Αφηρημένο

Ιστορικό

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) έχει τα τρίτα υψηλότερα ποσοστά θνησιμότητας μεταξύ του πληθυσμού των ΗΠΑ. Σύμφωνα με την πιο πρόσφατη έννοια της καρκινογένεσης, οι ανθρώπινοι όγκοι οργανώνονται ιεραρχικά, και η κορυφή του καταλαμβάνεται από κακοήθη βλαστικά κύτταρα (καρκινικά βλαστικά κύτταρα, ΚΕΠ, ή καρκινικά κύτταρα κίνηση, CICs), οι οποίες διαθέτουν απεριόριστη αυτο-ανανέωσης και του όγκου -initiating ικανότητες και μεγάλη αντοχή στις συμβατικές θεραπείες. Να αντανακλά την πολυπλοκότητα και την ποικιλομορφία των ανθρώπινων όγκων και να παρέχει κλινικά και φυσιολογικά σχετικές μοντέλα καρκίνου, οι μεγάλες τράπεζες χαρακτηρισμένων κυτταρικών σειρών με χαμηλό πέρασμα των ασθενών που προέρχονται, και ιδιαίτερα CIC εμπλουτισμένο κυτταρικές σειρές, χρειάζονται επειγόντως.

κύρια Ευρήματα

Εδώ αναφέρουμε τη δημιουργία ενός νέου CIC-εμπλουτισμένη, ιδιαίτερα ογκογόνο και κλωνογονικού κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου, CR4, που προέρχονται από μετάσταση στο ήπαρ. Αυτή η σταθερή κυτταρική γραμμή δημιουργήθηκε με συνδυασμό 3D καλλιέργεια και 2D καλλιέργεια σε μέσα βλαστικών κυττάρων, υποκλωνοποίηση των κυττάρων με ιδιαίτερη μορφολογία, συν-καλλιέργεια με ινοβλάστες που σχετίζεται με καρκίνωμα (CAFS) και σειριακές μεταμόσχευση σε NOD /SCID ποντίκια. Χρησιμοποιώντας ΚΝΑ-Seq πλήρης μεταγραφικό προφίλ του ογκογόνο κλάσμα των κυττάρων CR4 σε σύγκριση με τα κύτταρα του όγκου χύμα, έχουμε εντοπίσει περίπου 360 διαφορικά εκφραζόμενα μετάγραφα, πολλά από τα οποία αντιπροσωπεύουν βλαστική ικανότητα, pluripotency και αντίσταση στη θεραπεία. Πλειοψηφία των καθιερωμένων κυττάρων CR4 εκφράζουν την κοινή δείκτες βλαστική ικανότητα, συμπεριλαμβανομένης της CD133, CD44, CD166, EpCAM, CD24 και Lgr5. Χρησιμοποιώντας ανοσοκυτταροχημικές, FACS και αναλύσεις στυπωμάτων western, έχουμε δείξει ότι μία σημαντική αναλογία των κυττάρων CR4 εκφράζουν κλειδί δείκτες δεικτών πλειοδυναμίας, συμπεριλαμβανομένων Sox-2, Oct3 /4 και c-Myc. Συστατική υπερενεργοποίηση των μεταφορέων ABC και NF-kB και απουσία καταστολείς των όγκων p53 και p21 μπορεί να εξηγήσει εν μέρει εξαιρετική αντοχή στα φάρμακα των κυττάρων CR4.

Συμπεράσματα

Η εξαιρετικά ογκογόνο και κλωνογονικού CIC εμπλουτισμένο CR4 κυτταρική σειρά μπορεί να παρέχει ένα σημαντικό νέο εργαλείο για τη στήριξη της ανακάλυψης νέων διαγνωστικών ή /και προγνωστικούς βιοδείκτες, καθώς και την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών στρατηγικών

Παράθεση:. Rowehl RA, Burke S, Bialkowska AB, Pettet DW III, Rowehl L, Li Ε, et al. (2014) Ίδρυση πολύ ογκογόνων Γραμμή Κυττάρων του Ανθρώπου καρκίνου του παχέος εντέρου (CR4) με Ιδιότητες του Καρκίνου Υποθετικά βλαστικών κυττάρων. PLoS ONE 9 (6): e99091. doi: 10.1371 /journal.pone.0099091

Επιμέλεια: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10, Ιανουαρίου του 2014? Αποδεκτές: 10η Μάη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Rowehl et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από Fusion επιχορήγηση TRO (PI Δρ Botchkina? 1104347-5-37298), SBU Κέντρο Καρκίνου και SBU Αντιπρόεδρος για την Έρευνα (RSR 1111963-3-63845). Σύμφωνα με τους όρους TRO Fusion, το Τμήμα Παθολογίας, το Ερευνητικό Ινστιτούτο Χημικής Βιολογίας & amp? Drug Discovery (ICB & amp? DD) και το Ίδρυμα Simons έχουν επίσης εν μέρει συνέβαλαν σε αυτή τη μελέτη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου έχει το τρίτο υψηλότερο ποσοστό επίπτωσης και της θνησιμότητας μεταξύ του πληθυσμού των ΗΠΑ [1]. Η σημερινή έλλειψη θεραπευτικής χημειοθεραπείες και το υψηλότερο ποσοστό εγκατάλειψης των σπουδών των αντικαρκινικών φαρμάκων σε σύγκριση με άλλες ασθένειες (μόνο το 5% των παραγόντων που έχουν αντικαρκινική δράση σε προκλινικές ανάπτυξη είναι άδεια? [2]) να δημιουργήσει μια επείγουσα ανάγκη για πιο φυσιολογικά και κλινικά σχετικές πηγές καρκινικά κύτταρα, καθώς και για την πιο σχετική

in vitro

και

in vivo

μοντέλα. Παραδοσιακά έρευνα για τον καρκίνο και προκλινική αξιολόγηση των αντικαρκινικών παραγόντων υποψηφίου βασίζονται στη χρήση των μη επιλεγμένων μακροπρόθεσμη, υψηλής διόδου καθιερωμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου αναπτύχθηκαν ως μονοστιβάδα καλλιέργειες. Ωστόσο, η μακροπρόθεσμη

in vitro

συντήρηση οδηγεί αναπόφευκτα στη συσσώρευση επιπλέον γονιδιωματικές και Γενετικής αλλαγές, καθώς και η επιλογή των κυρίαρχων υποπληθυσμών κυττάρων. Πράγματι, πρόσφατα αποδείχθηκε ότι οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενη εγκατεστημένος καρκινικές κυτταρικές σειρές δεν έχουν καμία συσχέτιση με την αρχική κλινικά δείγματα [3]. Αυτό υποδηλώνει ότι η χρήση των καθιερωμένων κυτταρικών σειρών για τη μελέτη των γονιδιωματικών μεταβολών, ανακάλυψη κλινικά σχετικές μοριακών στόχων, και την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων είναι αμφισβητήσιμη, δεδομένου ότι η χρήση αυτών των κυτταρικών γραμμών δεν αντιπροσωπεύουν την πολυπλοκότητα και την παθοφυσιολογία του

σε vivo

όγκων.

