέον, οι αποκρίσεις των NOXA και Bax να σισπλατίνη ρυθμίζεται κυρίως από την ρ53 εκτός από ρ73 σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών. Λαμβάνοντας υπόψη τη μεγάλη ρυθμιστική λειτουργία του γονιδίου ρ53 επί NOXA και Bax, δύο γονίδια ρ53 ή /και του στόχου καθοδικά ρ73, επιλέξαμε περαιτέρω το p53 διπλό μετάλλαγμα εξάλειψης SKOV3 κυτταρική γραμμή ως μοντέλο του εγγενούς αντοχής [15] – [17], και το ρ53 -wild τύπος τα A2780S κυτταρική γραμμή, η οποία προέρχεται από ένα μη επεξεργασμένο ασθενή με πρωτογενή καρκίνο των ωοθηκών [17], [18], ως μοντέλο του εγγενούς χημειοευαισθησία, για να αξιολογηθεί η επίδραση του NOXA στην χημειοθεραπευτική αποτελεσματικότητα της σισπλατίνης σε τα A2780S και SKOV3 ωοθηκών μοντέλα καρκίνου

in vitro

και

in vivo

. Βρήκαμε ότι NOXA προκαλεί απόπτωση ανεξάρτητα από ρ53 σε αμφότερα τα A2780S και κύτταρα SKOV3, και ότι η αυξημένη έκφραση του NOXA μπορεί να ενισχύσει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών σε σισπλατίνη μέσω των μεταβολών στον άξονα Βαχ /Smac. Για τις γνώσεις μας, παρέχουμε νέα στοιχεία για την πιθανή εφαρμογή του NOXA ως χημειοευαισθητοποιητή στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλες οι μελέτες στις οποίες συμμετείχαν ποντίκια ήταν εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Περίθαλψης και Μεταχείρισης κράτους Βασικά Εργαστήριο Βιοθεραπεία, Πανεπιστήμιο Sichuan.

Υλικά |

το πεπτίδιο Smac-Ν7 (AVPIAQKPRQIKIWFQNRRMKWKK) αγοράστηκαν από την Calbiochem, Inc. (San Diego , CA). Ήταν τροποποιηθεί ώστε να είναι κύτταρο διαπερατό από σύνδεση του ΟΟΟΗ-τερματική λυσίνη στην αργινίνη της Antennapedia ομοπεδίου πεπτίδιο 16-μερές μέσω ενός συνδετήρα προλίνη. Τα πρωτογενή αντισώματα για western αποτύπωση έχουν ως εξής: Αντι-Bcl-2 (SC-130307), αντι-Bcl-x

L (sc-8392), αντι-Mcl-1 (SC-69839), αντι-NOXA (SC-30209), αντι-p53 (DO-1), Anti-p73 (Η-79), αντι-p21

WAF1 /Cip1 και αντι-β-ακτίνης (Santa Cruz, CA)? αντι-Bax Ν-20 (SC-493)? αντι-κασπάση-3, αντι-διασπασμένη κασπάση 3, αντι-κασπάση-9 και διασπασμένο μορφή του (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ)? αντι-Smac (κλώνος FKE02, R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ)? αντι-Cyt C (SC-13156), το κυτόχρωμα οξειδάση υπομονάδα IV (Molecular Probes).

πλασμίδια

Τόσο pcDNA3.1 (pc3.1) και το πλασμίδιο pcDNA3.1 που κωδικοποιεί την ανθρώπινη NOXA γονίδιο (pcDNA3.1-hNOXA, pc3.1-hNoxa) καθαρίστηκαν με δύο γύρους πέρασμα πάνω από στήλες EndoFree (Qiagen, Chatsworth, CA), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [19]. pc3.1-Βαχ κατασκευάσματα παρήχθησαν σύμφωνα με τις προηγούμενες μεθόδους μας [20].

γονιδιακή σίγηση με μικρά παρεμβαλλόμενα RNA

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) ολιγονουκλεοτίδια αγοράστηκαν από Dharmacon (Lafayette, CO ) με αλληλουχίες στόχευσης Βαχ (5′-AACUGAUCAGA ACCAUCAUGG-3 ‘) και Smac (5′-AACCCUGUGUGCGGUUCCUAU-3’). Για την κατασκευή Bax και Smac shRNA, το Bax και Smac siRNA κλωνοποιήθηκαν στον pSilencer 2.1-U6 πλασμίδιο hygro.

