Αφηρημένο

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι μια ιδιαίτερα θανατηφόρα νόσος που χαρακτηρίζεται από καθυστερημένη διάγνωση και την αντίσταση της θεραπείας. έχουν επαναλαμβανόμενες γενετικές αλλοιώσεις σε καθορισμένες γονίδια σε συνδυασμό με διαταραχές του μονοπάτια σηματοδότησης αναπτυξιακών κυττάρων έχουν συσχετιστεί με την ανάπτυξη και την εξέλιξη PDAC. Εδώ, δείχνουμε ότι GATA6 συμβάλλει στην παγκρεατική καρκινογένεση κατά τη διάρκεια της χρονικής εξέλιξης της παγκρεατικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας δυνάμει της ενεργοποίησης μονοπατιού Wnt.

GATA6

είναι περιοδικά ενισχύεται τόσο από ποσοτικής-PCR και φθορίζον υβριδοποίηση in-situ σε ανθρώπινα παγκρεατικά ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία και σε ιστούς PDAC, και

GATA6

αριθμός αντιγράφων είναι συσχετίστηκε σημαντικά με τη συνολική επιβίωση των ασθενών. Εξαναγκασμένη υπερέκφραση του GATA6 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές ενισχυμένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό αποικιών σε μαλακό άγαρ

in vitro

και ανάπτυξη

in vivo

, καθώς και αυξημένη σηματοδότηση Wnt. Αντίθετα siRNA μεσολαβεί knockdown του GATA6 οδήγησε σε αντίστοιχες μειώσεις σε αυτές τις ίδιες παραμέτρους. Τα αποτελέσματα του GATA6 βρέθηκαν να είναι λόγω της ικανότητάς του να δεσμεύει DNA, ως αναγκαστική υπερέκφραση ενός δέσμευσης DNA μεταλλάκτη του GATA6 είχε καμία επίδραση στην κυτταρική ανάπτυξη

in vitro

ή

in vivo,

ούτε επηρεάζουν Wnt επίπεδα σηματοδότησης σε αυτά τα ίδια κύτταρα. Μια ανάλυση μικροσυστοιχιών αποκάλυψε την Wnt ανταγωνιστή Dickopf-1 (DKK1) ως απορρύθμισης του γονιδίου σε συνδυασμό με GATA6 νοκ ντάουν, και την άμεση σύνδεση του GATA6 στον υποκινητή DKK1 επιβεβαιώθηκε από χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση και δοκιμασίες μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας. Παροδική επιμόλυνση GATA6, αλλά όχι μεταλλαγμένη GATA6, σε κυτταρικές σειρές καρκίνου οδήγησε σε μειωμένη έκφραση του mRNA DKK1 και έκκριση της πρωτεΐνης σε DKK1 μέσο καλλιέργειας. Εξαναγκασμένη υπερέκφραση DKK1 ανταγωνίζεται τις επιδράσεις της GATA6 επί σηματοδότηση Wnt σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι ένας μηχανισμός με τον οποίο

GATA6

προωθεί παγκρέατος καρκινογένεση είναι λόγω της ενεργοποίησης του κανονικού σηματοδότηση Wnt μέσω ρύθμισης της DKK1

Παράθεση:. Zhong Υ, Wang Ζ, Fu Β, Pan F, Yachida S, Dhara M, et al. (2011) GATA6 Ενεργοποιεί σηματοδότηση Wnt σε καρκίνο του παγκρέατος από Αρνητικά Ρύθμιση της Wnt Ανταγωνιστή Dickkopf-1. PLoS ONE 6 (7): e22129. doi: 10.1371 /journal.pone.0022129

Επιμέλεια: Ειρήνη Oi Lin Ng, Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 31 Ιαν 2011? Αποδεκτές: 16 του Ιούνη 2011? Δημοσιεύθηκε: 19, Ιούλ, 2011

Copyright: © 2011 Zhong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται από ΝΙΗ χορηγεί CA106610, CA62924 και CA140599, The George Rubis Κληροδότημα για καρκίνο του παγκρέατος Ερευνών, το Ίδρυμα Μιχάλης Rolfe καρκίνο του παγκρέατος, Sigma Beta αδελφότητα, Το Ίδρυμα Joseph C. Monastra, Ο Alfredo Scatena Memorial, Το Ίδρυμα Patty Boshell παγκρέατος Καρκίνος και επιχορηγήσεις SAF2007 -60.860 και ONCOBIO Consolider από Ministerio Επιστημών e Innovación, Μαδρίτη, Ισπανία (FR). Οι συγγραφείς δεν έχουν οικονομικές συγκρούσεις συμφερόντων που σχετίζονται με αυτό το έργο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

GATA6 είναι ένα μέλος της οικογένειας παράγοντα μεταγραφής ΟΑΤΑ που παίζει κρίσιμο ρυθμιστικό ρόλο στην ανάπτυξη του ιστού [1]. GATA πρωτεΐνες μοιράζονται μια διατηρημένη αλληλουχία δακτύλου ψευδαργύρου που δεσμεύεται με την κανονική DNA μοτίβο (G /A) GATA (Α /Τ) [2], και χωρίζονται σε δύο υποομάδες με βάση πρότυπα έκφρασης χωρικά και χρονικά. GATA1 /2/3 εκφράζονται σε γενεών αιμοποιητικών κυττάρων, και GATA4 /5/6 σε μεσόδερμα και ενδόδερμα προέρχονται οργάνων [1], [3]. GATA6, ειδικότερα, είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη της καρδιάς, του γαστρεντερικού σωλήνα, του παγκρέατος και άλλων ιστών [4], [5]. Η σημασία της GATA6 υπογραμμίζεται από την παρατήρηση ότι η στοχευμένη απενεργοποίηση του

GATA6

γονίδιο στα ποντίκια προκαλεί πρώιμη εμβρυϊκή θνησιμότητα, ως αποτέλεσμα της έλλειψης διαφοροποίησης ενδοδέρματος [5] – [7].

