Αφηρημένο

πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (GBM) είναι η πιο κοινή ενηλίκων κακόηθες γλοίωμα με κακή πρόγνωση λόγω της αντίστασης στην ακτινοθεραπεία και τη χημειοθεραπεία, η οποία μπορεί να εμπλέκονται κριτικά στην ανανέωση του πληθυσμού των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ) μετά τη θεραπεία. Είχαμε ερευνήσει τα χαρακτηριστικά των κυττάρων του καρκίνου του στελέχους που μοιάζει με την πλευρά του πληθυσμού (SP) κατατάσσονται από κύτταρα GBM, και μελέτησαν την επίδραση της Honokiol στοχεύουν σε ΚΕΠ. κύτταρα GBM8401 SP κατείχαν τους δείκτες βλαστικών κυττάρων, όπως νεστίνη, CD133 και Oct4, και τις εκφράσεις των γονιδίων που σχετίζονται με βλαστική ικανότητα αυτο-ανανέωσης, όπως

ΠΕΑ

,

Notch3

και

ΙΗΗ (Indian Hedgehog)

. Honokiol ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των δύο GBM8401 γονικά κύτταρα και κύτταρα SP με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, το IC

50 ήταν 5,3 ± 0,72 και 11 ± 1.1 μΜ, αντίστοιχα. Οι αναλογίες των SP σε κύτταρα GBM8401 είχαν μειωθεί κατά Honokiol από 1.5 ± 0.22% μέχρι 0.3 ± 0.02% και 0.2 ± 0.01% σε δόσεις των 2,5 μΜ και 5 μΜ, αντίστοιχα. Τα κύτταρα SP φαίνεται να έχουν υψηλότερη έκφραση του

O

6-μεθυλγουανίνη-DNA μεθυλοτρανσφεράση (MGMT) και είναι πιο ανθεκτικά στην τεμοζολομίδη (ΤΜΖ). Η αντίσταση στην ΤΜΖ μπορεί να αντιστραφεί μόνο ελαφρώς από αναστολέας MGMT

O

6-benzylguanine (

O

6-BG), αλλά σημαντικά ενισχυθεί περαιτέρω με την προσθήκη Honokiol. Τέτοια σημαντική ενίσχυση συνοδεύτηκε με την υψηλότερη επαγωγή της απόπτωσης, μεγαλύτερη ρύθμιση προς τα κάτω των

Notch3

καθώς και οι μεταγενέστεροι

Hes1

εκφράσεις της στα κύτταρα SP. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι Honokiol θα μπορούσε να έχει κλινικά οφέλη για τους ασθενείς GBM που είναι ανθεκτικοί στη θεραπεία με ΤΜΖ

Παράθεση:. Lai IC, Shih PH, Γιάο CJ, Yeh CT, Wang-Peng J, Lui TN, κ.ά. . (2015) Εξάλειψη των καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν και Ενίσχυση του Temozolomide ευαισθησίας από Honokiol στο γλοιοβλάστωμα ερυθήματος κύτταρα. PLoS ONE 10 (3): e0114830. doi: 10.1371 /journal.pone.0114830

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Waldemar Debinski, Πανεπιστημίου Wake Forest, Ιατρική Σχολή, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 1 Απρ του 2013? Αποδεκτές: 14 Νοεμβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 του Μαρτίου του 2015

Copyright: © 2015 Lai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από τις επιχορηγήσεις του Υπουργείου Υγείας και Πρόνοιας, Ταϊβάν (MOHW103-TD-B-111-01), Εθνική Έρευνα Υγείας Ινστιτούτα, την Ταϊβάν (03A1 CAPP33-014) και του Υπουργείου Επιστήμης και Τεχνολογίας, Ταϊβάν (NSC 100-2632-Β -038-001-my3). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

κακοήθη όγκο στον εγκέφαλο είναι μια από τις πιο θανατηφόρες καρκίνων στους ενήλικες. Με βάση την ταξινόμηση του ΠΟΥ, οι όγκοι βαθμού Ι είναι βιολογικά «καλοήθης», ενώ οι όγκοι βαθμού II είναι χαμηλής κακοήθειας με πλέον κλινικά μαθήματα [1]. Grade III και IV είναι κακοήθη γλοιώματα που είναι θανατηφόρα μέσα σε λίγα χρόνια και 9-12 μήνες, αντίστοιχα [2]. Γλοίωμα υψηλού βαθμού κακοήθειας (πολύμορφο γλοιοβλάστωμα, GBM), η πιο συχνή και κακοήθων όγκων του εγκεφάλου στους ενήλικες είναι συνήθως ανθεκτικά σε ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία. Η επιβίωση του GBM μετά από χειρουργική επέμβαση και ακτινοθεραπεία περιορίστηκε σε ένα χρόνο. Η χημειοθεραπεία, όπως η τεμοζολομίδη (ΤΜΖ), θα μπορούσε να παρατείνει περαιτέρω την επιβίωση μέχρι περίπου είκοσι μήνες [3], αλλά οι περισσότεροι ασθενείς πέθαναν μέσα σε δύο χρόνια. Έτσι, ψάχνουν για καινοτόμα θεραπευτικά μέσα και την ανάπτυξη νέων στρατηγικών για ασθενείς με ανθεκτική νόσο GBM είναι επιτακτική και επείγουσα.