είναι ευρέως αποδεκτό σήμερα ότι οι ανθρώπινοι όγκοι οργανώνονται ιεραρχικά, και η κορυφή της ιεραρχίας αυτής καταλαμβάνεται από κακοήθη βλαστικά κύτταρα, τα οποία έχουν απεριόριστη αυτο-ανανέωσης και ικανότητες ογκογενή. Σύμφωνα με την πιο πρόσφατη έννοια της καρκινογένεσης, η οποία έφερε επανάσταση στην κατανόηση της ογκογένεσης και της θεραπείας του καρκίνου, μόνο συγκεκριμένα υποπληθυσμός φαινοτυπική (ες) των καρκινικών βλαστοκυττάρων (CICs) ή κύτταρα καρκίνου κίνηση (CICs) είναι υπεύθυνες για την ανάπτυξη του όγκου, την παραγωγή του ολόκληρο το φάσμα των διαφοροποιημένων απογόνων που συνθέτουν μια μάζα όγκου, μετάσταση, και την αντίσταση σε αντικαρκινικές θεραπείες [4] – [6]. Τέτοια κύτταρα απομονώθηκαν πρόσφατα από δεκάδες ανθρώπινους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του παχέος [7] – [9]. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι οι ειδικές φαινότυποι των βλαστικών-όπως ογκογενή καρκινικά κύτταρα είναι πολύ ανθεκτικά σε φάρμακα και είναι ικανές να αυτο-ανανέωση, μετά πρότυπο θεραπευτικών παρεμβάσεων [10] – [17]. Όλα τα ανωτέρω τονίζουν τον καίριο ρόλο της CICs στην ανακάλυψη των κλινικά σχετικών μοριακών στόχων και την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων.

Η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός των CICs ασθενή που προέρχεται, η ανάπτυξη της βέλτιστης

in vivo

και

in vitro

προκλινικά μοντέλα, και CIC ​​στοχευμένες αναλύσεις που προκαλείται από φάρμακα μεταβολές αντιπροσωπεύουν κρίσιμα βήματα στην αξιολόγηση των νέων αντικαρκινικών θεραπειών. Είναι προφανές επίσης ότι προκειμένου να διατηρηθεί η κατάλληλη πιστότητα στην αρχική όγκους, τα καρκινικά κύτταρα κίνηση (CICs), καθώς και άλλους τύπους κυττάρων που χρησιμοποιούνται για γονιδιωματική και πρωτεομική προφίλ, θα πρέπει να απομονωθεί από ένα μεγάλο φάσμα των πρωτογενών και μεταστατικών όγκων και όχι από τις καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Ωστόσο, είναι εξαιρετικά δύσκολο να καθοριστεί πρωτογενείς κυτταρικές γραμμές και ιδιαίτερα γραμμές CIC από νωπά δείγματα όγκου [18]. Πρώτον, υπάρχουν αντικειμενικές δυσκολίες στην απομόνωση καθαρών κυτταρικών πληθυσμών από ετερογενείς ιστούς όγκων. Tumor ακαθαρσία (διαφορετικά επίπεδα μόλυνσης κυττάρων μη-όγκου) και multiclonality είναι καλά τεκμηριωμένα προβλήματα [19], [20]. Στο μοριακό επίπεδο, δεν υπάρχουν σήμερα οριστικά δείκτες για να αποδείξει την κακοήθη ή κακοήθη φύση των κυττάρων, καθώς και για την ακρίβεια γίνεται διάκριση μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών βλαστικών κυττάρων. Καλλιέργεια στοιχεία δείχνουν επίσης ότι CICs μπορεί να αντιπροσωπεύουν μια ετερογενή υποπληθυσμό των ογκογενή κύτταρα [21] – [25]. Παρ ‘όλα αυτά, ένας συνδυασμός πολλαπλές προσεγγίσεις και πολλαπλούς δείκτες κυτταρικής επιφάνειας που ακολουθείται από μια λεπτομερή λειτουργικό χαρακτηρισμό των απομονωμένων φαινοτύπων κυττάρου μπορεί να επιτρέψει τον καθαρισμό της πλέον λειτουργικά σημαντικές, δηλαδή όγκου-και μετάσταση-κίνησης και τα περισσότερα κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο. Αρκετές κυτταρικές σειρές ορθοκολικού διαφορετικών κυτταρικών, βιοχημικών και μοριακών χαρακτηριστικών αποδειχθεί κατά τη διάρκεια των δύο τελευταίων δεκαετιών [26] – [30]. Εδώ αναφέρουμε τη δημιουργία ενός νέου CIC-εμπλουτισμένη, ιδιαίτερα ογκογόνο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή απομονώθηκε από μετάσταση στο ήπαρ ενός ασθενούς CRC.

Αποτελέσματα

δείγματα ασθενών και πρωτογενείς καλλιέργειες

διαχωρισμένα κυτταρικά εναιωρήματα από 13 προσφάτως εκτομή καρκινώματα παχέος διαφόρων ιστολογικών βαθμών και 3 ηπατικές μεταστάσεις εξετάστηκαν για κλωνογόνο και ογκογόνο δυναμικό