Περιοδική αριθμού αντιγράφων κέρδος

GATA6

έχει πρόσφατα ταυτοποιηθεί σε αδενοκαρκινώματος παγκρεατικού πόρου κυτταρικές γραμμές (PDAC) και ξενομοσχεύματα [8], [9]. Ενώ ο ρόλος του στην PDAC καρκινογένεση είναι άγνωστη, αυξανόμενες αποδείξεις δείχνουν ότι GATA6 σχετίζεται με ογκογένεση σε μια ποικιλία τύπων ιστού [10] – [14]. Σε όγκους των ωοθηκών, έκτοπη έκφραση GATA6 συσχετίζεται με κυτταρικές αποδιαφοροποίηση [15] ενώ σε καρκίνο του παχέος εντέρου, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων επιρροές GATA6 και την απόπτωση επηρεάζοντας την έκφραση της 15-λιποξυγενάσης-1 που παίζει ένα ρόλο σε ρ53-εξαρτώμενη κυτταρική σύλληψης [16]. Η ανώμαλη έκφραση GATA6 του έχει επίσης εμπλακεί σε όγκους των επινεφριδίων ανθρώπινη καθώς και σε μία άλφα /SV40 Τ-αντιγόνου διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού που αναπτύσσεται φλοιού των όγκων σε ένα γοναδοτροπίνης τρόπο εξαρτώμενο [17], [18]. Αντίθετα,

GATA6

έχει ενοχοποιηθεί ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε αστροκυτώματα [14].

Αυτή η μελέτη επιδίωξε να διευκρινίσει τους μηχανισμούς με τους οποίους GATA6 συμβάλλει στην παγκρέατος καρκινογένεση. Δείχνουμε τώρα ότι

GATA6

ενίσχυση λαμβάνει χώρα κατά τα τελευταία στάδια της παγκρεατικής ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία, είναι συσχετίστηκε σημαντικά με αποτέλεσμα ασθενή, και προωθεί παγκρεατική καρκινογένεση ενεργοποιώντας το κανονικό μονοπάτι σηματοδότησης Wnt λόγω της άμεσης μεταγραφική καταστολή της εκκρινόμενης Wnt ανταγωνιστή Dickkopf-1.

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα δείγματα ανθρώπινου ιστού συλλέχθηκαν με την έγκριση του Διοικητικού κριτική Johns Hopkins Hospital Θεσμική (IRB πρωτόκολλα # NA_00036610 και NA_00001584) μετά από ενημέρωση και γραπτή συγκατάθεση. Για τα πειράματα σε ζώα, οι μελέτες διεξήχθησαν αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Πανεπιστημίου της Μινεσότα (ACUC πρωτόκολλο # MO09M84). Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Γραμμές κυττάρων και ιστών

Το A6L, A13A, καθιερώθηκαν κυτταρικές σειρές A10.7 και IMIM-PC2 στο δικό μας εργαστήρια. PK8 και PK9 ήταν από τον Δρ Akira Ηοπί (Πανεπιστήμιο Tohoko, Σεντάι, Ιαπωνία), και HCG-25 από το Δρ Tony Hollingsworth (Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Omaha NE). Όλες οι υπόλοιπες κυτταρικές σειρές καρκίνου του παγκρέατος χρησιμοποιείται ελήφθησαν από την ATCC (Manassas νΑ). Οι κανονικές επιθηλίου παγκρεατικού πόρου κυτταρικές γραμμές HPNE και HPDE παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Ο καρκίνος του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές HCT116 (

CTNNB1

μεταλλαγμένο), SW480 (

APC

μεταλλαγμένα) και RKO (

APC

και

CTNNB1

άγριου τύπου) ήταν που παρέχονται από τον Δρ Τζέιμς Eshleman (Johns Hopkins Ιατρικών Ιδρυμάτων, Baltimore MD ΗΠΑ). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη, 100 mg /ml στρεπτομυκίνη και 2 mmol /L Ε-γλουταμίνη στους 37 ° C και 5% CO

2.

δείγματα Ανθρωπίνων παγκρεατικού ιστού ελήφθησαν από το Χειρουργικό Τμήμα Παθολογίας του Πανεπιστημίου Johns Hopkins και ξενομοσχεύματα γενναιόδωρα από τον Dr. Scott Kern (Johns Hopkins Ιατρικών Ιδρυμάτων, Baltimore MD ΗΠΑ). Όλα τα δείγματα που συλλέχθηκαν με την έγκριση του Διοικητικού Συμβουλίου Institutional Review Johns Hopkins Hospital.

λεντοϊών μορφώματα

Η ανασυνδυασμένη φακοϊούς εκφράζουν GFP κατάντη μια παρωδία shRNA ή shRNA ειδικά για GATA6 δημιουργήθηκαν με χρήση τριών σύστημα ιού όπως περιγράφηκε προηγουμένως λεπτομερώς [20], [21]. αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίου για GATA6 knockdown ήταν sense, 5′-gatccgctgtcacaccacaactaccttcaagagaggtagttgtggtgtgacagctttttta-3 ‘? και αντι-νόημα, 5’-cgataaaaaagctgtcacaccacaactacctctcttgaaggtagttgtggtgtgacagcg-3 ‘. Μετά τη μόλυνση, ένα δείγμα από κάθε κυτταρική γραμμή (1 × 10

5) αναλύθηκε με FACS στην Εγκατάσταση Κυτταρομετρία Ροής πυρήνα για να επιβεβαιώσει την αποτελεσματικότητα της μεταγωγής (& gt? 95% σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν) με παρακολούθηση της έκφρασης GFP 60 ώρες μετά την μεταγωγή.

πλασμίδιο μορφώματα

Το ανθρώπινο φορέας GATA6 pcDNA3.1-GATA6 ήταν ένα δώρο από τον Δρ Κλήμης Ho (University of Pennsylvania, Philadelphia PA) και χρησιμοποιείται για να δημιουργήσει pcDNA3.1 -mGATA6 με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση (Invitrogen) στις οποίες διαγράφηκαν τα οκτώ πιο υψηλά συντηρημένες βάσεις του μοτίβου δακτύλου ψευδαργύρου [22], [23]. Ανθρώπινα φορέα έκφρασης pCMV-DKK1 DKK1 και ο DKK1 υποκινητή αναφοράς λουσιφεράσης pGL3-DKK1 ήταν τόσο γενναιόδωρα από τον Dr. Hirotaka Osada (Aichi Cancer Instititue, Ναγκόγια, Ιαπωνία). Σταθερές κυτταρικές γραμμές δημιουργήθηκαν ακόλουθες μεθόδους μας έχουν αναφερθεί προηγουμένως λεπτομερώς [8].

