Αφηρημένο

Διάχυτη τύπου είναι συμπαγείς όγκους συχνά αποτελείται από ένα υψηλό ποσοστό σπάνια πολλαπλασιάζονται (δηλαδή, σε φυτική νάρκη) τα καρκινικά κύτταρα, δείχνοντας έντονα την συμμετοχή των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ) Αν και διάχυτου τύπου γαστρικό καρκίνο (GC) ασθενείς έχουν κακή πρόγνωση λόγω της υψηλής συχνή ανάπτυξη περιτοναϊκή διάχυση (PD), είναι περιορισμένη γνώση ότι το PD-συνδέονται ΚΕΠ και η αποτελεσματικότητα του CSC- στόχευση θεραπεία σε διάχυτη τύπου GC. Σε αυτή τη μελέτη, ιδρύσαμε άκρως μεταστατικών κυττάρων GC γραμμές από

in vivo

επιλογή σχεδιαστεί για τον εμπλουτισμό των κυττάρων GC PD-συνδέονται. Με ανάλυση μικροσυστοιχιών, βρήκαμε CXC τύπου υποδοχέα χημειοκινών 4 (CXCR4) μπορεί να είναι ένα μυθιστόρημα δείκτης για εξαιρετικά μεταστατικό ΚΕΠ, αφού CXCR4-θετικά κύτταρα μπορούν να αναπτυχθούν αγκύρωση-ανεξάρτητα, να ξεκινήσει όγκοι σε ποντίκια, να είναι ανθεκτικά στην κυτταροτοξική ναρκωτικών, και να παράγουν διαφοροποιημένα κόρη κύτταρα. Σε κλινικά δείγματα, αυτά CXCR4-θετικά κύτταρα βρέθηκαν από όχι μόνο στάδιο αργά μετάσταση (συσσωρευμένη ασκίτης), αλλά και προγενέστερο στάδιο (περιτοναϊκή πλύσεις). Επιπλέον, η θεραπεία με αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού-β αύξησε την αντικαρκινική επίδραση της docetaxel μέσω επαγωγής κυτταρικής διαφοροποίησης /ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση των CXCR4-θετικών γαστρικών CSCs ακόμη και σε μια λανθάνουσα κατάσταση. Ως εκ τούτου, επαγωγείς διαφοροποίησης κρατήσει την υπόσχεση για την απόκτηση του μέγιστου θεραπευτικού αποτελέσματος από σήμερα διαθέσιμα φάρμακα κατά του καρκίνου μέσω ανακύκλωσης των ΚΕΠ

Παράθεση:. Fujita Τ, Chiwaki F, Takahashi Ru, Aoyagi Κ, Yanagihara K, Nishimura Τ, et al. (2015) Ταυτοποίηση και Χαρακτηρισμός των CXCR4-θετικό καρκίνο του γαστρικού βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 10 (6): e0130808. doi: 10.1371 /journal.pone.0130808

Επιμέλεια: Masaharu Seno, Πανεπιστήμιο Okayama, Ιαπωνία

Ελήφθη: 18η Φεβρουαρίου 2015? Αποδεκτές: 25η Μαΐου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιουνίου 2015

Copyright: © 2015 Fujita et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και. Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών έχουν κατατεθεί σε μια βάση δεδομένων συμβατή MIAME, GEO? αριθμός ένταξη GSE53276

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Βιοϊατρικής Καινοτομίας (για το Advanced Research για Ιατρικά Είδη Mining πρόγραμμα ID10-41), το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας της Ιαπωνίας (για την Τρίτη Περιεκτική 10-Year στρατηγική για τον έλεγχο του καρκίνου H22-007), Εθνικό Κέντρο Ταμείου Έρευνας και Ανάπτυξης του Καρκίνου (25-Α-6, 26-Α-3). Δρχ Τ Fujita, Μ Tamaoki και Τ Nishimura είναι οι αποδέκτες μιας έρευνας Resident υποτροφία από το Ίδρυμα Προώθησης Έρευνας για τον Καρκίνο στην Ιαπωνία

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι μία από τις κύριες αιτίες των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Ιστοπαθολογικά, ΔΘ μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες: εντερική-τύπου και διάχυτη τύπου. Εντερικού τύπου GC κυριαρχεί σε γεωγραφικές περιοχές υψηλού κινδύνου και αναπτύσσεται μέσα από κάποια διαδοχικά στάδια συμπεριλαμβανομένων των

Helicobacter pylori

(

Η

.

pylori

) -associated ατροφική γαστρίτιδα, εντερική μεταπλασία (IM), και δυσπλασία. Αντίθετα, διάχυτη τύπου GC, το οποίο αντιπροσωπεύει το ήμισυ του συνόλου των ασθενών GC, έχει μια ευρεία γεωγραφική κατανομή και αναπτύσσεται ακόμα και από

Η

.