Η ΤΜΖ είναι ένας αλκυλιωτικός χημειοθεραπευτικού παράγοντα που χρησιμοποιείται σήμερα για τη θεραπεία της GBM. Το θεραπευτικό όφελος της ΤΜΖ εξαρτάται από την ικανότητά της να αλκυλικού /μεθυλικό πυρηνικό οξύ, η οποία τις περισσότερες φορές λαμβάνει χώρα στο Ν-7 ή Ο-6 θέσεις των καταλοίπων γουανίνης [4]. Αυτή η μεθυλίωση βλάβες της αντιγραφής του DNA με κακό ταίριασμα των βάσεων

O

-6 αλκυλο-γουανίνη με θυμίνη και ενεργοποιεί τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων. Αποδεικνύεται ότι τα καρκινικά κύτταρα εάν ρητή υψηλότερη δραστηριότητα του

O

6-μεθυλγουανίνη-DNA μεθυλοτρανσφεράση (MGMT), ένα DNA επισκευή ένζυμο για να αφαιρέσετε το TMZ-DNA προϊόντος προσθήκης, μπορεί να μειώσουν τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα της TMZ και φαίνεται να είναι πιο ανθεκτική και ανθεκτική στη θεραπεία με ΤΜΖ. Σε συνδυασμό με αναστολέα MGMT, O

6-benzylguanine (

O

6

-BG), μπορεί να ενισχύσει την κυτταροτοξικότητα της ΤΜΖ [3]. Ωστόσο, η κλινική δοκιμή φάσης ΙΙ η

O

6-BG με ΤΜΖ δεν έδειξε το όφελος απάντηση για GBM, εκτός από τους ασθενείς με αναπλαστικό αστροκύτωμα (ΑΑ) [5]. Οι λόγοι για αυτήν τη διαφορά μπορεί να οφείλεται στις διαφορετικές κακοήθεις συμπεριφορές συμπεριλαμβανομένης της παρουσίας υψηλότερη αναλογία των καρκινικών βλαστοκυττάρων (CSC) σε GBM [6]. Αυτό κλινικά στοιχεία έδωσε αφορμή για το κίνητρό μας για να αναζητήσετε οποιαδήποτε θεραπευτική που είναι σε θέση να στοχεύουν στην CSC της ΤΜΖ ανθεκτικά GBM.

Η έρευνα για την CSC ή ογκογενή κυττάρων (TIC) έγινε ένα ενδιαφέρον πεδίο από το 2000. δεν έχει σημασία τι είδους των μεθόδων που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της CSC, αρκετές συμπαγών όγκων κυτταρικές σειρές που περιέχουν CSC είχε αναφερθεί σε μυελοβλάστωμα, νευροβλάστωμα, γλοίωμα, καρκίνο του μαστού, γαστρικού καρκίνου του παχέος εντέρου και του καρκίνου, κλπ [7] είχε επίσης αποδειχθεί ότι οι ασθενείς με υποτροπή και πυρίμαχα με το TMZ συσχετίζονται με το μεγαλύτερο ποσοστό της CSC παρέμεινε στην μάζα του όγκου [6]. Ως εκ τούτου, η αναζήτηση για τα νέα θεραπευτικά μέσα που στοχεύουν στην CSC γίνεται μια νέα στρατηγική για να επιτευχθεί μια καλύτερη κλινική έκβαση των ασθενών πυρίμαχων GBM.

ΚΕΠ διαθέτουν χαρακτηριστικά των δυνατοτήτων αυτο-ανανέωση, ογκογένεση και τη διαφοροποίηση της γενεαλογίας σε καρκινικά κύτταρα μη βλαστικών καθώς και την έκφραση των πρωτεϊνών με αντοχή πολυφαρμάκου. Εκτός από τη χρήση δεικτών CD να εντοπιστούν ΚΕΠ, μία κοινή μέθοδος για να απομονωθεί το ΚΕΠ είναι η τεχνική πλευρά πληθυσμός (SP), η οποία γινόταν όλο και πιο δημοφιλής από το 2004. Αυτή η διαλογή τεχνική για την απομόνωση SP κύτταρα με κυτταρομετρία ροής διπλού μήκους κύματος βασίζεται σχετικά με την ικανότητα των κυττάρων αυτών να εκρέει η φθορίζουσα χρωστική δέσμευσης DNA Hoechst 33342 [8]. Ο φαινότυπος των κυττάρων SP χαρακτηρίζεται από υψηλή έκφραση του καρκίνου του μαστού ανθεκτικών πρωτεΐνη-1 (BCRP1 ή ABCG2), ένα από ΑΤΡ-σύνδεσης κασέτας (ABC) μεταφορείς, η οποία συνδέεται με την αντίσταση σε πολλά φάρμακα σε πολλούς καρκίνους με άντληση τα φάρμακα [ ,,,0],9]. Από αντοχή πολυφαρμάκου είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό του ΚΕΠ, έχει επίσης δειχθεί ότι τα ταξινομημένα κύτταρα SP εμπλουτισμένο ΚΕΠ [10]. Έτσι, η διαλογή κυττάρων SP είναι τεκμηριωθεί ότι είναι μια πλούσια πηγή των ΚΕΠ και αποτελεί μια τεχνολογική πλατφόρμα για τη διαλογή θεραπευτικών που είναι σε θέση να στοχεύσουν σε ΚΕΠ.

έχουν Παραδοσιακά Κινέζικα φάρμακα έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για τον έλεγχο της νόσου εδώ και χιλιάδες χρόνια .

Magnolia Officinalis

, που ονομάζεται επίσης Houpo στα κινέζικα ή Saiboku-tu στα ιαπωνικά, είναι ένα αρχαίο γένος διανέμονται κυρίως στη Νότια και Ανατολική Ασία, καθώς Ανατολή και τη Βόρεια Αμερική. Πολλές δραστικές ενώσεις που προέρχονται από φλοιούς του είχαν εντοπιστεί, όπως magnolol, Honokiol, 4-

O

-methylhonokiol, Obovatol και άλλες ενώσεις νεολιγνάνης, η οποία διέθετε πολλές διαφορετικές βιολογικές λειτουργίες συμπεριλαμβανομένης της βελτίωσης των αλλεργικών και ασθματικών αντιδράσεων [11 ]. Honokiol, ένα από τα biphenolic βιοενεργών συστατικών, κατέχει πολυλειτουργικό δραστηριότητες, όπως αντιοξειδωτικό, αντιφλεγμονώδες, χημειοπροληπτική και νευροπροστατευτικές επιδράσεις [12, 13, 14, 15]. Όπως βιβλιογραφία αναφέρονται, Honokiol συγκεκριμένα αναστέλλεται PI3K /mTOR ενεργοποίηση στα γλοιώματα [16] σηματοδότησης. Επιπλέον, πρόσφατα ευρήματα μας πρότεινε ότι Honokiol μπορούσαν να ταξιδέψουν μέσω του αίματος-εγκεφάλου (ΒΒΒ), υποδεικνύοντας την πιθανότητα για κακόηθες γλοίωμα θεραπεία [17]. Ωστόσο, υπάρχουν ελάχιστες πληροφορίες σχετικά με αντικαρκινική δράση της εναντίον κυττάρων GBM, ειδικά η επίπτωση στα ΚΕΠ.

