Αφηρημένο

τηλέφωνα που βασίζονται σε ενεργό ανοσοθεραπεία για τον καρκίνο είναι μια πολλά υποσχόμενη νέα στρατηγική, με το πρώτη δενδριτικών κυττάρων (DC) εμβόλιο επίτευξη ρυθμιστική έγκριση για κλινική χρήση το περασμένο έτος. Βιομηχανία παραμένει επίπονη, ειδικά για τα εμβόλια DC, και η προοπτική της χρήσης με βάση κύτταρα ανοσοθεραπεία στην επικουρική θεραπεία ή σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία παραμένει σε μεγάλο βαθμό έχουν δοκιμαστεί. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε μια συγκριτική προσέγγιση ογκολογίας να δοκιμάσει την ασφάλεια και την πιθανή αποτελεσματικότητα όγκου φορτωμένα με RNA, CD40-ενεργοποιημένα Β κύτταρα σε ιδιόκτητες σκύλους που παρουσιάζουν με λέμφωμα μη Hodgkin (NHL), ένα κλινικό σενάριο που αντιπροσωπεύει όχι μόνο ένα σημαντικό πρόβλημα στην κτηνιατρική αλλά και μια καλόπιστη αυθόρμητο ζωικό μοντέλο για την ανθρώπινη κατάσταση. Όταν χορηγείται σε σκύλους NHL σε ύφεση μετά από χημειοθεραπεία εφόδου, CD40-Β κύτταρα ηλεκτροδιατρήθηκαν

ex vivo

με αυτόλογα RNA καρκινικά διεγείρεται με ασφάλεια ανοσία

in vivo

. Παρά το γεγονός ότι η χημειοθεραπεία συν εμβολιασμού CD40-Β δεν βελτίωσε time-to-εξέλιξης ή λέμφωμα ειδικά επιβίωσης σε σύγκριση με τους σκύλους που έλαβαν μόνο χημειοθεραπεία, ο εμβολιασμός ενίσχυσε τις επιδράσεις της θεραπείας διάσωσης και βελτίωσε το ποσοστό των διαρκών δεύτερης ύφεσης καθώς και τις μεταγενέστερες λέμφωμα ειδικά επιβίωση μετά από θεραπεία διάσωσης. Αρκετά από αυτά τα υποτροπιάζοντα σκυλιά είναι πλέον μακροχρόνια επιζώντες και απαλλαγμένα από τη νόσο για περισσότερο από ένα χρόνο. Συνολικά, αυτά τα κλινικά και ανοσολογικά αποτελέσματα δείχνουν ότι με βάση τα κύτταρα εμβολιασμό καρκίνου CD40 είναι ασφαλές και συνεργεί με χημειοθεραπεία για τη βελτίωση της κλινικής έκβασης σε κυνικός NHL. Γενικότερα, τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν τη μοναδική αξία των κλινικών ερευνών σε ζώα συντροφιάς που φέρει όγκο

Παράθεση:. Sorenmo KU, Krick Ε, Coughlin CM, Overley Β, Gregor TP, Vonderheide RH, et al. (2011) CD40-ενεργοποιημένων Β κυττάρων του καρκίνου εμβόλιο Βελτιώνει Δεύτερη Κλινικής Ύφεσης και επιβίωσης σε ιδιόκτητα σκυλιά με λέμφωμα non-Hodgkin. PLoS ONE 6 (8): e24167. doi: 10.1371 /journal.pone.0024167

Συντάκτης: Eric J. Bernhard, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15η Απριλίου του 2011? Δεκτές: 1 Αυγ 2011? Δημοσιεύθηκε: 31 Αυγούστου, 2011

Copyright: © 2011 Sorenmo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη Συμμαχία για τον Καρκίνο Gene Therapy (RHV), το Ίδρυμα Onyx και Breezy (KUS), ο Barry και Savannah Ταμείο Poodle Memorial και η Μαρί Lowe Συγκριτική Ογκολογικό Κέντρο (NJM), το Πρόγραμμα Ανοσοβιολογικό του Κέντρου Καρκίνου Abramson κατά τη Πανεπιστήμιο της Πενσυλβάνια (ΝΙΗ P30 επιχορήγηση CA016520, RHV), και το ταμείο Ογκολογίας Έρευνας στο Κτηνιατρικό Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου της Πενσυλβάνια (KUS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

με την πρόσφατη έγκριση FDA του εμβολίου δενδριτικών κυττάρων sipuleucel-Τ για τη θεραπεία του προχωρημένου καρκίνου του προστάτη [1], υπήρξε ανανέωση των προσπαθειών για την περαιτέρω βελτιστοποίηση θεραπείες που βασίζονται σε κύτταρα δεύτερης γενιάς με στόχο την τόνωση αντι- ανοσίας όγκου για τη θεραπεία του καρκίνου [2] – [3]. Επειδή η χρήση του ηρεμίας ή μη ενεργοποιημένων κυττάρων που εμφανίζουν αντιγόνο (APC) μπορεί να προκαλέσει πραγματικά αντιγόνου-ειδική ανοχή Τ κυττάρων και ως εκ τούτου είναι ιδιαίτερα αντιπαραγωγικό εάν χορηγηθούν σε ασθενείς, είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη και σκευάσματα APC δοκιμασία που προβλέπεται ρητά, ειδικά για την ενεργοποίηση APC είτε

in vivo

ή

ex vivo

. Μία προσέγγιση που έχει προκύψει είναι φαρμακολογική εγκάρσια σύνδεση του CD40 που εκφράζεται επί της επιφανείας του APC [4], προκειμένου να πλειορύθμιση MHC και συν-διεγερτικά μόρια, διεγείρει την έκκριση φλεγμονωδών κυτοκινών όπως IL-12, και ρυθμίζουν αντι-αποπτωτική μόρια – μια διαδικασία συλλογικά γνωστή ως «αδειοδότησης APC» που επιτρέπει την ενεργοποίηση των αφελή CD4 + και CD8 + Τ κύτταρα και τόνωση ισχυρή αποκρίσεις μνήμης Τ κυττάρων [5]. Κλινικά αντιδραστήρια που ενεργοποιούν CD40 έχουν αναπτυχθεί για συστηματική χρήση και παρουσίαζαν κλινικά υπόσχεση [6] – [8], αλλά αυτοί οι παράγοντες δεν πρέπει απαραίτητα οδηγούν αποκρίσεις Τ κυττάρων

in vivo

λόγω περιοριστικά χαρακτηριστικά της μικροπεριβάλλον του όγκου [8]. Εδώ, μελετάμε ένα