in vivo

και

in vitro

όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι. Δύο δείγματα ήταν σοβαρά μολυσμένο με βακτήρια, και παρά τις επανειλημμένες θεραπείες με αντιβιοτικά, οι πρωτογενείς αποικίες επίσης μολυνθεί και, ως εκ τούτου απορρίπτεται. Δύο πρωτογενείς καλλιέργειες αναπτύχθηκαν από την πρωτοβάθμια και τη μεταστατική δείγματα όγκων των ασθενών είχαν λάβει προηγουμένως θεραπεία με χημειοθεραπεία υποβλήθηκε σε βαθιά κυτταρικό θάνατο μετά από 1-2 ημέρες καλλιέργειας και δεν δείχνουν κανένα βιώσιμο κύτταρο κατά τη διάρκεια της επόμενης εβδομάδας παρατήρησης. Τα άλλα εννέα δείγματα περιείχαν ένα υποπληθυσμό ταχείας προσκολλημένων κυττάρων (FA) προς το κολλαγόνο τύπου Ι, η οποία αρχικά πολλαπλασιάστηκαν σε μέσο βλαστοκυττάρων χωρίς ορό και διεγείρονται επιπλέοντα σφαιρίδια, τα οποία είναι χαρακτηριστικά του CICs, καθώς και χαλαρά πολυκύτταρους συσσωματώματα σε 3D πολιτισμών. Ωστόσο, 6 από 9 πρωτογενείς καλλιέργειες χάσει κλωνογονικού και σχηματισμού σφαίρας των ικανοτήτων τους μετά από αρκετά περάσματα, το οποίο είναι σύμφωνο με τις πολυάριθμες παρατηρήσεις που πρωτογενή καρκινικά κύτταρα έχουν ένα πεπερασμένο (περίπου 5-6 περάσματα) διάρκεια ζωής [31]. Σε αντίθεση, τα καρκινικά κύτταρα που απομονώνονται από το ήπαρ μετάσταση του αρσενικού ασθενούς με το στάδιο 4 καρκίνο του παχέος εντέρου συνεχίσει μακροχρόνια

in vivo

και

in vitro

ανάπτυξης (15 περάσματα, επί του παρόντος) και αντιπροσωπεύουν ιδρύθηκε, CIC εμπλουτισμένο καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή, CR4. Τρεις άλλες πρωτογενείς καλλιέργειες είναι σήμερα σε μια φάση εξέλιξης παρόμοια με την κυτταρική γραμμή CR4. Αυτά τα κύτταρα είναι στη διαδικασία της λειτουργικής, γενωμικό, κυτταρικό και μοριακό χαρακτηρισμό.

Κυτταρική και κλωνική ετερογένεια των καρκινικών κυττάρων CR4

Μετά την αρχική απομόνωση της ταχείας προσκολλημένα στα κολλαγόνο τύπου Ι πρωτογενή κύτταρα όγκου και τον πολλαπλασιασμό τους

in vitro

σε MSCB ή SPC μέσα, πολλά διαφορετικά είδη κυτταρικού σχήματος και του κλώνου μορφολογία ήταν εμφανείς: (i) πυκνά μακράς ατράκτου κύτταρα που μοιάζουν με ινοβλάστες που αντιπροσωπεύουν συνδέονται καρκίνωμα (CAFS) και κανονικούς ινοβλάστες, που κυριαρχούσαν κυτταρικό φαινότυπο σύντομα μετά την απομόνωση και κατά τη διάρκεια αρκετών πρώτα περάσματα της καλλιέργειας (Σχήμα 1Α)? (Ii) αραιή μεγάλο επίμηκες κυττάρων με dychotomized διεργασίες (Σχήμα 1Β)? (Iii) είναι σπάνια μικρές κλώνους που περιέχουν μικρά στρογγυλά κύτταρα περίπου 7-10 μm σε διάμετρο με ένα πολύ λεπτό χείλος του στο κυτταρόπλασμα και μεγάλο επίμηκες πυρήνες (Σχήμα 1 C, D)? και μεταξύ αυτών, (iv) είναι σπάνια, πολύ μεγάλες (≥100-200 μm), συχνά πολυπύρηνα (ΤΜΧ? Σχήμα 1Ε). Συχνά παρατηρούμε τέτοια κύτταρα σε καθιερωμένες όσο και πρωτογενείς κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου και του προστάτη αναπτύσσονται υπό συνθήκες που προάγουν την βλαστική ικανότητα. Αυτά τα πολυπύρηνα γιγαντιαία ήταν ικανά τόσο αργή πολλαπλασιασμού, παράγοντας είτε επιπλέον ΤΜΧ (Σχήμα 1 F) ή μεγάλα μονοπύρηνα κύτταρα.

(Α) Αρχικά κυριαρχεί πληθυσμός των πυκνά επίμηκες ινοβλάστες σαν κύτταρα. (Β) αραιές επιμήκη καρκινικών κυττάρων με διεργασίες. (Γ) εμφάνιση των μικρών συστάδων πολύ μικρών κυττάρων (~ 7 μm) που γειτνιάζουν με ινοβλάστες σαν κύτταρα. (Δ) Τυπικά holoclone προκαλείται από μικρά κύτταρα CR4. (Ε) Giant πολυπύρηνων κυττάρων εντός CR4 holoclone των μικρών κυττάρων. (F) Αποικία των πολυπύρηνων.

Η

Έχουμε συνέχισε τον πολιτισμό των πληθυσμών μικτών κυττάρων κάτω από καθορισμένες συνθήκες βλαστική ικανότητα, την προώθηση αναμένει ότι αυτή η προσέγγιση, παρόμοια με προηγουμένως συσταθεί πρωτοβάθμια προστάτη μας CIC-εμπλουτισμένη κυτταρική γραμμή, ΡΡΤ2 [32] θα οδηγήσει σε εξάπλωση των σπάνιων CICs. Σύμφωνα με τις παρατηρήσεις μας, αποδείχθηκε προηγουμένως ότι συν-καλλιέργεια των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου με ινοβλάστες καρκίνωμα σχετιζόμενη οδήγησε anincrease του αριθμού των CICs μέσω ενεργοποίησης του μονοπατιού β-κατενίνης [33]. Τέλος, η περιορισμένη πέρασμα των πρωτογενών κυττάρων σε ένα μέσο βλαστοκυττάρων οδήγησε στην εμφάνιση πολλών αραιή, μικρών κυττάρων που περιέχουν πυκνά κλώνοι με στρογγυλευμένες γωνίες (holoclones) που περιβάλλεται από επιμήκη κύτταρα (Σχήμα 2Α). Αυτό το πρότυπο είναι χαρακτηριστική για τα εμβρυϊκά, πολυδύναμα και άλλους τύπους βλαστικών κυττάρων συν-καλλιεργήθηκαν με ινοβλάστες [32], [34]. Sucloning τέτοιων holoclones οδήγησε στην ίδρυση της καρκινικής κυτταρικής σειράς καθαρισμένο του παχέος εντέρου, CR4, με όλα τα βασικά χαρακτηριστικά της CICs, συμπεριλαμβανομένων των υψηλών όγκων-κίνηση, 3D σφαιροειδή και holoclone που σχηματίζουν τις ικανότητες και την έκφραση του pluripotency και βλαστικών κυττάρων σχετικές δείκτες (περιγράφεται παρακάτω). Μαζί με τις υποθετικές απαλή holoclones, τα κύτταρα μπορούν να επάγουν CR4 paraclones με διάχυτη ακμές (Σχήμα 2C), οι οποίες είναι χαρακτηριστικές για προγονικά κύτταρα. Κατά τη διάρκεια των προηγούμενων περάσματα, σχεδόν όλοι οι holoclones CR4 περιείχε ομοιόμορφα συσκευασμένα μικρά κύτταρα από το κέντρο προς την περιφέρεια του κλώνου (Σχήμα 2Β). Ωστόσο, αργότερα περάσματα είχε πολύ υψηλότερες αναλογίες των μεγάλων πολυπύρηνων βρίσκονται κυρίως στην περιφέρεια του κλώνου, ενώ μικρά κελιά κατέλαβαν το πιο κεντρικό τμήμα του κλώνου (Σχήμα 2 Ε, F). Τα εξαιρετικά χαμηλά περάσματα των κυττάρων CR4 διατηρούνται σε aliquotes σε υγρό άζωτο? επί του παρόντος, αυτή η γραμμή στο πέρασμα 14. Για το χαρακτηρισμό που περιγράφεται, τα κατεψυγμένα aliquotes διαδόθηκαν είτε ως NOD /SCID ποντίκια ξενομοσχευμάτων όγκου, πλωτό 3D σφαιροειδή ή καλλιέργειες κολλαγόνου προσκολλημένα τύπου Ι.