Σε αυτή την εργασία, μελετήσαμε τα αποτελέσματα της Honokiol για την εξάλειψη των ΚΕΠ και την αντιστροφή της αντίστασης ΤΜΖ στο κύτταρα GBM8401 SP, και σπούδασε τι υποκείμενοι μηχανισμοί είναι υπεύθυνοι.

Υλικό και Μέθοδοι

Cells και Υλικά |

Honokiol (5,3′-διαλλυλ-2,4′- διϋδροξυδιφαινυλίου), σουλφοροδαμίνη Β (SRB), Hoechst 33342, βεραπαμίλη, Reserpine,

O

6

βενζυλγουανίνη (

O

6

–

BG) και τεμοζολομίδη (ΤΜΖ) αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich (Σαγκάη, Κίνα). αντιδραστήριο εκχύλισης ΤπζοΙ RNA ελήφθη από MDBio Co. (Frederick, MD, USA). Ανθρώπινα πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (GBM8401, BCRC Νο 60163) και το ανθρώπινο γλοιοβλάστωμα /αναπλαστικό αστροκύτωμα (U-87 MG, BCRC Νο 60360) κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την Bioresource Συλλογή και Ερευνητικό Κέντρο (BCRC) της Ταϊβάν Βιομηχανίας Τροφίμων Έρευνας και του Ινστιτούτου Ανάπτυξης . Άλλα αντιδραστήρια υψηλής ποιότητας αγοράστηκαν από εμπορικές επιχειρήσεις.

Cell Culture

Ανθρώπινο πολύμορφο γλοιοβλάστωμα κύτταρα GBM8401 διατηρήθηκαν με ϋυΐββοοο Modified Eagle Medium (DMEM) και το ανθρώπινο γλοιοβλάστωμα /αναπλαστικό αστροκύτωμα U87 κύτταρα MG διατηρήθηκαν σε Minimum Essential Medium (ΜΕΜ) του Eagle. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε πλήρες μέσο που περιείχε 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 1 Χ μη-βασικά αμινοξέα και 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη /

Ε-γλουταμίνη (Gibco, Invitrogen Corporation, Grand Island, ΝΥ, USA ) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα.

SRB την Κυτταρική Βιωσιμότητα δοκιμασία

κυτταροτοξικότητα επίδραση του Honokiol προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη SRB δοκιμασία χρωματομετρικού συστηματική διαλογή αντικαρκινικού φαρμάκου [18]. Εν συντομία, κατάλληλες ποσότητες κυττάρων σπάρθηκαν πάνω σε 96-φρεατίων επίπεδου πυθμένα πλάκες σε 200 μΙ μέσου. Μετά από επώαση 24 h, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Honokiol (διαλυμένο σε DMSO, η τελική συγκέντρωση ρυθμίστηκε σε λιγότερο από 0,05%), ακολουθούμενη από επώαση για 3 ακόμη ημέρες στους 37 ° C, 5% CO

2. Το μέσο στη συνέχεια αναρροφήθηκε, και τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν πάνω στο πλαστικό σκελετό με την προσθήκη 100 μΐ 10% τριχλωροξικού οξέος (TCA) και επώαση για 2 ώρες στους 4 ° C. Οι πλάκες πλύθηκαν πέντε φορές με νερό για την απομάκρυνση TCA και ξηραίνεται στον αέρα για τουλάχιστον 1 ώρα. Αυτό ακολουθήθηκε από χρώση με 200 μΐ 0,065% SRB (σουλφοροδαμίνη Β) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, πλένοντας πέντε φορές με 1% οξικό οξύ για να απομακρυνθεί η μη δεσμευμένη χρωστική, και στη συνέχεια ξήρανση στον αέρα. Η δεσμευμένη χρωστική διαλύθηκε με 200 μΙ βάσης Tris 10 mM (ρΗ 10,5). Απορρόφηση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο στα 570 nm.

Απομόνωση του Side Πληθυσμού (SP) και μη-SP (NSP) Κύτταρα

Στοιχεία της πλευράς πληθυσμού έγινε με μικρή τροποποίηση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. GBM8401 ή U-87 κύτταρα MG (10

6 /ml) επωάστηκε σε μέσο που περιέχει Hoechst 33342 (5 μg /ml) με ή χωρίς θετικού ελέγχου (αναστολέας μεταφορέα ABC, Verapamil ή ρεζερπίνη) για 3 h στους 37 ° C . Μετά την επώαση, τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φθορίζον-Activated σύστημα κυτταρική διαλογή με ένα λογισμικό DIVA (FACSAria III, Becton Dickinson). Ζωντανά κύτταρα περιφραγμένη χρησιμοποιώντας ιωδιούχο προπίδιο και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό ενός 450 nm (Hoechst Μπλέ) και 675 nm (Hoechst Red) φίλτρο μετά από διέγερση με ένα λέιζερ NUV 350 nm. Τα κύτταρα SP ήταν σίγουρα εντοπίστηκαν κατά την επεξεργασία των ειδικών αναστολέων έναντι ΑΤΡ-σύνδεσης μεταφορείς κασέτας. Το μεγαλύτερο πληθυσμό κυττάρων, τα κύτταρα μη-SP (ΕΚΣ) το όνομα, ήταν σημαντικά χρωματίστηκαν με Hoechst 33342. Και τα δύο κύτταρα SP και μη-SP ταξινομήθηκαν και η συγκομιδή αντίστοιχα για περαιτέρω μελέτη. κύτταρα SP διατηρήθηκαν με μέσο HEscGro (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) παράγοντα που περιέχει επιδερμικής ανάπτυξης (EGF, 10 ng /ml) συν βασικού αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (bFGF, 8 ng /ml), αλλά χωρίς ορό, και μη-SP κύτταρα επωάστηκαν με DMEM πλήρες μέσο.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της διαφοροποίησης και της κυτταρικής επιφάνειας Markers