πυλωρού

-δωρεάν, μορφολογικά φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνο χωρίς ατροφική γαστρίτιδα ή IM, και διάχυτη τύπου GC μπορεί να διαφέρουν από την εντερική τύπου και γενετικά και φαινοτυπικά [1-5]. Σε αντίθεση με την φθίνουσας συχνότητας του εντερικού-τύπου, ο επιπολασμός του διάχυτου τύπου φέρεται αυξάνεται παγκοσμίως [6]. Η πρόγνωση για τους ασθενείς GC προχωρημένη διάχυτου τύπου παρέμεινε φτωχή κατά την τελευταία δεκαετία, λόγω του υψηλού ποσοστού του περιτοναϊκή διάχυση (PD) (78%) σε σύγκριση με εκείνη του εντερικού-τύπου (45%) [7]. Ειδικότερα, οι ασθενείς με τύπου IV Bormann GC έχουν μια εξαιρετικά φτωχή πρόγνωση, ακόμη και αν λάβει πολλαπλών ειδικοτήτων θεραπεία [8]. Ως εκ τούτου, η αντιμετώπιση PD είναι ένα επείγον ζήτημα για βελτίωση στην πρόγνωση των ασθενών με διάχυτη τύπου GC.

Διάχυτη τύπου GCs συνήθως χαρακτηρίζονται από μια εκτεταμένη στρωματικά ίνωση με κακή αγγείωση και σπάνια πολλαπλασιασμού (

i

.

e

. αδρανής) καρκινικά κύτταρα, η οποία οδηγεί σε σημαντική θεραπευτική αντίσταση. Από την άποψη της χημειοθεραπείας, μετατρέποντας β παράγων ανάπτυξης (ΤΟΡ-β) έχει σκεφτεί να συμβάλει στην επιθετική εξέλιξη μέσω επιθηλίου-μεσεγχύματος μετάβασης και με επαγωγή ίνωσης [9]. Ωστόσο, ο ΤΟΡ-β αναστέλλει επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, επάγει την απόπτωση, και μεσολαβεί διαφοροποίηση στα επιθηλιακά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα συστατικά των οδών σηματοδότησης ΤΟΡ-β έχουν ογκο-κατασταλτική δραστηριότητα σε επιθηλιακούς όγκους [10, 11]. Αν και συσσώρευση στοιχεία έχουν καταδείξει τον κρίσιμο ρόλο του ΤΟΡ-β στον καρκίνο βλαστοκυττάρων (CSC) βιολογία, υπάρχουν περιορισμένες πληροφορίες σχετικά με το ρόλο της στην GCs διάχυτου τύπου.

Έχει αναφερθεί ότι κάθε πληθυσμός κυττάρων όγκου δείχνουν λειτουργική ετερογένεια που χαρακτηρίζονται από διακριτή πολλαπλασιασμό και την ικανότητα διαφοροποίησης σε διάφορους τύπους όγκων [12]. Για να ληφθεί υπόψη για την εν λόγω ετερογένεια των όγκων, δύο μοντέλα έχουν προταθεί: η κλωνική μοντέλο εξέλιξη [13] και το μοντέλο CSC [14]. Το τελευταίο μοντέλο έχει λάβει μεγάλη προσοχή, δεδομένου ότι παρέχει μια λογική εξήγηση για αντίσταση σε συμβατική χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία, στα οποία επιβιώνουν ηρεμίας ή αργή ποδηλασία ΚΕΠ, και οδηγεί σε ενδεχόμενη υποτροπή του όγκου [15-17]. Ως εκ τούτου, θεραπευτικές στρατηγικές για τη στόχευση ΚΕΠ είναι επιτακτική ανάγκη για την εξάλειψη της υπολειμματικής νόσου και να αποτραπεί η επανάληψη δεν είναι μόνο GC, αλλά και άλλες μορφές καρκίνου. Επιπλέον, με τις τρέχουσες γνώσεις σχετικά με τους κυτταρικούς μηχανισμούς της καρκινογένεσης, το μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων αποδίδεται σε ΚΕΠ, η οποία μπορεί να κινήσει κλωνική σχηματισμό όγκου σε απομακρυσμένες θέσεις [18 19]. Αν και ένας αριθμός μορίων κυτταρικής επιφάνειας έχουν προταθεί ως δείκτες CSC σε μια μεγάλη ποικιλία ανθρώπινων κακοηθειών, δεν υπήρξε καμία αναγνώριση δείκτης για PD-σχετίζεται CSCs σε GCs [20-23]. Για τον προσδιορισμό των εν λόγω δεικτών, θεωρήσαμε την έννοια που λειτουργικά και γενετικά ετερογενή όγκοι έχουν κοινά και εγγενείς μηχανισμούς της συντήρησης των όγκων, σύμφωνα με το πλαίσιο μιας δεδομένης μικροπεριβάλλον. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι ΚΕΠ θα πρέπει να ορίζονται λειτουργικά με έγκυρες αναλύσεις, όπως

