Αφηρημένο

χειλεογναθουπερωιοσχιστία διαμεμβρανική πρωτεΐνη 1-Like (CLPTM1L), βρίσκεται σε μια περιοχή του χρωμοσώματος 5 για τις οποίες η αντιγραφή κέρδος αριθμός έχει βρεθεί να είναι η πιο συχνή γενετική εκδήλωση στα πρώιμα στάδια του μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC). Αυτή η θέση έχει βρεθεί από πολλαπλές μελέτες γονιδιώματος σε επίπεδο σύνδεσης να συνδέεται με τον καρκίνο του πνεύμονα σε καπνιστές και μη-καπνιστές. CLPTM1L έχει ταυτοποιηθεί ως υπερεκφρασμένη πρωτεΐνη σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές όγκων των ωοθηκών που είναι ανθεκτικά σε σισπλατίνη, η οποία είναι η μόνη εικόνα μέχρι στιγμής στη λειτουργία του CLPTM1L. Εδώ βρίσκουμε CLPTM1L έκφραση να αυξηθεί σε αδενοκαρκινώματα πνεύμονα σε σύγκριση με συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων και σε κυτταρικές γραμμές όγκου του πνεύμονα με μηχανισμούς μη αποκλειστική για την αντιγραφή κέρδος αριθμό. Μετά την απώλεια της συσσώρευσης CLPTM1L σε κύτταρα όγκου πνεύμονα, σισπλατίνη και καμπτοθεκίνη απόπτωση που επάγεται αυξήθηκαν σε άμεση αναλογία με το επίπεδο του CLPTM1L knockdown. συσσώρευση Bcl-xL μειώθηκε σημαντικά μετά την απώλεια της CLPTM1L. Έκφραση εξωγενούς Bcl-xL καταργηθεί ευαισθητοποίηση σε αποπτωτικό σκοτώνει με CLPTM1L νοκ ντάουν. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι CLPTM1L, ένα υπερεκφρασμένο πρωτεΐνη σε κύτταρα όγκου πνεύμονα, προστατεύει από την επαγόμενη γενοτοξικό στρες απόπτωση μέσω της ρύθμισης των Bcl-xL. Έτσι, αυτή η μελέτη εμπλέκει αντι-αποπτωτική λειτουργία CLPTM1L ως πιθανός μηχανισμός της ευαισθησίας σε πνεύμονα ογκογένεση και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία

Παράθεση:. James MA, Wen W, Wang Υ, Byers LA, Heymach JV, Coombes KR, et al. (2012) Λειτουργική Χαρακτηρισμός CLPTM1L ως υποψήφιο γονίδιο του καρκίνου του πνεύμονα Κινδύνου στο 5p15.33 Locus. PLoS ONE 7 (6): e36116. doi: 10.1371 /journal.pone.0036116

Επιμέλεια: Swati Palit Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Αυγ 2011? Αποδεκτές: 30 Μαρ 2012? Δημοσιεύθηκε: 4, Ιουνίου, 2012

Copyright: © 2012 James et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από NCI Κέντρο Καρκίνου Υποστήριξη Grant # P30 CA91842, η ανθρώπινη πρωτεΐνη έργου Atlas, και επιχορήγηση NCI U19CA148127. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

CLPTM1L ονομάστηκε έτσι, με βάση την ομολογία της με χειλεογναθουπερωιοσχιστία διαμεμβρανική πρωτεΐνη 1, η οποία αναγνωρίστηκε ως διαταράσσεται σε μια οικογένεια με χειλεογναθουπερωιοσχιστία [1]. CLPTM1L ταυτοποιήθηκε ως άνω ρυθμιζόμενη μεταγραφή σε ένα σισπλατίνη ανθεκτική κυτταρική γραμμή όγκου ωοθήκης [2]. Ωστόσο, η ερμηνεία των αποτελεσμάτων της μελέτης αυτής είναι δύσκολη, καθώς δεν υπάρχει καμία επίπτωση του μηχανισμού και η επίδραση της υπερέκφρασης του CLPTM1L σε σισπλατίνη ευαισθησία αντικρουόμενες σε διαφορετικές κυτταρικές γραμμές όγκου ωοθήκης, ανάλογα με προϋπάρχουσες το επίπεδο της αντίστασης. Παρ ‘όλα αυτά, ένας ρόλος για CLPTM1L σε αντοχή στη σισπλατίνη προτάθηκε. Είναι ενδιαφέρον ότι η CLPTM1 ομόλογο έχει βρεθεί ότι εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα σε ανθεκτικά δοξορουβικίνη όγκους του μαστού, και η έκφραση του CLPTM1 είναι προβλεπτική απόκριση στη δοξορουβικίνη [3]. Μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε ότι μια γενετική παραλλαγή μέσα στο γονίδιο CLPTM1L (rs402710) σχετίζεται με τη συσσώρευση των προϊόντων προσθήκης DNA στον όγκο παρακείμενο πνευμονικό ιστό [4]. Αυτή η ίδια SNP, μεταξύ άλλων στην περιοχή των γονιδίων CLPTM1L και TERT συνδέεται με κίνδυνο καρκίνου των πνευμόνων [5], [6], [7]. Σε μια πρόσφατη μελέτη για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ενσωμάτωση των δεδομένων δοσολογία γονιδίου και έκφρασης, ο τόπος CLPTM1L /TERT βρέθηκε να έχει κέρδος αριθμό αντιγράφων σε όγκους και τα μοτίβα έκφρασης που συσχετίζεται με αύξηση του αριθμού αντιγράφων [8]. Μια άλλη πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι με την αύξηση του αριθμού αντιγράφων σε όλη 5ρ, CLPTM1L εκφράσεως είναι αυξημένο περίπου 5 φορές σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές πάνω φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας, ενώ η έκφραση των άλλων γονιδίων στο 5p15.33 δεν άλλαξε [9]. Αυτές οι γνώσεις σχετικά με την λειτουργία του CLPTM1L, και το γεγονός ότι αριθμός αντιγράφων κέρδος της περιοχής του χρωμοσώματος 5p περιέχουν CLPTM1L είναι η πιο συχνή κυτταρογενετική εκδήλωση στα πρώιμα στάδια του μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) [10] είναι επιτακτική δικαιολογία για η μελέτη του ρόλου των CLPTM1L στον καρκίνο του πνεύμονα, καθώς και άλλους τύπους καρκίνου.