επιλεγμένα εναιωρήματα απλού κυττάρου χρησιμοποιώντας ένα FACScalibur 4-λέιζερ (BD Science) και βάφτηκαν με μια ποικιλία αντισωμάτων κατά των δεικτών CD που είναι εντόνως εκφρασμένα σε βλαστοκύτταρα του καρκίνου: αντι-ανθρώπινο CD24-FITC, αντι-ανθρώπου CD26-FITC, αντι-ανθρώπου CD29-FITC, αντι-ανθρώπου CD90-FITC, αντι-ανθρώπου CD133-ΡΕ, αντι -ανθρώπινη CD44-PE. Η γονική, SP και μη SP κύτταρα επωάστηκαν με ειδικά αντισώματα που αναφέρθηκαν παραπάνω για 1 ώρα, και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής μετά πλύσιμο. Σε περίπτωση της μελέτης της ικανότητας διαφοροποίησης των κυττάρων SP, η διαφοροποιημένη SP κύτταρα (d-SP) ελήφθησαν μετά από καλλιέργεια σε πλήρες μέσο για μία εβδομάδα. Η d-SP, SP και γονικά κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με φθορίζουσα χρωστική-συζευγμένα αντισώματα όπως αντι-ΟΡΑΡ-ΡΕ και αντι-MAP2B-Alexa Fluor488, αντίστοιχα, για 1 ώρα. Οι εντάσεις του κυτταρικού φθορισμού στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής μετά πλύσιμο. Όλα τα φθορίζοντα αντισώματα αγοράστηκαν από BD Biosciences, San Jose, CA, USA, εκτός από το αντι-ανθρώπινο CD24-FITC (eBioscience, San Diego, CA, USA).

ανάλυση PCR αντίστροφης μεταγραφής

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Honokiol ή τεμοζολομίδη για 48 ώρες, το ολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας MasterPure RNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή, και στη συνέχεια ποσοτικά με απορρόφηση στα 260 nm. καθαρότητα του RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αναλογία A260 /A280 (μέσος ≥ 1.8). Ολικό RNA από κάθε δείγμα πρώτα μεταγράφεται αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας ένα κιτ MMLV ανάστροφης μεταγραφάσης 1ο-Strand cDNA Synthesis (Epicentre Biotechnologies), και στη συνέχεια τα γονίδια στόχους ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας Taq DNA Polymerase Master Mix (Ampliqon, Lars Quist, Δανία). Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε 30 κύκλους ενίσχυσης (σύνθεση του cDNA στους 37 ° C για 1 ώρα ακολουθούμενο από προ-μετουσίωση στους 94-C για 2 λεπτά, και η ενίσχυση PCR πραγματοποιήθηκε με μετουσίωση στους 94 C για 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση σε 58- 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα, επέκταση στους 72 ° C για 1 λεπτό, και η τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά). Τα προϊόντα PCR αναμείχθηκαν με EZ-Vision DNA Dye (Amresco, Solon, ΟΗ, USA) και στη συνέχεια σε ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης 1,8%, τέλος ορατές με UV-Visible System διαφανοσκόπια. Τα δεδομένα στη συνέχεια ποσοτικά με λογισμικό Image J.

Western Blotting

Μετά την επεξεργασία, τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ReadyPrep Kit Protein Extraction (Bio-Rad) σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται. λύματα Σύνολο κυττάρου (20μg) διαχωρίστηκαν ηλεκτροφορητικά από ένα 10% πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου τη χρήση του συστήματος μεταφοράς Bio-Rad Mini-Protean. Η μεμβράνη περικοπεί και επωάστηκαν περαιτέρω όλη τη νύκτα στους 4 ° C με ειδικά αντισώματα έναντι CD133 (Αγίου Ιωάννη Laboratory Ltd, London, UK), MGMT (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA) και της τουμπουλίνης (Abcam, Cambridge, ΜΑ, USA ), αντίστοιχα. Μετά την επώαση με πρωτογενή αντισώματα, τα περικομμένη μεμβράνες πλύθηκαν με TBST 3 φορές και στη συνέχεια επωάστηκαν με υπεροξειδάση αρμορακίας-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα για 90 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση με TBST 3 φορές, η τελική ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) κηλίδωση Western αντιδραστήρια (Minipore) και του συστήματος απεικόνισης BioSpectrum (UVP, Upland, CA, USA).