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση

τα A2780S, IGROV1, OAW42, A2780cp, OVCAR-3 και SKOV3 ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών ωοθηκών αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA) και αναπτύχθηκαν σε DMEM ή RPMI 1640 καλλιέργειας που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), αντίστοιχα, στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε με Lipofectamine ™ 2000, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή

Θεραπείες των κυττάρων στο

in vitro πειράματα

τα A2780S και κύτταρα SKOV3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ως εξής: α. Έλεγχος, τα κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία και συλλέχθηκαν όταν καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες. pc3.1 (κενός φορέας), τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pc3.1, και στη συνέχεια συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά την διαμόλυνση. hNOXA, κύτταρα επιμολυσμένα με pc3.1-hNOXA συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά την διαμόλυνση. Η σισπλατίνη, η σισπλατίνη (5 μg /ml) προστέθηκε όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες. 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν. hNOXA συν σισπλατίνη, κύτταρα επιμολυσμένα με pc3.1-hNOXA προστέθηκαν σισπλατίνη (5 μg /ml) σε 24 ώρες μετά την διαμόλυνση. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν.

Για γονιδιακή σίγηση ή υπερέκφραση του Βαχ και Smac, οι αντίστοιχες siRNAs ή πλασμίδια συν-επιμολύνθηκαν με pc3.1 /πλασμίδια pc3.1-NOXA σε τα A2780S ή SKOV3 κύτταρα. Τα κύτταρα που κατεργάστηκαν παραπάνω προστέθηκαν σισπλατίνης για επιπλέον 12 ώρες σε 12 ώρες μετά την επιμόλυνση, και στη συνέχεια συλλέχθηκαν στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Ανίχνευση της έκφρασης hNOXA

in vitro

και

in vivo

Η

Για την ανίχνευση της έκφρασης hNOXA

in vitro

, τα A2780S κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή σύμφωνα με τα χρονοδιαγράμματα που περιγράφονται παραπάνω. Τα συλλεγέντα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της έκφρασης hNOXA με RT-PCR και στυπώματος western, αντίστοιχα. Οι ιστοί όγκου συλλέχθηκαν για ανίχνευση έκφρασης hNOXA

in vivo

με RT-PCR. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για ενίσχυση hNOXA και GAPDH ήταν ως ακολούθως: NOXA-F 5′-3 ‘και AAGAACGCTCAACCGAGC-NOXA-R 5′-GGTTCCTGAGCAGAAGAGT-3′? GAPDH-F 5’-AATCCCATCACCATCTTCC-3 ‘και GAPDH-R 5′-CAT CACGCCACAGTTTCC-3’.

Κυτταρική βιωσιμότητα και η απόπτωση δοκιμασίες

Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ [21] . Η απόπτωση εκτιμήθηκε ως εξής: ανίχνευση του DNA κατακερματισμού με το κύτταρο κιτ Death Detection ELISA (Roche Diagnostics), ανάλυση στυπώματος western της ενεργοποίησης κασπάσης, μέτρηση των αποπτωτικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής (χρώση ΡΙ για την υπο-G1) και Hoechst 33258 χρώσης. Κυτταρικό θάνατο Ανίχνευση ELISA ποσοτικά τις αποπτωτικά κύτταρα με ανίχνευση των θραυσμάτων DNA ιστόνης που σχετίζονται με (μονο- και ολιγο-νουκλεοσωμάτων) που δημιουργούνται από τα αποπτωτικά κύτταρα [20], [22].

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και Hoechst 33258 χρώση

ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε για την ταυτοποίηση κυττάρων υπο-G1 /αποπτωτικών κυττάρων και για τη μέτρηση του ποσοστού των κυττάρων υπο-G1 σε υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Hoechst χρώση 33258 διεξήχθη accordingto τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ποσοτικαί RT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen). Ημιποσοτική RT-PCR έγινε για να ενισχυθεί NOXA και GAPDH.

Υποκυτταρική κλασματοποίηση και τη δυτική

κηλίδα

Υποκυτταρική κλασμάτωση έγινε για να ληφθεί μιτοχονδριακή και κυτοσολικά κλάσματα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Σύνολο κυτταρολύματα και προϊόντα λύσης υποκλασμάτωση χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση στυπώματος western.

ζωικά μοντέλα όγκων και τη θεραπεία

τα A2780S και κύτταρα SKOV3 (2 × 10

6 κύτταρα) εμφυτεύθηκαν υποδορίως στα δεξιά πλευρά των 6 έως 8 εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών, αντίστοιχα. Για να διερευνήσουν την θεραπευτική αποτελεσματικότητα του NOXA συν σισπλατίνη, υποβάλλαμε σε αγωγή τους ποντικούς την ημέρα 10 μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου, όταν διάμετρος του όγκου έφθασε περίπου 5 χιλιοστά σε διάμετρο. Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε 5 ομάδες (5 ποντικοί ανά ομάδα) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με: (α) 0.100 μΙ PBS? (Β) 0,10 μg pc3.1 πλασμιδίου /30 μg σύμπλοκα λιποσώματος σε 100 μΙ PBS? (Γ) 0,10 μg pc3.1 -hNoxa πλασμιδίου /30 μg σύμπλοκα λιποσώματος σε 100 μΙ PBS? (Δ) 0,100 μΙ 0,1 mg σισπλατίνης (5 mg /kg σωματικού βάρους)? (Ε) 0,10 μg pc3.1-hNoxa πλασμιδίου /30 μg σύμπλοκα λιποσώματος σε 100 μΙ PBS και 100 μΙ 0,1 mg σισπλατίνης. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με σύμπλοκο DNA-λιποσώματος με ενδοφλέβια χορήγηση