βλάβη DNA, όπως αυτή που προκαλείται από γονιδιοτοξικές χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, προκαλεί απόπτωση μέσω δίκλωνο σπάσιμο συνδέονται κινάσες, και την επακόλουθη μεταγραφική ρύθμιση των αποπτωτικών τελεστές κυρίως μέσω p53 [11]. τα μέλη οικογένειας Bcl-2 ρυθμίζεται από ρ53, συμπεριλαμβανομένων Bax είναι κεντρικής σημασίας για την ενεργοποίηση της απόπτωσης μέσω αυτής της οδού και να ενεργούν με διαπερατότητας της μιτοχονδριακής μεμβράνης [12]. Αντι-αποπτωτικά Bcl-2 μέλος της οικογένειας Bcl-xL προστατεύει τα καρκινικά κύτταρα από το ρ53 απόπτωση που επάγεται από [13] και δρα μέσω της δέσμευσης και αδρανοποίηση του Bax [14] και πρόσδεση των πρωτεϊνών που προσλαμβάνουν Bax στην μιτοχονδριακή μεμβράνη [15]. Bcl-XL είναι συχνά υπερεκφράζεται σε όγκους του πνεύμονα, συνδέεται με κακή πρόγνωση [16], [17] και παίζει σημαντικό ρόλο στην αντίσταση σε γονοτοξική χημειοθεραπευτικών παραγόντων σε πνεύμονα και άλλους τύπους καρκίνου [18], [19], [20] , [21], [22], [23]

Αν και η σύνδεση των CLPTM1L τον καρκίνο προτείνεται από αύξηση του αριθμού αντιγράφων, του γονιδιώματος μεγάλη ένωση και μελέτες σε κυτταρικές σειρές όγκων των ωοθηκών.? η λειτουργία του CLPTM1L και ο ρόλος του στην ογκογένεση είναι μέχρι στιγμής άγνωστη. Εδώ αναφέρουμε ότι CLPTM1L είναι συνήθως υπερεκφράζεται αντι-αποπτωτικό παράγοντα σε όγκους του πνεύμονα. Εξόντωση CLPTM1L μεταγραφής σε NSCLC κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της ευαισθησίας σε γενοτοξικό στρες που προκαλείται αποπτωτική θανάτωση και μειώνει την έκφραση των Bcl-xL με ένα τρόπο που εξαρτάται από τη δόση της έκφρασης CLPTM1L. Επιπλέον, η έκφραση της εξωγενούς Bcl-xL καταργεί ευαισθητοποίηση σε γονοτοξικό στρες απόπτωση που επάγεται από CLPTM1L νοκ ντάουν. Αυτή η προστατευτική επίδραση δεν είναι αποκλειστική για μεσολάβηση σισπλατίνη δολοφονία. Μάλλον, CLPTM1L δρα έμμεσα ως γενικός αναστολέας της μιτοχονδριακής οδού της απόπτωσης μέσω της ρύθμισης Bcl-XL. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ένα ρόλο για CLPTM1L σε χημειοθεραπευτική αντοχή σε κύτταρα όγκου πνεύμονα, και προτείνουν ένα ρόλο για CLPTM1L στον πνεύμονα ογκογένεση μέσω προστασία από την απόπτωση μέσω της αυξημένης συσσώρευσης των Bcl-xL.

Αποτελέσματα

Έκφραση του CLPTM1L στον πνεύμονα όγκους

Δεδομένου εκθέσεις του κέρδους αριθμού αντιγράφων στον καρκίνο του πνεύμονα, GWAS αποδείξεων, και αυξημένη έκφραση CLPTM1L σε ανθεκτικά cisplatin κύτταρα όγκου ωοθήκης, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί εάν CLPTM1L υπερεκφράστηκε σε όγκους του πνεύμονα. Η έκφραση του mRNA σε CLPTM1L NSCLC όγκους ασθενών συγκρίθηκε με εκείνη της συμφωνημένα όγκο γειτονικών ιστών με qPCR. CLPTM1L αυξήθηκε κατά μέσο όρο 2,24 φορές την επίτευξη μιας συνολικής σημασία για διαφορική έκφραση σε 30 ασθενείς σταδίου Ι NSCLC (p = 0,0028, Δύο ουρά του Student t-test) (Εικόνα 1Α). Αν και η έκφραση TERT ήταν κατά μέσο όρο 1,76 φορές υψηλότερη σε ιστούς όγκων, συνολικές διαφορές στην έκφραση TERT δεν έφθασαν σημασία και δεν συσχετίστηκαν με σημαντικά CLPTM1L έκφρασης (r

2 = 0,0018, p = 0,994) (Σχήμα S1A). Το δείγμα αποτελούνταν από 22 αδενοκαρκινώματος και 8 ασθενείς πλακώδες καρκίνωμα Πίνακα S1 περιγράφει τα γνωστά χαρακτηριστικά του πληθυσμού της μελέτης. Δεν υπήρχε διαφορά σε όγκο υπερ-έκφραση μεταξύ καρκινώματα πλακωδών κυττάρων και αδενοκαρκινώματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών έκφρασης από κυτταρικές γραμμές όγκου 148 του πνεύμονα και 59 «κανονική» κυτταρικές σειρές αθανατοποιημένα με TERT και Cdk4 επιβεβαίωσε αυτά τα αποτελέσματα, αποκαλύπτοντας ένα 2,02 φορές μέση διαφορά σε CLPTM1L έκφραση σε σύγκριση με αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές (ρ = 1.48E-9, Δύο t-test του Student -ουράς) (Σχήμα 1Β). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν επίσης ότι η έκφραση του CLPTM1L αυξάνεται σε καρκινικά κύτταρα με μηχανισμούς διαφορετικούς από αντίγραφο παραλλαγή αριθμό, όπως ανάλυση εξαιρουμένων των καρκινικών κυτταρικών γραμμών με μεταβολή του αριθμού αντιγράφων παρέμεινε σημαντική (ρ = 1.28E-8, Δύο κατεύθυνσης Student t-test) και παρόμοια σε μέγεθος (1,83 φορές) (Σχήμα 1 C). αλλαγή αριθμού αντιγράφων ήταν πανομοιότυπα μεταξύ CLPTM1L και TERT γονίδια. Ωστόσο, δεν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης CLPTM1L και της έκφρασης TERT παρατηρήθηκε μέσα σε κυτταρικές σειρές όγκων (r

