Abstract

Τα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιούν κυρίως γλυκόλυση για την παραγωγή ΑΤΡ, ακόμη και με την παρουσία άφθονων οξυγόνου, ένα περιβάλλον που κανονικά θα οδηγούσε σε παραγωγή ενέργειας μέσω οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. Αν και ο μοριακός μηχανισμός για αυτή την μεταβολική αλλαγή σε αερόβια γλυκόλυση δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί, είναι πιθανό ότι μιτοχονδριακές βλάβες στην αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων και η προκύπτουσα αυξημένη παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου είναι σημαντικές κινητήριες δυνάμεις. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε το ρόλο του μεταγραφικού παράγοντα Ets-1 στην ρύθμιση της μιτοχονδριακής λειτουργίας και του μεταβολισμού. Ets-1 υπερεκφράζεται χρησιμοποιώντας μια σταθερά-ενσωματώνεται τετρακυκλίνη φορέα έκφρασης επαγώγιμο στην κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών 2008, η οποία δεν εκφράζουν ανιχνεύσιμα επίπεδα της βασικής πρωτεΐνης Ets-1. ανάλυση μικροσυστοιχιών των αποτελεσμάτων του Ets-1 υπερ-έκφραση σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών δείχνει ότι Ets-1-up ρυθμίζει βασικά ένζυμα που εμπλέκονται στη γλυκόλυση και συνδέονται πορείες τροφοδότη, το μεταβολισμό των λιπαρών οξέων, και αντιοξειδωτική άμυνα. Σε αντίθεση, Ets-1 ρυθμίζει προς τα κάτω γονίδια που εμπλέκονται στον κύκλο του κιτρικού οξέος, αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων, και μιτοχονδριακών πρωτεϊνών. Στο λειτουργικό επίπεδο, έχουμε βρει ότι Ets-1 έκφραση συσχετίζεται άμεσα με την κυτταρική κατανάλωση οξυγόνου σύμφωνα με την οποία αυξημένη έκφραση αιτίες μειωμένη κατανάλωση οξυγόνου. Ets-1 υπερ-έκφραση προκάλεσε επίσης αυξημένη ευαισθησία στο γλυκολυτικό αναστολείς, καθώς και αναστολή της ανάπτυξης σε ένα περιβάλλον καλλιέργειας γλυκόζη εξαντληθεί. Συλλογικά τα ευρήματά μας δείχνουν ότι Ets-1 εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού μεταβολισμού και την απόκριση στο οξειδωτικό στρες στα κύτταρα του καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Verschoor ML, Wilson LA, Verschoor CP, Singh G (2010) ETS- 1 Ρυθμίζει το μεταβολισμό της ενέργειας στα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 5 (10): e13565. doi: 10.1371 /journal.pone.0013565

Επιμέλεια: Jen-Τσαν Ashley Chi, το Πανεπιστήμιο Duke, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Ιουνίου 2010? Αποδεκτές: 24 του Σεπτέμβρη 2010? Δημοσιεύθηκε: 22 Οκτώβρη 2010

Copyright: © 2010 Verschoor et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεων από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (CIHR). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

Πάνω από 50 χρόνια πριν, Otto Warburg προτάθηκε για πρώτη φορά ότι η μιτοχονδριακή τραυματισμό που οδηγεί σε κατάθλιψη λειτουργία της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων και το αναπνευστικό ελαττώματα είναι ένα σημαντικό βήμα για την ανάπτυξη και την εξέλιξη της καρκινογένεσης [1], [2]. Κατά τη διάρκεια των δύο τελευταίων δεκαετιών, πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι οι όγκοι χρησιμοποιούν κατά προτίμηση γλυκόλυση για την παραγωγή ενέργειας σε σχέση με την οξειδωτική φωσφορυλίωση, ένα χαρακτηριστικό που έχει γίνει σήμα κατατεθέν της παθοφυσιολογίας του όγκου [3] – [5]. Γνωστή ως αποτέλεσμα Warburg, τα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιούν κυρίως γλυκόλυση για την παραγωγή ΑΤΡ, ακόμη και με την παρουσία άφθονων οξυγόνου, ένα περιβάλλον που κανονικά θα οδηγούσε σε παραγωγή ενέργειας μέσω οξειδωτικής φωσφορυλίωσης [2], [6]. Μεταβολές στο μιτοχονδριακό DNA αντιστοιχεί σε αυξημένη παραγωγή ROS και μειωμένη οξειδωτική φωσφορυλίωση, οδηγώντας σε μειωμένη παραγωγή ΑΤΡ και αυξημένη εξάρτηση γλυκολυτικά [5], [7]. Η αυξημένη παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου, ιδίως H

2O

2, από τα καρκινικά κύτταρα είναι πιθανόν το αποτέλεσμα δυσλειτουργίας των μιτοχονδρίων, όπως οι μιτοχόνδρια θεωρείται ότι είναι η επικρατούσα κυτταρική πηγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου [8]. Τέσσερις έως πέντε τοις εκατό του O

2 καταναλώνονται από την οξειδωτική φωσφορυλίωση σε μιτοχόνδρια κανονικά μετατρέπεται σε αντιδραστικά είδη οξυγόνου? Ως εκ τούτου, ελαττώματα στο σύστημα αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων σε καρκινικά κύτταρα θα οδηγήσει σε υπερβολική αντιδραστικά είδη οξυγόνου σχηματισμός [8] – [10]. Υπερβολικά παραχθεί, H

2O

2 μπορεί να δρα ως ένα μόριο σηματοδότησης με οξείδωση μόρια κυστεΐνης σε πρωτεΐνες, ενεργοποιώντας διάφορες οδούς σηματοδότησης περιλαμβανομένων ΜΑΡΚ, καθώς και διάφορους παράγοντες μεταγραφής συμπεριλαμβανομένων ΑΡ-1, ρ53, NF-κΒ, και Ets-1 [11] – [15]