μέσω

της φλέβας της ουράς δύο φορές την εβδομάδα, και σισπλατίνη με ενδοπεριτοναϊκή οδό μία φορά την εβδομάδα για 4 εβδομάδες. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν με τον ακόλουθο τύπο: όγκος του όγκου (mm

3) = 0,52 × μήκος (mm) χ πλάτος (mm) χ πλάτος (mm) [26]. Οι ιστοί όγκου συλλέχθηκαν για πειράματα TUNEL.

Τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλ-τρανσφεράση μεσολάβηση dUTP nick τέλος επισήμανση (TUNEL) ανάλυση

TUNEL διεξήχθη με μία επί τόπου κιτ ανίχνευσης κυτταρικού θανάτου (Roche). Κυτταρικής απόπτωσης ποσοστώθηκε με προσδιορισμό του ποσοστού των θετικά χρωσμένων κυττάρων για όλους τους πυρήνες σε 20 τυχαία επιλεγμένα πεδία /τμήμα στα 200 × μεγέθυνση. Διαφάνειες από τις μελέτες απόπτωσης προσδιορίστηκαν ποσοτικά με τυφλό τρόπο από δύο ανεξάρτητους κριτές δύο διαφορετικές χρονικές στιγμές.

Στατιστικές αναλύσεις

Η στατιστική ανάλυση έγινε με το λογισμικό SPSS (έκδοση 17.0 για Windows). Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέσο ± SD. ANOVA και Tukey-Kramer τεστ πολλαπλής σύγκρισης χρησιμοποιήθηκαν σε συγκρίσεις. Οι καμπύλες επιβίωσης κατασκευάσθηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο Kaplan-Meier. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία log-rank.

σ

αξία & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SEM εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Αποτελέσματα

Γενετικές παραλλαγές μεταξύ των cisplatin ευαίσθητα και ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

ανάλυση κηλίδωσης Western έδειξε ότι η σισπλατίνη-ευαίσθητα ( τα A2780S, IGROV1 και OAW42) κυτταρικές σειρές εκφράζουν σχετικά χαμηλά ενδογενή επίπεδα Bcl-2, Bcl-x

L και Mcl-1, ενώ η σισπλατίνη ανθεκτικά (A2780cp, OVCAR-3 και SKOV3) κυτταρικές γραμμές ήταν το αντίθετο. Σε αντίθεση με prosurvival οικογένειας Bcl-2 πρωτεϊνών, τα επίπεδα της προ-αποπτωτικών Bak και Βαχ με τα A2780S, κυτταρικές σειρές IGROV1 και OAW42 είναι υψηλότερες από εκείνες στο A2780cp, OVCAR-3 και κυτταρικές σειρές SKOV3 (Εικόνα 1Α).

(Α) Western στύπωμα διεξήχθη για τις μεταβολές έκφραση του prosurvival Bcl-2, Bcl-x

L και Mcl-1 και προαποπτωτικά πρωτεΐνες Bak και Βαχ μεταξύ των cisplatin ευαίσθητα (τα A2780S, IGROV1 και OAW42) και ανθεκτικών ( A2780cp, OVCAR-3 και SKOV3) ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) τα A2780S (ρ53 WT) και SKOV3 (ρ53 – /-) κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σισπλατίνη (5 μg /mL) για 24 ώρες και αναλύθηκαν για την έκφραση του p53, p73, p21

WAF1 /Cip1, NOXA και Bax από κηλίδωση Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) OVCAR3 (που φιλοξενεί το μεταλλαγμένο ρ53 R248Q) και A2780cp (που περιέχει αλληλουχία γονιδίου άγριου τύπου ρ53, αλλά που δείχνει την απώλεια της λειτουργίας ρ53) κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σισπλατίνη (5 μg /mL) για 24 ώρες και αναλύθηκαν για την έκφραση του p53, p73 , p21

WAF1 /Cip1, NOXA και Bax με κηλίδωση Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

εξετάστηκε περαιτέρω σισπλατίνη που προκαλείται από τα επίπεδα έκφρασης της ρ53, ρ73, ρ21

WAF1 /Cip1, NOXA και Bax σε διάφορες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών με διαφορετικό καθεστώς ρ53 περιλαμβανομένων τα A2780S (ρ53 WT), SKOV3 (ρ53 – /-), OVCAR-3 (που φιλοξενεί μεταλλαγμένο R248Q p53) και A2780cp (που περιέχει αλληλουχία γονιδίου άγριου τύπου ρ53, αλλά που δείχνει την απώλεια της λειτουργίας ρ53). Όλες οι υποδεικνύεται κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μg /ml σισπλατίνης για 24 ώρες. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1 Β και C, ρ53, ρ73, ρ21