δοκιμασίες in vitro της αύξησης των κυττάρων

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση κυττάρων Μετρώντας Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies) ακολουθώντας το προτεινόμενο πρωτόκολλο. δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε σε ένα Becton Dickenson LSR Benchtop Κυτταρόμετρο Ροής (BD Biosciences, San Jose, CA). Ποσοστά των κυττάρων σε Ο0-G1, S, G2 και φάση προσδιορίσθηκαν με τη χρήση CellQuest (BD Biosciences).

Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ELISAs διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας mAb ποντικού αντι-ανθρώπινο DKK-1 αντίσωμα (κλώνος 141119) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (R &? D Systems, Inc., Minneapolis, ΜΝ, USA). Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Western Blotting

Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε 15% SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (DuPont ΝΕΝ, Boston, ΜΑ). Οι μεμβράνες υβριδοποιήθηκαν με αραίωση 1: 100 του πρωτογενούς αντισώματος (SS-κατενίνης mAb κλώνος ποντικού Ε-5 ή GATA6 pAb κλώνο κουνέλι H-92, Santa Cruz Biotechnology, CA) ακολουθούμενη από horseradish υπεροξειδάση (HRP) αντι-κουνελιού αιγός IgG και ορατές με το σύστημα ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) (Amersham). Η έκφραση του β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Ανοσοϊστοχημεία

Ανοσοεπισήμανση εκτελέσθηκε ακολουθώντας προηγουμένως αναφερθείσες μεθόδους πρότυπες μεθόδους [8] χρησιμοποιώντας μία αραίωση 1:100 κάθε πρωτογενούς αντισώματος για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Η εξειδίκευση των αντισωμάτων για GATA6 και DKK1 παρουσιάζεται από πλήρη οθόνη κηλίδωση Western στο σχήμα S1.

μικροσυστοιχίες γονιδιακής έκφρασης

Το συνολικό RNA απομονώθηκε με ένα κιτ RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) . Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε υβριδισμό σε Agilent Ανθρωπίνων 4 × 44K συστοιχίες (Santa Clara, CA) και τα ανεπεξέργαστα δεδομένα αναλύθηκαν ακόλουθα τυποποιημένα πρωτόκολλα στον μηχανισμό μικροσυστοιχιών πυρήνα στο Johns Hopkins. Όλα τα δεδομένα είναι MIAME συμβατό και τα πρωτογενή αρχεία έχουν κατατεθεί στη βάση δεδομένων MIAME συμβατό GEO (

αριθμό ένταξης

GSE27173).

ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου για την έκφραση mRNA

Ένα μικρογραμμάριο RNA ανά δείγμα μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας SuperScriptTMIII Platinum® Δύο Βήμα qRT-PCR Kit (Invitrogen). ανάλυση RT-qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας 7.300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) για την παρακολούθηση του πράσινου φθορισμού χρωστικής (SYBR®Green, Invitrogen Inc, CA, USA). Σχετική πολλαπλών μεταβολών της γονιδιακής έκφρασης σε σύγκριση με το γονίδιο οικοκυρική β-ακτίνης προσδιορίστηκαν με υπολογισμό του 2

ΔΔCt. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. (Οι Primer αλληλουχίες που παρέχονται στο S1 File).

GATA6 Copy Number Δοκιμασίες

Γονιδιωματικό αριθμό αντιγράφων DNA του GATA6 προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως λεπτομερώς [8]. αριθμοί Αντίγραφο & gt? 2,3 θεωρήθηκαν κέρδος αριθμού αντιγράφων να λογοδοτήσει για πολυσωμία του χρωμοσώματος 18q, και επειδή μέχρι 20-πλάσια υπερέκφραση GATA6 μπορεί να συμβεί σε PDACs με ακόμη αντίγραφο χαμηλό επίπεδο κέρδους αριθμού [8]

λουσιφεράσης. και TOPFLASH αναλύσεις

Για προσδιορισμούς TOPFLASH, pGL3-ΟΤ και pGL3-πλασμιδίων χρησιμοποιήθηκαν (ευγενώς από τον Dr. Bert Vogelstein). Σχετική Wnt δραστικότητα προσδιορίστηκε από την αναλογία της έκφρασης λουσιφεράσης από το pGL3-ΟΤ φορέα διαιρεμένο με εκείνη της pGL3-φορέα όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Για όλες τις άλλες δοκιμασίες λουσιφεράσης, ο φορέας ρΡΙ_-ΤΚ (Promega) που εκφράζουν λουσιφεράση θάλασσα πανσές χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Ο φορέας pcDNA3.1-κενού χρησιμοποιήθηκε για να προσαρμόσει το συνολικό ποσό των επιμολυσμένων DNA. Λουσιφεράσης δοκιμασίες διεξήχθησαν 40 ώρες μετά την επιμόλυνση χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας Dual-Luciferase Reporter-(Promega), και η δραστικότητα της λουσιφεράσης προσδιορίστηκε με την 1420 μετρητή multilabel (ζωή PerkinElmer και επιστήμη ανάλυση, CT, USA). Λουσιφεράσης πυγολαμπίδας δραστηριότητες ομαλοποιήθηκαν από τις δραστηριότητες της λουσιφεράσης θάλασσα πανσές. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Δοκιμασία χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (δοκιμασία CHIP)

δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια και πρωτόκολλα από την Upstate Biotechnology (Lake Placid, ΝΥ) χρησιμοποιώντας προηγουμένως περιγραφείσες μεθόδους [24 ]. Όλες οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν είχαν σχεδιαστεί για να στοχεύουν συγκεκριμένα μοτίβα πρόσδεσης GATA στο

DKK1

υποκινητή. (Αλληλουχίες Probe παρέχονται στο S1 File).