2 = 0,0126, p = 0,175) (Εικόνα S1B). Ανάλυση της έκφρασης διεξήχθη επίσης για διαφορετικούς υποτύπους όγκου πνεύμονα. Αδενοκαρκίνωμα κυτταρικές σειρές παρουσίασαν μία μέση 2,15 φορές μεγαλύτερη έκφραση CLPTM1L σε κανονική αθανατοποιημένες κυτταρικές γραμμές (p = 3.59E-7, Δύο κατεύθυνσης Student t-test) και μικροκυτταρικός καρκίνος κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα έδειξαν μέσο όρο 2,07 φορές μεγαλύτερη έκφραση (p = 1.15 T-Test Ε-9, Δυο-tailed Student) (Σχήμα 1 D). Ως εκ τούτου, η αυξημένη έκφραση CLPTM1L φαίνεται να είναι ένα χαρακτηριστικό των όγκων του πνεύμονα, ανεξάρτητα από τον υπότυπο.

Α) συσσώρευση CLPTM1L μεταγραφής όπως μετράται με qPCR σε ιστούς πνευμονικού αδενοκαρκινώματος σε σχέση με τη μέση τιμή των συμφωνημένα φυσιολογικό γειτονικό ιστό του όγκου σε 30 ασθενείς που αποδεικνύουν μια μέση αύξηση 2,23 φορές σε έκφραση σε ιστούς όγκων. Β) συσσώρευση CLPTM1L μεταγραφής όπως μετράται με μικροσυστοιχιών σε κυτταρικές γραμμές όγκου πνεύμονα σε σχέση με τη μέση τιμή των μη μετασχηματισμένων αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές που αποδεικνύουν 2,02 φορές μέση αύξηση στην έκφραση σε κυτταρικές γραμμές όγκου. Γ) στοιχεία έκφρασης γραμμή κυττάρων εκτός από εκείνα τα κυτταρικές γραμμές όγκου με μεταβολή του αριθμού αντιγράφων παρουσιάζοντας 1,83 φορές αύξηση σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. γραμμή D) Cell διαιρείται σε κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος και μικρών κυτταρικών γραμμών καρκίνου του πνεύμονα. Μαύρες μπάρες αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές. p-τιμές ελήφθησαν με τη χρήση t-test δύο ουρών Student.

Η

CLPTM1L προσδίδει αντοχή στην Γονοτοξική στρες που προκαλείται απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα

Από αυξημένη έκφραση του CLPTM1L συνδέεται με πνεύμονα όγκους, στοχεύσαμε να ρυθμίζουν τα επίπεδα CLPTM1L στις κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και να καθορίσει την απόκριση σε γονοτοξικούς παράγοντες. Εξόντωση CLPTM1L σε Α549 και H838 κυτταρικές σειρές πνευμονικού αδενοκαρκινώματος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τρία ανεξάρτητα ιικών φορέων shRNA και οδήγησε σε μια σειρά από βελτιώσεις της αποτελεσματικότητας μέχρι 90%, όπως μετράται με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR και με ανοσοκηλίδα (Σχήμα 2Α και Β). Η επίδραση της CLPTM1L knockdown σε θανάτωση από σισπλατίνη προσδιορίστηκε σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Τα κύτταρα μετρήθηκαν, επιστρώθηκαν σε ίσο αριθμό σε περίπου 50% συρροή, και δοκιμάστηκαν γιά βιωσιμότητα με μέτρηση κυττάρων μετά από 48 ώρες θεραπείας σισπλατίνη. Η θανάτωση των κυττάρων του όγκου πνεύμονα με σισπλατίνη είναι αυξημένο μετά την απώλεια του CLPTM1L σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, που κυμαίνονται από 53% βιωσιμότητα σε κύτταρα Α549 μόνο με φορέα σε 12% βιωσιμότητα σε κύτταρα με shCLPTM1L-3 (Σχήμα 2C). Ομοίως, επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα Α549 με σταθερή knockdown του CLPTM1L χρησιμοποιώντας καμπτοθεκίνη, ένα παρεμποδιστή τοποϊσομεράσης Ι Α549 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ίσους αριθμούς και δοκιμάστηκαν γιά βιωσιμότητα με δοκιμασία MTS μετά από 48 ώρες θεραπείας με καμπτοθεκίνη. Και πάλι, η απώλεια της CLPTM1L μέσω νοκ ντάουν ευαισθητοποιημένα κύτταρα του πνεύμονα όγκου shRNA να δοσοεξαρτώμενη φόνο αποπτωτική κατά τρόπο σύμφωνο με το επίπεδο έκφρασης CLPTM1L (Εικόνα S2), αποδεικνύοντας ότι τα αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα της CLPTM1L δεν είναι αποκλειστικά για σισπλατίνη. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε H838 κύτταρα, η οποία κατέδειξε αυξημένη ευαισθησία σε επαγόμενη καμπτοθεκίνη θανάτωση κατά knockdown έκφρασης CLPTM1L (Σχήμα 2D). Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, εξωγενές υπερέκφραση CLPTM1L σε Η1299 κύτταρα, τα οποία προσδιορίστηκαν για να εκφράσουν σχετικά χαμηλά επίπεδα ενδογενούς μεταγράφου CLPTM1L σύγκριση με Α549 κύτταρα με ανάλυση μικροσυστοιχιών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), είχε ως αποτέλεσμα μια αύξηση της βιωσιμότητας των κυττάρων από 27% με φορέα μόνο σε 36% με CLPTM1L υπερ-έκφραση (p & gt? 0,04) μετά από θεραπεία με καμπτοθεκίνη σε σχέση με τους ελέγχους DSMO διαλύτη (Σχήμα 2Ε)