in vivo

μεταμόσχευση. Σε διάχυτη τύπου GC, αρχικά επικεντρώθηκε στην περιτόναιο ειδικά αποικισμό των κυττάρων και εμπλουτίζονται οι PD που σχετίζεται ΚΕΠ από επαναλαμβανόμενες

in vivo

επιλογές [24, 25]. Εδώ, βρήκαμε CXC τύπος υποδοχέα χημειοκινών 4 (CXCR4) μπορεί να είναι ένας δείκτης για PD-σχετίζεται ΚΕΠ γαστρικών και απέδειξαν ότι ο ΤΟΡ-β ενισχύει την αποτελεσματικότητα των φαρμάκων κατά των όγκων μέσω επαγωγής κυτταρικής διαφοροποίησης /διαίρεση ασύμμετρη κυττάρων στο CXCR4

+ πληθυσμού CSC, ακόμη και σε λανθάνουσα κατάσταση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα

Κλινικά δείγματα που παρέχονται από το Εθνικό Αντικαρκινικό Νοσοκομείο Κέντρο (Τόκιο, Ιαπωνία) μετά την απόκτηση γραπτή συγκατάθεση από τον κάθε ασθενή και την έγκριση από την Εθνική Επιτροπή Επανεξέτασης Αντικαρκινικό Κέντρο Θεσμικών (ID: 15-44, 2012 – 181, 2010-031).

Οι κυτταρικές σειρές και πρωτογενείς καλλιέργειες

Ένα ανθρώπινο GC κυτταρική γραμμή, HSC-60 ιδρύθηκε από έναν συνεργάτη, χρησιμοποιώντας τη διαδικασία που περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Ένα εξαιρετικά περιτοναϊκή-μεταστατική κυτταρική γραμμή, 60As6 ιδρύθηκε από HSC-60 με τη χρήση ορθοτοπική εμφύτευση ιστού σε ποντίκια SCID SCID /όπως εν συντομία ακολούθως: το ξενομόσχευμα όγκου του HSC-60 κύτταρα μεταμοσχεύονται εντός του γαστρικού τοιχώματος ενός ποντικιού. Επαναλάβαμε έξι κύκλους των κυττάρων του όγκου συγκομιδής ασκητικό και την ορθοτοπική εμβολιασμό αυτών των κυττάρων. Αυτές οι δύο κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Ιδρύσαμε επίσης δύο λουσιφεράσης που εκφράζουν κυτταρικές σειρές (HSC-60Luc και 60As6Luc). Έξι άλλες κυτταρικές σειρές GC-προέρχεται (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9 και ΚΑΤΩ III) επίσης διατηρείται κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Από αυτά τα έξι, HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, και 58As9 καθορίστηκαν από την ανωτέρω διαδικασία [27, 28], και ΚΑΤΩ III λήφθηκε από την American Type Culture Collection. Για πρωτογενείς καλλιέργειες, τα κύτταρα συλλέγονται από την περιτοναϊκή εκπλύματα και ασκίτη των ασθενών (NSC-16C, NSC-20C, και NSC-22C) και καλλιεργήθηκαν σε ένα μέσο RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου.