Ets-1, ένα μέλος της οικογένειας πρωτεΐνης Ets των παραγόντων μεταγραφής, ρυθμίζει την έκφραση του ένα διαφορετικό σύνολο των πρωτεϊνών μέσω της αλληλεπίδρασης της με συγκεκριμένες συναινετικές αλληλουχίες ανοδικά. γονιδίων στόχων [16]. Η υπερ-έκφραση του ETS-1 έχει συσχετισθεί με ένα πλήθος διαφορετικών καρκίνων, ειδικά σε σχέση με την εξέλιξη του όγκου και εισβολή [16] – [19]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του ETS-1 έχει επίσης συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση σε μαστού [20], των ωοθηκών [21], και του τραχήλου της μήτρας καρκινώματα [22]. Παραδοσιακά, Ets-1 πιστεύεται ότι λειτουργεί ως μεταγραφικός ενεργοποιητής και υψηλή έκφραση του στα ενδοθηλιακά και στρωματικά κύτταρα συσχετίζεται με διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων και δυσμενούς αποτελέσματος στον καρκίνο των ωοθηκών και του μαστού [23] – [25]. Το εργαστήριο μας και των άλλων τόνισαν τη σημασία του ETS-1 στη ρύθμιση των διαφόρων πτυχών της συμπεριφοράς των καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων αναδιαμόρφωση εξωκυττάριας μήτρας, εισβολή, την αγγειογένεση [26], και η αντίσταση των ναρκωτικών [27]. Ο σύνδεσμος μεταξύ Ets-1 και διεισδυτικότητα του καρκίνου μπορεί ενδεχομένως να εξηγηθεί από την λίστα των γνωστών γονιδίων στόχων ρυθμίζεται από τον παράγοντα αυτό μετεγγραφής. Αρκετές MMPs και ιντεγκρίνης γονίδια, όπως επίσης και ενεργοποιητής πλασμινογόνου ουροκινάσης (υΡΑ), οι οποίες είναι όλες γνωστές μεσολαβητές της εξωκυττάριας μήτρας και αποικοδόμησης κυτταρική μετανάστευση, είναι γνωστοί στόχοι για Ets-1 [28] – [31]. Πολλά γονίδια ζωτικής σημασίας για την αγγειογένεση και εξωκυτταρική αναδιαμόρφωση μήτρας, όπως μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-9), υΡΑ και Integrinβ3, είναι κάτω από την άμεση ρύθμιση του ETS-1 [26]. Αυτός ο παράγοντας μεταγραφής θεωρείται έτσι ότι είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων και την εξέλιξη του όγκου.

Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι Ets-1 παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση του μεταβολισμού ενέργειας σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Χρησιμοποιώντας υψηλής απόδοσης γονιδιωματική ανάλυση, βρήκαμε ότι Ets-1 ρυθμίζει, είτε άμεσα είτε έμμεσα, πολλά σημαντικά γονίδια που εμπλέκονται στη μιτοχονδριακή μεταβολικές οδούς και αντιοξειδωτική άμυνα στο μοντέλο καρκινικού κυττάρου μας Ets-1 υπερ-έκφραση των ωοθηκών. Λειτουργικά, έχουμε δείξει ότι η γλυκόλυση, οξειδωτική φωσφορυλίωση, και τα κυτταρικά συστήματα αναπνευστικής μεταβάλλεται σε απόκριση σε μεταβολές Ets-1 έκφρασης. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι Ets-1 είναι ένας βασικός παράγοντας μεταγραφής εμπλέκονται στη ρύθμιση του μεταβολισμού και του οξειδωτικού στρες στα καρκινικά κύτταρα.

Αποτελέσματα

μοντέλο των κυττάρων του καρκίνου της γονιδιακής έκφρασης Ets-1

Ets-1 ήταν υπερ-εκφράζεται σε 2008 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών χρησιμοποιώντας ένα σύστημα που επάγεται από τετρακυκλίνη, δημιουργώντας 2.008-Ets1 κύτταρα. Ets-1 έκφραση πρωτεΐνης σε τετρακυκλίνη επεξεργασμένου 2008 και 2008-Ets1 εξετάστηκε μέσω κηλίδωση Western (Σχήμα 1). έκφραση πρωτεΐνης Ets-1 δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε 2.008 ολόκληρο κυτταρολύματα, αλλά ανιχνεύθηκε εύκολα στην επαγόμενη λύμα 2.008-Ets1. Αυξημένη έκφραση Ets-1 βρέθηκε να είναι ένας ειδικός αποτέλεσμα όπως τα επίπεδα της πρωτεΐνης δύο παρόμοιων μελών της οικογένειας Ets, Ets-2 και PEA3 δεν μεταβλήθηκε σε αυτό το μοντέλο του ETS-1 υπερ-έκφραση (Σχήμα 2).

2008 κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών διαμολύνθηκαν σταθερά να υπερ-εκφράζουν Ets-1 σε ένα επαγώγιμο σύστημα τετρακυκλίνης. Πρωτεΐνη έκφραση του 2008 και του 2008, Ets1 κυττάρων μετρήθηκε μέσω κηλίδας Western μετά από επαγωγή με τετρακυκλίνη (n = 3).

Η

Η πρωτεΐνη έκφραση των παραγόντων της οικογένειας ETS μεταγραφής (Α) Ets-2 και (Β ) PEA3 συγκρίθηκαν το 2008 και το 2008-Ets1 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών να προσδιοριστεί η ειδικότητα του μοντέλου Ets-1 έκφραση μας. Ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι κανένας από αυτούς τους παράγοντες μεταγραφής που επηρεάζονται από Ets-1 έκφρασης σε κύτταρα 2008.