Α) εξόντωση έκφραση CLPTM1L σε κύτταρα Α549 μέσω σταθερών shRNA.. Επιβεβαίωση των νοκ ντάουν με κηλίδα western (ένθετο). Β) Νοκ ντάουν της CLPTM1L έκφρασης σε κύτταρα H838 με σταθερή shRNA. Επιβεβαίωση των νοκ ντάουν με κηλίδα western (ένθετο). C) Σχετική βιωσιμότητα κυττάρου των Α549 κυττάρων με CLPTM1L knockdown μετά από 48 ώρες αγωγή με μέσο ή σισπλατίνη. Δ) Σχετική βιωσιμότητα κυττάρου των κυττάρων με H838 CLPTM1L knockdown μετά από 48 ώρες αγωγή με φορέα DMSO ή 1 μΜ καμπτοθεκίνης. Ε) Σχετική βιωσιμότητα κυττάρου των Η1299 κυττάρων με CLPTM1L υπερ-έκφραση μετά από 48 ώρες αγωγή με φορέα DMSO ή 10 μΜ καμπτοθεκίνη. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν μία τυπική απόκλιση από το μέσο του βιολογικού τριπλούν.

Η

αννεξίνης V ανοσοφθορισμού ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης της πρώιμης απόπτωσης στα Α549 κύτταρα με ή χωρίς CLPTM1L knockdown και τη θεραπεία cisplatin. Παρατηρήσαμε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην απόπτωση με απώλεια CLPTM1L (Σχήμα 3Α). Ενώ μόνο το 16% των κυττάρων μόνο με φορέα ήταν αποπτωτικά μετά τη θεραπεία cisplatin 10μΜ για 24 ώρες, το 76% των κυττάρων με shCLPTM1L-3 ήταν αποπτωτικά. Αντοχή σε σισπλατίνη απόπτωση που επάγεται βρέθηκε να είναι ανάλογη με την ποσότητα της συσσώρευσης μεταγραφής CLPTM1L σε αυτά τα κύτταρα, με μια r

2 του 0,9808 (p = 2 × 10

-8) μεταξύ τοις εκατό knockdown και τοις εκατό αποπτωτικών κυττάρων ( Εικόνα S3A). Οι συγκεντρώσεις σισπλατίνης στα κατώτερα όρια ευαισθησίας χρησιμοποιήθηκαν για να καταστεί δυνατή η επίλυση των ευαισθησιών που παρέχεται από διαφορετικά επίπεδα CLPTM1L νοκ ντάουν. Οι παράγοντες βλάβης του DNA σισπλατίνη και νιτροζαμίνη 4- (μεθυλ-nitrosamino) -1- (3-πυριδυλ) -1-βουτανόνη (ΝΝΚ) δύο προκαλούνται συσσώρευση ρηγμάτων της έλικας του DNA ανεξάρτητα από την έκφραση CLPTM1L όπως ανιχνεύεται με τη μέθοδο COMET (Σχήμα S4) . Ως εκ τούτου, η παρατηρούμενη αύξηση στην ευαισθησία στη σισπλατίνη tositivity κατά την απώλεια του CLPTM1L οφείλεται σε μία επίδραση επί της απόπτωσης ή αποπτωτική σηματοδότηση παρά μια επίδραση στα επίπεδα της οξείας βλάβης του DNA. Ευαισθησία σε σισπλατίνη απόπτωση που επάγεται αυξήθηκε επίσης με την απώλεια της έκφρασης με CLPTM1L shRNA σε καρκινικά κύτταρα H838 (Εικόνα 3Β), μετρήθηκαν με τη δοκιμασία δραστικότητας χρωματομετρική Caspase 3/7. Πάλι αντίσταση στη σισπλατίνη απόπτωση που επάγεται ήταν ανάλογη προς την ποσότητα της συσσώρευσης μεταγραφής CLPTM1L στα κύτταρα, με μια r

2 του 0,8847 (ρ = 1.3 × 10

-4) μεταξύ τοις εκατό knockdown και σχετική δραστικότητα κασπάσης 3 (Εικόνα S3b). Η εμφάνιση των κυττάρων σε καλλιέργεια είναι συνεπής με αυξημένη ευαισθησία σε επαγόμενη σισπλατίνη απόπτωση μετά την απώλεια του CLPTM1L (Σχήμα 3C).

Α) δέσμευσης αννεξίνης με κυτταρομετρία ροής των κυττάρων Α549 με CLPTM1L knockdown μετά από 48 ώρες αγωγή με σισπλατίνη V . Β) Σχετική κασπάσης 3/7 δραστηριότητα σε H838 κύτταρα με CLPTM1L knockdown μετά από 48 ώρες αγωγή με σισπλατίνη. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν μία τυπική απόκλιση από την μέση τιμή. ** – P & lt? 0,01 * – p & lt? 0,02 από δύο-κατεύθυνσης Student t-test. Γ) Μικρογραφίες των Α549 κυττάρων με CLPTM1L νοκ ντάουν μετά από 24 ώρες θεραπείας με 50 μΜ cisplatin δείχνει αυξημένη γενοτοξική κυτταρικό θάνατο μετά την απώλεια της CLPTM1L.