Κύκλου Κυττάρου Αξιολόγησης

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Honokiol ή τεμοζολομίδη για 48 ώρες. Στο τέλος της επώασης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με 70% αιθανόλη όλη τη νύκτα και στη συνέχεια επωάστηκαν με 25 μg /ml ΡΙ, 0.5% Triton Χ-100, και 0,2 μg /ml RNase Α διάλυμα για 30 λεπτά μετά το πλύσιμο με ψυχρό PBS . Τέλος, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 500 μΙ PBS και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Cytomics FC500, Beckman Coulter). Τα δεδομένα συλλέχθηκαν από 10.000 κύτταρα και αξιολογούνται από λογισμικά CXP.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν τουλάχιστον τρεις φορές και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. Στατιστικά σημαντικές διαφορές βασίστηκαν σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα ομάδες, και υπολογίστηκαν από το ένα ή αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) και

t-test

στατιστικό λογισμικό Student. Οι τιμές των p & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

Απομόνωση Side Πληθυσμού (SP) Κύτταρα από GBM8401 και U-87 MG τηλέφωνα Γραμμές

Το ποσοστό των Verapamil-. ευαίσθητος SP κύτταρα GBM8401 ή U-87 MG αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής με βάση τον αποκλεισμό της συνδέσεως χρωστική Hoechst 33342 DNA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, υπάρχουν 1,3 ± 0,2% και 1,7 ± 0,3% του SP κύτταρα ανιχνεύθηκαν σε U-87 MG και GBM8401 κύτταρα, αντίστοιχα. Αυτά τα κύτταρα SP στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε ένα σύστημα ανάρτησης με μέσο βλαστοκυττάρων καλλιέργειας. Οι σφαίρες εμφανίστηκαν στο αιώρημα ήταν σαφώς παρατηρήθηκαν κατά την ημέρα 7-10, η οποία θα μπορούσε να συγκομισθεί για μετέπειτα μοριακές αναλύσεις.

(Α) Το ποσοστό SP αναλύθηκε σε GBM8401 και U-87 MG κύτταρα με χρώση Hoechst και κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα επωάστηκαν με την απουσία ή παρουσία του ειδικού αναστολέα Verapamil (100 μΜ) για 3 ώρες. δοκιμασία SP διεξήχθη ακολουθούμενο από χρώση των κυττάρων με Hoechst33342 (5 μg /ml) για 90 λεπτά. Η μορφολογία του GBM8401 (Β) και U-87 MG (C) γονικών και SP κύτταρα παρακολουθήθηκαν και φωτογραφήθηκαν μετά την εκτέλεση του SP κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα SP επωάστηκαν σε εμπλουτισμένο μέσο χωρίς ορό για 1 εβδομάδα και παρατηρήθηκε η σφαιροειδές μορφολογία. Τα κύτταρα SP διαφοροποιήθηκαν σε κύτταρα μη-SP (NSP) για μακροχρόνια καλλιέργεια σε πλήρες θρεπτικό μέσο που περιέχει ορό.

Η

Διαφοροποίηση Δυνατότητα SP κύτταρα

Σε περίπτωση μελέτη της διαφοροποίησης ικανότητα των κυττάρων SP, τα κύτταρα διαφοροποιημένα SP (d-SP) ελήφθησαν μετά από καλλιέργεια σε πλήρες μέσο για μία εβδομάδα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2 (Α), κύτταρα GBM8401 SP κατείχε πολύ χαμηλότερη έκφραση των νευρωνικών MAP2B δείκτη (2 ± 0,4%), υποδεικνύοντας αδιαφοροποίητη κατάσταση τους. Όταν τα κύτταρα GBM8401 SP διαφοροποιήθηκαν σε κύτταρα d-SP, η έκφραση των νευρωνικών MAP2B δείκτη έγινε τόσο υψηλή όσο εκείνη των γονικών κυττάρων (50 ± 1,9% σε γονικά και 55 ± 2,7% σε κύτταρα d-SP). Ομοίως, η έκφραση των αστροκυττάρων GFAP-ειδικών δείκτη (γλοιακή ινιδική όξινη πρωτεΐνη) σε U-87 MG κύτταρα SP (1,7 ± 0,2%) ήταν πολύ χαμηλότερη από ότι στα γονικά κύτταρα (30 ± 1,8%). Όταν αυτές οι U-87 κύτταρα SP MG διαφοροποιήθηκαν σε κύτταρα d-SP, η έκφραση GFAP ήταν σημαντικά αυξημένη σε 8 ± 1,1% (Εικ. 2 (Β)).

Γονική, SP και διαφοροποιημένη SP ( d-SP) κύτταρα συλλέχθηκαν για την ανάλυση της έκφρασης ειδικών πρωτεΐνη δείκτη όπως μικροσωληνίσκους πρωτεΐνη που συνδέεται 2Β (MAP2B) σε GBM8401 (Α) και γλοιακή ινιδική όξινη πρωτεΐνη (GFAP) σε κύτταρα U-87 MG (Β). Σήματα προσαρμόστηκαν αφαιρώντας το υπόβαθρο των αντίστοιχων έλεγχο ισοτόπου.

Η

Χαρακτηρισμός GBM8401 SP κύτταρα με τον καρκίνο Stem Cell Surface Μαρκαδόροι

CD24, CD26, CD29, CD44, CD90 και CD133 έχουν έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για τον εντοπισμό ΚΕΠ στερεών όγκων [20]. Η έκφραση αυτών των δεικτών CD στα φρέσκα SP και μη SP κύτταρα ταξινομούνται από κύτταρα GBM8401 δείχθηκε στο Σχ. 3. Οι εκφράσεις του CD24, CD26, CD44 και CD133 στα κύτταρα SP ήταν σημαντικά (ρ & lt? 0,05) από εκείνες στα κύτταρα μη-SP, ο βαθμός πτυχώσεων ήταν 1.8 ± 0.2, 2.5 ± 0.3, 1.7 ± 0.1 και 1.8 ± 0.2, αντίστοιχα. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση των δύο άλλων δεικτών, CD29 και CD90 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

GBM8401 SP και μη SP κύτταρα ταξινομήθηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν με ειδικά αντισώματα δείκτη αντι-CD ή με έλεγχος ισοτύπου για 1 ώρα, αντίστοιχα. Μετά από πλύση με PBS και φυγοκέντρηση, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν με PBS και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα ιστογράμματα των ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του CD133 (Α), CD24 (Β), CD26 (C) και CD44 (D) έχουν δείξει. Οι εκφράσεις από τις παραπάνω βλαστική ικανότητα σημειωτές σε κύτταρα SP ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες σε κύτταρα μη-SP. Ωστόσο, οι εκφράσεις των άλλων δεικτών, όπως CD29, CD90, και SSEA-4, δεν ήταν προφανώς διαφορετικό (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