Η

Ets-1 ρυθμίζει την ανάλυση μεταβολικών γονιδιακής έκφρασης

μικροσυστοιχιών του 2008 και 2008- κύτταρα Ets1 αποκάλυψε ότι 3.131 γονίδια των 28.869 γονιδίων ανιχνεύθηκαν ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω ή προς τα κάτω ρυθμισμένα σε απόκριση προς Ets-1 υπερ-έκφραση κατά τουλάχιστον 1,45 φορές (p≤0.001) (GEO ένταξη βάση δεδομένων # GSE21129). Για τη μελέτη αυτή, έχουμε επιλέξει να υποβάλει έκθεση και να εξετάσει τις αλλαγές σε επιλεγμένες mRNAs των οποίων οι λειτουργίες είναι σχετικές με μιτοχονδριακή δραστηριότητα, τον κυτταρικό μεταβολισμό, και το οξειδωτικό στρες. Σε πραγματικό χρόνο επικύρωσης qRT-PCR διεξήχθη με τη χρήση 10 γονιδίων-στόχων που αντιπροσωπεύουν διάφορες φορές τιμές μεταβολής, και τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν σε 4 διαφορετικά γονίδια καθαριότητας. Παρά το γεγονός ότι και οι δύο την έκφραση του γονιδίου PPARG και SDHB το 2008-Ets1 κύτταρα δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές από τα κύτταρα του 2008, οι φορές αλλαγές προσδιορίζονται από πραγματικό χρόνο qRT-PCR συνδέθηκαν με τις αλλαγές μικροσυστοιχιών φορές με συντελεστή συσχέτισης 0,99 (Πίνακας 1). Ως εκ τούτου, διπλώστε αλλαγές μεγαλύτερη από 1,45 θεωρήθηκαν να είναι έγκυρα τα αποτελέσματα και συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη.

Η

Η έκφραση του ενζύμου G6PD, PDHA, Χονγκ Κονγκ, και CYC εξετάστηκαν με κηλίδωση Western για να προσδιοριστεί αν το γονίδιο διαφορές έκφρασης που παρατηρήθηκαν ήταν επίσης παρόντες στο επίπεδο της πρωτεΐνης. Εμείς δεν βρούμε σημαντικές διαφορές στην έκφραση της πρωτεΐνης μεταξύ του 2008 και του 2008, Ets1 κύτταρα για οποιοδήποτε από τα ένζυμα που εξετάστηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Το γλυκολυτικό ικανότητα των καρκινικών κυττάρων ρυθμίζεται από Ets-1

ανάλυση μικροσυστοιχιών του 2008-Ets1 καρκίνο των ωοθηκών κυττάρων αποκάλυψε ότι Ets-1 εμπλέκεται στη ρύθμιση της μιτοχονδριακής στρες και δυσλειτουργία και μεταβολικές γονίδια, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων που εμπλέκονται στη γλυκόλυση, glycolytic μονοπάτια τροφοδότη, τον κύκλο TCA, και το μεταβολισμό των λιπιδίων (Πίνακας 2), και τα γονίδια που εμπλέκονται στην αντιοξειδωτική άμυνα (Πίνακας 3) μεταβλήθηκαν σε Ets-1 υπερ-εκφράζοντα κύτταρα. Για να αξιολογηθεί το κατά πόσον τα κύτταρα με σταθερή υπερέκφραση του ETS-1 υπέρ γλυκόλυση πάνω οξειδωτική φωσφορυλίωση για την ενέργεια, όπως προβλέπεται από την ανάλυση μικροσυστοιχιών μας, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσα χωρίς γλυκόζη συμπληρωμένο με τον γλυκολυτικό αναστολέα 2-DG, ένα ανάλογο της γλυκόζης. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν παρουσία διαφόρων ποσοτήτων 2-DG, και αντιπροσωπευτικές καμπύλες ανάπτυξης παράχθηκαν για κάθε κυτταρική γραμμή. Η ανάπτυξη των κυττάρων σε μέσα που περιέχουν 2-DG αναστάλθηκε σε μεγαλύτερο βαθμό σε κύτταρα με ένα υψηλότερο Ets-1 έκφραση σε σχέση με γονικά κύτταρα (Σχήμα 3Α). Η 2-DG IC

50 δόσεις, ή δόσεις όπου το 50% των κυττάρων είχε σταματήσει πολλαπλασιαζόμενα, υπολογίστηκαν από 4 ανεξάρτητα πειράματα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα κύτταρα 2008-Ets1 που προκαλείται με τετρακυκλίνη ήταν η πιο ευαίσθητη σε 2-DG, με IC

50 0,75 mM, η οποία ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι τα γονικά κύτταρα 2008, IC

50 4,29 mM ( p≤0.01). C13 * κύτταρα, μια σισπλατίνη ανθεκτική παραλλαγή των κυττάρων 2008, είχε μια IC

50 2,04 mM, η οποία ήταν επίσης σημαντικά χαμηλότερη από γονικά κύτταρα 2008 (p ≤ 0,05). Παραβλέπεται καμία επίδραση της θεραπείας, τα κύτταρα γονική 2008 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τετρακυκλίνη, και δεν έδειξε σημαντική αναστολή της ανάπτυξης κατά 2-DG με IC

50 του 3.67 mM (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Η ανάπτυξη των κυττάρων σε φυσιολογικά ή χωρίς γλυκόζη μέσα (συμπληρωμένο με πυροσταφυλικό νάτριο) συγκρίθηκε επί 96 ώρες, μετά το οποίο παρατηρήθηκε ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων με αυξημένη έκφραση του ETS-1 κυρίως βραδύτερη σε σύγκριση με γονικά κύτταρα 2008 (Σχήμα 3Β ). Η θεραπεία με τα μέσα ενημέρωσης ελεύθερο γλυκόζης οδήγησε σε μειωμένο ρυθμό πολλαπλασιασμού για όλα τα κύτταρα δοκιμάστηκαν σε σύγκριση με κανονικά συμπληρωμένο μέσο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) 2.008, C13 *, και το 2008-Ets1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ο αναστολέας γλυκολυτικά 2-DG, και η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε ακόλουθες 96 ώρες επώασης. 2008-Ets1 και C13 * κύτταρα τα οποία εκφράζουν Ets-1 έδειξαν σημαντικά μειωμένη ανάπτυξη μετά γλυκολυτικό αναστολή σε 2008-Ets1 συγκριτικά με γονικά κύτταρα 2008 (n = 4). (Β) 2,008 και 2,008 κύτταρα-Ets1 αναπτύχθηκαν σε απουσία γλυκόζης, και προσδιορισμοί πολλαπλασιασμού έγιναν σε διαστήματα 24 ωρών. 2008-Ets1 καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του ETS-1 έδειξαν μειωμένη ικανότητα για ανάπτυξη σε μέσο καλλιέργειας χωρίς γλυκόζη, γεγονός που υποδηλώνει αυξημένη εξάρτηση από την γλυκόλυση για την ενέργεια (n = 3).