Η

Κανονισμός του Bcl-xL έκφραση είναι ουσιαστικής σημασίας για την CLPTM1L Επιδράσεις στην απόπτωση

για να διερευνήσουν τον μηχανισμό της CLPTM1L προστασία από την απόπτωση, μετρήσαμε τα επίπεδα της πρωτεΐνης των αποπτωτικών ρυθμιστών σε μη επεξεργασμένα κύτταρα Α549 σε σύγκριση με εκείνους που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη. Για την αξιολόγηση της απαίτησης του CLPTM1L για τη ρύθμιση της απόπτωσης, η πιο αποτελεσματική κατασκευάσματα knockdown σε κύτταρα Α549 (SH2 και SH3) αξιολογήθηκαν. Θεραπεία της Α549 κυττάρων με 20 μΜ επαγόμενη σισπλατίνη συσσώρευση της ρ53 και της προ-αποπτωτικά στόχος p53, Bax, και μειωμένη συσσώρευση της αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-2, σύμφωνα με την βλάβη του DNA που προκαλείται από τις εγγενείς αποπτωτικό μονοπάτι (Σχήμα 4Α). Έκφραση αυτών των αποπτωτικών ρυθμιστών ήταν ανεπηρέαστη από νοκ ντάουν της και μόνο CLPTM1L. Ωστόσο, η αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-xL, ενώ δεν επηρεάζεται από σισπλατίνη θεραπεία σε κύτταρα Α549, μειώθηκε όταν τα επίπεδα CLPTM1L είχαν squelched με έκφραση shRNA. Εξόντωση CLPTM1L με Τα siRNAs μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης Bcl-xL κατά 81% και 76% σε κύτταρα κατεργασμένα σισπλατίνη (ρ & lt? 0.003, Δύο κατεύθυνσης Student t-test), όπως μετράται με τρεις ανεξάρτητες αναλύσεις Western (Σχήμα 4Β). Ως εκ τούτου, εκφράζονται σταθερά εξωγενές Bcl-xL σε κύτταρα με και χωρίς knockdown του CLPTM1L να αξιολογηθεί ο ρόλος των Bcl-xL σε CLPTM1L προστασία από την απόπτωση. Re-έκφραση των Bcl-xL επιβεβαιώθηκε με στύπωμα Western (Σχήμα 4C). Ενώ knockdown του CLPTM1L αυξημένη απόπτωση σε άδειο φορέα επιμολυσμένα κύτταρα κατά 71%, εξωγενές Bcl-xL εξάλειψε την εξαρτώμενη από CLPTM1L απόπτωση (Εικόνα 4D). Αντοχή σε γενοτοξικό στρες που προκαλείται απόπτωση αντιστοιχούσε σε μεγάλο βαθμό με τα επίπεδα του Bcl-XL, και Bcl-xL ανασύσταση καταργηθεί εντελώς ευαισθητοποίηση σε γενοτοξικό στρες που προκαλείται απόπτωση από CLPTM1L.

Α) κηλίδωση Western για αποπτωτικών ρυθμιστών σε κύτταρα Α549 με CLPTM1L νοκ ντάουν μετά θεραπεία με σισπλατίνη παρουσίαζαν μειωμένη έκφραση Bcl-xL μετά την απώλεια του CLPTM1L. Οι Bcl-xL κηλίδες για δύο ξεχωριστά αντιπροσωπευτικά κλωνικών πληθυσμών κυττάρων Α549 με CLPTM1L knockdown (# 1 και # 2) που φαίνεται. Β) Γραφική αναπαράσταση της έκφρασης Bcl-χ σε κύτταρα με CLPTM1L νοκ ντάουν από τρία ξεχωριστά κλωνική populationsA549. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν μία τυπική απόκλιση από την μέση τιμή. * – Ρ & lt? 0.003 από του Student t-test C) κηλίδες Western επιβεβαιώνει την έκφραση εξωγενών Bcl-xL σε Α549 κύτταρα με CLPTM1L knockdown. Δ) Σχετική βιώσιμων κυττάρων σε κύτταρα Α549 με CLPTM1L νοκ ντάουν και έκτοπη έκφραση Bcl-xL μετά από θεραπεία με σισπλατίνη αποδεικνύουν την κατάργηση των αποπτωτικών επίδραση της απώλειας CLPTM1L κατά την έκτοπη έκφραση Bcl-XL.

Η

Συζήτηση

η επιβίωση των κυττάρων που υφίστανται βλάβη στο DNA από γενωμική αστάθεια ή γενοτοξικό στρες οδηγεί στη συσσώρευση των γενετικών αλλοιώσεων που χαρακτηρίζουν ανθρώπινους όγκους. Κατάργηση του σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και αποπτωτικών εγγυήσεις κατά την αντιγραφή του κατεστραμμένου DNA είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου. Το αποτέλεσμα της προστασίας από βλάβες στο DNA που προκαλείται απόπτωση περιλαμβάνει τόσο την ευπάθεια σε ανεξέλεγκτη σωματική μετάλλαξη και μειωμένη ευαισθησία στην ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία. Η προηγουμένως αναφερθείσα μελέτη από Zienolddinny et al. δείχνει ότι οι πολυμορφισμοί CLPTM1L μπορεί να επηρεάσει τη συσσώρευση της βλάβης του DNA [4]. Με βάση τις παρατηρήσεις μας, είναι εύλογο ότι η προστασία από την απόπτωση από CLPTM1L συμβάλλει στη συσσώρευση της βλάβης του DNA, παρέχοντας έτσι την ευαισθησία στην ογκογένεση. Μια εναλλακτική υπόθεση είναι ότι CLPTM1L παίζει ένα ρόλο στην αναγνώριση ή την επισκευή της βλάβης του DNA, που επηρεάζουν τη συσσώρευση τέτοιων ζημιών. Ένας άλλος λόγος είναι ότι CLPTM1L επηρεάζει άμεσα το ποσό της βλάβης του DNA που πραγματοποιήθηκαν από γονοτοξικούς παράγοντες. Τα δεδομένα μας (Σχήμα S4) υποδηλώνει ότι CLPTM1L έκφραση δεν επηρεάζει άμεσα τα επίπεδα της οξείας βλάβης του DNA που πραγματοποιήθηκαν από σισπλατίνη ή ΝΝΚ. Επιπλέον, η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι CLPTM1L έχει ένα αποπτωτικό ρόλο κατάντη της βλάβης του DNA και μέσω της ρύθμισης της έκφρασης Bcl-XL, το οποίο είναι πιθανό να επηρεάσει τη συσσώρευση της βλάβης του DNA. Η παρατήρηση της διαφορικής συσσώρευσης των Bcl-xL μετά διαμόρφωση του CLPTM1L έκφρασης, μαζί με την ανασύσταση ενός ανθεκτικού απόπτωση φαινοτύπου με την έκφραση του εξωγενούς Bcl-XL, παρέχουν αποδείξεις ότι CLPTM1L δρα ανοδικά της Bcl-xL να προσδίδουν αντίσταση σε γενοτοξικό στρες απόπτωση. Στην εξωγενή πειράματα έκφρασης Bcl-xL, φαίνεται ότι οι λιγότερο Bcl-xL εκφράζεται σε φορέα που περιέχει κύτταρα από ό, τι παρατηρήθηκε σε προηγούμενα πειράματα, αν και μειωμένη συσσώρευση σε κύτταρα με CLPTM1L knockdown παραμένει εμφανής. Παράλληλα, αποπτωτικών δολοφονία είναι ελαφρώς πιο ισχυρή σε φορέα που περιέχει κύτταρα που παρατηρήθηκε σε προηγούμενα πειράματα, αλλά η τάση της αυξημένης ευαισθησίας μετά την απώλεια της CLPTM1L και Bcl-xL παραμένει. Σημαντικά, αυτή η μελέτη δείχνει ότι το αντι-αποπτωτική λειτουργία του CLPTM1L δεν είναι αποκλειστική στο σισπλατίνη ευαισθησία, αλλά είναι μία γενική αναστολή της μιτοχονδριακής οδού απόπτωσης.