ex vivo

προσέγγιση στην αδειοδότηση APC. Παρά το γεγονός ότι τα δενδριτικά κύτταρα στα περισσότερα μοντέλα είναι τα κύτταρα κυρίως υπεύθυνα για φυσιολογική Τ κυττάρων αστάρωμα

in vivo

, Β κύτταρα μπορούν επίσης να δράσουν ως APC και μπορεί επίσης να έχουν λάβει άδεια από την ενεργοποίηση CD40 [9] – [10]. CD40-ενεργοποιημένα Β κύτταρα (CD40-Β), όπως και DC, μπορεί προνομιακή αφελείς αποκρίσεις Τ κυττάρων έναντι νεοαντιγόνων

ex vivo

και μπορεί να ενισχύσει αποκρίσεις μνήμης Τ κυττάρων [9] – [11], υποδηλώνοντας ότι φορτωμένο με αντιγόνο , CD40-Β μπορεί να αντιπροσωπεύει μια βιώσιμη εναλλακτική λύση για DC σε στρατηγικές εμβολιασμού που βασίζονται στα κύτταρα. Σε έντονη αντίθεση με DC, ωστόσο, Β κύτταρα μπορούν να επεκταθούν εύκολα

in vitro

χρησιμοποιώντας CD40 σύνδεση, αφαιρώντας την ανάγκη των μεγάλων λευκαφαίρεση όγκου (όπως απαιτείται για την κατασκευή sipuleucel-T) για την προμήθεια επαρκούς αριθμού των APC για επαναλαμβανόμενες εμβολιασμοί [9] – [10], [12]. Μολονότι CD40-Β μπορεί να αυξήσει το αντιγόνο-ειδικών αποκρίσεων Τ κυττάρων τελεστών

in vitro

έναντι ιικών και σχετίζεται με όγκο αντιγόνα, λίγα είναι γνωστά αν αυτές οι εναλλακτικές APC μπορεί να διεγείρει αποτελεσματική κατά του όγκου ανοσοαποκρίσεων

in vivo

.

Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, έχουμε πραγματοποιήσει μια κλινική δοκιμή ενός εμβολίου CD40-Β σε ιδιόκτητες σκύλων (κατοικίδια ζώα) με λέμφωμα non-Hodgkin λέμφωμα (NHL). Canine NHL αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό πρόβλημα υγείας σε σκύλους και μερίδια παρόμοια κλινική, συμπεριφορικές, γενετικών και κυτταρογενετική χαρακτηριστικά για NHL στον άνθρωπο. Είναι πλέον ευρέως αποδεκτή ως κλινικά σχετική σύστημα μοντέλο στο οποίο να αξιολογήσει την ασφάλεια και την αποτελεσματικότητα νέων θεραπευτικών παραγόντων πριν από μετάφρασή τους σε κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους [13]. Όπως και σε ανθρώπους ασθενείς με NHL, το πρότυπο φροντίδας για την αρχική θεραπεία του σκύλου NHL αποτελείται από τα πρωτόκολλα συνδυασμού χημειοθεραπείας. Αν και χημειοθεραπεία εφόδου είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικό και 60% -85% των σκύλων επιτευχθεί πλήρης κλινική ύφεση μετά τη θεραπεία επαγωγής, σχεδόν όλα τα σκυλιά υποτροπή εντός ενός έτους με νόσο ανθεκτική στα φάρμακα και πεθαίνουν από λέμφωμα [14] – [15]. Τα ποσοστά ίασης του σκύλου NHL δεν έχουν αλλάξει σημαντικά κατά τις τελευταίες δεκαετίες, παρά τη χρήση των πρωτοκόλλων πιο δόσης έντονη.

Σε αυτή τη μελέτη, θα δοκιμαστεί κλινικά θεραπευτικό πλατφόρμα που έχουμε περιγράψει προηγουμένως σε προκλινικές μελέτες [12 ] στην οποία τα Β κύτταρα από τους σκύλους NHL επεκτάθηκε

in vitro

χρησιμοποιώντας CD40L επιμολυσμένα κύτταρα Κ562 (KtCD40L) και κατόπιν φορτώθηκε με αυτόλογα RNA όγκου για να δημιουργήσει ένα εμβόλιο που βασίζεται σε κύτταρα. Φορτωμένα με RNA του CD40-Β προέρχεται από κυνόδοντα περιφερικού αίματος Β κύτταρα διεγείρουν λειτουργική, ειδικών για το αντιγόνο αποκρίσεων των Τ κυττάρων

in vitro

από υγιείς σκύλους και από σκύλους με αυθόρμητα συμβαίνουν NHL [12]. Η χρήση ολόκληρων RNA όγκου ως αντιγονική ωφέλιμο φορτίο επιτρέπει την HLA-ανεξάρτητο, όλη προσέγγιση αντιγόνο που έχει ως στόχο να προωθήσει ένα πολύκλωνο αντι-όγκου απόκριση των Τ κυττάρων. Εδώ, αναφέρουμε την πρώτη κλινική δοκιμή σε οποιοδήποτε είδος του RNA όγκου εμβόλιο φορτωθεί καρκίνο του CD40-B, πραγματοποιείται στη ρύθμιση της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι CD40-Β μπορεί να τονώσει το ανοσοποιητικό απαντήσεις

in vivo

εν λόγω επιπτώσεων δεύτερη ύφεση και την επιβίωση σε μια αυθόρμητη, μεγάλο ζωικό μοντέλο NHL. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το αντιγόνο του όγκου φορτώνεται CD40-Β μπορεί να χρησιμεύσει ως πρακτική εναλλακτική λύση για DC σε στρατηγικές εμβολίου που βασίζεται σε κύτταρα και για τα δύο σκύλους και ανθρώπους με καρκίνο.