Η

Ets-1 ρυθμίζει την κυτταρική κατανάλωση οξυγόνου στα κύτταρα του καρκίνου

μικροσυστοιχιών μας αναλύει υποδηλώνουν ότι Ets-1 υπερέκφραση οδήγησε σε συνολική ρύθμιση προς τα κάτω των γονιδίων που κωδικοποιούν ηλεκτρονίων συστατικά αλυσίδα μεταφοράς, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτές οι κυτταρικές σειρές θα ήταν πιθανόν απεικόνιση μειώθηκε O

2 κατανάλωσης (Πίνακας 4). Αυτή η υπόθεση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας υψηλής ανάλυσης αναπνευσιομετρίας, όπου μετράται βασική κατανάλωση οξυγόνου μετά την προσθήκη των κυττάρων σε ένα oxygraph. Βασική κατανάλωση οξυγόνου ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε επαγόμενη από κύτταρα 2008-Ets1 (26,23 pmoles O

1.2 × 10

6 κύτταρα /sec? P ≤ 0,05) σε σύγκριση με κύτταρα 2008 (40.60 pmoles O

2/1 × 10

6 κύτταρα /sec, p ≤ 0,05) (Σχήμα 4). Καμία σημαντική επίδραση της θεραπείας τετρακυκλίνης επί της βασικής κατανάλωσης οξυγόνου βρέθηκε μετά από επαγωγή των κυττάρων 2008, επιβεβαιώνοντας ότι η τετρακυκλίνη δεν επηρέασε την κατανάλωση οξυγόνου στο μοντέλο μας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Basal κατανάλωση οξυγόνου προσδιορίστηκε για το 2008 και 2008- Ets1 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. Ets-1 έκφραση συσχετίστηκε με σημαντική μείωση στη βασική κατανάλωση οξυγόνου υποδηλώνει μειωμένη εξάρτηση από την οξειδωτική φωσφορυλίωση σε κύτταρα 2008-Ets1.

Η

Συζήτηση

μιτοχονδριακού αντιδραστικά είδη οξυγόνου ενεργοποιούν διάφορα μονοπάτια σηματοδότησης κλειδί που εμπλέκονται στην ογκογένεση και ρυθμίζουν την έκφραση σημαντικών ογκογόνους παράγοντες μεταγραφής συμπεριλαμβανομένων Ets-1 [32]. Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι η αυξημένη παραγωγή ενδοκυτταρικών αντιδραστικών ειδών οξυγόνου σε C13 * κύτταρα, ένα cisplatin ανθεκτική παραλλαγή του 2008 κυττάρων καρκινώματος των ωοθηκών, συσχετίζεται με μια αύξηση στην Ets-1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης [15], [33]. Η επακόλουθη κατεργασία αυτών των κυττάρων με Η

2O

2 αυξημένη έκφραση Ets-1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας ότι αυτός ο παράγοντας μεταγραφής είναι υψηλής απόκρισης σε σήματα που προέρχονται από όγκους.

προηγούμενη ανάλυση μας του ο υποκινητής Ets-1 οδήγησε στην ταυτοποίηση ενός αντιοξειδωτικού στοιχείου απόκρισης (ARE) που αποδείχθηκε ότι είναι καθοριστική στη ρύθμιση της έκφρασης του ETS-1 στο πλαίσιο τόσο βασική και H

2O

2-επαγόμενες συνθήκες [15] . Παραδοσιακά, η λειτουργική σημασία της Ets-1 υπερέκφραση σε καρκίνο έχει συσχετιστεί με τη ρύθμιση των πρωτεασών αποδόμησης μήτρας και αγγειογόνοι παράγοντες [26], [34]. Ωστόσο, πρόσφατα ευρήματα μας ότι το μιτοχονδριακό αντιδραστικά είδη οξυγόνου επηρεάζει ισχυρά την έκφραση Ets-1 στο μεταγραφικό επίπεδο [15] δείχνουν ότι η σημασία αυτού του παράγοντα μεταγραφής στην έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου του επεκτείνεται πέρα ​​από την αγγειογένεση και μετάσταση μόνο. ​​

υπέθεσαν ότι Ets-1 μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση του μεταβολισμού του μιτοχονδριακού σε καρκινικά κύτταρα, επειδή το μιτοχονδριακό στρες τόσο από την αύξηση της παραγωγής και μεταφοράς ηλεκτρονίων αντιδραστικά είδη οξυγόνου αλυσίδα αποτέλεσμα δυσλειτουργία σε αυξημένη 1-Ets mRNA και η πρωτεΐνη [15]. Προκειμένου να προσδιοριστεί η λειτουργική σημασία του ETS-1 έκφραση στον μεταβολισμό των καρκινικών κυττάρων, δημιουργήσαμε τις επάγεται από τετρακυκλίνη Ets-1 υπερεκφράζουν καρκινική κυτταρική γραμμή ωοθηκών 2.008-Ets1. Γονικά κύτταρα 2008 δεν εκφράζουν ανιχνεύσιμα επίπεδα της πρωτεΐνης Ets-1 ενδογενώς. Για να αναλυθούν οι γονιδιωματικές συνέπειες του ETS-1 υπερ-έκφραση σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, πραγματοποιήσαμε ένα ανθρώπινο γονίδιο μικροσυστοιχιών. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι Ets-1 είναι είτε εμπλέκονται άμεσα ή έμμεσα στην ρύθμιση της έκφρασης περισσότερο από 3000 από τις πάνω από 28.000 ανθρώπινα γονίδια που εξετάστηκαν. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι Ets-1 θα μπορούσε να ενεργήσει σαν ένας μεταγραφικός καταστολέας του περισσότερο από το ήμισυ (1665) αυτών των γονιδίων σε κύτταρα καρκινώματος των ωοθηκών.