Κοινό υπερέκφραση του CLPTM1L σε όγκους υποστηρίζει την ιδέα ενός ογκογόνου ή όγκου προώθηση του ρόλου CLPTM1L σε καρκίνους του πνεύμονα. μελέτες έκφρασης πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκαν και σχολιασμένο από το έργο του Ανθρώπου πρωτεΐνη Atlas [24] επιβεβαιώνουν τα ευρήματα μας. Ανοσοϊστοχημεία σε ανθρώπινα κανονικά κύτταρα κυψελιδικού και όγκων του πνεύμονα αποδειχθεί αρνητική έκφραση του CLPTM1L σε φυσιολογικούς ιστούς, ενώ η έκφραση σε 12 όγκους του πνεύμονα κατά μέσο όρο μία βαθμολογία 1,91 σε μια κλίμακα από 0-3 (Σχήμα S5). Μια βαθμολογία 0 είναι αρνητική, 1 είναι «αδύναμη», το 2 είναι «μέτρια» και 3 είναι «ισχυρή». Έξι από αυτούς τους ασθενείς διαγνώστηκαν με καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων και των έξι διαγνώστηκαν με αδενοκαρκίνωμα. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην έκφραση μεταξύ των δύο παθολογίες. Ένα σύνολο από 66 φυσιολογικούς ιστούς από διάφορα όργανα βαθμολογήθηκαν με μέσο όρο 0,98 (αδύναμη). Κανένας από τους όγκους του πνεύμονα που ελέγχθηκαν ήταν αρνητικά. Πνεύμονα κυτταρικές γραμμές όγκου Α549 (NSCLC) και SCLC-21H (μικρό κύτταρο) έδειξαν ισχυρή χρώση και μέτρια χρώση, αντίστοιχα.

δεδομένα μικροσυστοιχιών από όγκο και αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές καταδεικνύει ότι οι μηχανισμοί εκτός από αντίγραφο αποτέλεσμα κέρδος αριθμό σε αυξημένη έκφραση σε ένα υποσύνολο των όγκων. Σε ευρεία ενώσεις γονιδιώματος, οι λογαριασμοί θέση 5 p15.33 για τη μεγαλύτερη συμβολή στον κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα τριών γνωστών θέσεων στον άνθρωπο [6]. Το 5 ρ τόπος εμπλέκεται επίσης σε δερματική καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων και μελάνωμα [25], τον καρκίνο των ωοθηκών [26], ο καρκίνος των όρχεων γεννητικών κυττάρων [27] και του καρκίνου του τραχήλου με κέρδος αριθμού αντιγράφων [8]. Στη μελέτη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, CLPTM1L προέκυψε από την 5 ρ τόπο ως έχουσα πρότυπα έκφρασης που συσχετίζεται με αύξηση του αριθμού αντιγράφων. Μια άλλη πρόσφατη μελέτη του αριθμού και η έκφραση αντιγράφων αλλαγές στην αυχενική καρκινικές κυτταρικές σειρές αποκάλυψαν ότι με την αύξηση του αριθμού αντιγράφων σε 5 ρ, CLPTM1L εκφράσεως είναι αυξημένο περίπου 5 φορές πάνω από φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας, ενώ η έκφραση των άλλων γονιδίων σε 5 p15.33 δεν ήταν αλλαγμένο [9]. Το γονίδιο TERT είναι επίσης εντός αυτής της γενετικής περιοχής. Σε ανάλυση του SNPs στην 5 ρ περιοχή, έχουμε βρει ότι ο καρκίνος του πνεύμονα σχετίζεται SNPs δεν σχετίζονται με το μήκος των τελομερών (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), σε συμφωνία με δύο άλλες μελέτες [28], [29]. Σε αντίθεση, μια μελέτη από Rafnar et al. έδειξε σύνδεσης (

σ

= 0,017 και 0,027, αντίστοιχα) μεταξύ 5 σ παραλλαγές (rs401681 και rs2736098) και το μήκος των τελομερών, αν και η επίδραση αυτή παρατηρήθηκε μόνο όταν οι γυναίκες ηλικίας άνω των 75 ετών με ομόζυγη γονότυπους συμπεριλήφθηκαν [30 ]. Για τις γνώσεις μας, δεν υπάρχουν κοινά κωδικοποίησης μεταλλάξεις είτε CLPTM1L ή TERT έχουν ταυτοποιηθεί. Είναι εύλογο ότι τόσο TERT και CLPTM1L συμβάλλουν στην ευπάθεια σε αυτό τον τόπο, που έχει ένα αποτέλεσμα συν-ιδρυτής. Μια πρόσφατη μελέτη [5] παρέχει πολλαπλές γραμμές αποδείξεις ότι η συσχέτιση του καρκίνου του πνεύμονα rs31489 στο γονίδιο CLPTM1L είναι μια ανεξάρτητη παρατήρηση από την ένωση του rs2376100 στο γονίδιο TERT. Η πιο πρόσφατη μελέτη πυκνά γονοτυπική 5 p15.33 βρέθηκαν πολλαπλές ενώσεις σε 5p15.33, με την περιοχή της ένωσης που επικεντρώνεται πάνω CLPTM1L [7]. προηγούμενη ανάλυσή μας δείχνει ότι rs31489 είναι η παραλλαγή πιο έντονα συνδέεται με οικογενή καρκίνο του πνεύμονα σε αυτό το τόπο. Η τρέχουσα μελέτη υποδεικνύει ότι CLPTM1L παίζει επίσης σημαντικό λειτουργικό ρόλο σε σχέση με τον καρκίνο, και ότι αυτό το γονίδιο μπορεί να είναι τουλάχιστον εν μέρει υπεύθυνη για τη σύνδεση των παραλλαγών στην περιοχή 5p15.33 με καρκίνο του πνεύμονα. Συνεχείς προσπάθειες για να καθορίσει περαιτέρω τη γενετική παραλλαγή οδήγηση ευαισθησία του καρκίνου του πνεύμονα σε αυτήν την γενετική περιοχή είναι ένα σημαντικό επόμενο βήμα στην αξιολόγηση της σχέσης των CLPTM1L και άλλων γονιδίων στην περιοχή με την ευαισθησία του πνεύμονα όγκου.