WAF1 /Cip1, NOXA και Βαχ βρέθηκαν να επάγεται σημαντικά από σισπλατίνη σε ρ53-άγριου τύπου τα A2780S κυτταρική γραμμή, αλλά σε άλλες τρεις ρ53 μεταλλαγμένη σισπλατίνη ανθεκτικά κυτταρικές σειρές SKOV3 OVCAR-3, A2780cp και οι εκφράσεις του p73, p21

WAF1 /Cip1, NOXA και Bax παρέμειναν αμετάβλητες. Επιπλέον, το επίπεδο των ενδογενών Bax σε σισπλατίνη ανθεκτικά OVCAR-3, κυτταρικές σειρές A2780cp και SKOV3 είναι πολύ χαμηλή (Σχήμα 1 Β και C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι αποκρίσεις των NOXA και Bax να σισπλατίνη ρυθμίζεται κυρίως από την ρ53 εκτός από ρ73 σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών.

Μειωμένη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

in vitro από

hNOXA και σισπλατίνη

Η προ-αποπτωτική λειτουργία του NOXA και η έλλειψη επαγωγής NOXA σε εγγενώς σισπλατίνη ανθεκτικά SKOV3 (p53 – /-) κύτταρα των ωοθηκών μας ώθησε να διερευνήσει κατά πόσον η υπερέκφραση του NOXA καταστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Η υπερέκφραση του hNOXA σε επιμολυσμένα κύτταρα τα A2780S επιβεβαιώθηκε με RT-PCR (Σχήμα 2Α) και κηλίδωση Western ανάλυση (Σχήμα 2Β), αντίστοιχα. Θεωρώντας ότι οι λειτουργίες NOXA κατάντη του αποπτωτικό μονοπάτι ρ53-διαμεσολαβούμενη, και ότι η κυτταροτοξική δράση της σισπλατίνης διαμεσολαβείται από βλάβη του DNA, η οποία, με τη σειρά του, διαενεργοποιεί γονιδίων στόχων (egp53AIP, Puma, NOXA) για να προκαλέσει την απόπτωση, θα προβλέπει ότι τα αυξημένα έκφραση NOXA μπορεί να ευαισθητοποιήσει ωοθηκών καρκινικά κύτταρα με σισπλατίνη. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, έχουμε πρώτα επεξεργασία τα A2780S κυττάρων με σισπλατίνη σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις, με διάστημα 24- ή 48-hr, και διαπίστωσαν ότι η δόση του IC

50 σισπλατίνης κυμαινόταν από 5 μg /ml έως 10 μg /ml (Σχήμα 2C). Στη συνέχεια, κατεργασμένα κύτταρα με σισπλατίνη σε μία υποβέλτιστη δόση (5 μg /ml), με ενδιάμεσο διάστημα 24/48 ώρες, ανάλογα με τις διάφορες χρονοδιαγράμματα, όπως περιγράφεται στο meterials και Μέθοδοι. Μετά τη θεραπεία, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2D, σε σύγκριση με τον έλεγχο, είτε hNOXA ή σισπλατίνη μείωσε σημαντικά τα A2780S βιωσιμότητα των κυττάρων κατά 41% /47% (Ρ & lt? 0.001) και 43% /49% (Ρ & lt? 0.001), αντίστοιχα. hNOXA συν σισπλατίνη μειωθεί πολύ σημαντικά τα A2780S βιωσιμότητα των κυττάρων κατά 68% /76% (P & lt? 0.001). Σε κύτταρα SKOV3 ρ53 ανεπάρκεια, σε σύγκριση με τον έλεγχο pc3.1, hNOXA επίσης μείωσε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα (Ρ & lt? 0.001), ενώ η σισπλατίνη έδειξε μόνο μια ελαφρά, αλλά όχι στατιστικά σημαντική επίδραση στην κυτταρική ανάπτυξη SKOV3 (24 h, ρ = 0.874? 48 h, p = 0,921). Ωστόσο, ο συνδυασμός του hNOXA και σισπλατίνη ελαττωμένη πολύ σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα SKOV3 κατά 65% /68% (Ρ & lt? 0.001). (Εικόνα 2Ε)

(Α) RT-PCR ανάλυση της έκφρασης hNOXA

σε vitro

μετά την διαμόλυνση των κυττάρων τα A2780S. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Κηλίδωση Western ανάλυση της έκφρασης hNOXA

in vitro

μετά από επιμόλυνση τα A2780S κυττάρων. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) Η επεξεργασία της σισπλατίνης σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις και τις περιόδους ελαττωμένη τα A2780S βιωσιμότητα του κυττάρου, που δείχνουν ότι η δόση του IC