Αποτελέσματα

Ιδιόκτητο πρωτόκολλο σκύλος

Τριάντα ιδιόκτητα σκυλιά με NHL εντάχθηκαν στην παρουσίαση της νόσου σε αυτή την προ-κλινική δοκιμή σκοπιμότητας και υποβλήθηκαν σε χημειοθεραπεία εφόδου (Ομάδα 1? πρόθεση θεραπείας). Τα χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Δεκαεννέα σκύλοι (63%) επιβεβαιώθηκαν να είναι σε πλήρη κυτταρολογική και κλινική ύφεση στο τέλος της χημειοθεραπείας και ήταν ως εκ τούτου είναι επιλέξιμα για εμβολιασμό με αυτόλογα CD40-ενεργοποιημένα Β κύτταρα (κάθε δεύτερη εβδομάδα για τρεις ενδοδερμικές ενέσεις στο πλευρό) που είχε φορτωθεί με ολικό RNA απομονώθηκε προηγουμένως από αυτόλογα κύτταρα λεμφώματος (Μέθοδοι και υλικά, και Συμπληρωματικό Μέθοδοι) (Ομάδα 2). Ένας ίσος αριθμός αυτόλογων CD40-Β φορτωμένο με κυνικός αιμοσυγκολλητίνη ιού λοιμός mRNA εγχύθηκε στην αντίθετη πλευρά ως ένα ανοσολογικό έλεγχο. Εξήντα τέσσερις σκύλους με NHL επιλέχθηκαν από μία ομάδα 130 σκυλιά ως μάρτυρες για την μη εμβολιασμένη ομάδα (Ομάδα 3). Αυτά τα σκυλιά επιλέχθηκαν με βάση το γεγονός ότι υποβλήθηκαν σε θεραπεία με την ίδια επαγωγή χημειοθεραπείας αγωγή ως εμβολιασμένη ομάδα (Ομάδα 2) και επιβεβαιώθηκαν να είναι σε πλήρη κλινική και κυτταρολογικών ύφεση κατά το τέλος του πρωτοκόλλου χημειοθεραπείας, αλλά δεν έλαβαν CD40 -Β εμβόλια κυττάρων. Δεν υπήρχαν κίνητρα για σκύλους σε κάθε ομάδα για να λαμβάνετε χημειοθεραπεία αποφεύγοντας έτσι οποιαδήποτε προκατάληψη στη θεραπευτική προσέγγιση ή την ένταση της θεραπείας. Αν και ο αριθμός των σκύλων στην ομάδα ελέγχου (Ομάδα 3) ήταν μεγαλύτερη από την εμβολιασμένη ομάδα σκυλιών (Ομάδα 2), δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε προγνωστικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων ανοσοφαινότυπος μεταξύ των ομάδων 2 και 3 (Πίνακας 1).

Τοξικότητα

ο εμβολιασμός με RNA φορτωμένο CD40-B ήταν πολύ καλά ανεκτή. Ένας σκύλος εμφάνισε σημάδια οξείας συστημικής αντίδρασης, συμπεριλαμβανομένης της αδυναμίας, υπόταση, έμετο και μέσα σε λίγες ώρες από τη λήψη του πρώτου εμβολίου. Η θεραπεία με ενδοφλέβια υγρά, διφαινυδραμίνη και αντι-εμετικά οδήγησε σε αδιατάρακτο ανάκαμψη. Αυτό το συγκεκριμένο σκυλί προεπεξεργασία με διφαινυδραμίνη αμέσως πριν από τις 2 επόμενες εμβολιασμούς, και δεν προέκυψαν περαιτέρω συστηματικές αντιδράσεις. Ήπιες αντιδράσεις στο σημείο της ένεσης που περιλαμβάνουν ερύθημα και οίδημα συνέβη σε πολλά σκυλιά. Δεν υπήρχαν σημαντικές μεταβολές στην πλήρη χημείες αίματος κατά τη διάρκεια ή μετά τον εμβολιασμό σε οποιοδήποτε από τα σκυλιά. Επιπλέον, δεν υπάρχει μακροχρόνιες επιπλοκές του εμβολιασμού, όπως αυτοανοσία εντοπίστηκαν κλινικά, clinicopathologically (παρακολουθείται από σειριακή CBCs) ή κατά τη νεκροψία.

Τα κλινικά αποτελέσματα

Ο διάμεσος χρόνος μέχρι την εξέλιξη της νόσου (TTP) ήταν 236 ημέρες (διαστήματα εμπιστοσύνης 95% [CI], 158-314 ημέρες) στην ομάδα 1 (πρόθεση για θεραπεία), 366 ημέρες (95% CI, 349 – 383 ημέρες) στην ομάδα 2 (εμβολιασμένα σκυλιά), και 327 ημέρες (95 % CI, 223-431) στην ομάδα 3 (μη εμβολιασμένων σκύλων). Δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στη ΤΤΡ μεταξύ Ομάδες 1 και 3 (ρ = 0,16) ή τις ομάδες 2 και 3 (ρ = 0,34). Οι Kaplan Meier καμπύλες για ΤΤΡ φαίνεται στα Σχ. 1Α και 2Α. Διάμεση λέμφωμα συγκεκριμένες επιβίωση (LSS) ήταν 489 ημέρες στην ομάδα 1 (95% CI, 309 έως 669 ημέρες), 809 ημέρες στην ομάδα 2 (95% CI, 289 έως 1335 ημέρες), και 594 ημέρες στην ομάδα 3 (95% CI, 536-652 ημέρες). Οι Kaplan Meier καμπύλες για LSS φαίνεται στα Σχ. 1Β και 2Β. Αν και υπήρχε μια βελτίωση 36% στο μεσαίο LSS στο εμβολιασμένο Group 2 σε σύγκριση με την μη εμβολιασμένη ομάδα ελέγχου 3, η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0.18). Ομοίως, δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στη μέση LLS μεταξύ των ομάδων 1 και 3 (p = 0,37). Το συνολικό ποσοστό επιβίωσης στην ομάδα 2 και ομάδα 3 σκύλους σε 1 έτος ήταν 89,5% και 74,1%, αντίστοιχα, και στο έτος 2 ήταν 41,4% και 25,4%, αντίστοιχα. Δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στη συνολική επιβίωση, υποδεικνύοντας ότι ο εμβολιασμός δεν αυξάνει τη θνησιμότητα.