Microarray ανάλυση

Ολικό RNA του 60As6, 60As6Luc, HSC-60, και τα κύτταρα HSC-60Luc απομονώθηκε με αιώρηση των κυττάρων σε ένα ρυθμιστικό ISOGEN λύσης (Nippon Gene, Toyama, Japan) που ακολουθείται από καθίζηση με ισοπροπανόλη. Διενεργήσαμε μικροσυστοιχιών αναλύει δύο φορές με τη χρήση Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Οι διαδικασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα των προμηθευτών. Οι συστοιχίες σαρώθηκαν με ένα σαρωτή GeneChip 3000 (Affymetrix), και τα δεδομένα αναλύθηκαν με Microarray Suite έκδοση 5.0 με προεπιλεγμένες ρυθμίσεις Affymetrix ανάλυση και ολικής διαβαθμίσεως ως μέθοδος κανονικοποίησης. Η στολισμένα μέση ένταση στόχος της κάθε συστοιχίας αυθαίρετα οριστεί σε 1000. Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών έχουν κατατεθεί σε μια βάση δεδομένων συμβατή MIAME, GEO? αριθμός ένταξη GSE53276. Με 2 φορές αλλαγή, επιλέχθηκαν 684 γονίδια και ειδικά γονίδια για τα κύτταρα 60As6 και 60As6Luc, και επιλέχθηκαν 1150 γονίδια για HSC-60 και HSC-60Luc κύτταρα.

Τα πειράματα σε ζώα

Έξι -Εβδομάδα θηλυκούς C.B17 /ICR-scid (SCID /SCID) (CLEA Japan, Ιαπωνία) εκτράφηκαν σε θερμοκρασία δωματίου με ένα /σκότους ημερήσιο κύκλο 12 ώρες φως. Τα ποντίκια διατηρήθηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων και παρέχονται στείρα τροφή, νερό, και τα κλουβιά. 1 × 10

4 έως 1 χ 10

6 καρκινικών κυττάρων αιωρήθηκαν με 1 ml αλατούχου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS) και στη συνέχεια εγχέεται στην κοιλιακή κοιλότητα με χρήση βελόνας 26 1/2-gauge. Οι ποντικοί ζυγίστηκαν και μετρήθηκαν σε εβδομαδιαία βάση. Τα τελικά σημεία ευθανασίας κριτήρια που περιλαμβάνονται σημαντική συσσώρευση κοιλιακού ασκίτη, δύσπνοια, ανόρθωση των τριχών, αναιμία, ή απώλεια βάρους που υπερβαίνει το 10% του αρχικού βάρους. Όλα τα πειράματα διεξάγονται σύμφωνα με τις ηθικές κατευθυντήριες γραμμές της Διεθνούς Ένωσης για τη Μελέτη του Πόνου και εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Εθνικού Κέντρου Καρκίνου. Έγιναν προσπάθειες για την ελαχιστοποίηση των αριθμών και των κάθε ταλαιπωρίας των ζώων που χρησιμοποιούνται σε πειράματα.

RT-PCR

Το συνολικό RNA απομονώθηκε με αιώρηση των κυττάρων σε ένα ρυθμιστικό ISOGEN λύσης που ακολουθείται από καθίζηση με ισοπροπανόλη. Ημι-ποσοτική RT-PCR διεξήχθη μέσα σε γραμμικό εύρος 25 με 30 κύκλους για

MUC5AC

,

CXCR4

,

CXCR7

,

CXCL12

,

LGR5

,

TGFBR1

,

TGFBR2

, και

ACTB

χρήση των ακόλουθων εκκινητών: 5′-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 ‘και 5’-GTTGTCCACATGGCTGTT-3 για

MUC5AC

, 5′-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3 ‘και 5′-AGACTGTACACTGTAGGTGC-3’ για το

CXCR4

, 5′-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3 ‘και 5′-ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3’ για

CXCR7

, 5′-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 ‘και 5′-AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3’ για το

CXCL12

, 5′-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3 ‘και 5′-CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3’ για το

LGR5

, 5′-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 ‘και 5′-GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3’ για το

TGFBR1

, 5′-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3 ‘και 5′-GAGACCTTCCACCATCCAAA-3’ για το

TGFBR2

, και 5′-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 ‘και 5’-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3 »για

ACTB

.