50 κυμάνθηκαν από 5 μg /ml έως 10 μg /ml. (Δ) Η επεξεργασία των hNOXA συν σισπλατίνη μειώνονται τα A2780S βιωσιμότητα των κυττάρων πιο σημαντικά από ό, τι η θεραπεία hNOXA μόνος ή μόνη τη σισπλατίνη έκανε. Σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (24 h, ** Ρ & lt? 0,001? 48 h,

## Ρ & lt? 0.001). (Ε) Η επεξεργασία της σισπλατίνης μόνο είχε μικρή επίδραση στην επιβίωση των κυττάρων SKOV3, και ο συνδυασμός του hNOXA συν σισπλατίνη μειωμένη βιωσιμότητα SKOV3 κυττάρων πιο σημαντικά από την επεξεργασία των hNOXA μόνος ή μόνη τη σισπλατίνη έκανε. Σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (24 h, ** Ρ & lt? 0,001? 48 h,

## Ρ & lt? 0.001). Ποσοστό επιβίωσης υπολογίστηκε. Τα αποτελέσματα δείχνονται ως μέσοι όροι ± SD από τρία φρεάτια και πειράματα εις τριπλούν. Σε κάθε πείραμα, το μέσο μόνο θεραπεία (μη επεξεργασμένα) δείχνει 100% βιωσιμότητα των κυττάρων.

Η

Διέγερση απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

in vitro από

hNOXA και σισπλατίνη

Η ποσοτική εκτίμηση του υπο-G1 κύτταρα με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, σε κύτταρα τα A2780S σισπλατίνη ευαίσθητα, τα αποπτωτικά κύτταρα αντιπροσώπευαν 34,6% στην ομάδα hNOXA αγωγή έναντι 15,6% στην ομάδα pcDNA3.1 αγωγή και 8,7% στην ομάδα ελέγχου. Τα αποπτωτικά κύτταρα αντιπροσώπευαν 63,6% στην ομάδα συνδυασμού έναντι 48,3% στην ομάδα σισπλατίνη φάρμακο. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η σισπλατίνη ή hNOXA μόνα σημαντικά την απόπτωση που επάγεται από τα A2780S κυττάρων και hNOXA συν σισπλατίνη επαυξημένης περαιτέρω την επαγωγή απόπτωσης. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε εγγενώς ανθεκτικά κύτταρα SKOV3, εκτός του ότι η σισπλατίνη από μόνη βρέθηκε να έχει μικρή ικανότητα να επάγει απόπτωση των κυττάρων SKOV3 (Σχήμα 3Β).

(Α) Αντιπροσωπευτική ιστογράμματα φθορισμού του DNA του ΡΙ-βαμμένων κυττάρων. Τα A2780S κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με hNOXA για 24 ώρες, στη συνέχεια με 5 μg /ml σισπλατίνης για επιπλέον 24 ώρες. A2780S κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με pcDNA3.1 ή hNOXA, σισπλατίνη μόνη της ή hNOXA συν σισπλατίνη και ομάδες Ctrl, pc3.1, hNOXA, Cis και hNOXA + Cis αντιστοιχούν σε αυτά τα πέντε θεραπείες (το ίδιο όπως φαίνεται στα επόμενα πάνελ), με 8,7 % (Ctrl), 15,6% (pc3.1), 34,6% (hNOXA), 48,3% (cis) και 63,6% (+ hNOXA Cis) κύτταρα υπο-G1 (αποπτωτικά κύτταρα), αντίστοιχα, όπως αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής. κύτταρα (Β) SKOV3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με hNOXA για 24 ώρες, στη συνέχεια με 5 μg /ml σισπλατίνης για επιπλέον 24 ώρες. κύτταρα SKOV3 ήταν χωρίς θεραπεία, αντιμετωπίζεται με άδειο φορέα ή hNOXA, σισπλατίνη μόνη της ή hNOXA συν σισπλατίνη, με 4,9% (Ctrl), 6,4% (pc3.1), 38,4% (hNOXA), 9,1% (ΚΑΚ) και 52,3% (hNOXA + Cis) κύτταρα υπο-G1 (αποπτωτικά κύτταρα), αντίστοιχα, όπως αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής. (Γ) Η κανονική και αποπτωτική πυρηνική μορφολογία των κυττάρων τα A2780S αναλύθηκε με Hoechst 33258 χρώσης. Τα A2780S κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις ίδιες συνθήκες όπως περιγράφεται ανωτέρω. (D) Η κανονική και αποπτωτική πυρηνική μορφολογία των κυττάρων SKOV3 αναλύθηκε με Hoechst 33258 χρώσης. κύτταρα SKOV3 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τις ίδιες συνθήκες όπως αναφέρθηκε παραπάνω.