Κοινή υπερέκφραση του CLPTM1L στον πνεύμονα όγκους και ένα λειτουργικό ρόλο στην επαγόμενη από γενοτοξικό στρες απόπτωση εντοπισμό CLPTM1L ως σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει την επιβίωση του DNA κατεστραμμένων κυττάρων όγκου και πιθανώς ευαισθησίας στον καρκίνο του πνεύμονα. Στόχευση CLPTM1L καθώς και Bcl-xL μπορούν να αποδειχθούν χρήσιμες προσεγγίσεις για χημειοπροφύλαξη και θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. Στόχευση αυτά τα αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών μπορεί επίσης να έχει δυνατότητα για ευαισθητοποίηση των όγκων με τις παραδοσιακές χημειοθεραπείες και radiotherapies.

Υλικά και Μέθοδοι

RT-ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Ασθενής συμφωνημένα όγκου και φυσιολογικά δείγματα RNA καρκινικά-δίπλα ελήφθησαν από τον πυρήνα Tissue Προμηθειών στο Πανεπιστήμιο Ουάσιγκτον στο Σεντ Λούις στο πλαίσιο του πρωτοκόλλου που εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο κριτική Θεσμικών στο Πανεπιστήμιο Ουάσιγκτον στο Σεντ Λούις Ιατρική Σχολή, Γραφείο Προστασίας Ανθρωπίνων Έρευνας. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς που συμμετέχουν σε αυτή την τράπεζα ιστών. RNA απομονώθηκε από τις κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Tri-ζολεδρονικό οξύ και τα πρωτόκολλα (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qPCR) διεξήχθη χρησιμοποιώντας τη μέθοδο όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Chaparro, Wen et al. 2005). Εν συντομία, ένα μικρογραμμάριο του συνολικού RNA ανά δείγμα μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας το σύστημα SuperScript First-Strand Synthesis για RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ποσοτική δοκιμασία RT-PCR έγινε χρησιμοποιώντας την SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Ένα μικρολίτρο cDNA προστέθηκε σε ένα 25 μL συνολικός όγκος μίγματος αντίδρασης που περιέχει νερό, SYBR Green PCR Master Mix, και εκκινητές. Κάθε δοκιμασία πραγματικού χρόνου έγινε εις διπλούν σε ένα μηχάνημα MyIQ BioRad. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με το λογισμικό Stratagene MX3000. Η

β-ακτίνης

γονίδιο (Actb) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για να υπολογιστεί το σχετικό επίπεδο έκφρασης (ΔΟ

T) για κάθε δείγμα. Primer απόδοση σετ και γραμμικότητα υπολογίστηκε, και την ομαλοποίηση εκτελέστηκε σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές MIQE. Η αναδίπλωση αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης σε ιστούς όγκων σε σύγκριση με τα ζεύγη φυσιολογικούς ιστούς υπολογίστηκε ως 2

d, όπου d = ΔΟ

T

κανονικό -. ΔΟ

T όγκου

Microarray Ανάλυση

μικροσυστοιχίες έκφρασης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Illumina HumanWG-6 V3 πλατφόρμα, η οποία περιέχει 48.800 ανιχνευτές που αντιστοιχούν σε 20.700 μοναδικά γονίδια. RNAs (500 ng) σημάνθηκαν και υβριδοποιήθηκαν σε συστοιχίες BeadChip όπως καθορίζεται από τον κατασκευαστή (www.illumina.com). δεδομένων Array προ-επεξεργασία με τον αλγόριθμο MBCB (Ding, LH et al, Ναοί Acids Research, 2008, 36:. Ε58). και η διαφορική έκφραση προσδιορίστηκε με τον υπολογισμό φορές αλλαγή και τη δοκιμή Τ

Cell Culture, νοκ ντάουν και υπερέκφραση

κύτταρα Α549 (ATCC, Manassas, VA), επικυρωμένο πρόσφατα από Genetica Laboratores, Inc. (Cinncinati, ΟΗ), καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συν 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Τα κύτταρα σε μεταγωγή με φορείς λεντοϊού βραχείας φουρκέτας RNA (shRNA) με βάση τον φορέα pLKO.1 και σχεδιάστηκε για να στοχεύει ειδικά την ανθρώπινη CLPTM1L μεταγραφής (Sigma, St. Louis). Άδειο φορέα ή φορέα χτυπήσει κάτω CLPTM1L μεταγραφής πρώτα συσκευάζονται σε κύτταρα 293Τ (Orbigen, San Diego, CA) με βοηθητικά πλασμίδια και μετά να μεταχθεί σε κύτταρα Α549 με 8 μg /ml Polybrene (Sigma, St. Louis, ΜΟ). Το μέσο αντικαταστάθηκε 24 ώρες μετά την μεταγωγή, και κύτταρα χωρίστηκαν 1:04 48 ώρες μετά την μεταγωγή. Στις 72 ώρες μετά την μεταγωγή, τα κύτταρα που φιλοξενούν λεντοϊού κατασκευάσματα επιλέχθηκαν με 1 μg /ml πουρομυκίνη για 2-4 ημέρες, μέχρι mock μολυσμένων κυττάρων ήταν νεκρά. Surviving κύτταρα συνενώθηκαν

pBABEpuro φορέα έκφρασης ή pBABEpuro:. CLPTM1L, κλωνοποιήθηκε με PCR από pOTB7-CLPTM1L, (Thermo Scientific), σε EcoRI /SalI θέσεις ρΒΑΒΕ-puro, μετασκευάστηκε σε Η1299 κύτταρα. Τα επιμολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη μέχρις ότου ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα ήταν νεκρά.