μετατόπισης κινητικότητας ηλεκτροφορητικής Δοκιμασία (EMSA)

δοκιμασίες EMSA πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση μεθόδων που περιγράφηκαν προηγουμένως [24]. Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα κανονικοποιήθηκαν για ολική πρωτεΐνη, και 5-10 mg πρωτεΐνης επωάστηκαν με τα

32Ρ-επισημασμένο υψηλής συγγένειας GATA6 ανιχνευτές ειδικούς για κάθε ένα από τα τέσσερα εν δυνάμει μοτίβα πρόσδεσης GATA εντός του

DKK1

υποκινητή . Μεταλλαγμένα ιχνηλάτες στους οποίους μεταλλάχθηκε ο δεσμευτικός αλληλουχία μοτίβο χρησιμοποιήθηκαν επίσης. Ένας ανιχνευτής GATA6-Ρ (5′-GCCAGCAGATAGCATGGAAAAG-3 ‘) που προέρχεται από

TFF2

προαγωγό που περιέχει μία θέση σύνδεσης GATA6 [25] χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος. σύμπλοκα πρωτεΐνης-ϋΝΑ διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου nondenaturating 5% και αναλύθηκε με αυτοραδιογραφία χρησιμοποιώντας φιλμ Kodak. (Αλληλουχίες Probe παρέχονται στο S1 File).

shRNA Mediated Knockdown

Καλλιεργημένα κύτταρα σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης (50% συρροή) μορφομετατράπηκαν με DKK1 shRNA (Dharmacon), CTNNB1 shRNA (CTNNB1- VHS50819, Invitrogen Inc, CA) ή ψευδο shRNA (# 4611, Ambion) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMAX (Invitrogen Inc, CA) ακολουθώντας την συνιστώμενη πρωτόκολλο. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών προσδιορισμοί RT-qPCR.

Φθορισμός ίη situ υβριδισμού (FISH)

FISH διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [8] με τη χρήση βακτηριακών κλώνων τεχνητού χρωμοσώματος CTD-2376C8 που περιέχουν τις γονιδιωματικές αλληλουχίες του αμπλικονίου 18q11.2 στο 0,11 Mb (Invitrogen, Carlsbad, CA).

ειδικούς μεθυλίωσης PCR

Promoter μεθυλίωση ήταν αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας εκκινητές και οι συνθήκες έχουν αναφερθεί στο παρελθόν από τον Suzuki et al. [26]

Στατιστική ανάλυση

οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με ένα ασύζευκτο

t-test για

παραμετρικές κατανομές, ή ένα Chi-τετράγωνο τεστ για τη σύγκριση των συχνοτήτων. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

GATA6 Αντιγραφή Αριθμός Κέρδος εμφανίζεται κατά τη διάρκεια του παγκρέατος ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία

Κανονική παγκρεατικού πόρου επιθηλίου πιστεύεται να προχωρήσει σε διείσδυση του καρκίνου μέσω μιας σειράς. μορφολογικά ορίζεται προδρόμων ονομάζεται παγκρεατικό ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (PanIN-1, 2, 3) [27]. Για να κατανοήσουμε τη σχέση μεταξύ των γενετικών κέρδος του

GATA6

και ανάπτυξη PDAC, αξιολογήσαμε

GATA6

αριθμού αντιγράφων σε μικροτομή δείγματα φυσιολογικού επιθηλίου του αγωγού, PanIN, και τα ανθρώπινα PDAC με ποσοτική PCR. Σε σχέση με το απλοειδές γονιδίωμα, δεν υπήρχε κέρδος

GATA6

σε φυσιολογικό επιθήλιο αγωγό (0 4), PanIN-1 (0 13) ή PanIN-2 (0 10) βλαβών. Αντιθέτως, η αυξημένη

GATA6

αριθμό αντιγράφων (≥2.3 αντίγραφα) ταυτοποιήθηκε σε 6/17 δείγματα (35%) του PanIN-3 και σε 18/55 δείγματα (33%) του PDAC (Σχήμα 1Α).

GATA6

αντίγραφο κέρδος αριθμό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με φθορίζοντα

in situ

υβριδισμού (FISH) σε τομές παραφίνης-embedded ενός PanIN-3 και 10 δείγματα PDAC (Εικόνα 1Β).

(Α)

GATA6

αριθμό αντιγράφων (μέση τιμή ± SE) σε μικροδιατομή κανονική αγωγούς (Ν = 4), PanIN-1 (Ν = 13), PanIN-2 (10), PanIN-3 (Ν = 17) βλάβες και καρκίνο του παγκρέατος (Ν = 55). (Β) Αντιπροσωπευτικά FISH του πυρήνα ενός νεοπλασματικού κυττάρου εντός μιας αλλοίωσης PanIN3 με & gt? 11-πλάσια

GATA6

ενίσχυση (δεξιά) σε σύγκριση με τον πυρήνα ενός νεοπλαστικού κυττάρου από ένα διαφορετικό βλάβη PanIN3 χωρίς κέρδος αριθμού αντιγράφων του

GATA6

(αριστερά). ανιχνευτής GATA6 σημάνθηκε με κόκκινο και χρωμόσωμα ανιχνευτή 18 κεντρομεριδίου (18 Cent) σημάνθηκε με πράσινο. Τα τμήματα βάφτηκαν αντίθετα με DAPI να τονίσει πυρήνες. (C) Συσχέτιση της έκφρασης GATA6 mRNA και τον αριθμό αντιτύπου σε μικροτομή δείγματα της κανονικής, PanIN και καρκινικό ιστό. (D) GATA6 ανοσοσήμανση των δύο παγκρεατικών καρκινικών ιστών με την αύξηση του αριθμού αντιγράφων GATA6 σε σύγκριση με δύο καρκίνους χωρίς κέρδος αριθμού αντιγράφων. Αυξημένος αριθμός αντιγράφων είναι πολύ συνδέεται με την πυρηνική επισήμανση της πρωτεΐνης GATA6. καμπύλη επιβίωσης (Ε) Kaplan Meier που απεικονίζει τη σχέση του

GATA6

αντιγράψετε κέρδος αριθμό (≥2.3 αντίγραφα ανά απλοειδές γονιδίωμα) με τη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με χειρουργικά καρκίνο του παγκρέατος.