Η

Δεκαπέντε από τα 19 (79%) εμβολιασμένοι σκύλοι της ομάδας 2, τελικά υποτροπίασαν, αλλά 4 σκύλους (21 %) δεν το έκανε και πέτυχε ένα ανθεκτικό (& gt? 16 μήνες) πρώτη ύφεση μετά τη χημειοθεραπεία και CD40-Β εμβολιασμό. Ένα από αυτά τα τέσσερα σκυλιά πέθαναν από άσχετες αιτίες σε 492 ημέρες χωρίς ενδείξεις λεμφώματος επιβεβαιωθεί από τη νεκροψία. Τα άλλα 3 σκυλιά είναι ζωντανοί χωρίς ενδείξεις λεμφώματος σε 959, 1103, και 1287 ημέρες μετά την έναρξη της χημειοθεραπείας (με την κλινική παρακολούθηση σε εξέλιξη). Δέκα από τα εμβολιασμένα σκυλιά (52,6%) πέθαναν εξαιτίας λεμφώματος? έξι παραμείνουν ζωντανά σε διαρκή πρώτη ή δεύτερη ύφεση, και 3 υποβλήθηκαν σε ευθανασία οφείλεται σε άλλες αιτίες. Δύο από τα τρία σκυλιά ευθανασία είχε αιμαγγειοσαρκώματος, χωρίς ενδείξεις λεμφώματος, και ο άλλος σκύλος υποβλήθηκε σε ευθανασία λόγω της «μείωσης της υγείας.» Περιορισμένη επεξεργασία αυτή επιτρέπεται σε αυτό το σκυλί, αλλά νεκροψία δεν βρήκε κανένα στοιχείο του λεμφώματος. Η αιτία της μείωσης της υγείας δεν είχε εντοπιστεί? Ωστόσο, δεν υπήρξε ένδειξη της αυτοανοσίας και όλων των κυτταρικών σειρών με πλήρους ωρίμανση ήταν παρόντα στο μυελό των οστών. Ένα σύνολο 7 σκύλους υποβλήθηκαν σε νεκροψία όταν πέθαναν ή θανατώθηκαν. Με την εξαίρεση των 3 σκύλων που συζητήθηκαν προηγουμένως, όλα τα άλλα σκυλιά (4 σκύλοι) ευθανατώθηκαν λόγω προχωρημένου σταδίου λέμφωμα και δεν είχαν ενδείξεις αργά τοξικότητες από το εμβόλιο. Τέσσερις από τους 64 σκύλους στην ομάδα ελέγχου (ομάδα 3) χάθηκαν κατά την παρακολούθηση μετά την αναβίωση και πληροφορίες αποτέλεσμα δεν ήταν διαθέσιμα. Από τους υπόλοιπους 60 σκύλους, 46 (76,7%) υποτροπίασαν και 14 (23,3%) δεν το έκανε. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο ποσοστό υποτροπής μεταξύ των ομάδων 2 και 3 (p = 1,0).

θεραπεία διάσωσης και την αιτία του θανάτου

Δέκα από τους 15 εμβολιασμένους σκύλους (66,7%) στην ομάδα 2 ότι υποτροπή υποβλήθηκαν σε θεραπεία με κυκλοφωσφαμίδη, βινκριστίνη και πρεδνιζόνη (COP) ως θεραπεία διάσωσης και τέσσερα από αυτά τα σκυλιά (40%) επιτυγχάνεται ανθεκτική δεύτερη κλινική ύφεση (& gt? 22 μήνες) και δεν υποτροπιάζουν. Τα άλλα 5 εμβολιασμένα σκυλιά που υποτροπίασαν ληφθέντα πρεδνιζόνη μονοθεραπεία ως θεραπεία διάσωσης, ένα εκ των οποίων επιτυγχάνεται μια ανθεκτική δεύτερη ύφεση και δεν υποτροπιάζουν. Τρία από αυτά τα τέσσερα εμβολιασμένους σκύλους με προκαλούμενη από χημειοθεραπεία ανθεκτικό δευτερόλεπτα άφεση είναι ακόμη ζωντανοί χωρίς ενδείξεις λεμφώματος σε 689, 1209, και 1216 ημέρες μετά την έναρξη της αρχικής τους χημειοθεραπείας. Τα δύο άλλα σκυλιά (μία αγωγή με COP χημειοθεραπεία και 1 έλαβαν μόνο πρεδνιζόνη) υποβλήθηκαν σε ευθανασία σε 722 και 958 ημέρες αντίστοιχα? όπως σημειώνεται παραπάνω, το πρώτο σκύλος είχε αιμαγγειοσαρκώματος και ο δεύτερος σκύλος υποβλήθηκε σε ευθανασία λόγω «μείωση της υγείας.» Ούτε σκύλος είχε ενδείξεις λεμφώματος κατά τη νεκροψία. Τα άλλα δέκα σκυλιά υποτροπίασαν κατά τη διάρκεια της θεραπείας διάσωσης και υποβλήθηκαν σε ευθανασία λόγω λεμφώματος τους

Σε μη εμβολιασμένα Ομάδα 3, 39, 46 σκύλους (84%) ότι η υποτροπή υποβλήθηκαν σε θεραπεία με χημειοθεραπεία διάσωσης και ενός σκύλου έλαβαν μόνο πρεδνιζόνη.? Ωστόσο, μόνο το 3 (7,7%) των σκύλων της ομάδας 3 που έλαβαν θεραπεία διάσωσης επιτευχθεί μια ανθεκτική δεύτερη ύφεση, σε σύγκριση με το 40% των εμβολιασμένων σκύλων που σημείωσε σταθερή δεύτερη ύφεση να σώσει θεραπεία, μια διαφορά που ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0.025). Η διαφορά αυτή οδήγησε σε στατιστικά σημαντική βελτίωση στην επιβίωση μετά από θεραπεία διάσωσης για υποτροπή Ομάδα 2 σκύλους που έλαβαν θεραπεία διάσωσης σε σύγκριση με υποτροπιάζον Ομάδα 3 σκυλιά που έλαβαν θεραπεία διάσωσης (p = 0,038) (Εικ. 3). Σημαντικά, δεν υπήρξε σημαντική διαφορά στη χρήση της θεραπείας διάσωσης μεταξύ σκυλιά που υποτροπίασε στην Ομάδα 2 (66,7%) και την Ομάδα 3 (84%), (p = 0.15).