ανοσοκυτοχημεία

Έμμεση φθορισμού ανοσοκυτταροχημεία εκτελέστηκε για CXCR4, MUC5AC, και Smad2 /3 σε κύτταρα που αναπτύσσονται σε διαφάνειες θάλαμο 4-καλά. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεϋδη σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Μετά από τρεις φορές την πλύση σε PBS (-), επωάστηκαν με αντι-ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα CXCR4 (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ), αντι-ανθρώπινο αντίσωμα MUC5AC (Santa Cruz Biochemistry, Santa Cruz, CA), ή αντι- ανθρώπινο αντίσωμα Smad2 /3 (BD ​​Biosciences, Bedford, ΜΑ) που ακολουθείται από επώαση με αραίωση 1: 1000 του γαϊδάρου αντι-ποντικού Alexa 488-συζευγμένη ορό (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης διυδροχλωρίδιο (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Για δοκιμασία κυττάρων-καταγωγή, κατατάσσονται μόνο CXCR4

+ μικρά κύτταρα βάφτηκαν με CellTracker Green (Invitrogen) για τον εντοπισμό των βιώσιμων κυττάρων.

Η κυτταρομετρία ροής και διαλογή κυττάρων

κύτταρα 60As6 (1 × 10

6 κύτταρα) συν-επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C με τα ακόλουθα αντισώματα: APC αντι-ανθρώπινο CD184 (CXCR4) (IgG2a, κλώνος 12G5) ή APC IgG2a ποντικού, k ισότυπο αναφοράς που λαμβάνεται από BioLegend ( San Diego, CA). Τα νεκρά κύτταρα σημάνθηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και εξαιρούνται από την ανάλυση. Στο κελί διαλογή, οι CXCR4-θετικά και CXCR4-αρνητικών υποπληθυσμοί καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας έναν ταξινομητή κυττάρων JSAN (Bay Bioscience, Kobe, Japan), και αναλύθηκαν με ένα λογισμικό, FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Για τις αναλύσεις του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε ένα μέσο χωρίς ορό για 5 ημέρες, και στη συνέχεια συγκομίζονται με 0.05% θρυψίνη-ΕϋΤΑ, και στη συνέχεια εναιωρήθηκε σε ψυχρή αιθανόλη 80%. Μετά τον καθορισμό όλη τη νύχτα στους -20 ° C, τα δείγματα πλύθηκαν σε PBS (-) και επωάστηκαν σε 500 μΐ PI /RNase ρυθμιστικό υλικό κηλιδώσεως (BD Pharmingen, San Diego, CA) ανά 1 × 10

6 κύτταρα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πριν την ανάλυση. Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση FACSCalibur (BD, Franklin Lakes, NJ), και αναλύθηκαν με ένα λογισμικό, FlowJo.

Anchorage-ανεξάρτητη δοκιμασία κυτταρικής ανάπτυξης

Ένα προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού άγαρ διεξήχθη χρησιμοποιώντας την CytoSelect 96 φρεατίων Kit κυττάρων μετασχηματισμού Δοκιμασία (Cell Biolabs, San Diego, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 5 χ 10

3 CXCR4-θετικά ή CXCR4-αρνητικά μικρό κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 0.4% χαμηλής τήξης αγαρόζη και 10% FBS και σπάρθηκαν σε 1% αγαρόζης χαμηλού σημείου τήξεως που περιείχε DMEM και 10% FBS. Μετά από επώαση των κυττάρων για 5 ημέρες στους 37 ° C σε 5% CO

2, τα κύτταρα λύθηκαν και ανιχνεύθηκαν με CyQuant GR βαφής. Ο φθορισμός των κυττάρων που σχηματίζουν αποικία διαβάζονται Πολυλειτουργικό Microplate Reader (Safire, Tecan, Μάνερντορφ, την Ελβετία) σε μήκη κύματος διέγερσης /εκπομπής 485/520 nm.

δοκιμασία εισβολή

κυττάρων εισβολής προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας BD Biocoat Tumor σύστημα προσδιορισμού Invasion (BD Biosciences) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 4 × 10

5 κυττάρων 60As6 με μέσο ελεύθερο ορού σπάρθηκαν στην άνω βουλή του συστήματος. Κάτω φρεάτια πληρώθηκαν με μέσα με 10 ng /ml SDF-1β (Invitrogen, Carlsbad, CA). Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα στον άνω θάλαμο απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα τα οποία εισέβαλαν μέσω της μεμβράνης Matrigel βάφτηκαν με Diff-Quick κηλίδα (BD Biosciences) και μετρήθηκαν με το χέρι.