Η

Η απόπτωση αξιολογήθηκε περαιτέρω από την Hoechst χρώση 33258. Παρόμοια με τα παραπάνω αποτελέσματα, τόσο τα A2780S και κύτταρα SKOV3, ο αριθμός των συμπυκνωμένους πυρήνες (ανέπαφο ή αποσπασματική), τα οποία είναι χαρακτηριστικά της απόπτωσης, στην ομάδα συνδυασμού παρατηρήθηκαν από εκείνο στο hNOXA- ή κύτταρα σισπλατίνη επεξεργασία. Δεν υπήρχε σημαντικά συμπυκνωμένους πυρήνες σε μέσο μόνο- και pc3.1-ομάδων. Ωστόσο, θα πρέπει να σημειωθεί ότι η σισπλατίνη-κατεργασμένα κύτταρα SKOV3 δεν έδειξαν παρόμοια αποπτωτικά σημάδια (Σχήμα 3C και D).

Τα ευαισθητοποίηση του NOXA προκαλούνται από την απελευθέρωση του Cyt C και SMAC στο κυτοσόλιο

NOXA επάγει απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης του Βαχ και /ή Bak για να προκαλέσει δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων και της κασπάσης-9 ενεργοποίησης [10], [11], [27]. Όπως αναμένεται, σε τα A2780S κύτταρα σισπλατίνη ευαίσθητα, είτε hNOXA ή cisplatin μόνο του είχε ως αποτέλεσμα σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση του Βαχ και ενεργοποίηση των κασπασών 3 και 9, και ο συνδυασμός τους ενισχυθεί περαιτέρω η προς τα πάνω ρύθμιση του Βαχ και ενεργοποίηση των κασπασών (Σχήμα 4Α ). Επιπλέον, η απόπτωση συνοδευόταν από την απελευθέρωση του Cyt C και Smac στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 4Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης σε εγγενώς ανθεκτικά κύτταρα SKOV3, εκτός από το ότι η σισπλατίνη από μόνη δεν φάνηκε να προκαλούν την προς τα πάνω ρύθμιση του Βαχ και ενεργοποίηση των κασπασών και την απελευθέρωση του Cyt C και Smac (Σχήμα 4Α και Β).

(Α) και τα κύτταρα τα A2780S SKOV3 υποβλήθηκαν σε υποδεικνυόμενες θεραπευτικές αγωγές, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Η ενεργοποίηση της κασπάσης αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Τα βέλη δείχνουν ενεργές μορφές κασπασών. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) τα A2780S και SKOV3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε υποδεικνυόμενες θεραπευτικές αγωγές, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Απελευθέρωση Cyt C και Smac στο κυτοσόλιο αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Cox-IV κηλίδες δείχνουν μιτοχονδριακό ελέγχους φόρτωσης ενώ β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για την κυτοσολικό κλάσμα.

Η

Αλλαγές στον άξονα Βαχ /Smac καθορίζει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών σε σισπλατίνη

Παρατηρήσαμε ότι τα πάνω ρύθμιση του Βαχ και απελευθέρωση Smac στο κυτταρόπλασμα σε NOXA κατεργασμένα τα A2780S και κύτταρα SKOV3 (Σχήμα 4), και ότι η σισπλατίνη οδήγησε επίσης σε Βαχ πάνω ρύθμιση και την απελευθέρωση Smac σε τα A2780S κύτταρα (Σχήμα 4 ), αλλά σε κύτταρα SKOV3, δεν προκάλεσε αυξητική ρύθμιση του Βαχ (Εικόνα 1 και 4) και την απελευθέρωση του Smac στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 4). Αυτές οι παρατηρήσεις μας ώθησε να υποθέσουμε ότι άξονα Bax /Smac μπορεί να είναι ένας από τους βασικούς παράγοντες που καθορίζουν την χημειοευαισθησίας στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών σισπλατίνη ανθεκτικά, και ότι NOXA που προκαλείται από μεταβολές στην Bax Smac Άξονα /μπορεί να ενισχύσει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών με σισπλατίνη. Για να ελεγχθεί η κερδοσκοπία, αποφασίσαμε να διερευνήσει κατά πόσο NOXA ή /και σισπλατίνη απόπτωση ήταν εξασθενημένος σε κύτταρα τα A2780S σισπλατίνη ευαίσθητα όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία με siRNA που στοχεύει Bax ή Smac, και αν NOXA ή /και σισπλατίνη απόπτωση που επάγεται ενισχύθηκε σε σισπλατίνη ανθεκτικά κύτταρα SKOV3 όταν προεπεξεργασία με Βαχ κατασκευάσει ή πεπτίδιο Smac Ν7, αντίστοιχα.