Η

Ανοσολογική αξιολόγηση

Για να καθοριστεί εάν όγκου φορτωμένα με RNA CD40-Β κυττάρων που επάγεται λειτουργικές αποκρίσεις Τ κυττάρου όγκου-ειδική

in vivo

, μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) που λαμβάνεται κατά τον χρόνο της διάγνωσης και 3 εβδομάδες μετά την το τελευταίο εμβολιασμό αναλύθηκαν για την παρουσία ΙΡΝ-γ παραγωγής, όγκου-ειδικά Τ κύτταρα με ELISPOT. ανάλυση ΙΡΝ-γ ELISPOT ήταν διαθέσιμη για 9 σκύλους της ομάδας 2 (Εικ. 4). Μία θετική απόκριση IFN-γ για θεραπεία ορίστηκε ως & gt? 50% αύξηση στον αριθμό των κυττάρων που εκκρίνουν κυτοκίνη μετά τον εμβολιασμό σε σύγκριση με την αρχική τιμή και με μια τιμή ρ & lt? 0.05. Θετική ανοσοαποκρίσεις προς CDV ΗΑ παρατηρήθηκαν σε 4 από 9 εμβολιασμένων σκύλων? ένα θετικό IFN-γ ανοσοαπόκριση προς αυτόλογο αντιγόνο όγκου παρατηρήθηκε επίσης σε 1 σκύλο και μια τάση προς σημαντικότητα (ρ & lt? 0,1) παρατηρήθηκε σε άλλες 2 σκύλους. Σε 2 άλλα σκυλιά (σκύλος 1 και σκύλου 16) υπήρχε & gt? 50% αύξηση στον αριθμό των κυτοκίνης κυττάρων που εκκρίνουν σε απόκριση σε αυτόλογο καρκινικό αντιγόνο μετά τον εμβολιασμό σε σύγκριση με την αρχική τιμή, αλλά στατιστική σημαντικότητα δεν μπορούσε να αποδοθεί λόγω διπλές αντί τριπλούν ανάλυση. Δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ ανοσολογική απόκριση και το μέσο αριθμό των CD40-Β κύτταρα χορηγούνται σε κάθε σκύλο κατά τη διάρκεια των τριών εμβολιασμών. Επειδή μόνο 9 σκυλιά ήταν σε θέση να αναλυθούν (λόγω της ανεπαρκούς διαθεσιμότητας των PBMC σε όλα τα χρονικά σημεία), ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ ανοσολογική απόκριση και την κλινική έκβαση.

PBMCs ελήφθησαν από σκύλους σε ο χρόνος της διάγνωσης (προ) και 3 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό (post) και ειδικών για το αντιγόνο ανοσολογικών αποκρίσεων που κατευθύνονται έναντι αντιγόνων όγκου (Α) CDV-HA και (Β) λεμφαδένας προσδιορίστηκαν με ΙΡΝ-γ ELISPOT. * P & lt? 0.1, ** p & lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να καθοριστεί αν όγκου RNA-επιμολυσμένα CD40-ενεργοποιημένα Β κύτταρα θα μπορούσαν με ασφάλεια να προκαλέσει αντι- ανοσία όγκου και να επηρεάσει τη φυσική ιστορία της αυθόρμητης NHL σε σκύλους μετά από την ύφεση με χημειοθεραπεία. Σε μια κλινική δοκιμή των ιδιόκτητων σκύλων, φορτωμένα με RNA αυτόλογα CD40-Β κύτταρα χορηγούνται ενδοδερμικά στη ρύθμιση της ελάχιστης νόσου λειτούργησε ως APC

in vivo

και διεγείρονται IFN-γ κύτταρα που εκκρίνουν. Παρά το γεγονός ότι η προσέγγιση του εμβολιασμού μας δεν είχε αντίκτυπο TTP ή LSS σε σύγκριση με μια ομάδα ελέγχου των σκύλων που έλαβαν μόνο χημειοθεραπεία, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική βελτίωση στην εμβολιασμένη ομάδα στην τιμή των διαρκών δεύτερης ύφεσης καθώς και τις μεταγενέστερες λέμφωμα ειδικά επιβίωση σε υποτροπή σκυλιά μετά από θεραπεία με τη θεραπεία διάσωσης. Αυτό το εύρημα είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα, επειδή η θεραπεία διάσωσης χρησιμοποιήθηκαν περιλάμβαναν μόνο φάρμακα που είχαν ήδη χρησιμοποιηθεί στην αρχική αγωγή χημειοθεραπείας. Από καιρό έχει εκτιμηθεί ότι η συντριπτική πλειοψηφία των σκύλων με NHL ότι η υποτροπή μετά την αρχική ύφεση υποστούν ταχεία εξέλιξη του όγκου και να πεθάνουν παρά τις θεραπείες διάσωσης [15]. Ως ένα παράδειγμα από αυτό, στο (όχι του εμβολίου) ομάδα της χημειοθεραπείας στη μελέτη αυτή, ανθεκτικό δεύτερη ύφεση επιτεύχθηκε σε μόλις 7,7% των σκύλων. Αντίθετα, για τα σκυλιά που υποτροπίασαν μετά τη χημειοθεραπεία συν CD40-Β εμβολιασμό, το 40% των σκύλων επιτευχθεί μια δεύτερη, ανθεκτικό ύφεση. Επιπλέον, λέμφωμα-ειδική επιβίωση ήταν πλέον σε υποτροπιάζον σκύλους που είχαν προηγουμένως εμβολιαστεί από εκείνα τα σκυλιά που δεν είχαν (με ενεργή κλινική παρακολούθηση σε εξέλιξη). Παρά το γεγονός ότι ο αριθμός των σκύλων στην εμβολιασμένη ομάδα είναι μικρή, τα κλινικά ευρήματα σε αυτή τη μελέτη σκοπιμότητας ενθάρρυνση και απαιτούν περαιτέρω δοκιμές σε ένα μεγαλύτερο, διπλή-τυφλή, τυχαιοποιημένη κλινική δοκιμή. Συνολικά, οι κλινικές και ανοσολογικές τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι με βάση τα κύτταρα εμβολιασμού καρκίνος CD40 συνεργεί με χημειοθεραπεία για τη βελτίωση της κλινικής έκβασης σε αυτή τη νόσο.

Η στρατηγική εμβόλιο που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη βασίζεται σε προηγούμενες προκλινικές εργασία μας [10], [ ,,,0],12] αποδεικνύοντας ότι η CD40-Β μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εναλλακτική λύση για DC σε στρατηγικές εμβολίου καρκίνου, με το πρόσθετο πλεονέκτημα του

ex vivo

επέκταση των κυττάρων επιτρέποντας πολλαπλές εμβόλια που πρόκειται να παραχθεί από έναν μικρό όγκο περιφερικού αίματος. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν ότι η χρήση ολικού RNA όγκου επιμολυσμένα CD40-Β κύτταρα, ως εναλλακτική λύση προς DC εμβολιασμό είναι εφικτή και καλά ανεκτή

in vivo

. Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήσαμε ολόκληρο RNA όγκου σαν το αντιγονικό φορτίο που τροφοδοτεί τόσο μεταλλαγμένη όγκου /ειδικά αντιγόνα λεμφώματος και μη μεταλλαγμένη αυτο-αντιγόνα.