δοκιμασίας κασπάσης

Τα κύτταρα 60As6 παρασκευάστηκαν σε μία πλάκα 96 φρεατίων (5 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο). Η δοκιμασία caspase 3/7 πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κασπάση-Glo 3/7 Assay (Promega, Madison, WI) σε 24 ώρες μετά την προσθήκη του ανασυνδυασμένου ΤΟΡ-β1 (amp 240-Β, Ε &? Συστήματα D) στην κυτταρική καλλιέργεια σε μια συγκέντρωση 2 ng /ml.

δοκιμασίες ανάπτυξης των κυττάρων

Για να προσδιοριστεί IC

50 τιμές κατά docetaxel (Doc), και τα δύο κύτταρα HSC-60 και 60As6 καλλιεργήθηκαν με την παρουσία του 0-100 ηΜ Doc (Aventis Pharma, Tokyo, Japan) επί 4 ημέρες στους 37 ° C σε 5% CO

2 ακολουθούμενη από τη συμβατική δοκιμασία ΜΤΤ. Για την επικύρωση της θεραπείας συνδυασμού με Doc και ΤΟΡ-β, όλα τα κύτταρά 60As6 και 2 πρωτογενείς καλλιέργειες (NSC-16C και -22C) παρασκευάστηκε σε ένα 6-φρεατίων (1 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) που ακολουθείται από μια θεραπεία με Doc (2,5 ηΜ) και ΤΟΡ-β1 (0 ή 2 ng /ml) για 72 ώρες στους 37 ° C σε 5% CO

2. Τα κύτταρα βάφτηκαν με κυανούν του τρυπανίου και μετρήθηκαν με TC20 Automated κυττάρων Counter (Bio-Rad, Hercules, CA).

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SE, και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας η μη ζευγαρωμένο t-test. Το αποδεκτό επίπεδο σημαντικότητας ήταν

σ

& lt? 0,05. SPSS (SPSS, Chicago, IL) χρησιμοποιήθηκε για όλες τις στατιστικές αναλύσεις.

Αποτελέσματα

Η φαινοτυπική διαφορές μεταξύ των γονικών κυττάρων HSC-60 και πολύ ογκογόνων υπογραμμή κύτταρα 60As6

Για να αντιμετώπιση του φαινομένου της διάχυσης τύπου GC-συνδέονται PD από την άποψη της μοριακής και κυτταρικής βιολογίας, έχουμε δημιουργήσει μια πολύ περιτοναϊκή-μεταστατική κυτταρική γραμμή, 60As6, από μια διάχυτη τύπου GC προέρχονται κυτταρική γραμμή, HSC-60, μέσω του

in vivo

επιλογές που αποτελούνται από ένα ορθοτοπικό τον ενοφθαλμισμό των καρκινικών κυττάρων και την απομόνωση των εξαιρετικά μεταστατικών αυτά από τον ασκίτη ανοσοανεπαρκών ποντικών [25]. Αν και ο χρόνος διπλασιασμού των δύο αυτών κυτταρικών γραμμών ήταν συγκρίσιμη (30 hr για HSC-60 και 31 ώρες για 60As6)

in vitro

, κύτταρα 60As6 σχηματίζονται πολλαπλά οζίδια όγκου πιο γρήγορα μετά ενδοπεριτοναϊκό εμβολιασμό σε ποντίκια. Ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης ήταν 167 ημέρες μετά την εμφύτευση του 5 × 10

6 HSC-60 κύτταρα, ενώ η εμφύτευση του ίδιου αριθμού κυττάρων 60As6 οδήγησε σε αξιοσημείωτη σχηματισμό αιματηρή ασκίτη και ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης ήταν μόνο 28 ημέρες. Anchorage-ανεξαρτησία μπορεί να απαιτείται για την επιβίωση των ελεύθερων καρκινικών κυττάρων στην περιτοναϊκή κοιλότητα και για τη δημιουργία αποικιών. Στην δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, κύτταρα 60As6 σχηματίζονται πολλές περισσότερες αποικίες σε σύγκριση με HSC-60 κύτταρα (S1 Σχήμα) που δείχνει ότι 60As6 διαθέτει υψηλή ικανότητα του ανεξάρτητο από αγκύρωση ανάπτυξη. Εμείς επικύρωσε την χημειοαντίσταση επίσης γνωστή ως μια σημαντική ιδιότητα των ΚΕΠ. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με την παρουσία του docetaxel (DOC), που είναι ένα συχνά χρησιμοποιούμενο αντικαρκινικό φάρμακο για τη θεραπεία των ασθενών GC. 60As6 έδειξε μια 6-φορές υψηλότερη IC