(Α) κλώνος του μικρά κύτταρα CR4 περιβάλλεται από καιρό μοιάζουν με ινοβλάστες κύτταρα με dychotomized διεργασίες. (Β) Μετά την υποκλωνοποίηση, μικρά κύτταρα CR4 σπάρθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα σε SPCM χωρίς ορό επί κολλαγόνου τύπου Ι που παράγεται τυπικά πυκνά holoclones χαρακτηριστικό για βλαστικών κυττάρων διαφορετικής προέλευσης. (Γ) Paraclone του επιμήκη μεγαλύτερα κύτταρα που γειτνιάζουν με μικρά κύτταρα CR4. (D) Χαμηλή αριθμός των καθαρισμένων μικρών κύτταρα που παράγονται κατά κύριο λόγο με στρογγυλό κόψης holoclones και σπάνια paraclones προσκολλημένα σε κολλαγόνο τύπου Ι με υψηλή απόδοση. (Ε) Μεγαλύτερη μεγέθυνση των holoclone κυττάρων με μεγάλους πυρήνες και λεπτό χείλος του κυτταροπλάσματος. (F) Μεγάλες πολυεθνικές (≥200 μm? Αιματοξυλίνη και ηωσίνη). Βρίσκονται συχνά στην περιφέρεια των holoclones

Η

Λειτουργικός χαρακτηρισμός των κυττάρων CR4

Για να επιβεβαιώσετε την κατάσταση βλαστική ικανότητα της κυτταρικής γραμμής CR4, διάφορες λειτουργικές δοκιμασίες διεξήχθησαν συμπεριλαμβανομένης της αξιολόγησης της ογκογενή δυναμικό (ικανότητα να σχηματίζουν υποδόριων όγκων σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια NOD /SCID), σχηματισμού σφαίρας ικανότητα (ικανότητα να σχηματίσει πυκνό επιπλέουν σφαιροειδή σε μη προσκολλημένα 3D καλλιέργειες) και ικανότητας κλωνισμού (ικανότητα να σχηματίζουν προσκολλημένη σε κολλαγόνο τύπου Ι holoclones). Έχουμε προσδιορίσει ότι τα κύτταρα CR4 διαθέτουν υψηλή αποτελεσματικότητα στην επαγωγή όγκων σε NOD /SCID ποντίκια (Σχήμα 3Α) μετά από υποδόρια σειριακή μεταμοσχεύσεις του αριθμού των κυττάρων σχετικά χαμηλή. Έτσι, 1 χ 10

3 CR4 κύτταρα ή 2-3 επιπλέοντα σφαιροειδή επάγεται μεγάλους όγκους σε όλους τους ποντικούς (6 ποντικοί ανά κάθε ομάδα). Για να διαπιστωθεί κλωνογόνο και σχηματισμού σφαίρας ικανότητες των κυττάρων CR4, ένας γνωστός αριθμός κυττάρων σπάρθηκαν με τον τύπο Ι επικαλυμμένες με κολλαγόνο ή εξαιρετικά χαμηλής προσκολλημένα πλάκες, αντίστοιχα. Μετά από μία εβδομάδα επωάσεως, επαγόμενης προσκολλημένα κλώνους ή επιπλέοντα σφαιροειδή μετρήθηκαν και η κλωνογονική αποτελεσματικότητα υπολογίστηκε ως ο λόγος του αριθμού των σπαρμένων κυττάρων σε σύγκριση με τον αριθμό των αποικιών που προκαλείται ή σφαιροειδή. Ειδικότερα, προσδιορίσαμε ότι μετά τη σπορά μη ταξινομημένα κύτταρα CR4 του περάσματος 13 σε σειριακή αραίωση (250, 100, 50 και 25 κύτταρα /φρεάτιο πλακών 96-φρεατίων) περίπου ένα κύτταρο σε 10 (10%) που προκαλείται τέλεια holoclones (Σχήμα 2Β, ΡΕ). Σχηματισμού σφαίρας αποτελεσματικότητα του CD133-θετικό κλάσμα των κυττάρων CR4 σε 3D καλλιέργεια με τύπο 5% Ι κολλαγόνου σε SPCM ήταν υψηλότερη σε σύγκριση με τους κυτταρικούς πληθυσμούς CD133-εξαντλημένο (8.4 ± 2.6 έναντι 3.7 ± 0.6 σφαιροειδή ανά 100 σπαρμένα κύτταρα /φρεάτιο , αντίστοιχα). Αμφότερες holoclones και σφαιροειδή συσκευάστηκαν με πολύ μικρό κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του κοινού βλαστική ικανότητα σημειωτές, συμπεριλαμβανομένων EpCAM, CD133, CD44, CD166 και Lgr5 (περιγράφεται παρακάτω). Αν και το CD133 (κλώνος 293C3), καθώς και οποιεσδήποτε άλλες κοινές δείκτες, δεν είναι ιδανικό για CICs παχέος εντέρου, παρ ‘όλα αυτά επιτρέπει επιπλέον εμπλουτισμός του ογκογενή και κλάσμα των κυττάρων CR4 σχηματισμού σφαίρας.