Αν και Ets-1 έχει μελετηθεί εκτεταμένα και στις δύο φυσιολογικές και παθολογικές διεργασίες [17], είναι σπανίως αναφέρεται ως μεταγραφικός καταστολέας. Στο πλαίσιο της μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και του μεταβολισμού, Ets-1 βρέθηκε να τουλάχιστον μερικώς ρυθμίζουν προς τα κάτω αρκετές συνιστώσες της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων. Complex μου, το πιο σημαντικό χώρο για διαρροή ηλεκτρονίων που οδηγεί σε υπερβολική παραγωγή αντιδραστικά είδη οξυγόνου στην αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων, αποτελείται από 39 κωδικοποιημένα γονίδια πυρηνική υπομονάδα, εκ των οποίων Ets-1 ρυθμίζει προς τα κάτω 11. Μια άλλη σημαντική περιοχή για διαρροή ηλεκτρονίων και αντιδραστική παραγωγή ειδών οξυγόνου είναι πολύπλοκη III, το οποίο αποτελείται από 10 υπομονάδες, εκ των οποίων Ets-1 ρυθμίζει προς τα κάτω 3. Ets-1 καταστέλλει επίσης τα στοιχεία του Complex IV, V Complex συνθάσες ΑΤΡ, καθώς και ορισμένες μεταφοράς ηλεκτρονίων συνδέονται παράγοντες. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα κατασταλτικά λειτουργίες προτείνουν ότι Ets-1 εμφανώς εμπλέκεται στην μειωμένη εξάρτηση από οξειδωτική φωσφορυλίωση συχνά σχετίζεται με τα καρκινικά κύτταρα. Κατά συνέπεια, τα γονίδια που κωδικοποιούν μιτοχονδριακών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην οξειδωτική φωσφορυλίωση θα ρυθμίζεται προς τα κάτω, και τα κύτταρα θα απαιτούσε εναλλακτικές μεθόδους παραγωγής ΑΤΡ συμπεριλαμβανομένων γλυκόλυση και η οξείδωση των λιπαρών οξέων. Δεδομένου ότι τα συστατικά του σχεδόν σε κάθε συγκρότημα της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων, αρκετές βασικές ένζυμα του κύκλου TCA, και τελικά τα αναγωγικά ισοδύναμα που απαιτούνται για τη μεταφορά ηλεκτρονίων ήταν ομοίως κάτω ρυθμισμένα, Ets-1 υπερεκφράζουν κύτταρα φαίνεται να έχουν μειωμένη ικανότητα να παράγουν ATP μέσω οξειδωτική φωσφορυλίωση σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης.

Τα καρκινικά κύτταρα συνήθως έχουν μειωμένη εξάρτηση από την οξειδωτική φωσφορυλίωση για την παραγωγή ενέργειας, και επίσης έχουν αυξημένο εξάρτηση από την γλυκόλυση και το λίπος του μεταβολισμού για την κυτταρική ενέργεια [35]. Σε περαιτέρω υποστήριξης που Ets-1 εμπλέκεται στη ρύθμιση του μεταβολισμού των αλλαγμένων καρκίνου, Ets-1 σχετίζεται με την αυξημένη έκφραση πολλών γονιδίων που εμπλέκονται στη γλυκόλυση, γλυκολυτικά οδούς τροφοδοσίας, και το μονοπάτι φωσφορικής πεντόζης. Επιπλέον, η έκφραση του ETS-1 επίσης συσχετίζεται με αυξήσεις στην έκφραση πολλών γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των λιπιδίων και βιοσύνθεση. Στο σύνολό τους, αυτές οι τάσεις δείχνουν ότι Ets-1 είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της μεταγραφής όχι μόνο στην καταβολική, αλλά και αναβολική μεταβολική μεταβάσεις των καρκινικών κυττάρων που προάγουν τελικά ογκογένεσης [35].

Ήταν σχεδόν πριν από μισό αιώνα όταν η αυξητική ρύθμιση του συνθάσης λιπαρού οξέος (FASN) περιγράφηκε για πρώτη φορά στον καρκίνο [36], η οποία είναι τώρα γνωστό ότι υπερ-εκφράζεται στην πλειοψηφία των καρκίνων. Είναι ενδιαφέρον ότι, Ets-1 βρέθηκε επίσης να εμπλέκεται στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης αυξήθηκε FASN σε μοντέλο καρκίνου των ωοθηκών μας. Έτσι, τα ευρήματα γονιδιακής έκφρασης μας υποδηλώνουν ότι Ets-1 είναι ένας βασικός παράγοντας μεταγραφής που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των καρκινικών κυττάρων, και ιδιαίτερα σημαντική στη μεταβολική μετατόπιση προς γλυκόλυση και αναβολική μέσα παραγωγής ενέργειας. Αν και είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι Ets-1-μεσολαβούμενη ρύθμιση του μεταβολισμού είναι πιθανή επιτυγχάνεται με μια μεγάλη κοινοπραξία διαφορετικών παραγόντων μεταγραφής, μια πιο σύνθετη ρυθμιστική δίκτυο των παραγόντων μεταγραφής επηρεάζεται από μιτοχονδριακή δυσλειτουργία έχουν ακόμη να διευκρινιστεί. Έχουμε αποδείξει ότι η υπερ-έκφραση του ETS-1 στο μοντέλο μας με καρκίνο των ωοθηκών δεν επηρέασε τα επίπεδα πρωτεΐνης από δύο στενά συνδεδεμένα μέλη της οικογένειας ETS? Ωστόσο, είναι πιθανό ότι άλλοι παράγοντες μεταγραφής ETS από αυτή την πολύ μεγάλη οικογένεια επηρεάζουν επίσης το μεταβολισμό του καρκίνου. Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι παράγοντες μεταγραφής αναγνωρίζουν σχεδόν ταυτόσημες αλληλουχίες συναίνεσης, η επανάληψη των πειραμάτων εντός αυτής της μελέτης μετά από την υπερ-έκφραση των άλλων μελών της οικογένειας ETS θα μπορούσαν να αποφέρουν παρόμοια αποτελέσματα. Επιπλέον, τέτοια πειράματα θα χαρακτηρίζουν περαιτέρω το δυνητικά μεγάλο δίκτυο μεταγραφική εμπλέκονται στην εξειδικευμένη μεταβολισμό των καρκινικών κυττάρων.