Η Εκδήλωση βλαστική ικανότητα Gene είναι διαφορετική σε SP και μη SP (NSP) κύτταρα

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η διαφορική έκφραση των γονιδίων βλαστική ικανότητα στο SP και μη-SP κύτταρα, εξετάσαμε την έκφραση του mRNA της

Oct-4

,

CD133

,

νεστίνη

,

β-τουμπουλίνης-III

,

Notch3

,

ΙΗΗ

και

ΠΕΑ

στο GBM8401 γονική, SP και τα κύτταρα μη-SP. Εκτός από το

β-τουμπουλίνης-ΙΙΙ

, οι εκφράσεις των mRNAs που αναφέρονται παραπάνω ήταν όλα σημαντικά (ρ & lt? 0,05). Υψηλότερα στα κύτταρα SP σε σύγκριση με το πατρικό και τα κύτταρα μη-SP (Σχήμα 4 (Α ) και 4 (Β)). Επιπλέον, το επίπεδο του mRNA του ανθεκτικού πρωτεΐνης σε πολλά φάρμακα, όπως

MDR1

και

ABCG2

, και το

MGMT

έκφραση στα κύτταρα SP ήταν επίσης υψηλότερες από εκείνες στο γονικής και μη-SP κύτταρα (Εικ. 4 (Α) και 4 (Β)). Σε συμφωνία με τα δεδομένα του mRNA, τα επίπεδα πρωτεΐνης του δείκτη GBM CSC CD133 και ΤΜΖ αντοχή σχετιζόμενη πρωτεΐνη MGMT ήταν προφανώς πολύ υψηλότερα στα κύτταρα SP σε σύγκριση με τα πατρικά και μη SP κύτταρα (Σχ. 4 (C)).

ανάλυση (Α) RT-PCR για τις εκφράσεις του βλαστική ικανότητα δεικτών (

CD113

,

Oct-4

), νευρωνική δείκτες διαφοροποίησης (

νηστίνη

,

β-τουμπουλίνης III

), το ένζυμο επιδιόρθωσης DNA (

MGMT

), οδός σηματοδότησης βλαστική ικανότητα (

Notch3

,

ΙΗΗ

,

ΠΕΑ

) και γονίδια ανθεκτικότητας στα φάρμακα (

ABCG2

,

MDR1

,

MGMT

). Εκτός από τη νευρωνική διαφοροποίηση δείκτη

β-τουμπουλίνης III

, όλα τα γονίδια βλαστική ικανότητα εκφράσεων σε κύτταρα SP ήταν σημαντικά υψηλότερα από εκείνα στα κύτταρα των γονέων και μη-SP (NSP). Η

β-ακτίνη

και

GAPDH

χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Ποσοτική και στατιστική ανάλυση δεδομένων του (Α) και δύο ανεξάρτητα παρόμοια πειράματα. *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με μητρικά κύτταρα. (C) ανάλυση Western blot για τα επίπεδα της πρωτεΐνης του δείκτη GBM CSC CD133 και ΤΜΖ αντίσταση πρωτεΐνη που συνδέεται με MGMT. Και τα δύο επίπεδα πρωτεΐνης CD133 και MGMT ήταν προφανώς πολύ υψηλότερα στα κύτταρα SP σε σύγκριση με τα πατρικά και μη SP κύτταρα. Η τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Honokiol Εξαλείφει SP και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των GBM8401 κύτταρα

Οι γονικών και SP κύτταρα GBM8401 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διαφορετικές δόσεις Honokiol. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία SRB και η αναλογία των κυττάρων SP αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι Honokiol ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των GBM8401 γονικών και SP κυττάρων σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 5Α). Τα κύτταρα GBM8401 SP ήταν πιο ανθεκτικά στην Honokiol σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα, το IC

50 ήταν 11,2 ± 1,1 και 5,3 ± 0,7 μΜ, αντίστοιχα. Η ευαισθησία των κυττάρων μη-SP (NSP) να Honokiol ήταν παρόμοια με εκείνη του γονικών κυττάρων (S1 Εικ.). Από την άλλη πλευρά, η αναλογία του πληθυσμού SP σε γονικά κύτταρα ελαττώθηκε με Honokiol από 1.5 ± 0.23% μέχρι 0.3 ± 0.02% και 0.2 ± 0.02% σε δόσεις των 2,5 μΜ και 5 μΜ, αντίστοιχα, όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β.

(Α) GBM8401 γονικής ή SP κύτταρα επωάστηκαν με συγκεντρώσεις σειρά Honokiol για 48 ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων εξετάσθηκε με τη δοκιμασία SRB. (Β) κύτταρα GBM8401 επωάστηκαν με την απουσία ή παρουσία του ειδικού αναστολέα Verapamil (50 μΜ) και Honokiol (2.5 και 5 μΜ) για 48 h, αντίστοιχα. Μετά πλύση με PBS και φυγοκέντρηση, δοκιμασία SP διεξήχθη ακολουθούμενο από χρώση των κυττάρων με Hoechst33342 (5 μg /ml) για 90 λεπτά.