50 αξία του Doc σε σύγκριση με εκείνη του HSC-60 (52 ηΜ και 8,4 ηΜ, αντίστοιχα) (S2 Εικ). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι 60As6 έχει αποκτήσει μεγάλη χημειοθεραπεία φαινότυπο. Επιπλέον, η μορφολογία του HSC-60 κύτταρα χαρακτηρίστηκε ως επίπεδη και μεγάλα, ενώ εκείνη των κυττάρων 60As6 ήταν ημι-κυμαινόμενο και μικρό, το οποίο είναι παρόμοιο με το μορφολογία συχνά παρατηρείται για ΚΕΠ (S3 Εικ). Στη συνέχεια εξετάσαμε τον εντοπισμό λιπιδικών σχεδιών χρησιμοποιώντας υπομονάδα τοξίνης χολέρας Β (CtxB) ως δείκτης λιπίδιο σχεδία, δεδομένου ότι έχει ήδη αναφερθεί ότι λιπιδικά συμπλέγματα σχεδία εμπλουτίστηκαν σε αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα [29]. Μια συσσώρευση του φθορίζοντος ctxB παρατηρήθηκε για 60As6 κύτταρα αλλά όχι σε HSC-60, γεγονός που υποδηλώνει μια άλλη CSC-όπως ιδιοκτησίας για τα πρώην κύτταρα (S3 σχήμα).

Για να αξιολογεί τις βιολογικές διαφορές μεταξύ των HSC-60 και 60As6 κύτταρα, συγκρίναμε τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης με ανάλυση μικροσυστοιχιών (S1 πίνακα). Ρύθμιση προς τα κάτω των τριών δεικτών κυτταρικής διαφοροποίησης γαστρικού λάκκο (

MUC5AC

,

MUC1

, και

TFF1

) και μερικά κερατίνες βρέθηκαν σε 60As6. Αντίθετα, αρκετές δείκτες βλαστικών κυττάρων (

LY75

,

CD44

,

GPNMB

, και

CXCR4

) ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε αυτή την κυτταρική σειρά. Το προφίλ έκφρασης υποδηλώνει ότι 60As6 έχει μια ισχυρή φαινότυπο μεσεγχυματικών, η οποία είναι ένα χαρακτηριστικό του επιθηλιακού ΚΕΠ που προέρχεται από κύτταρα.

Ερευνήσαμε περαιτέρω την έκφραση του mRNA και των δύο ενός τυπικού δείκτης διαφοροποίησης

MUC5AC

[3 , 4] και ένα υποδοχέα χημειοκίνης μετάσταση που σχετίζεται

CXCR4

[30] με RT-PCR. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα μικροσυστοιχιών,

MUC5AC

και

CXCR4

mRNAs έδειξαν μια αμοιβαία αποκλειστική έκφραση στα HSC-60 και 60As6 (Σχήμα 1Α). Μία χημειοκίνη SDF-1 που κωδικοποιείται από

CXCL12

είναι γνωστό ότι συνδέεται CXCR4 και συγγενή υποδοχέα του CXCR7 [30]? Ωστόσο, το mRNA της

CXCL12

και

CXCR7

δεν ανιχνεύθηκαν σε κάθε κυτταρική σειρά. Η έκφραση και των δύο MUC5AC και CXCR4 επιβεβαιώθηκε επίσης σε επίπεδο πρωτεΐνης με ανοσοκυτταροχημική χρώση (Σχήμα 1Β). Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κύτταρα HSC-60 φιλοξενούν περισσότερα διαφοροποιημένα κύτταρα από ό, τι τα κύτταρα 60As6, οι οποίες ως επί το πλείστον αποτελείται από αδιαφοροποίητα κύτταρα. Στο σύνολό τους, όλα αυτά τα CSC-όπως χαρακτηριστικά 60As6 δείχνουν ότι η αδιαφοροποίητο υποπληθυσμό με υψηλό ογκογονικότητα και της ανθεκτικότητας στα φάρμακα θα μπορούσαν να εμπλουτιστούν αποτελεσματικά από τα πατρικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της

in vivo

επιλογές.