(Α) Μεγάλα υποδόριου όγκου που προκαλείται από τη μεταμόσχευση των κυττάρων CR4 (1 × 10

3) σε NOD /SCID ποντικό (πέρασμα 2). (Β) Πυκνά κυμαινόμενο σφαιροειδή που επάγεται από σειριακό πέρασμα των κυττάρων CR4 σε 3D καλλιέργεια στις εξαιρετικά χαμηλού προσκολλημένα πλακών. (Γ) Τρισδιάστατο σφαιροειδές που προκαλείται στην επιφάνεια του προσκολλημένων holoclone CR4. (D) σχηματισμός ενός μεγάλου 3D οργανοειδούς στην επιφάνεια του προσκολλημένων holoclone CR4. (Ε) Εμφάνιση μεγάλης διεργασιών σε σφαιροειδές κυττάρων που επάγεται από τα κύτταρα CR4 σε 3D καλλιέργειας που περιέχει 15% του πήγματος κολλαγόνου, το οποίο δείχνει τους υψηλά διεισδυτική δυναμικό [35]. (F) Long dychotomized διαδικασίες που έχουν αναπτυχθεί από προσκολλημένα μικρά κελιά CR4. (G) Long διεργασίες των προσκολλημένων ΤΜΧ.

Η

Η επιθετική φύση και εξαιρετικές σχηματισμού σφαίρας /κλωνογόνο ικανότητα των κυττάρων CR4 αποδείχθηκε από την ικανότητά τους να παράγουν κυμαινόμενο σφαιροειδή όχι μόνο σε μη-προσκολλημένες καλλιέργειες (Σχήμα 3Β), αλλά και από εκβλάστηση του προσκολλημένα στο κολλαγόνο τύπου Ι holoclones και την επακόλουθη αποκόλληση των σχηματιζόμενων σφαιροειδή (σχήμα 3C). Οι holoclones CR4 ήταν επίσης σε θέση να παράγουν τα μεγάλα προσκολλημένη πολυστρωματικές organoids ακριβώς πάνω από την επιφάνεια holoclone (Σχήμα 3D). Πλωτή CR4 σφαιροειδή συμπεριφέρονταν διαφορετικά στα συστήματα καλλιέργειας 3D με και χωρίς κολλαγόνο τύπου Ι τζελ στο βλαστοκυττάρων μέσα μαζικής ενημέρωσης (MSCBM ή SPCM). Έτσι, σφαιροειδή που καλλιεργούνται με χαμηλή ή καθόλου τοις εκατό του πήγματος κολλαγόνου (έως 5%) συνήθως έχουν λεία άκρα (Σχήμα 3Β), ενώ υψηλότερη συγκέντρωση γέλη (μέχρι 10-15%) οδήγησε στην εμφάνιση πολλαπλών διεργασιών, οι οποίες σχηματίζονται αστερίσκος -όπως δομές που περιβάλλουν σφαιροειδή (Σχήμα 3Ε). Τέτοια φαινότυπος των πλωτών σφαιροειδή πρόσφατα συνδέεται με την υψηλή μεταστατική ικανότητα συγκεκριμένων καρκινικών κυττάρων [35], η οποία είναι σύμφωνη με το γεγονός ότι η κυτταρική γραμμή CR4 ιδρύθηκε από μετάσταση στο ήπαρ του ασθενούς καρκίνου του παχέος εντέρου. Ομοίως με 3D καλλιέργεια, η επεμβατική φύση των κυττάρων CR4 αντικατοπτρίζεται από την ικανότητά τους να αναπτύσσουν μεγάλες, μεγάλο, διαχωρίστηκαν μεταξύ τους διεργασίες στην εξωτερική άκρη των προσκολλημένων κλώνους (Σχήμα 3F). Τα μεγάλα πολυπύρηνα κύτταρα στην περιφέρεια των κλώνων, που περιγράφονται παραπάνω, καθώς και τα μεμονωμένα γιγαντιαία πολυπύρηνα, επίσης, συχνά εμφανίζεται μακρά και dychotomized διεργασίες (Εικόνα 3G).

Φαινοτυπική χαρακτηριστικών των κυττάρων CR4

Όπως αναφέραμε παραπάνω, υποκλωνοποίηση των μικρών κυττάρων που περιέχουν holoclones οδήγησε σε δραματική εμπλουτισμό των κυττάρων που εκφράζουν υψηλά επίπεδα βλαστική ικανότητα και πλειοδυναμία δείκτες (Πίνακας 1? Σχήματα 4 και 5). Σε γενικές γραμμές, τα βλαστικά φαινοτύπου των κυττάρων

in vitro

είναι δυναμική, λόγω του διττού χαρακτήρα της CICs (δηλαδή, την ικανότητά τους να αυτο-ανανέωση και να δημιουργήσει δεσμευτεί προγόνους). Έτσι, η έγκαιρη και τα ενδιάμεσα περάσματα των πρωτογενών κυττάρων CR4 είχε ασταθής φαινότυπο εκφράζουν υψηλά μεταβλητά επίπεδα CD133, CD44 και EpCAM (Πίνακας 1 και Σχήμα 4Α). Τα NOD /SCID ποντίκια ξενομοσχεύματα όγκου που επάγεται από αυτά τα κύτταρα εξέφρασαν παρόμοια επίπεδα όλων μελετήθηκαν δείκτες (Σχήμα 4Β). Σε αντίθεση, καθαρισμένα κύτταρα CR4 διατηρούν σχετικά σταθερή φαινότυπο σε 3D και προσκολλημένα στο κολλαγόνο τύπου Ι καλλιέργειες. Έτσι, τρεις ανεξάρτητες αναλύσεις FACS κατά τη διάρκεια των τελευταίων 7 μηνών (περάσματα 6-14) έδειξαν ότι σχεδόν το σύνολο του πληθυσμού των κυττάρων CR4 παραμένει αδιαφοροποίητα (μόνο 3-5% εκφρασμένο δείκτη διαφοροποίησης, παν-κερατίνη), και η πλειοψηφία των κυττάρων εκφράζουν υψηλά επίπεδα CD133 (62-82%), CD44 (65-99%), CD166 (97-98%), EpCAM (98-99%) και Lgr5 (80-83%? τα δεδομένα αντιπροσωπευτικά FACS παρουσιάζεται στο Σχήμα 4C). Συγκεκριμένα, περίπου το 65% των κυττάρων συνεκφράστηκε υψηλά επίπεδα CD133 και CD44. Σημαντικά, περίπου το 20% των κυττάρων CR4 είναι θετικά για τον προσωπικό του μεταστατικού δραστηριότητας, CXCR4.