Η

Honokiol ενισχύει περαιτέρω την κυτταροτοξικότητα και απόπτωση που επάγεται από το συνδυασμό τεμοζολομίδη και MGMT αναστολέα

O

6

-BG στο GBM8401 SP κύτταρα

Όπως Εικ. 6Α δείχνει τα κύτταρα GBM8401 SP ήταν πολύ υψηλότερες ανθεκτικά στην ΤΜΖ σε σύγκριση με τα μητρικά κύτταρα, το IC

50 ήταν 490 ± 5,3 μΜ και 15 ± 0,4 μΜ, αντίστοιχα. Παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε επίσης στα U-87 MG γονικών και SP κύτταρα. Καθώς τα κύτταρα GBM8401 ήταν σχετικά ανθεκτικά στην ΤΜΖ από U-87 κύτταρα MG, μπορούμε στη συνέχεια επιλέξαμε τα κύτταρα GBM8401 να διερευνήσει τις επιπτώσεις της Honokiol σε αυτή την αντίσταση των κυττάρων SP με το TMZ. Στη δόση των 50 μΜ, η ΤΜΖ μειώθηκε μόνο ελαφρώς περίπου το 20% του SP κυτταρικής βιωσιμότητας. Συν-θεραπεία είτε με

O

6

–

BG (10 μΜ) ή Honokiol (5 μΜ), την κυτταρική βιωσιμότητα των 50 μΜ ΤΜΖ επεξεργασμένο ομάδα μειώθηκε ελαφρά από περίπου 80% έως 60% και 40%, αντίστοιχα (Σχ. 6Β). Το αποτέλεσμα συν-θεραπεία 50 μΜ ΤΜΖ συν 10 μΜ

O

6

-BG δεν θα μπορούσε να ενισχυθεί περαιτέρω με την αύξηση της δόσης του

O

6

-BG έως 20 μΜ (Εικ. 6Β). Ωστόσο, θα μπορούσε να ενισχυθεί σημαντικά με Honokiol με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν περαιτέρω μειώθηκε στο 23% (ρ & lt? 0,05) σημαντικά και 10% (ρ & lt? 0,01) από Honokiol σε δόσεις 2,5 μΜ και 5 μΜ, αντίστοιχα, σε σύγκριση με 50 μΜ ΤΜΖ συν 10 μΜ

O

ομάδα 6

-BG επεξεργασμένο (Εικ. 6C). Σύμφωνα με αυτό, μόνο ελάχιστα αποπτωτικά αποτελέσματα που προκαλούνται από μοναδικός παράγοντας μόνος παρατηρήθηκαν και καμία σημαντική αύξηση των ποσοστών υπο-G1 παρατηρήθηκαν αν συνδυαστεί ΤΜΖ είτε με

O

6

–

BG ή Honokiol. Ωστόσο, εντυπωσιακή αύξηση της απόπτωσης (περίπου 30% των κυττάρων υπο-G1, σ & lt? 0,05) βρέθηκαν, ενώ τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΤΜΖ (10 μΜ),

O

6

–

BG (10 μΜ) και Honokiol (5 μΜ) μαζί (Εικ. 7). Οι υπο-G1 αναλογίες των κυττάρων GBM8401 SP αντιμετωπίζονται με Honokiol και ΤΜΖ, με ή χωρίς

O

6

–

BG φαίνονται στον Πίνακα 1.

(Α) U-87 MG και GBM8401 γονικά κύτταρα και κύτταρα SP υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις της ΤΜΖ. Τόσο GBM8401 και U87 MG SP κύτταρα πιο ανθεκτικά στην ΤΜΖ σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα τους. (Β) Τα αποτελέσματα του

O

6

-BG (μΜ) ή Honokiol (μΜ) για ΤΜΖ (μΜ) -suppressed βιωσιμότητα των κυττάρων GBM8401 SP. *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με κενό? #, Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα 50 μΜ ΤΜΖ επεξεργασία. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ κάθε δύο δίεση ομάδες. (Γ) το συνδυασμό των Honokiol και ΤΜΖ συν

O

6

-BG στην κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων GBM8401. *, P & lt? 0,05? **, P & lt? 0,01 σε σύγκριση με άλλη ομάδα που αναφέρονται στο γράφημα μπαρ. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία SRB με δείγματα εις τριπλούν. Η Honokiol? Τ, ΤΜΖ? Β,

O

6

-BG.

Η

κύτταρα GBM8401 SP υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 0,05% DMSO (Α), 5 μΜ Honokiol (Β) , 10 μΜ ΤΜΖ (C), 5 μΜ Honokiol σε συνδυασμό με 10 μΜ ΤΜΖ (D), 10 μΜ TMZ συν 10 μΜ

O

6

-BG (Ε), και 5 μΜ Honokiol σε συνδυασμό με 10 μΜ ΤΜΖ συν 10 μΜ

O

6

-BG (F) για 72 ώρες, αντίστοιχα. Μετά τη συγκομιδή, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με ΡΙ για 30 λεπτά και το κυτταρικό κύκλο εξετάστηκε με κυτταρομετρία ροής. Honokiol ενισχυμένη

O

6

-BG σε συνδυασμό με ΤΜΖ-μεσολάβηση κυτταροτοξικότητας με την προώθηση της αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Η Honokiol? Τ, ΤΜΖ? Β,

O

6

-BG.

Η

Honokiol σε Συνδυασμό με

O

6

–

BG Περαιτέρω Αναστέλλει Temozolomide που προκαλείται Notch3 /Hes1 Cascade στην GBM8401 SP κύτταρα

Όπως φαίνεται στο Σχ. 8 (Α) και 8 (Β), τα επίπεδα mRNA του

MGMT

καθώς και

Notch3

και του προς τα κατάντη

Hes1

ήταν σημαντικά (ρ & lt? 0,05) αυξήθηκε κατά ΤΜΖ (100 μΜ) θεραπεία σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Honokiol (5 μΜ) κατήργησε αποτελεσματικά τις ΤΜΖ που προκαλείται από τις εκφράσεις του

Hes1

και

MGMT

. Με την παρουσία του

O

6

–

BG (20 μΜ), το επίπεδο της πρωτεΐνης των MGMT ήταν σημαντικά μειωμένη (Εικ. 8 (C)) . Όταν συνδυάζεται με

O

6

–

BG (20 μΜ), Honokiol περαιτέρω (p & lt? 0.05) μειώνεται η ΤΜΖ επαγόμενη έκφραση του

Notch3

και

Hes1

mRNA, που δείχνει τον πιθανό ρόλο των Honokiol σε συνδυασμό με

O

6

–

BG για την αναστροφή η αντίσταση ΤΜΖ σε κύτταρα GBM SP.