Για να προσδιοριστεί η λειτουργική σημασία της γονιδιωματικής τα αποτελέσματά μας, εξετάσαμε το γλυκολυτικό ικανότητα του ETS-1 μας πάνω -έκφραση μοντέλο. Έχουμε αξιολόγησε έμμεσα την ικανότητα οξειδωτικής φωσφορυλίωσης αυτών των κυττάρων μέσω της επεξεργασίας με το γλυκολυτικό αναστολέα 2-DG. Ωοθηκών C13 * και επάγεται κύτταρα 2008-Ets1, που και οι δύο εκφράζουν Ets-1, έδειξε εξέχοντα αναστολή της ανάπτυξης σε απάντηση 2-DG, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα κύτταρα είναι περισσότερο εξαρτώνται από την γλυκόλυση για την παραγωγή ΑΤΡ. Επιπλέον, το ETS-1 υπερεκφράζουν ωοθηκών καρκινικά κύτταρα εμφανίζονται σημαντικά μειωμένη ανάπτυξη μετά από στέρηση γλυκόζης, περαιτέρω τονίζοντας γλυκόλυσης εξάρτηση τους. Ο ρυθμός ανάπτυξης όλων των τύπων κυττάρων σε μέσα χωρίς γλυκόζη μειώθηκε σε σύγκριση με κανονικά συμπληρώνεται μέσα, ιδιαίτερα μετά από 48 ώρες όταν παρατηρήθηκε με συνέπεια μια διακριτή απόκλιση στην ανάπτυξη των κυττάρων, πιθανόν λόγω της μειωμένης διαθεσιμότητας της γλυκόζης. Υπερ-έκφραση του ETS-1 ισχυρώς επιδεινώνεται η απόκλιση αυτή ως την ανάπτυξη της επαγόμενης 2008-Ets1 κυττάρων μειώθηκε δραστικά μετά από 48 ώρες. Ωστόσο στο πρωτεϊνικό επίπεδο, δεν βρήκαμε σημαντικές διαφορές στην έκφραση των αφυδρογονάσης γλυκόζης-6-φωσφορικής, πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης, κυτόχρωμα

c

, ή εξοκινάση, τα οποία είναι όλα τα ένζυμα που εμπλέκονται στη γλυκόλυση ή οξειδωτική φωσφορυλίωση. Είναι σημαντικό ότι, κάναμε δούμε επαναλαμβανόμενη και σημαντικές διαφορές στη γλυκολυτική εξάρτηση σχετίζεται με Ets-1 έκφραση, και η έλλειψη των αλλαγών στην έκφραση της πρωτεΐνης θα μπορούσε, επομένως, να οφείλεται σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που διαμεσολαβείται από Ets-1. Για παράδειγμα, διαφορές στο εσωτερικό της καταλυτική περιοχή ενός ενζύμου θα οδηγούσε σε λειτουργικές διαφορές, αλλά όχι κατ ‘ανάγκη να είναι ανιχνεύσιμα μέσω στυπώματος Western, όπως αυτή η τεχνική εξαρτάται από την συγκεκριμένη επιτόπιο στόχο του αντισώματος που χρησιμοποιείται. Έτσι, σχεδιάζουμε να εξετάσει την ενζυμική δραστηριότητα αυτών των μεταβολικών ενζύμων σε μελλοντικές μελέτες για να καθοριστεί αν υπάρχουν τυχόν διαφορές μεταξύ του 2008 και του 2008, Ets1 κύτταρα που θα μπορούσαν να ευθύνονται για τις λειτουργικές διαφορές έχουμε δείξει σε αυτή τη μελέτη.

Η αξιολόγηση O

2 κατανάλωση ενός πληθυσμού των κυττάρων είναι μια λειτουργική αξιολόγηση της οξειδωτική ικανότητα, δεδομένου ότι αντιπροσωπεύει μια καλή εκτίμηση του ρυθμού με τον οποίο τα ηλεκτρόνια περνούν κατά μήκος της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων και να μειωθεί στο H

2O

2. Το πολαρογραφικών σύστημα που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη για να μετρηθεί O

2 κατανάλωση περιλαμβάνει αισθητήρες που αποδίδουν ρεύμα ανάλογο με τη μερική πίεση του O

2 σε κύτταρο που περιέχει μέσα από την κατανάλωση O

2 σε μια κάθοδο ήμισυ αντίδραση, έτσι το σήμα ανταποκρίνεται εκθετικά σε μεταβολές O

2 πίεση μέσα στο δείγμα. Ελλείψει ειδικών πολύπλοκων υποστρωμάτων και ADP, προσομοιώνοντας έτσι την αναπνοή, το βασικό επιτόκιο O

2 κατανάλωση μπορεί να μετρηθεί. Έχουμε παρατηρήσει σημαντικές μειώσεις σε O

2 κατανάλωση σε κύτταρα με αυξημένη έκφραση Ets-1. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Ets-1 εμπλέκεται άμεσα στη ρύθμιση της κυτταρικής οξειδωτικής ικανότητας, όπου Ets-1 υπερέκφραση οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη O

2 κατανάλωση, και Ets-1 ρυθμίζεται προς τα κάτω κύτταρα επέδειξαν μία πολύ προεξέχουσα αύξηση O

2 κατανάλωσης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα επάνω ρυθμισμένη Ets-1 έκφραση προωθεί μια μειωμένη εξάρτηση από την οξειδωτική φωσφορυλίωση για την ενέργεια, και παρέχει περαιτέρω αποδείξεις προς τη λειτουργική σημασία του ETS-1 στο μεταβολισμό των καρκινικών κυττάρων.