Η

Για έξι ασθενείς αντιστοιχισμένη PanIN-3 και PDAC ήταν μικροτομή από το ίδιο τμήμα του ιστού και αναλύθηκαν για

GATA6

αντιγράψετε τον αριθμό,

KRAS

και

TP53

κατάστασης του γονιδίου (Πίνακας 1) . Σε δύο ασθενείς (ασθενείς με 7 και 53)

GATA6

αντίγραφο κέρδος αριθμό βρέθηκε τόσο στα δείγματα PanIN-3 και PDAC δείχνει ότι προέκυψαν πριν από την ανάπτυξη της διηθητικό καρκίνωμα, ενώ σε ένα τρίτο ασθενή (ασθενής 53)

GATA6

αντιγράψετε κέρδος αριθμός ήταν παρούσα μόνο στο δείγμα PDAC γεγονός που υποδηλώνει ότι προέκυψε κατά τη διάρκεια της χρονικής εξέλιξης σε PDAC. Ωστόσο, ως ένα ενιαίο PanIN-3 αναλύθηκε σε αυτόν τον ασθενή, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι οι πρόσθετες και δεν έχουν δοκιμαστεί PanIN-3 βλάβες στο πάγκρεας αυτού του ασθενούς περιείχε επίσης αύξηση του αριθμού αντιγράφων. Για να επιβεβαιωθεί ότι αυξάνει σε

GATA6

αριθμού αντιγράφων αποτέλεσμα σε αυξημένη γονιδιακή έκφραση, μπορούμε ποσοτικοποιηθεί επίπεδα GATA6 mRNA σε αυτούς τους ίδιους μικροδιατομή δείγματα (Σχήμα 1 C), υποδεικνύοντας ότι τα σχετικά επίπεδα του mRNA GATA6 ήταν σημαντικά μεγαλύτερες σε δείγματα με

GATA6

αντιγράψετε αριθμούς ≥2.3 σε σύγκριση με εκείνους με τους αριθμούς αντιγράφων & lt? 2.3 (461,9 ± 126,2 και 194,1 ± 69,7, p & lt? 0,0004). Ομοίως, ανοσοϊστοχημικής για GATA6 σε πέντε καρκίνους του παγκρέατος με την αύξηση του αριθμού αντιγράφων έδειξε ισχυρή θετική πυρηνική επισήμανση ενώ δεν επισήμανση παρατηρήθηκε σε πέντε καρκίνους του παγκρέατος με αριθμούς αντιγράφων & lt?. 2.3 (Σχήμα 1D)

Η

παγκρέατος καρκινογένεση είναι συνοδεύεται από τη συσσώρευση των γενετικών αλλοιώσεων στο

KRAS, CDKN2A, TP53

και

Smad4

γονίδια [27]. Ως εκ τούτου, καθορίζεται η σχέση του

GATA6

αντιγράψετε κέρδος αριθμό με τη γενετική κατάσταση αυτών των τεσσάρων γονιδίων στο εμπλουτισμένο PDACs 56 ξενομόσχευμα. Δεκαεπτά ξενομοσχεύματα (30%) είχαν μια

GATA6

αντιγράψετε αριθμό ≥2.3 σε σχέση με το απλοειδή γονιδιώματος, εκ των οποίων έξι (11%) είχαν αριθμό αντιγράφων & gt? 5.0. Ωστόσο, δεν υπήρχε συσχέτιση των

KRAS, CDKN2A, TP53

ή

Smad4

κατάσταση με

GATA6

αριθμό αντιγράφων. Επειδή

GATA6

βρίσκεται επίσης στον ίδιο βραχίονα του χρωμοσώματος όπως

Smad4

ότι συχνά στόχο ομόζυγη διαγραφή [28], μπορούμε επόμενο αναρωτήθηκε αν

GATA6

αντιγράψετε κέρδος αριθμός είναι που σχετίζονται ειδικά με γονιδιωματικά γεγονότα αναδιάταξη που μπορεί να οδηγήσει σε ομόζυγη διαγραφή του

Smad4

στην ίδια ξενομοσχεύματος DNA. Ωστόσο, αυτό και πάλι δεν αποκάλυψε σύνδεσης, με έξι από τα οκτώ

Smad4

μεταλλάξεις που συμβαίνουν οφείλονται σε ομόζυγη διαγραφή σε ξενομοσχεύματα με αυξημένη

GATA6

αριθμού αντιγράφων έναντι 13 των 21 με ομόζυγη διαγραφή στο ξενομοσχευμάτων χωρίς να

GATA6

αντιγράψετε κέρδους αριθμού (p = 0,2844). Στο σύνολό τους, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι

GATA6

αντιγράψετε numbe≥r κέρδος εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της τελευταία στάδια της παγκρεατικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας, αλλά δεν είναι εμπλουτισμένη ειδικά για μέσα σε καρκινώματα με μεταβολές αυτών των τεσσάρων γονιδίων.

επόμενο καθορίζεται ο βαθμός στον οποίο

GATA6

αντιγράψετε κέρδος αριθμός σχετίζεται με κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά εκτομή PDAC. Δεν σχέσεις αποτελέσματα για

GATA6

και την ηλικία, το φύλο, το μέγεθος του όγκου, η διαφοροποίηση του όγκου, εντόπιση όγκου ή την κατάσταση των λεμφαδένων. Ωστόσο, οι ασθενείς με αριθμό αντιγράφων ≥2.3 είχαν μεγαλύτερη συνολική επιβίωση συγκριτικά με τους ασθενείς χωρίς αύξηση του αριθμού αντιγράφων από εκτίμηση επιβίωσης Kaplan Meier (p = 0,0096, Σχήμα 1Ε).