Όπως ήταν αναμενόμενο, Βαχ siRNA εξασθενημένα σημαντικά NOXA ή /και σισπλατίνη επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα τα A2780S (Σχήμα 5Α). Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν και σε κύτταρα τα A2780S μετά από επεξεργασία με siRNA που στοχεύει Smac (Σχήμα 5Β). Η εξειδίκευση του Βαχ και Smac siRNA δίπολα αξιολογήθηκε αναλύοντας Bax και η έκφραση πρωτεΐνης Smac σε τα A2780S κύτταρα επιμολυσμένα με το αντίστοιχο shRNA κατασκευή (Σχήμα 5C). Σε pc3.1-Bax-επιμολυσμένα κύτταρα SKOV3, η υπερέκφραση του Βαχ, η οποία επιβεβαιώθηκε με στύπωση western ανάλυση (Σχήμα 5D), αυξήθηκαν σημαντικά NOXA και /ή σισπλατίνη απόπτωση (Σχήμα 5Ε). Παρομοίως, η προσθήκη ενός επταπεπτιδίου ΝΗ2-τερματικό Smac (Smac-N7) επίσης σημαντικά ενισχυμένη NOXA ή /και σισπλατίνη που προκαλείται από απόπτωση (Σχήμα 5F).

(Α) siRNAs που στοχεύουν Βαχ εξασθενημένα σημαντικά NOXA ή /και σισπλατίνη επαγόμενη απόπτωση σε νόσο ευαίσθητη τα A2780S κύτταρα (* P & lt? 0,01? ** P & lt? 0.001). (Β) siRNAs που στοχεύουν Smac εξασθενημένα σημαντικά NOXA ή /και σισπλατίνη επαγόμενη απόπτωση σε νόσο ευαίσθητη τα A2780S κύτταρα (

# Ρ & lt? 0,05? * Ρ & lt? 0,01? ** Ρ & lt? 0.001). (C) προς τα κάτω ρύθμιση του Βαχ ή Smac με Βαχ siRNA ή Smac siRNA επιβεβαιώθηκαν με στύπωση Western. (Δ) Η υπερέκφραση του Βαχ επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western. κύτταρα (Ε) SKOV3 συν-επιμολύνθηκαν με πλασμίδια NOXA και pc3.1-Βαχ επί 12 ώρες, ακολουθούμενη από /mL θεραπεία cisplatin 5 μg για επιπλέον 12 ώρες. Η υπερέκφραση του Βαχ αυξήθηκε σημαντικά NOXA και /ή σισπλατίνη απόπτωση σε χημειοθεραπεία κύτταρα SKOV3 (* Ρ & lt? 0,01). κύτταρα (F) SKOV3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με NOXA ή /και σισπλατίνη όπως περιγράφηκε παραπάνω, στη συνέχεια με 20 μmol /L Smac-N7 πεπτιδίου για επιπλέον 3 ώρες. Smac-N7 πεπτιδίου αύξησε σημαντικά NOXA ή /και σισπλατίνη επαγόμενη απόπτωση σε χημειοθεραπεία κύτταρα SKOV3 (

# Ρ & lt? 0,05? * Ρ & lt? 0,01)

Η

Ενισχυμένη αντικαρκινική αποτελεσματικότητα του συνδυασμού hNOXA. και σισπλατίνη in vivo

με βάση το

in vitro

ανασταλτική της ανάπτυξης και προ-αποπτωτικά αποτελέσματα της hNOXA και σισπλατίνη, έχουμε περαιτέρω εξέτασε την αντινεοπλασματική δράση της hNOXA συν σισπλατίνη για τα A2780S και SKOV3 όγκους

in vivo

. Όπως φαίνεται στο σχήμα 6Α και Β, κατά την ημέρα 34 μετά την εμφύτευση, οι όγκοι τα A2780S και SKOV3 των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με PBS έφθασαν 1174,28 ± 70.43 και 823.82 ± 73,27 mm

3 σε όγκο, αντίστοιχα. Οι όγκοι τα A2780S και SKOV3 αντιμετωπίζονται με hNOXA ήταν σημαντικά (τα A2780S μοντέλο,

P

& lt? 0.001? SKOV3 μοντέλο,

P

& lt? 0.001) μικρότερους από εκείνους που αντιμετωπίστηκαν με PBS, φθάνοντας μόλις 686,06 ± 81,39 και 429,38 ± 22,9 χιλιοστά

3 σε όγκο, αντίστοιχα. Ο συνδυασμός των hNOXA και cisplatin περαιτέρω κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου, έτσι ώστε τα τα A2780S και όγκων SKOV3 έφθασε 342,84 ± 38,8 και 279,27 ± 47,16 mm

3 κατ ‘όγκο, αντίστοιχα, οι οποίες ήταν σημαντικά (τα A2780S μοντέλο,

P

& lt ? 0,001? μοντέλο SKOV3,

P

& lt? 0.001) μικρότερη από όγκους ελέγχου, και σημαντικά μικρότερο από τα καρκινώματα που υπέστησαν αγωγή με hNOXA (τα A2780S μοντέλο,

P

& lt? 0,001? SKOV3 μοντέλο, ρ & lt ? 0,05) ή σισπλατίνη (τα A2780S μοντέλο,

P

& lt? 0,05? SKOV3 μοντέλο,

P

& lt? 0.001). Η σισπλατίνη είχε επίσης ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση στον όγκο του όγκου (577,08 ± 77,04 mm

3), σε σύγκριση με όγκους ελέγχου (

P

& lt? 0.001) στο μοντέλο τα A2780S. Ωστόσο, σε μοντέλο SKOV3, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στο μέγεθος του όγκου (605,44 ± 80,51 mm

3) παρατηρήθηκε στην ομάδα σισπλατίνη σε σύγκριση με την ομάδα pc3.1 αγωγή (695,57 ± 79,28 mm

3) (

P

= 0,222).