Τα υψηλά επίπεδα του οξειδωτικού στρες είναι τυπικώς παρατηρούνται στο μικροπεριβάλλον του όγκου ως αποτέλεσμα των ανισορροπιών στην αντιοξειδωτική άμυνα παράγοντες, και διαταραχή των μηχανισμών επιδιόρθωσης του DNA [37] – [39]. Σε κύτταρα καρκίνου του μαστού γραμμές, η αυξημένη κακοήθεια σχετίζεται με υψηλά επίπεδα δραστικών μορφών που παράγουν οξυγόνο υπεροξειδίου δραστικότητα δισμουτάσης, σε συνδυασμό με μειωμένα επίπεδα δραστικού οξυγόνου σε είδη αποτοξίνωση υπεροξειδάσες γλουταθειόνης και το H

2O

2-αποτοξίνωση ένζυμο καταλάση [40]. Παρόμοια αντιοξειδωτικό ανισορροπίες ένζυμο βρέθηκε σε μελάνωμα [41], καθώς επίσης και του πνεύμονα [42], του προστάτη [43], και καρκίνων του θυρεοειδούς [44]. ανάλυση μικροσυστοιχιών μας προσδιορίζεται ότι Ets-1 είναι ένας ρυθμιστής του αντιοξειδωτικού γονιδιακής έκφρασης σε καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα, ιδιαίτερα υπεροξειδάσες γλουταθειόνης, τα οποία στοχεύουν επιλεκτικά H

2O

2 και λιπιδίων υδροϋπεροξείδια για αποτοξίνωση. Αυτή η αυξημένη έκφραση των αντιοξειδωτικών είναι σε απόκριση σε μιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες, με τη μορφή της υπερβολικής αντιδραστικών παραγωγή ειδών οξυγόνου, και έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι οι αυξήσεις έκφραση Ets-1 γονίδιο σε απόκριση H

2O

2 [15]. Ωστόσο, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι Ets-1 επίσης προς τα κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια που κωδικοποιούν ορισμένες H

2O

2-ένζυμα αποτοξίνωσης, υποδηλώνοντας ότι αυτά τα καρκινικά κύτταρα ενδέχεται να απαιτήσει και να διατηρηθεί ένα ορισμένο επίπεδο H

2O

2 να ενθαρρύνει τους υψηλούς ρυθμούς ανάπτυξης εγγενή εξέλιξης του όγκου.

μια νέα λειτουργία για Ets-1 διευκρινιστεί σε αυτή τη μελέτη μετά από γονιδιωματική και λειτουργική ανάλυση ενός μοντέλου έκφρασης καρκίνο των ωοθηκών Ets-1. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που δείχνει ένα ρόλο για τον παράγοντα αυτό μετεγγραφής στο μεταβολισμό. Πολυάριθμες κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια ταυτοποιήθηκαν σε Ets-1 επί κυττάρων που εκφράζουν περιλαμβανομένων εκείνων που κωδικοποιούν αρκετές μιτοχονδριακών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην οξειδωτική φωσφορυλίωση, καθώς και σημαντικά μεταβολικά ένζυμα που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή των απαιτούμενων υποστρωμάτων της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων. Λειτουργικές δοκιμασίες επιβεβαίωσαν ότι Ets-1 υπερεκφράζουν καρκινικά κύτταρα εμφανίζονται ελαττωμένη δυνατότητες οξειδωτική φωσφορυλίωση, καθώς και ενισχυμένη εξάρτηση από γλυκόλυση για την κυτταρική ενέργεια. Επιπλέον, Ets-1 δείχθηκε να είναι σημαντική στη ρύθμιση της κυτταρικής O

2 κατανάλωση υποδηλώνοντας περαιτέρω μια μειωμένη χρήση της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης στα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν Ets-1.

Ως εκ τούτου, βλάβη στα αποτελέσματα μιτοχόνδρια σε αυξημένη παραγωγή H

2O

2 και την επακόλουθη αυξητική ρύθμιση του ETS-1, το οποίο στη συνέχεια συμμετέχει σε ένα ενεργό δίκτυο ρυθμιστικών που θα ενθαρρύνει την εξάρτηση από τη γλυκόλυση και μεταβολισμού λιπιδίων για την κυτταρική ενεργειακές απαιτήσεις. Έτσι, Ets-1 μπορεί να ομαδοποιηθούν με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες που έχουν παρατηρηθεί να ρυθμίζουν την έκφραση των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών (NRFs) ή γονίδια που εμπλέκονται στη γλυκόλυση (HIF-1) σε απόκριση σε συγκεκριμένες καταπονήσεις [45], [46] . Συνοπτικά, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν μία νέα ρόλο για Ets-1 στη ρύθμιση του κυτταρικού μεταβολισμού σε απόκριση σε μιτοχονδριακή στρες.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Το ανθρώπινο κυτταρικές σειρές ωοθηκικού καρκινώματος, 2008 και C13 *, ευγενικά από τον Dr. Paul Andrews (Πανεπιστήμιο Georgetown, Rockville MD) [33]. Τα κύτταρα 2008 και C13 * διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 2% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Η σταθερή κυτταρική γραμμή 2008-Ets1 [27] διατηρήθηκε σε μέσο ανάπτυξης, όπως περιγράφεται με την προσθήκη 200 ng /ml από το επιλεκτικό αντιβιοτικό ζεοκίνη. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Μέσα μαζικής ενημέρωσης και τα συμπληρώματα αγοράστηκαν από την Invitrogen Life Technologies (Burlington, ON, Καναδάς), και FBS από τη Fisher Scientific (Ottawa, ON, Καναδάς). Όλα τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Sigma (Oakville, ΟΝ, Canada).