GATA6 προωθεί την ανάπτυξη των κυττάρων

In Vitro

και

In Vivo

Η

ενίσχυση και υπερέκφραση του

GATA6

στην PanIN και PDAC δείχνει ότι συμβάλλει στην PDAC βιολογία [8], [9]. Ως εκ τούτου, κατασκευάστηκαν φορείς λεντοϊών που εκφράζουν είτε ένα ομοίωμα ή GATA6 συγκεκριμένες shRNA και τους χρησιμοποιούνται για να μολύνουν σταθερά τις κυτταρικές γραμμές PDAC AsPC1 και A13A με αριθμούς αντιγράφου του 2.3 και 9.0 σε σχέση με το απλοειδές γονιδίωμα, αντιστοίχως [8], [9]. Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, GATA6 επίσης υπερεκφράζεται τουλάχιστον 10 φορές σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα του αγωγού [8], [9] (Σχήμα S2). Εξόντωση GATA6 στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Α, 2Β) οδήγησε σε σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών (Σχήμα 2C και D), τη μείωση των κυττάρων μέσα φάση G2 /M (σχήμα 2Ε) και μειωμένη ανάπτυξη in vivo (Σχήμα 2F και 2G). Αντιστρόφως, η αναγκαστική υπερέκφραση του GATA6 στο PDAC κυτταρική γραμμή PANC1 με χαμηλά επίπεδα ενδογενούς έκφρασης GATA6 [8] (Σχήμα 3Α και Σχήμα S2) οδήγησε σε αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών (Σχήμα 3Β και 3C) παρόμοια με αυτή που δείχνεται επίσης στο παρελθόν για η κυτταρική γραμμή MIAPaCa2 που δεν έχει ενδογενή έκφραση του GATA6 [8].

(Α) η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται από τα κύτταρα και ψευδο ελέγχους shRNA AsPC1-GATA6sh και A13A-GATA6sh και αναλύθηκαν με κηλίδα Western για σχετικών επιπέδων πρωτεΐνης GATA6 σχέση με ακτίνη. (Β) σε πραγματικό χρόνο PCR για την έκφραση GATA6 σε AsPC1-GATA6sh και τα κύτταρα A13A-GATA6sh. (C) Τα κύτταρα αναλύθηκαν επίσης για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε διάφορα χρονικά σημεία, (D) καλλιεργήθηκαν σε μαλακό άγαρ και ο αριθμός των αποικιών στις 2 εβδομάδες μετρήθηκαν, και (Ε) αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για να προσδιοριστεί το ποσοστό των κυττάρων σε G2 /Μ φάση. (F) σχηματισμός Αντιπροσωπευτικά ξενομοσχεύματος

in vivo

(παραπάνω) και μετά την εκφύτευση (κατώτερο) του ελέγχου AsPC1 και κυττάρων GATA6sh στις 8 εβδομάδες μετά την ένεση. (G) Μέσος όγκος του όγκου (μέσος όρος ± SE) από αυτές τις ίδιες ξενομοσχευμάτων στις 8 εβδομάδες μετά την ένεση. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για τα κύτταρα A13A-GATA6sh (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Με εξαίρεση την κυτταρομετρία ροής που εκτελέστηκε εις διπλούν, όλες οι πειραματικά δεδομένα που εμφανίζονται αντιπροσωπεύουν την περίληψη τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *, P & lt? 0,05? **, P & lt? 0,01? *** P & lt?. 0.001

Η

(Α) σε πραγματικό χρόνο PCR για την έκφραση GATA6 σε PANC1-παρωδία, PANC1-GATA6 και τα κύτταρα PANC1-mGATA6. (Β) PANC1-mock, PANC1-GATA6 και PANC1-mGATA6 κύτταρα είτε αναλύθηκαν για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή (Γ) καλλιεργήθηκαν σε μαλακό άγαρ και ο αριθμός των αποικιών στις 2 εβδομάδες μετρήθηκαν. (D) Αντιπροσωπευτική σχηματισμός ξενομοσχεύματος

in vivo

(παραπάνω) και μετά την εκφύτευση (κατώτερο) του PANC1-mock, PANC1-GATA6 και κυττάρων PANC1-mGATA6 στις 8 εβδομάδες μετά την ένεση. (Ε) Μέσος όγκος του όγκου (μέσος όρος ± SE) από αυτές τις ίδιες ξενομοσχευμάτων στις 8 εβδομάδες μετά την ένεση. Όλα τα πειραματικά δεδομένα που εμφανίζονται αντιπροσωπεύουν την περίληψη τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *, P & lt? 0,05? **, P & lt? 0,01? *** P & lt?. 0.001

Η

GATA6 ρυθμίζει την μεταγραφή του DNA μέσω σύνδεσης με κανονική μοτίβα GATA, ή ως μεταγραφικός συμπαράγοντας [2], [29]. Για να προσδιοριστεί εάν οι επιδράσεις στα κύτταρα PANC1 οφείλονταν σε δραστικότητα σύνδεσης GATA6 DNA, χρησιμοποιήσαμε τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση για να δημιουργήσει ένα μεταλλαγμένο cDNA στο οποίο διακόπηκε η περιοχή δακτύλου GATA6 Ζη (που ονομάζεται mGATA6), και πάλι σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα PANC1 (Σχήμα 3Α ). Δεν υπήρχε διαφορά στην ανάπτυξη των κυττάρων ή τον σχηματισμό αποικιών μεταξύ των κυττάρων PANC1-mGATA6 και τα κύτταρα ελέγχου PANC1 επιμολυσμένα (Σχήμα 3Β και 3C), υποδεικνύοντας ότι η ανάπτυξη αποτελέσματα προαγωγής της GATA6 παρατηρήθηκαν

in vitro

οφείλονται στην λειτουργία του ως ένας παράγοντας μεταγραφής. Για να διευκρινίσει περαιτέρω την αυξητική επίδραση της GATA6, άτριχων ποντικών εμβολιάστηκαν υποδορίως με PANC1-GATA6 ή κύτταρα PANC1-mGATA6. Μετά από 8 εβδομάδες, ο μέσος όγκος του όγκου ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα PANC1-GATA6 ό, τι με κύτταρα PANC1-mGATA6 (Σχήμα 3D και 3Ε), οδηγώντας μας να συμπεράνουμε ότι GATA6 προάγει την καρκινογένεση μέσω της ικανότητάς του να δεσμεύει DNA.