In vitro

, RNA-επιμολυσμένα CD40-Β μπορούν να διεγείρουν ανταποκρίσεις κυτταροτοξικών Τ κυττάρων έναντι αντιγόνων όγκου τα οποία είναι συγκρίσιμα με ανταποκρίσεις που προκαλούνται από αντιγόνο φορτωμένα DC [10], [16]. Εδώ, έχουμε μεταφράσει αυτά τα ευρήματα στην κλινική αρένα και να δείξει ότι, παρόμοια με το αντιγόνο-φορτωμένα DC, CD40-Β μπορεί να προκαλέσει ανοσολογικές αντιδράσεις όταν χορηγούνται

in vivo

. Είναι σημαντικό ότι, βρήκαμε ότι τα αυτόλογα RNA φορτώθηκαν CD40-Β θα μπορούσε να χορηγηθεί με ασφάλεια σε σκύλους με μόνο περιστασιακά και ήπιες αντιδράσεις στο σημείο της ένεσης σημειωθεί ως οξεία ανεπιθύμητες ενέργειες. Ένας σκύλος είχε ένα μόνο αναφυλακτικού σαν αντίδραση προς τον πρώτο εμβολιασμό το οποίο δεν συνέβη μετά τη δεύτερη ή την τρίτη εμβολιασμό. Δεν μακροχρόνιες επιπλοκές του εμβολιασμού, συμπεριλαμβανομένων αυτοανοσίας εντοπίστηκαν είτε κλινικά είτε κατά τη νεκροψία σε οποιοδήποτε από τα σκυλιά. Επιπλέον, αξιολογήσαμε επίσης τη συνολική επιβίωση μεταξύ των εμβολιασμένων ομάδας και της ομάδας ελέγχου και διαπιστώθηκε καμία στατιστικά σημαντική διαφορά, υποδεικνύοντας ότι ο εμβολιασμός δεν αυξάνει τη θνησιμότητα.

Οι παρατηρήσεις μας ότι πριν από τον εμβολιασμό CD40-B επηρεάζει θετικά το ποσοστό της δεύτερης ύφεση και η επακόλουθη επιβίωση σε υποτροπή σκυλιά που έλαβαν θεραπεία με παραλληλισμούς θεραπεία διάσωσης ευρήματα που προκύπτουν από την πρόσφατη δουλειά στις δοκιμές ανθρώπινο εμβόλιο? δηλαδή, παρατεταμένη διάμεση συνολική επιβίωση [1] ή ένα απρόσμενο υψηλό ποσοστό ανταπόκρισης για να σώσει θεραπεία [17], χωρίς κατ ‘ανάγκη βελτίωση στην επιβίωση χωρίς εξέλιξη σε ανθρώπους ασθενείς που εμβολιάστηκαν με το αντιγόνο-φορτωμένα DC. Αυτές οι μελέτες σε ανθρώπους τεκμηριώνεται σύνδεσης μεταξύ πρώιμη ανοσολογική απάντηση στον εμβολιασμό και την απροσδόκητη και διαρκείς ανταποκρίσεις για αργότερα χημειοθεραπεία, και προτείνουν μια περίπλοκη αλληλεπίδραση μεταξύ χημειοθεραπείας και ανοσοθεραπείας που μπορεί να είναι θεραπευτικά εκμεταλλεύσιμα. Αν και οι υποκείμενοι μηχανισμοί πίσω από αυτές τις παρατηρήσεις δεν είναι πλήρως κατανοητοί, υποτίθεται ότι η χρήση της κυτταροτοξικής χημειοθεραπείας σε ασθενείς των οποίων τα ανοσοποιητικά συστήματα έχουν καταλλήλως γεμάτοι να αναγνωρίζουν το αντιγόνο του όγκου μέσω εμβολιασμού καρκίνος μπορεί να αυξήσει αντικαρκινικής ανοσίας [18] – [19] . Κυτταροτοξικοί παράγοντες όπως οι ανθρακυκλίνες μπορεί να προκαλέσουν «ανοσογόνο» κύτταρο όγκου θάνατο και την απελευθέρωση ισχυρών προ-φλεγμονωδών μορίων που προάγουν την ενεργοποίηση DC και την επεξεργασία και παρουσίαση αντιγόνων [20]. Επιπλέον, οι κυτταροτοξικές επιδράσεις της θεραπείας διάσωσης μπορεί να παράγει μια ανοσολογική αντινεοπλασματική ενισχυτικό αποτέλεσμα, με διάσπαση των κυττάρων όγκου και έτσι την αποδέσμευση καρκινικά αντιγόνα για παρουσίαση [21]. Πολύ πρόσφατα στοιχεία δείχνουν επίσης ότι η χημειοθεραπεία μπορεί να ευαισθητοποιήσει στόχων όγκου για τη θανάτωση από ειδικά Τ κύτταρα που επάγονται από τον εμβολιασμό [22]. Κυτταροτοξικοί παράγοντες όπως κυκλοφωσφαμίδη μπορεί επίσης την ενίσχυση της ανοσίας κατά του όγκου μέσω της αναστολής των ρυθμιστικών Τ κυττάρων [23] και με ρύθμιση της ισορροπίας των δενδριτικών κυττάρων υποσύνολα σε λεμφοειδή όργανα [24]. Έτσι, στη μελέτη μας, είναι πιθανό ότι η θεραπεία διάσωσης υπηρέτησε για να αυξήσει αντικαρκινικές ανοσολογικές αποκρίσεις που είχε καταλλήλως προετοιμαστεί από πριν τον εμβολιασμό CD40-Β, που οδηγεί σε διαρκή φορές δεύτερη ύφεση και παρατεταμένη συνολική επιβίωση.