(Α) Αντιπροσωπευτική FACS αναλύσεις των διαφόρων έκφραση δεικτών κυτταρικής επιφάνειας στις αρχές πρωτογενή καλλιέργεια των fast-προσκολλημένα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε CR4 κολλαγόνο τύπου Ι σε μέσο MSCB. (Β) Ανάλυση FACS της πρώτης διόδου των κυττάρων του όγκου που απομονώνονται από FA NOD SCID ξενομοσχεύματα /όγκο ποντικών που επάγεται από νωρίς-πέρασμα κυττάρων CR4. (C) Δραματική αύξηση στην έκφραση των κοινών δεικτών βλαστική ικανότητα, συμπεριλαμβανομένης της CD133, CD44, CD166, Lgr5 και EpCAM στα τέλη διέλευσης (p13) κύτταρα CR4. Σημειώστε ότι το 19% των κυττάρων εξέφρασαν επίσης δείκτης της CICs με μεταστατικό δραστηριότητα, CXCR4, το οποίο προσδιορίστηκε σε πολλαπλά ανθρώπινων καρκίνων.

Η

(Α) Πυρηνικός εντοπισμός των βασικών δεικτών πλειοδυναμίας, c-myc, Sox- 2 και Oct3 /4. (Β) Κοινός εντοπισμός των πυρηνικών c-Myc με έκφραση υψηλού μεμβράνη του CD133. (Α, Β: Ανοσοκυτταροχημική ανάλυση των κυττάρων που καλλιεργούνται σε CR4 τύπου Ι επικαλυμμένες με κολλαγόνο θαλαμωτά πλακίδια). Ανάλυση (Γ) Western στύπωμα επιβεβαιώνει την έκφραση του c-myc και Oct-3/4 για στην πυρηνική κλάσματα των κυττάρων CR4. Αντίθετα, είναι αρνητικά για ρ53 και ρ21. Πυρηνική κλάσμα εξέφρασε επίσης υψηλότερα επίπεδα του φωσφορυλιωένη ρ65 (τα οποία υποδεικνύουν συστατική ενεργοποίηση του NF-kB), ενώ unphosphorilated p65 εντοπίστηκε κυρίως σε ένα κυτταρόπλασμα. (D, E) Αντιπροσωπευτικά FACS αναλύσεις δείχνουν υψηλότερη έκφραση του Sox-2 και c-Myc σε CD133-θετικά κύτταρα σε σύγκριση με μη ταξινομημένα κύτταρα. (F) Ανοσοϊστοχημική ανάλυση δείχνει υψηλή πυρηνική έκφραση του Sox-2 στο CR4-επαγόμενης NOD /SCID ποντίκια ξενομοσχεύματος όγκου. (G) Αρνητικός έλεγχος (τμήμα ιστού χωρίς επώαση με πρωτογενές αντι-Sox-2 Abs).

Η

Χρησιμοποιώντας ανοσοκυτταροχημικές, FACS και αναλύσεις στυπωμάτων western, έχουμε δείξει ότι μία σημαντική αναλογία της κύτταρα CR4 εκφράζουν αρκετούς βασικούς δείκτες της πλειοδυναμίας, συμπεριλαμβανομένων Sox-2, Oct3 /4 και c-Myc. Πυρηνικός εντοπισμός αυτών των δεικτών φαίνεται από ICC (Σχήμα 5Α, Β) επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western (C), η οποία έχει αποδείξει την έκφρασή τους στο κλάσμα πυρηνική πρωτείνη και η απουσία τους στην κυτταροπλασματική ένα. Έχουμε βρει ότι το CD133

+ κλάσμα των κυττάρων CR4 εκφράζουν υψηλότερες αναλογίες των διαφόρων δεικτών της πλειοδυναμίας σε σύγκριση με τα μη ταξινομημένα κύτταρα CR4. Έτσι, η ανάλυση FACS έδειξε ότι περισσότερο από το ένα τέταρτο του CD133

+ πληθυσμού που εκφράζεται Sox-2 και 10% του πληθυσμού ήταν θετικές για το c-Myc (Σχήμα 5D). Σε αντίθεση, μη ταξινομημένα κύτταρα CR4 και CD133-αρνητικών κλάσμα εκφράζεται χαμηλότερα επίπεδα αυτών των δεικτών πλειοδυναμίας (6 και 4%, και 1,4 και 0,8%, αντίστοιχα? Σχήμα 5Ε? Αρνητικό κλάσμα δεν φαίνεται). ανάλυση Κοινός εντοπισμός έχει δείξει ότι μόνο τα κύτταρα με την υψηλότερη έκφραση του CD133 έχουν συνήθως πυρηνική χρώση για τους δείκτες pluripotancy (Σχήμα 5Β? μόνο c-myc δείχνονται). Υψηλό ποσοστό των Sox-2positive κύτταρα και πυρηνική εντόπιση του επιβεβαιώθηκε επίσης από την IHC των ξενομοσχευμάτων NOD /SCID ποντίκια όγκου (Σχήμα 5F). [Αξίζει να σημειωθεί ότι η χρήση του αντι-Oct3 /4 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) για ανάλυση FACS παρέχονται ύποπτα υψηλές αναλογίες θετικών κυττάρων (πάνω από 90%) και τα δεδομένα αυτά δεν περιελήφθησαν.] Σημαντικά, το CR4 κύτταρα, ομοίως στον προστάτη ΡΡΤ2 CIC-εμπλουτισμένο κυτταρική γραμμή [32], δεν εκφράζουν τους δύο κύριους ρυθμιστές της απόπτωσης και ογκοκατασταλτικών γονιδίων, ρ53 και ρ21 (Εικόνα 5C). Επιπλέον, η πυρηνική κλάσμα των κυττάρων CR4 αναπτύχθηκαν σε κολλαγόνο τύπου Ι σε μέσο βλαστοκυττάρων ως ξεχωριστά holoclones εκφράζεται έντονα φωσφορυλιωμένη p65, το οποίο σημαίνει ότι NFkB είναι ιδιοσυστατικά υπερεκφράζεται σε ορθοκολικό CICs. Σε αντίθεση, μη φωσφορυλιωμένη ρ65 βρισκόταν κυρίως στο κυτταροπλασματικό κλάσμα. Όλα τα παραπάνω μπορεί να εξηγήσει εν μέρει τα υψηλά ογκογόνο και κλωνογονικού ικανότητες και εξαιρετική αντοχή στα φάρμακα αυτής της CIC-εμπλουτισμένη κυτταρική γραμμή. Ειδικότερα, τα κύτταρα CR4 είναι πολύ ανεκτική σε θεραπεία με τα συνήθως χρησιμοποιούμενα κυτταροτοξικά φάρμακα όπως η πακλιταξέλη ή ταξόλη (σχήμα 6). Έτσι, μετά την επεξεργασία 72 ωρών σε εύρος συγκεντρώσεων από 10 ηΜ έως 10 μΜ (ΜΤΤ δοκιμασία), κύτταρα CR4 έχουν δείξει μικρή ή καθόλου κυτταροτοξικότητα? Επιπλέον, συχνά αυξημένο πολλαπλασιασμό τους σε απόκριση σε χαμηλότερες δόσεις του paclitaxel. Έχουμε βρει ότι αρκετά μέλη της ταξοειδή νέας γενιάς, συμπεριλαμβανομένης της SBT-1214, SBT-121602 και SBT-12834 είναι περισσότερο αποτελεσματική έναντι ογκογενή κύτταρα CR4. Το ποσοστό θανάτου IC50 επιτεύχθηκε σε ≥10 μΜ όλης της συγκέντρωσης φαρμάκων. Αξίζει να σημειωθεί ότι η πολλά υποσχόμενη αποτελεσματικότητα χαμηλών συγκεντρώσεων ταξοειδή νέας γενιάς μπορεί να βελτιωθεί περαιτέρω με το συνδυασμό τους με το συνθετικό παράγωγο της κουρκουμίνης, CMC2.24 (μη δημοσιευμένα δεδομένα), η οποία είναι σύμφωνη με προηγούμενη μελέτη μας [32].