το Wnt ανταγωνιστής Dickkopf1 (DKK1) είναι ένα GATA6 γονιδίου στόχου

GATA πρωτεΐνες που συνδέονται με σηματοδότηση Wnt στην εμβρυογένεση της καρδιάς και των πνευμόνων [4], [30], [31]. Ως εκ τούτου υποθέσαμε ότι GATA6 συμβάλλει στην καρκινογένεση του παγκρέατος εν μέρει μέσω επιπτώσεις του στην σηματοδότηση Wnt, μια υποθετική σχέση που δεν έχει διερευνηθεί σε οποιαδήποτε λεπτομέρεια για αυτόν τον τύπο όγκου. Σε σύγκριση με mock κύτταρα λεντοϊού μολυσμένα shRNA, αμφότερα τα κύτταρα AsPC1-GATA6sh και A13A-GATA6sh έδειξε σημαντική μείωση στην λειτουργική δραστηριότητα σηματοδότηση Wnt με δοκιμασία TOPFLASH (Σχήμα 4Α), ενώ η υπερέκφραση της GATA6 σε PANC1 και κυττάρων HPNE προωθείται Wnt δραστικότητα σηματοδότησης (Σχήμα 4Β ). Για να καθοριστεί εάν η έκφραση της β-κατενίνης απαιτείται για αυτά τα αποτελέσματα μπορούμε σιγήσει έκφραση β-κατενίνης χρησιμοποιώντας μια στρατηγική shRNA σε κύτταρα PANC1-GATA6, που οδηγεί σε σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών (Εικόνα 4C και 4D). Σε παγκρέατος καρκινικούς ιστούς, GATA6 υπερέκφραση συσχετίστηκε σημαντικά με πυρηνική συσσώρευση της πρωτεΐνης β-κατενίνης (8/12 PDACs με GATA6 υπερέκφραση δείχνει β-κατενίνης πυρηνική συσσώρευση έναντι 3/20 χωρίς GATA6 υπερέκφραση, p = 0,004) (Εικόνα 4Ε). Έτσι, η υπερέκφραση GATA6 σε PDAC συμβάλλει στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και το σχηματισμό αποικιών από την ενίσχυση κανονική σηματοδότηση Wnt.

(Α) Wnt δραστηριότητα σηματοδότησης σε κύτταρα που βασίζονται σε δοκιμασία TOPFLASH AsPC1-GATA6sh και A13A-GATA6sh. Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης παριστάνεται ως ο λόγος του ΟΤ για ΤΩΝ επίπεδα σε κύτταρα με GATA6 knockdown σε σχέση με εκείνο του ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα. (Β) Wnt δραστηριότητα σηματοδότησης σε PANC1-GATA6 και HPNE-GATA6 κύτταρα προσδιορίζεται με δοκιμασία TOPFLASH. Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης παριστάνεται ως ο λόγος του ΟΤ για ΤΩΝ επίπεδα σε GATA6 επιμολυσμένα κύτταρα σε σχέση με εκείνη των ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα. (C και D) κύτταρα PANC1-GATA6 επιμολύνθηκαν παροδικά με β-κατενίνη ή ψευδο shRNA και (Γ) τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή του σχηματισμού (D) αποικία προσδιορίστηκε. Όλα τα πειραματικά δεδομένα που εμφανίζονται αντιπροσωπεύουν την περίληψη τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *, P & lt? 0,05? **, P & lt? 0,01. (Ε) ανοσοσήμανση προτύπων GATA6 και της πρωτεΐνης β-κατενίνης σε δύο αντιπροσωπευτικά PDAC ιστούς. Τα βέλη υποδεικνύουν την πυρηνική επισήμανση τόσο της GATA6 και SS-κατενίνης σε σειριακές τομές από τον ίδιο ιστό καρκίνου. Αντιθέτως, το δείγμα PDAC με χαμηλή έκφραση GATA6 δείχνει επίσης καθόλου έκφραση των β-κατενίνης.

Η

GATA6 ρυθμίζει γονιδίων στόχων του μέσω σύνδεσης προς το μοτίβο GATA-δέσμευσης [2]. Για τον εντοπισμό γονιδίων στόχων GATA6 που μπορεί να επηρεάσουν σηματοδότηση Wnt, πραγματοποιήσαμε γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιώντας AsPC1-GATA6sh και A13A-GATA6sh και κοροϊδεύει τους ελέγχους τους και εντόπισε 113 συχνά απορυθμίζεται γονίδια (Σχήμα 5Α και στον Πίνακα S1) ένας εκ των οποίων ήταν Dickkopf-1 (

DKK1

), ένας ανταγωνιστής του κανονικού σηματοδότηση Wnt [32]. Wnt11, ένα γονίδιο γνωστό στόχο GATA6 [30], επίσης εντοπιστεί γεγονός που υποδηλώνει ότι GATA6 συμβάλλει στην Wnt ρύθμιση μονοπάτι εν μέρει μέσω της ρύθμισης των γονιδίων αυτών. Επειδή DKK1 δεν έχει προηγουμένως αναγνωριστεί ως

GATA6

γονίδιο στόχο επικεντρωθήκαμε ειδικά για τη σχέση της GATA6 να DKK1.