(Α) ανάλυση RT-PCR για την έκφραση

Notch3

,

Hes1

και

MGMT

mRNAs σε κύτταρα SP. κύτταρα GBM8401 SP υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2,5 και 5 μΜ Honokiol (λωρίδα 2 και 3, αντίστοιχα), 100 μΜ ΤΜΖ (λωρίδα 4), 100 μΜ TMZ συν 5 μΜ Honokiol (λωρίδα 5), 100 μΜ TMZ συν 20 μΜ

O

6

-BG (λωρίδα 6), και 2,5 και 5 μΜ Honokiol σε συνδυασμό με 100 μΜ ΤΜΖ συν 20 μΜ

O

6

-BG (λωρίδα 7 και 8, αντίστοιχα) για 48 ώρες. Οι

18S

χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Honokiol σε Συνδυασμό με

O

6

–

BG Περαιτέρω κατέστειλε Temozolomide που προκαλείται ανύψωση του

Notch3

και

Hes1

mRNAs. (Β) Ποσοτική και στατιστική ανάλυση δεδομένων του (Α) και δύο ανεξάρτητα παρόμοια πειράματα. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western για το επίπεδο της πρωτεΐνης των MGMT σε κύτταρα GBM8401 SP υφίσταται επεξεργασία με παράγοντες όπως περιγράφεται στο (Α). Η τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. CTL, DMSO μακέτα ελέγχου? Η Honokiol? Τ, ΤΜΖ? Β,

O

6

-BG. *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με το DMSO ομάδα παρωδία ελέγχου. #, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με 100 μΜ ομάδα ΤΜΖ επεξεργασμένο

Η

Συζήτηση

Η «πλευρά πληθυσμός» (SP) τεχνική είναι μια καθιερωμένη μέθοδο για να απομονώσουν τη STEM καρκίνο. όπως τα κύτταρα. Πρόσφατα, Fukaya και οι συνεργάτες του είχαν δημοσιεύσει ένα άρθρο χρησιμοποιώντας την τεχνική SP για την απομόνωση καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν από διάφορες κυτταρικές γραμμές γλοιοβλαστώματος ανθρώπινο [21]. Η μελέτη τους έδειξε ότι τα κύτταρα SP είχαν υψηλότερη ικανότητα αποβολής του φαρμάκου, περισσότερο έκφραση γονιδίων βλαστική ικανότητα και μεγαλύτερη tumorigenesity σε σύγκριση με κύτταρα μη-SP. Ομοίως σε αυτή τη μελέτη, το SP απομονώνεται από GBM8401 κύτταρα εμφανίστηκαν να έχουν ιδιότητες CSC. Εκτός από την

νεστίνη

,

Notch-1

και

ABCG2

, είχαμε επίσης έδειξε άλλα βλαστική ικανότητα γονίδια, όπως

CD133

,

Oct4

,

MGMT

και

MDR1

, ήταν πιο εκφράζονται σε κύτταρα SP σε σύγκριση με κύτταρα μη-SP. Περαιτέρω, τα κύτταρα SP θα μπορούσε να διαφοροποιηθούν σε διαφορετικούς φαινότυπο των κυττάρων με δεικτών διαφοροποίησης όπως GFAP και MAP2B. Τα προφανώς πολύ υψηλότερα επίπεδα CD133 και πρωτεΐνες MGMT των κυττάρων SP χαρακτηρίζεται περαιτέρω στελέχους-όπως ιδιότητες των κυττάρων τους, και ως εκ τούτου η GBM8401 SP αντιπροσώπευε μια εμπλουτισμένη πληθυσμού CSC.

Γλοίωμα ΚΕΠ θα μπορούσε να απομονωθεί και να ταυτοποιηθεί με δείκτες κυτταρικής επιφάνειας, όπως νεστίνη και CD133, οι οποίες επίσης εντόνως εκφρασμένα σε SP κύτταρά μας. CD133 είναι τα πιο κοινά δεικτών κυτταρικής επιφάνειας για την ταυτοποίηση αρχέγονων κυττάρων όγκου στον εγκέφαλο και απομόνωση? Ωστόσο, τα ποσοστά των θετικών κυττάρων CD133 απομονωθεί από ιστούς ανθρώπινου εγκεφάλου όγκος δεν ήταν συνεπείς, κυμαίνονταν από 3% έως 45% [22]. Ως εκ τούτου, δεν είναι καταπειστός να χαρακτηρίσει καρκινικά βλαστικά κύτταρα, χρησιμοποιώντας μόνο ένα συγκεκριμένο δείκτη επιφάνειας κυττάρου [23]. Με βάση τα ευρήματά μας, άλλοι δείκτες όπως CD24, CD26 και CD44 ήταν επίσης εκφράστηκαν σε κύτταρα GBM8401 SP σύγκριση με τα κύτταρα μη-SP, κυμαίνονταν από 1,7 έως 2,5 πτυχώσεις. Οι ιδιότητες CSC κυττάρων SP επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με την απόδειξη της τριτοβάθμιας εκφράσεις πολλαπλών βλαστική ικανότητα δείκτες που περιγράφονται ανωτέρω.

Έχει αποδειχθεί ότι CD133-υψηλής έκφρασης κύτταρα που βρίσκονται στο κεντρικό τμήμα του όγκου έδειξε πιο ανθεκτικά στην ΤΜΖ στο αντίθεση με εκείνους που βρίσκονται στο περιφερειακό στρώμα [6]. Κατά συνέπεια, το ανθεκτικό ΤΜΖ GBM είχε αποδειχθεί ότι περιέχουν υψηλότερο ποσοστό CD133

+ κύτταρα και τα κύτταρα ανθεκτικά SP ΤΜΖ σε αυτή τη μελέτη διέθετε επίσης και υψηλότερο επίπεδο CD133.