συνήθως χρησιμοποιείται πακλιταξέλη (ταξόλη) σε δόσεις μικρότερες από 10 μΜ δεν είναι αποτελεσματικό ενάντια σε κύτταρα CR4 και συχνά αυξάνει τον πολλαπλασιασμό τους. Σε αντίθεση, αρκετές ταξοειδή νέας γενιάς επάγει δοσο-εξαρτώμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού των εν λόγω ισχυρών ογκογενή κύτταρα. (ΜΤΤ δοκιμασία μετά την επεξεργασία φαρμάκου για 48 ώρες). Τα λαμβανόμενα

σ

τιμές για όλα τα φάρμακα και όλες τις συγκεντρώσεις του φαρμάκου ήταν πολύ μικρότερη από 0,05. λήφθηκε η μεγαλύτερη

σ

τιμή για το SBT-1214 σε συγκέντρωση 10 nM (

σ

= 0,0131)? ειδικότερα, σε συγκέντρωση 10 μΜ της SBT-1214

σ

= 0.00032.

Η

Η ιστοπαθολογική και IHC αναλύσεις των ξένων μοσχευμάτων NOD /SCID ποντίκια όγκου

Όπως έχουμε που αναφέρθηκαν παραπάνω, υποδόρια μεταμόσχευση σχετικά χαμηλό αριθμό κυττάρων CR4 (1 × 10

3 των διαχωρισμένων κυττάρων CR4 ή 2-3 επιπλέοντα σφαιροειδή) που προκαλείται από μεγάλες αγγειούμενων όγκων σε όλα τα εγχυθεί NOD /SCID ποντίκια (Σχήματα 3Α και 7Α) . Οι τομές ιστών αιματοξυλίνη-ηωσίνη και χρώση των ξενομοσχευμάτων όγκου ποντικοί έδειξαν κλασσική ιστολογική χαρακτηριστικά της ανθρώπινης μεταστατικού καρκίνου του παχέος εντέρου (Σχήμα 7Β, C). Εξαιρετικά άτυπα επιθηλιακά κύτταρα που σχηματίζονται λαχνών-όπως δομές με εξέχοντα επιμήκεις πυρήνες και, σύμφωνα με πτωχά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα, πολυάριθμα άτυπα μιτωτικά σχήματα. Κεντρική νέκρωση ήταν συνήθως παρόντες. Πολυάριθμες μεγάλα πολυπύρηνα κύτταρα ήταν εμφανής σε μεγαλύτερη μεγέθυνση (Εικόνα 7C? Βέλη). Ανοσοϊστοχημική ανάλυση αποκάλυψε ότι ολόκληρη η περιοχή του όγκου (αλλά όχι στρώματος του όγκου) εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του EpCAM μεμβράνη εντοπισμένη (Σχήμα 7D, E). Παρόμοια μοτίβα και τα επίπεδα έκφρασης ήταν χαρακτηριστικά για CD166 (F). Σε αντίθεση, ανοσοχρώση με πολυκλωνικό CD44 (κλώνος F10-44-2? Invitrogen /Biosources, USA) αποκάλυψε τρία διαφορετικά πρότυπα έκφρασης σε διαφορετικές περιοχές του ίδιου όγκου, δηλαδή σαφώς μεμβράνη (Σχήμα 7G), καθώς επίσης και κυτταροπλασματική και σαφώς πυρηνικών σε άλλα μέρη (Σχήμα 7Η). Υψηλή cytolasmic έκφραση της κοινής δείκτη των βλαστικών κυττάρων του παχέος εντέρου και CICs, Lgr5, ήταν εμφανής σε ορισμένα μέρη του όγκου (Σχήμα 7J), ενώ σε άλλα μέρη, ήταν είτε μετρίως ή ασθενώς εκφραζόμενο (Κ), ή ακόμη και απούσα. Μεγάλες περιοχές των μοσχευμάτων όγκων εξέφρασε ισχυρή πυρηνική χρώση για τον δείκτη πλειοδυναμία Sox-2 (Σχήμα 7L).

(Α) μεγάλο όγκο που προκαλείται από μεταμόσχευση 1 × 10

3 CR4 κύτταρα. (Β) αιματοξυλίνη και ηωσίνη τμήμα ιστού χρώση δείχνει κλασικά ιστολογικά χαρακτηριστικά της ανθρώπινης μεταστατικού καρκίνου του παχέος εντέρου. (C) μεγέθυνση υψηλής ισχύος της περιοχής που φαίνεται στο (Β)? βέλη δείχνουν γιγαντιαία πολυπύρηνα κύτταρα εντός των θηλώδες δομές. (D, E) Ισχυρή έκφραση κυτταρικής επιφάνειας του επιθηλιακού δείκτη, EpCAM. (F) Ισχυρή έκφραση κυτταρικής επιφάνειας του CD166. (G) κυτταροπλασματική έκφραση του CD44. (H) Μικροσκοπική εστίαση με ισχυρή πυρηνική και ασθενέστερες κυτταροπλασματική έκφραση του CD44. (Ι) Αρνητικός μάρτυρας (πρωτογενής Abs είχαν παραλειφθεί). (J, K) Ισχυρή και μέτρια έκφραση, αντίστοιχα, του δείκτη βλαστικών κυττάρων του παχέος εντέρου, Lgr5 /GPR49. (L) Ισχυρή πυρηνική έκφραση του δείκτη πλειοδυναμίας, Sox-2 σε μεγάλες περιοχές του όγκου.