χρησιμοποίησε στοιχεία από τα σκυλιά που έλαβαν θεραπεία με το ίδιο πρωτόκολλο χημειοθεραπείας στο ίδιο ίδρυμα με τον πληθυσμό ελέγχου στην TTP αναλύσεις /LSS. Στην ιδανική περίπτωση, ο πληθυσμός ελέγχου θα αποτελείται από τους σκύλους που τυχαιοποιήθηκαν να λάβουν χημειοθεραπεία μόνο, και οι συγκρίσεις πραγματοποιήθηκαν με βάση την πρόθεση για θεραπεία? Ωστόσο, όσο το 40% των σκύλων που παρουσιάζουν σε ίδρυμα μας με NHL αποτύχει χημειοθεραπεία εφόδου και ως εκ τούτου δεν θα είναι επιλέξιμες για τον εμβολιασμό ή τη συμπερίληψη στον πληθυσμό ελέγχου. Το μέγεθος του δείγματος πρέπει να έχουν επαρκή ισχύ για μια τέτοια μελέτη θα ήταν αρκετά μεγάλο και ως εκ τούτου δεν είναι πρακτικό για μια μελέτη σκοπιμότητας. Ως εναλλακτική λύση, επιλέξαμε σκύλους με την ίδια ασθένεια, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με το ίδιο καθεστώς χημειοθεραπείας 20-εβδομάδων που οδήγησε σε πλήρη ύφεση από μια μεγαλύτερη ομάδα των σκύλων με NHL, ως μη εμβολιασμένη ομάδα ελέγχου. Είναι σημαντικό ότι, αναλύοντας τεκμηριωθεί προηγουμένως αρνητικοί προγνωστικοί παράγοντες μεταξύ των ομάδων 2 και 3 (Πίνακας 1), επιβεβαιώσαμε ότι δεν υπήρχε στατιστική διαφορά σε αυτούς τους παράγοντες μεταξύ των ομάδων 2 και 3. Ωστόσο, λόγω του μικρού μεγέθους του πληθυσμού της ομάδας 2 και της ποικιλομορφίας μεταβλητών είναι πιθανό ότι οι διαφορές στην αρνητικοί προγνωστικοί παράγοντες μεταξύ των ομάδων μπορεί να υπήρχε.

Τέλος, τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν την αξία μιας προσέγγισης συγκριτικής ογκολογίας [13], [25], στην οποία ιδιόκτητα σκυλιά με NHL αντιπροσωπεύουν όχι μόνο ένα σημαντικό κλινικό πρόβλημα στην κτηνιατρική αλλά και ένα αυθόρμητο ζωικό μοντέλο για την ανθρώπινη κατάσταση. Η δοκιμή νέων θεραπειών ανοσοποιητικού στην υψηλού κινδύνου, αλλά ελάχιστη ρύθμιση υπολειμματικής νόσου σε σκύλους είναι κατάλληλη και ηθικά, και ενδεχομένως ζωτικής σημασίας για την επιτυχή ανάπτυξη των ανοσολογικών προσεγγίσεων που θα μπορούσαν αλλιώς να κατασταλεί από τα μεγάλα βάρη όγκου. Εδώ, αντί για την ανάπτυξη πολύπλοκων θεραπευτικών προσπαθειών για την αντιμετώπιση των ζητημάτων της ανοσοκαταστολής στο μικροπεριβάλλον του όγκου, χρησιμοποιήσαμε την πρώτη κλασική χημειοθεραπεία για να μειώσει μαζικά το βάρος του όγκου πριν από την ανοσολογική θεραπεία. Στη συντριπτική πλειονότητα των κλινικών δοκιμών φάσης Ι που αξιολογούν ανοσολογικές θεραπείες σε ανθρώπους, οι ασθενείς έχουν σημαντικά το φορτίο του όγκου, προχωρημένη νόσο, και έχουν υποστεί τις ανοσοκατασταλτικές δράσεις της πολλαπλούς γύρους χημειοθεραπείας και άλλων θεραπειών. Η μελέτη των σκύλων με αυθόρμητη NHL παρέχει μια μοναδική ευκαιρία για την αξιολόγηση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας του ανοσοποιητικού θεραπειών στον καθορισμό της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου. Τα αποτελέσματα από αυτή τη μελέτη δείχνουν ότι συνεργιστικές επιδράσεις μεταξύ χημειοθεραπείας και ανοσοθεραπείας συμβεί και ότι ο βέλτιστος συνδυασμός αυτών των τρόπων μπορεί να οδηγήσει σε σημαντικές θεραπευτικές αποκρίσεις. Περαιτέρω μελέτες σε ιδιόκτητες σκύλων με φυσικά καρκίνους μπορεί να δώσει την ευκαιρία να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς που διέπουν πίσω από αυτό το φαινόμενο και να προσδιοριστεί το βέλτιστο συνδυασμό και την αλληλουχία των χημειο-ανοσοθεραπεία για τη θεραπευτική επιτυχία. Αυτή η προσέγγιση μπορεί να επιταχύνει τη μετάφραση αυτών των συνδυασμών σε ανθρώπους ασθενείς.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Animal Care and Use πανεπιστημίου μας ( πρωτόκολλο 800.900) και ιδιόκτητο επιτροπή των ζώων πρωτόκολλο του Πανεπιστημίου της Πενσυλβάνια Κτηνιατρική Σχολή (πρωτόκολλο POAP-197).

πληθυσμός της μελέτης πρωτόκολλο, τα κριτήρια επιλεξιμότητας και ο σχεδιασμός της μελέτης

Σκύλοι με πρόσφατα διάγνωση, μη επεξεργασμένο πολυκεντρική NHL που ζύγιζε περισσότερο από 5 κιλά ελέγχθηκαν για την επιλεξιμότητα για συμμετοχή σε αυτή τη μελέτη. Κατά τη στιγμή της διάγνωσης, πλήρης στάσης, περιλαμβανομένων CBC, το προφίλ χημεία ορού, ανάλυση ούρων, θωρακικές ακτινογραφίες, κοιλιακό υπέρηχο, ανοσοφαινότυπου, αναρροφήσεις μυελού των οστών, αναρροφήσεις λεμφαδένα και βιοψίες, διεξήχθη. Κριτήρια επιλεξιμότητας περιλαμβάνεται καμία σοβαρή ταυτόχρονη νόσο, λιγότερο από το 30% λεμφοβλάστες στις αναρροφήσεις μυελού των οστών, σπάνια απουσιάζει λεμφοβλάστες ανιχνεύονται σε επανεξέταση επίχρισμα περιφερικού αίματος, και γραπτή συγκατάθεση από τον ιδιοκτήτη.

Πριν από την έναρξη της χημειοθεραπείας ένα ενιαίο, περιφερικού λεμφαδένα χειρουργικά αποκόπηκε, και το περιφερικό αίμα συλλέχθηκε για την παραγωγή εμβολίων και μελέτες ανοσοποιητική λειτουργία βασικής γραμμής. Επαγωγή χημειοθεραπεία αποτελείτο από μια σύντομη, 20-εβδομάδων πρωτόκολλο χημειοθεραπεία συνδυασμού, συμπεριλαμβανομένων κυκλοφωσφαμίδη, δοξορουβικίνη, βινκριστίνη, L-ασπαραγινάση, πρεδνιζόνη και, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Το ίδιο πρωτόκολλο επαγωγής χημειοθεραπεία χρησιμοποιήθηκε για σκύλους σε ομάδες 2 και 3. όλοι οι σκύλοι υποβλήθηκαν σε πλήρη αναβίωση συμπεριλαμβανομένων λεπτών αναρροφήσεις βελόνα και κυτταρολογική αξιολόγηση ενός περιφερικού λεμφαδένα, δύο εβδομάδες μετά την ολοκλήρωση του πρωτοκόλλου. Μόνο τα σκυλιά που επιβεβαιώθηκαν να είναι σε πλήρη ύφεση ήταν επιλέξιμες για τον εμβολιασμό και μόνο αυτά τα σκυλιά υποβλήθηκαν σε περαιτέρω αίματος κληρώσεις για συλλογή PBMC.