απομόνωση πρωτεϊνών και ανάλυση Western blot

λύματα ολόκληρων κυττάρων συλλέχθηκαν, 30 μg πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Amersham Biosciences, Baie D’Urfe, QC, Canada), και αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα ΤΒδ-Τ. Οι μεμβράνες επωάστηκαν για μια νύχτα με το πρωτογενές αντίσωμα σε 0.5% αποβουτυρωμένο γάλα ΤΒδ-Τ. Μετά την επώαση πρωτογενές αντίσωμα, οι μεμβράνες πλύθηκαν και επωάστηκαν για 1 ώρα με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας IgG (1:10,000) (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA). Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας ECL (Amersham), και εκτέθηκαν σε φιλμ. Αντισώματα έναντι Ets-1 (1:100), G6PD (1:1000), και PDHA (1:500) ήταν από Abcam? αντισώματα έναντι Ets-2 (1:500), PEA3 (1:100), και Χονγκ Κονγκ (1:250) ήταν από την Santa Cruz Biotechnology? και το αντίσωμα έναντι CYC (1:250) ήταν από BD Biosciences.

απομόνωση RNA και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ αντιδραστήριο όπως υποδεικνύεται από τον κατασκευαστή (Invitrogen) . Δείγματα RNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ϋΝάση χρησιμοποιώντας Turbo DNA-free ™ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Ambion), και 3 μg ολικού κυτταρικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας πολυ-Τ εκκινητές και το Superscript III First Strand Synthesis System (Invitrogen). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα DNA Engine® θερμικό ανακυκλωτή (Bio-Rad) και Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen) με αλληλουχίες εκκινητή που παρατίθενται στον Πίνακα 5. έκφραση του γονιδίου-στόχου ομαλοποιήθηκε στα συγχωνευμένες τιμές γονιδιακή έκφραση του β β-ακτίνης (ACTB), Β-2 μακροσφαιρίνη (Β2Μ), αφυδρογονάση 3-phosphdate αφυδρογονωμένο (GAPDH), και RNA πολυμεράση II (RPII) ως έλεγχοι καθαριότητας. Δεδομένα ομαλοποιήθηκε με την έκφραση του γονιδίου οικονόμος και την αποτελεσματικότητα διορθωθεί χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt της σχετικής ποσοτικοποίησης, όπου στατιστική σημαντικότητα και το τυπικό σφάλμα προσδιορίστηκαν από τις τιμές ΔCt.

Η

μικροσυστοιχιών ανάλυση

Το συνολικό RNA ήταν απομονώθηκε από τετρακυκλίνη επαγόμενη 2008 και κύτταρα 2008-Ets1 όπως περιγράφεται, καθαρίζεται χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού RNeasy (Qiagen), και υβριδοποιήθηκε με τον GeneChip® Human Gene 1,0 ST Array (28.869 ανθρώπινο γονίδιο ανιχνευτές). ανάλυση της ποιότητας του RNA μέσω BioAnalyzer, την προετοιμασία των μικροσυστοιχιών, υβριδισμό και ανίχνευση πραγματοποιήθηκαν από το Κέντρο Εφαρμοσμένης Genomics, το Νοσοκομείο για Άρρωστα Παιδιά, στο Τορόντο του Καναδά. Όλα τα χαμηλού επιπέδου αναλύσεις, τον υπολογισμό της διαφορικής έκφρασης, και στατιστικές προσαρμογές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας R έκδοση 2.9.2 [47]. Εκτίμηση της ποιότητας του RNA μετα-υβριδοποίησης, και ανάλυση χαμηλού επιπέδου διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το πακέτο «Affy» [48]. οικόπεδα υποβάθμιση RNA αποκάλυψε λίγο 5 ‘προς 3’ προκατάληψη και όλες οι συστοιχίες ήταν εντός 1,35 τυπικές αποκλίσεις από το μέσο όρο της πλαγιάς. διόρθωση Ιστορικό και ομαλοποίηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο εύρωστη μέσος multi-array (RMA). Για να μειωθεί ο αριθμός των δοκιμών διαφορικής έκφρασης κατάντη, αυξάνοντας έτσι τη συνολική δύναμη, το 50% από τα χαμηλότερα κανονικοποιημένων Σύνδεση

2 εντάσεις ανιχνευτή που αφαιρέθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις από Hackstadt και Hess (2009) [49]. εκτιμήσεις διαφορικής έκφρασης υπολογίστηκαν με βάση την αναπροσαρμοσμένη Τοπική δοκιμασία Συγκεντρωτικά σφάλμα στο πακέτο ‘LPEadj »[50]. Η διαδικασία Benjamini-Hochberg για τον έλεγχο ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) εφαρμόστηκε σε p-τιμές σύγκρισης-σοφός, χρησιμοποιώντας το πακέτο «multtest». Αναφέρθηκαν q-τιμές αντιπροσωπεύουν το ελάχιστο FDR κατά την οποία ένα συγκεκριμένο τεστ μπορεί να θεωρηθεί σημαντική. Διπλώστε τιμές έκφραση της αλλαγής των 10 τυχαίων γονιδίων στόχων ποικίλης φορές το μέγεθος της αλλαγής επικυρώθηκαν με τη χρήση πραγματικού χρόνου PCR. Αντίστοιχες μεταβολές των σχετικών φορές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCT της σχετικής ποσοτικοποίησης, και οι συντελεστές συσχέτισης υπολογίστηκαν για να καθορίσουν τη σχέση μεταξύ πραγματικού χρόνου PCR και μικροσυστοιχιών ευρήματα.

γλυκολυτικό δοκιμασίες εξάρτηση

Κινητά ρυθμό ανάπτυξης και