Η

RNA-Seq πλήρη μεταγραφικό προφίλ των CR4 μικρό σε σχέση με χύμα καρκινικά κύτταρα

Χρήση RNA-Seq, πραγματοποιήσαμε μια λειτουργική γονιδιωματική ανάλυση σε κλάσματα ογκογενή του CR4 (μικρό) κύτταρα που αναπτύσσονται προσκολλημένα σε κολλαγόνο τύπου Ι έναντι καλλιεργούνται ως 3D σφαιροειδή, σε σύγκριση με τις χονδρικές κύτταρα όγκου (μήκος και dychotomized κύτταρα αναπτύσσονται υπό τυποποιημένες συνθήκες καλλιέργειας ). Χρησιμοποιώντας ένα HiSeq 2000, έχουμε την αλληλουχία μεταξύ 40 και 50 εκατομμυρίων διαβάζει ανά βιολογικό δείγμα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35], [36], [37]. Εν συντομία, οι βιβλιοθήκες για NGS έγιναν από 100 νανογραμμάρια ολικού RNA. Η ποιότητα δείγματα RNA εκτιμήθηκε με ένα Agilent Bioanalyzer. Όλα τα δείγματα RNA είχε ένα RIN ανωτέρω 8. βιβλιοθήκες Sequencing δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ Illumina TruSeq Λανθάνον mRNA LT σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Η ποιότητα της κάθε βιβλιοθήκης αξιολογήθηκε με την δοκιμασία υψηλής ευαισθησίας Agilent BioAnalyzer, και ποσοτικοποιούνται με qPCR (Kappa Biosystem, CT). Οι βιβλιοθήκες ομαδοποιήθηκαν μαζί σε 10 ηΜ με βάση τα αποτελέσματα qPCR, και στη συνέχεια η πισίνα ποσοτικοποιήθηκε και πάλι από qPCR. Το συγκεντρωμένο βιβλιοθήκη αλληλουχήθηκε σε μία λωρίδα ενός HiSeq2000 ζεύγη κύτταρο ροής 100bp άκρο. Αυτό μας επέτρεψε να εντοπίσει ποια μεταγραφές εκφράζονται διαφορικά μεταξύ αυτών των τύπων κυττάρων CR4, χτίζοντας έτσι μια ολοκληρωμένη εικόνα των ενεργοποιημένων ή καταστέλλονται μονοπατιών σηματοδότησης. Έχουμε βρει ότι οι μικρές κύτταρα CR4 καλλιεργούνται είτε ως χωριστές holoclones προσκολλημένα στα κολλαγόνο τύπου Ι ή ως 3D κυμαινόμενο σφαιροειδή έχουν ένα μεγάλο αριθμό διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε σύγκριση με τα κύτταρα του όγκου χύμα αναπτύσσονται υπό πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας. Έτσι, σε προσκολλημένα μικρά κελιά CR4 και 3D σφαιροειδή, 357 και 365 γονιδίων, αντίστοιχα, υπερεκφράζεται σε σύγκριση με τα κύτταρα μακρύ (χύμα) του όγκου CR4. Μεταξύ αυτών των γονιδίων, 287 ήταν συνήθως ρυθμίζεται προς τα πάνω, πράγμα που σημαίνει ότι και οι δύο συνθήκες καλλιέργειας επιτρέπουν την διατήρηση των μικρών κυττάρων CR4 σε κρατικό βλαστική ικανότητα. Ειδικότερα, οι δύο μικρές προσκολλημένη και 3D σφαιροειδή έχουν διατυπωθεί έως πολλές τάξεις μεγέθους της προς τα άνω ρύθμιση στα ακόλουθα: (i) πολλαπλές κοινών δεικτών βλαστική ικανότητα, συμπεριλαμβανομένων των CD44, CD24, EpCAM, ESA, Lgr5, ALDH1A1 και άλλοι? (Ii) παράγοντες ανάπτυξης, συμπεριλαμβανομένου του επιδερμικού (EGF), ινοβλαστών (FGF) και ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού-βήτα (ΤΟΡβ) μέλη της οικογένειας? (Iii) παράγοντες μεταγραφής (ΤΡ), συμπεριλαμβανομένων των πολλαπλών ομοιοακολουθίας (CDX1, CDX2, CEACAM6, MSX2) και TFs πλειοδυναμία (POU5F1B, Oct4, Sox-2, Sox-9? (Iv) φλεγμονώδεις κυτοκίνες και τους υποδοχείς τους, συμπεριλαμβανομένων IL18, IL20 , IL2RG, IL20RA και άλλοι? (v) μεταφορείς ABC? (vi) γονίδια που είναι υπεύθυνα για τη μεταφορά υψηλής φωσφορικού ενέργειας από τα μιτοχόνδρια (CKMT1 και CKMT1B) και τα μέλη της οικογένειας του κυτοχρώματος Ρ450, συμπεριλαμβανομένων των CYP2B6, CYP2J2, CYP2S1 και άλλων συμφερόντων. , ο ογκογενή κλάσμα των κυττάρων CR4 υπερεκφράζεται πολλαπλά γονίδια ελέγχουν κύτταρο-προς-κύτταρο προσκόλληση, συμπεριλαμβανομένων καδερίνες (CDH 1, 3 και 17, και CDHR5)? intergins (ITGB4)? γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες σφιχτό-διασταύρωση (CLDN3, 4 και 6, COL17A1 και άλλοι)?. και κεράτινες (KRT19, 20, 23 και KRTAP3-1) Αυτή η διαπίστωση υποστηρίζει παραδοσιακά χρησιμοποιούνται προσέγγιση μας για την αρχική εμπλουτισμό των ογκογενή κύτταρα του προστάτη και του παχέος εντέρου με βάση την ικανότητά τους να προσκολλώνται προς τον τύπο Ι επικαλυμμένες με κολλαγόνο επιφάνειες μέσα σε 15-20 λεπτά της επώασης. Τα λαμβανόμενα ανεπεξέργαστα δεδομένα RNA-Seq υποβλήθηκαν στο National Center for Biotechnology Information (NCBI) έκφραση γονιδίων Omnibus (GEO), ένα δημόσιο αποθετήριο λειτουργικής γονιδιωματικής δεδομένων (ο αριθμός ταυτότητας είναι <