Η αυτόλογη εμβόλιο αποτελείτο του συνολικού όγκου RNA-φορτωμένο CD40-Β κύτταρα και το εμβόλιο ελέγχου αποτελούνταν από CD40-Β κύτταρα φορτωμένα με CDV-ΗΑ mRNA. Εμβολιασμοί ξεκίνησαν 3 έως 4 εβδομάδες μετά την ολοκλήρωση της χημειοθεραπείας. Τα εμβολιασμένα περιοχές ξυρίστηκαν και ασηπτικώς παρασκευάζονται πριν από τον εμβολιασμό. Τα εμβόλια δόθηκαν ενδοδερμικά (όγκου RNA CD40-B σε μία πλευρά? CDV ΗΑ-CD40-Β στην αντίθετη πλευρά) κάθε 2 έως 3 εβδομάδες για ένα σύνολο τριών εμβολιασμών. Αίμα για το ανοσοποιητικό μελετών και την παρακολούθηση της τοξικότητας συλλέχθηκαν αμέσως πριν από κάθε εμβολιασμό και 3 εβδομάδες μετά την τελευταία εμβόλιο δόθηκε.

Τα σκυλιά που δεν κατάφεραν να επιτύχουν ύφεση και ως εκ τούτου δεν έλαβαν το εμβόλιο και τα σκυλιά που είχαν εμβολιαστεί, αλλά υποτροπιάσει αργότερα προσφέρθηκαν θεραπεία διάσωσης πρότυπο-of-care σύμφωνα με τις προτιμήσεις και τις συστάσεις κτηνίατρο ιδιοκτητών τους ». Όλα τα εμβολιασμένα σκυλιά παρακολουθήθηκαν για υποτροπή μέσω μηνιαίων εξετάσεων για το πρώτο έτος, κάθε άλλο μήνα για την 2

ου έτους και κάθε 3 μήνες για το τρίτο έτος. Υποτροπές επιβεβαιώθηκαν με λεπτή βελόνα αναρρόφησης σε όλους τους σκύλους.

RNA και mRNA προετοιμασία

Στοιχεία Παραγωγής για την προετοιμασία CD40-Β, η απομόνωση RNA και ηλεκτροπόρωση έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [12]. Εν συντομία, ολικό RNA εκχυλίστηκε από κακοήθη ιστό λεμφαδένα ελήφθησαν κατά τον χρόνο της διάγνωσης και πριν τη χημειοθεραπεία χρησιμοποιώντας το κιτ RNAeasy (Qiagen, Valencia, CA). ποσότητα RNA προσδιορίστηκε με μέτρηση Ο.Π. στα 260 nm και το RNA ποιότητα προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση γέλης. Το RNA αποθηκεύθηκε στους -80 ° C πριν από τη χρήση. mRNA που κωδικοποιεί πλήρους μήκους CDV-ΗΑ ή GFP παρασκευάσθηκε από πρότυπα πλασμίδια με in vitro μεταγραφή όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Μεταγραφή του RNA πολυαδενυλιωμένα στο 3 ‘άκρο με τη χρήση της Escherichia coli Πολυ (Α) πολυμεράση Ι (E-ΡΑΡ), υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ϋΝΑση για να απομακρυνθεί το πλασμίδιο αλληλουχίες και καθαρίστηκε με όξινη εκχύλιση με φαινόλη /χλωροφόρμιο και RNeasy διαχωρισμού στήλη (Qiagen).

Εμβόλιο κατασκευή

CD40-Β παράχθηκαν από κυνόδοντα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) με τη χρήση Κ562 κύτταρα επιμολυσμένα με ανθρώπινο CD40L (KtCD40L) ως κύτταρα τροφοδότες, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. 5 × 10

6 PBMCs συν-καλλιεργήθηκαν με 10

6 θανατηφόρα ακτινοβολημένων κυττάρων KtCD40L παρουσία ανασυνδυασμένης κυνικός IL-4 και κυκλοσπορίνη. Μετά από 5-7 ημέρες, τα κύτταρα Β συλλέχθηκαν, μετρήθηκαν και επαναδιεγέρθηκαν με ακτινοβολημένα κύτταρα KtCD40L παρουσία IL-4 και κυκλοσπορίνη. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με κύτταρα KtCD40L τρεις φορές. Πέντε ημέρες μετά την τελευταία διέγερση CD40-Β συλλέχθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και επανεναιωρήθηκαν σε 2 χ 10

6 κύτταρα ανά 100 μΙ διαλύματος Nucleofector Β (Amaxa, Κολωνία, Γερμανία). Έως 5 × 10

6 κύτταρα ηλεκτροδιατρήθηκαν είτε με 10 μg αυτόλογη RNA καρκινικά ή 2 ug CDV mRNA με τη χρήση της συσκευής Amaxa Nuceofector (πρόγραμμα παλμό U08). Η ηλεκτροδιατρητή έχει σχεδιαστεί και κατασκευαστεί σύμφωνα με τα πρότυπα GMP που καθορίζονται από το FDA και έχει εγκριθεί για χρήση στην κατασκευή ανθρώπινο εμβόλιο. Μετά την ηλεκτροφόρηση, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά σε μέσο Β κυττάρων και στη συνέχεια δύο φορές σε PBS. Ηλεκτροδιαπήδηση κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 300 μΐ PBS και χορηγήθηκαν ενδοδερμικά πάνω από το δεξί πλευρό για όγκο φορτωμένα με RNA του CD40-Β κύτταρα και αριστερό πλευρό για CDV-φορτωμένο CD40-Β κύτταρα πάνω.

Η παρασκευή εμβολίων και την παραγωγή

CD40-Β κύτταρα και RNA καρκινικά δημιουργήθηκαν από όλους τους σκύλους αν και ο αριθμός των CD40-Β κυττάρων που παράγονται ποικίλει ανά σκύλο.