καταστολή των όγκων και πλεονέκτημα επιβίωσης σε ποντίκια. Τα A2780S κύτταρα (A, C) ή κύτταρα SKOV3 (Β, D) 2 × 10

6 εμβολιάστηκαν υποδορίως σε θηλυκούς γυμνούς ποντικούς σε ηλικίας 6-8 εβδομάδων. Τα ποντίκια (πέντε ανά ομάδα) υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS, pcDNA3.1, pcDNA3.1-hNOXA, σισπλατίνη και pcDNA3.1-hNOXA + σισπλατίνη. Στο μοντέλο όγκου τα A2780S, σημαντικές διαφορές στην καταστολή του όγκου (** Ρ & lt? 0.001) και ο χρόνος επιβίωσης (

ΔΡ & lt? 0,05) σε ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με hNOXA ή σισπλατίνη έναντι PBS και pcDNA3.1 ελέγχους? σημαντική διαφορά για όγκους που έλαβαν θεραπεία με hNOXA + σισπλατίνη έναντι PBS και έλεγχοι ροϋΝΑ3.1 (** P & lt? 0.001?

ΔΔP & lt? 0.01), και σημαντική διαφορά για τη θεραπεία συνδυασμού σε σχέση με hNOXA ή μονοθεραπεία με σισπλατίνη (

# P & lt? 0,05?

† P & lt? 0,05). Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν και σε μοντέλο SKOV3, εκτός από το ότι δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές στην καταστολή του όγκου (

P

= 0,222) και την επιβίωση του χρόνου (

P

= 0,433) μεταξύ σισπλατίνη και pcDNA3.1- αγωγή όγκοι βρέθηκαν. χρώση (Ε-Ρ) TUNEL ιστών όγκου. Αντιπροσωπευτικές τομές λήφθηκαν από τα A2780S (Ε) και SKOV3 (F) ιστούς όγκων των ποντικών που έλαβαν PBS, pcDNA3.1, hNOXA, σισπλατίνη και hNOXA + σισπλατίνη. δείκτη (G) αποπτωτικά κατά τα A2780S και SKOV3 ιστούς όγκων μετρήθηκαν. Στο μοντέλο τα A2780S, στατιστικώς σημαντική διαφορά στο αποπτωτικό δείκτη για όγκους που έλαβαν θεραπεία με hNOXA ή σισπλατίνη, έναντι PBS και οι έλεγχοι pcDNA3.1 (** Ρ & lt? 0.001)? σημαντική διαφορά για όγκους που έλαβαν θεραπεία με hNOXA + σισπλατίνη έναντι των δύο ελέγχων (** P & lt? 0.001)? και σημαντική διαφορά για τη συνδυαστική θεραπεία έναντι hNOXA ή σισπλατίνη μονοθεραπεία (

## Ρ & lt? 0.001). Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν και σε μοντέλο SKOV3, εκτός του ότι δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές στη αποπτωτικό δείκτη μεταξύ cisplatin επεξεργασμένου όγκου και pcDNA3.1 αγωγή όγκου (Ρ = 0,981) ή PBS-αγωγή όγκου (Ρ = 0,705). Η αποπτωτική δείκτης υπολογίστηκε ως λόγος του αριθμού αποπτωτικών κυττάρων προς τον συνολικό αριθμό των κυττάρων σε κάθε πεδίο. (H) RT-PCR ανάλυση της έκφρασης του εξωγενούς hNOXA in vivo.

Η

Επιβίωση ανάλυση καμπύλης (Σχήμα 6C) έδειξαν ότι τα A2780S ποντικών που φέρουν όγκο σε PBS ή ομάδες pc3.1 αγωγή επιβίωσαν λιγότερο από 65 ημέρες κατά μέσο όρο. Αντιθέτως, είτε hNOXA ή σισπλατίνη είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική (

P

& lt? 0,05) αύξηση στο χρόνο ζωής σε σύγκριση με τις δύο ομάδες ελέγχου, με το μέσο χρόνο επιβίωσης είναι 74 και 80 ημέρες, αντίστοιχα. Ο συνδυασμός των hNOXA και cisplatin περαιτέρω βελτιωμένη επιβίωση σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι οι δύο ομάδες ελέγχου (

P

& lt? 0,01), με ο μέσος χρόνος επιβίωσης είναι 87 ημέρες.