διάνυσμα pSSFV Bcl-xL έκφρασης (Addgene πλασμίδιο 8749) ή κενό φορέα επιμολύνθηκε σε κύτταρα με και χωρίς knockdown του CLPTM1L όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα επιμολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με Geneticin (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Βιωσιμότητα Δοκιμασία

Cells εκφράζουν σταθερά διανύσματα shRNA όπως περιγράφεται παραπάνω σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων δίσκους καλλιέργειας ιστού σε ίσες πυκνότητες περίπου 50% εις τριπλούν. Μετά την προσκόλληση όλη τη νύκτα ακολουθούμενο από 48 ώρες θεραπείας με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης (Sigma, St. Louis, ΜΟ) διαλυμένη σε μέσα, καμπτοθεκίνη (Sigma, St. Louis. ΜΟ) διαλύθηκε σε DMSO (Sigma, St. Louis, ΜΟ) ή διαλύτη DMSO μόνο. Οι συγκεντρώσεις DMSO σε μέσα καλλιέργειας διατηρήθηκαν συνεπής και ήταν στο ή κάτω από 0,08%. Τα κύτταρα αναλύθηκαν για αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων με βαφή κυανούν τρυπανίου και μετρήθηκαν σε ένα αυτοματοποιημένο Countess κύτταρο-counter (Invitrogen, Carlsbad, CA). Για τις δοκιμασίες καμπτοθεκίνη, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με Κυττάρου Titer Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού 96 Υδατικό One Solution κυττάρων (MTS) στις 24 πηγαδιών πλάκες καλλιέργειας ιστού εις τριπλούν. Ρ-τιμές προσδιορίστηκαν από την T-Test μονόπλευρο Student.

Κυτταρομετρίας Ροής

Τα υποδεικνυόμενα κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24 ώρες με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης επί 10 cm δίσκους καλλιέργειας ιστού. 10

6 κύτταρα πλύθηκαν και αιωρήθηκαν σε PBS και χρωματίστηκαν με Αννεξίνη V-FITC. Κύτταρα σε χρώση διάλυμα αραιώθηκαν με 500 μΙ PBS και αναλύθηκαν σε Coulter κυτταρομετρητή ροής.

Caspase 3/7 Δοκιμασία

Τα υποδεικνυόμενα κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητες από 5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο μίας πλάκας καλλιέργειας ιστών 12 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται με γονοτοξικούς παράγοντες μετά τη σύνδεση όλη τη νύχτα. Κασπάσης 3 και 7 δραστικότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας SensoLyte® Ομογενή RH110 Caspase – 3/7 Assay Kit (Anaspec, Fremont, CA)

Western Blotting

Τα υποδεικνυόμενα κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη σε. οι υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις σε πλάκες 6 φρεατίων για 72 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν με 100 μΙ 1Χ ΝΡ40 ρυθμιστικό λύσης που περιέχει αναστολείς πρωτεϊνάσης, ψαλιδισμένα 10 φορές με βελόνα 28 gauge, στροβιλίστηκε στις 16,000 χ g για 30 λεπτά, κανονικοποιούνται με συγκέντρωση πρωτεΐνης όπως προσδιορίζεται με τη μέθοδο Bradford, και το υπερκείμενο βρασμένο για 10 min. 20 μΙ κανονικοποιημένου λύματος επιλύθηκε με SDS-PAGE και ανοσοκηλίδωση αναλύθηκαν με υποδεικνυόμενα αντισώματα. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-CLPTM1L κουνελιού (Sigma, St. Louis, ΜΟ), αντι-βήτα κουνελιού τουμπουλίνης (Sigma, St. Louis, ΜΟ), ποντικού αντι-Bcl2 κλώνος 124 (Dako, Carpinteria, CA), κουνέλι αντι-Βαχ # 2774 (Cell Signaling, Boston, ΜΑ), αντι-ρ53 ποντικού (Ab-1) (Oncogene, San Diego, CA), Bcl-xL – Bcl2L1 κουνελιού (Abcam, Cambridge, ΜΑ). Ο ποσοτικός προσδιορισμός της Δυτικής αναλύσεις των τριών ανεξάρτητων πολιτισμών έγινε με τη χρήση του λογισμικού J Image διαθέσιμα στο διαδίκτυο από ΝΙΗ σε https://rsbweb.nih.gov. P-τιμές που καθορίζονται από την T-Test μονόπλευρο μαθητή.

COMET Δοκιμασία

Η μέθοδος βασίζεται ηλεκτροφόρηση γέλης για την ανίχνευση της βλάβης του DNA διεξήχθη τροποποιήθηκε από την Ελιά, et al.

Φύση πρωτόκολλα

1, 23-29 (2006). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του ΝΝΚ, σισπλατίνη ή διαλύτη DMSO 0,1% για 24 ώρες. πλάκες μικροσκοπίου προ-επικαλύπτονται με χαμηλό σημείο τήξης αγαρόζης (Sigma, St. Louis, ΜΟ) 1% σε dH2O και ξηραίνεται. Ένα mL από χαμηλού σημείου τήξεως αγαρόζης 1% σε dH2O διατηρήθηκε στους 40 ° C προστέθηκε σε 0,4 mL ενός εναιωρήματος των 2 × 10

4 κύτταρα /mL σε κρύο μέσα ενημέρωσης. Το μίγμα αγαρόζης /κυττάρων (1 ml /slide) απλώθηκε στις προ-επικαλυμμένες πλάκες.