(Α) διάγραμμα Venn δείχνει τον αριθμό των απορυθμισμένη γονίδια που προσδιορίζονται από την ανάλυση μικροσυστοιχιών της AsPC1-GATA6sh (αριστερά κύκλος, μπλε) και τα κύτταρα A13A-GATA6sh (δεξιά κύκλο, κίτρινο). Το πράσινο σταυρό-περιοχή υποδηλώνει συνήθως δυσρυθμισμένη γονιδίων και περιλαμβάνει DKK1. (Β) σε πραγματικό χρόνο PCR επιβεβαιώνοντας DKK1 υπερέκφραση σε AsPC1-GATA6sh και τα κύτταρα A13A-GATA6sh. (Γ) Η ανίχνευση της εκκρινόμενης πρωτεΐνης DKK1 σε ρυθμισμένα μέσα στο AsPC1-GATA6sh και τα κύτταρα A13A-GATA6sh. εκκρίνονται επίπεδα πρωτεΐνης DKK1 υποδεικνύεται από τη χρήση OD450 απορρόφησης. (D) δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης που επιβεβαιώνει τη δέσμευση της GATA6 στο

DKK1

υποκινητή. Μη-άνοσο IgG και ολόκληρο το γονιδίωμα προέρχεται gDNA χρησιμοποιούνται ως αρνητικοί και θετικοί μάρτυρες αντίστοιχα. δοκιμασία (Ε) EMSA που επιβεβαιώνει τη δέσμευση της GATA6 σε υποθετικές θέσεις πρόσδεσης GATA # 2 και # 3. Η μεταλλαγμένη αλληλουχία mGATA- # 3 δεν δημιουργούν καμία ανιχνεύσιμη δεσμευτική. Πυρηνική Extr, πυρηνικό εκχύλισμα? GATA6-P, ένας θετικός ανιχνευτής ελέγχου που προέρχονται από το

TFF2

υποκινητή που περιέχει μια θέση σύνδεσης GATA6? GATA- # 2, ανιχνευτής που περιέχει υποτιθέμενη GATA θέση πρόσδεσης Νο 2? GATA- # 3, ανιχνευτής που περιέχει υποτιθέμενη GATA θέση πρόσδεσης Νο 3? mGATA- # 3, ιχνηλάτης περιέχει μία μεταλλαγμένη υποθετική θέση δέσμευσης GATA Νο 3? αναφέρονται σε μεθόδους για περισσότερες λεπτομέρειες (F) Επίδραση της έκφρασης GATA6 σχετικά με τη δραστηριότητα του

DKK1

υποκινητή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η αναλογία της δραστικότητας λουσιφεράσης πυγολαμπίδας με τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης θάλασσα πανσές. pGL3 χρησιμοποιήθηκε ως ένας αρνητικός έλεγχος για το φόντο. (G) σε πραγματικό χρόνο PCR για έκφραση DKK1 mRNA σε κύτταρα PANC1. Όταν κρίνεται σκόπιμο, όλα τα πειραματικά δεδομένα που εμφανίζονται αντιπροσωπεύουν την περίληψη τρία ανεξάρτητα πειράματα. *, P & lt? 0,05? *** P & lt?. 0.001

Η

Σε πραγματικό χρόνο PCR επιβεβαίωσε DKK1 mRNA ρύθμιση προς τα πάνω και την αυξημένη έκκριση της DKK1 πρωτεΐνης σε κύτταρο μέσα μαζικής ενημέρωσης και στις δύο κυτταρικές σειρές με την παρουσία του GATA6 νοκ ντάουν (Σχήματα 5Β και 5Γ) . Για να προσδιοριστεί εάν

DKK1

αποτελεί άμεσο στόχο GATA6, ψάξαμε το

DKK1

προαγωγός για αλληλουχίες σύνδεσης GATA6 συναίνεση. Τέσσερις ανεξάρτητες μοτίβα GATA δέσμευσης ταυτοποιήθηκαν (Σχήμα S3), και με χρωματίνη δοκιμασία ανοσοκαταβύθισης άμεσης δέσμευσης GATA6 σε αυτά τα μοτίβα στο εσωτερικό της

DKK1

υποκινητή καταδείχθηκε (Εικόνα 5D). Η σύνδεση με GATA6 επιβεβαιώθηκε επίσης με δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (Σχήμα 5Ε και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Χρησιμοποιήσαμε δίπλα σε έναν δημοσιογράφο λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο του

DKK1

υποκινητή για να καθορίσει εάν GATA6 σύνδεση με

DKK1

επιπτώσεις επί της μεταγραφικής δραστηριότητας από το γονίδιο. Αυτή η δημοσιογράφος ενεργοποιήθηκε στις δύο κύτταρα 293Τ και PANC1 αντανακλώντας ενδογενή ενεργοποίηση της έκφρασης DKK1. Ωστόσο, κατά την ανάγκασε την έκφραση GATA6 (Εικ. 5F) δραστηριότητα λουσιφεράσης μειώθηκε σημαντικά, ενώ καμία επίδραση στο

DKK1

δράση προαγωγού παρατηρήθηκε στην παρουσία της δεσμευτικής μεταλλαγμένο μοτίβο (mGATA6) GATA6, υποδεικνύοντας ότι οι κατασταλτικές επιδράσεις της GATA6 στο

DKK1

απαιτεί την άμεση σύνδεση του GATA6 στο

DKK1

υποκινητή. Εξαναγκασμένη έκφραση του άγριου τύπου αλλά όχι mGATA6 πρωτεΐνης σε PANC1 οδήγησε επίσης σε σημαντικές μειώσεις στα επίπεδα DKK1 mRNA (Σχήμα 5G). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι GATA6 ρυθμίζει αρνητικά DKK1 μεταγραφή μέσω της άμεσης σύνδεσης με το μοτίβο GATA στο

DKK1

περιοχή του υποκινητή.

DKK1 Έκφραση σε PDAC συσχετίζεται με Wnt Ενεργοποίηση

τα μέλη της οικογένειας DKK (DKK1, DKK2, DKK3 και DKK4) που εκκρίνονται πρωτεΐνες που αναστέλλουν κανονική σηματοδότηση Wnt μέσω σύνδεσης με μία υπομονάδα του υποδοχέα Wnt συγκρότημα LRP5 /6 [32]. Real-time PCR έδειξε ότι DKK1 ήταν το μόνο μέλος της οικογένειας DKK που εκφράζονται τόσο σε κανονικές κυτταρικές γραμμές αγωγού και στην πλειονότητα των κυτταρικών γραμμών PDAC αναλύθηκαν (Σχήμα S4A). 0,01?