(Α ) RT-PCR του

MUC5AC

,

CXCR4

,

CXCR7

, και

CXCL12

σε ένα κύτταρο GC γραμμής HSC-60 και υπογραμμή της 60As6. (Β) ανοσοκυτταροχημεία για MUC5AC (αριστερό πάνελ, πράσινο) και CXCR4 (δεξιά πάνελ, πράσινο) στην HSC-60 και 60As6 κύτταρα, αντίστοιχα. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (μπλε). Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 100 μm. (Γ) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυτταρικής επιφάνειας CXCR4 στα κύτταρα 60As6. Τα εσωτερικά πάνελ αντιπροσωπεύουν CXCR4

+ μικρά κύτταρα (Ι), CXCR4

– μικρά κύτταρα (II) και CXCR4

– μεγάλα κύτταρα (III) (Ci). Κάθε κυτταρικός πληθυσμός διαχωρίστηκε με FACS στα αντίστοιχα καθαρότητα του (Ci-CIV). Ανοσοθετικών κυττάρων για MUC5AC παρατηρήθηκαν σε μόνο το CXCR4

– μεγάλο κλάσμα κυττάρων (CIV, κάτω πάνελ, πράσινο). Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 50 μm. (Δ) Εκπρόσωπος εικόνες μετά από καλλιέργεια CXCR4

– μικρά και μεγάλα κύτταρα για 3 ημέρες. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 50 μm.

Η

Ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός των γαστρικών ΚΕΠ σε 60As6 και πρωτογενή καλλιεργημένα κύτταρα

Στη συνέχεια εξετάσαμε το ρόλο των CXCR4 στα κύτταρα GC διάχυτη τύπου για PD. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, του υποδοχέα

CXCR4

ήταν εντόνως εκφρασμένο σε σύγκριση με 60As6 HSC-60, ενώ συνδέτη τους

CXCL12 /SDF1

δεν ήταν και στις δύο. Ωστόσο, αξίζει να σημειωθεί ότι αυτός ο συνδετήρας είναι γνωστό ότι εκφράζεται σε περιτοναϊκή μεσοθηλιακών κυττάρων [31] και να λειτουργεί ως χημειοκίνη να επάγουν απομακρυσμένη μετάσταση μέσω μιας αλληλεπίδρασης με CXCR4-καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν [30]. Επομένως, εξετάσαμε αν CXCR4 θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως δείκτης για την ταυτοποίηση PD-σχετίζεται ΚΕΠ. Η έκφραση των CXCR4 στα κύτταρα 60As6 αναλύθηκε με ΡΑΟδ ανάλυση (FACS). Σύμφωνα με την έκφραση CXCR4 και προς τα εμπρός πρότυπο σκέδασης, τα κύτταρα 60As6 παρουσίασαν ετερογένεια αποτελείται από τρία διαφορετικά υποπληθυσμούς: I. CXCR4

+ μικρά κύτταρα (15%), II. CXCR4

– μικρά κύτταρα (65%), και III. CXCR4

– μεγάλα κύτταρα (20%) (Σχήμα 1 Ci). Τα κύτταρα στη συνέχεια διαχωρίζονται σε κάθε υποπληθυσμό, καθαρότητας I: 97%, II: 99%, και III: 54%, αντίστοιχα (Σχήμα 1 CII-1Civ). Η χαμηλής καθαρότητας διαλογή του CXCR4

– μεγάλων κυττάρων υποπληθυσμό III οφειλόταν στη μόλυνση με συγκεντρωτικά CXCR4

– μικρά κύτταρα (Εικ 1Civ, μαύρο-εγκλωβιστούμε πίνακα). Μεταξύ αυτών των τριών υποπληθυσμών, μόνο ένα CXCR4

– μεγάλων κυττάρων υποπληθυσμό που περιέχονται MUC5AC

+ διαφοροποιημένα κύτταρα (Εικ 1Civ, τρεις εξωτερικές επιφάνειες). Με την παρακολούθηση της κυτταρικής ανάπτυξης σε ένα μόνο κυτταρικό επίπεδο, διαπιστώθηκε ότι CXCR4

– μικρά κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν, ενώ το CXCR4

– μεγάλα κύτταρα δεν υφίστανται κυτταρική διαίρεση, ακόμη και 3 ημέρες μετά την καλλιέργεια (Σχήμα 1D και S4 Εικ). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι CXCR4

– μικρά κύτταρα είναι παροδική κύτταρα ενίσχυση, ενώ το CXCR4

– μεγάλα κύτταρα τερματικά-διαφοροποιημένα κύτταρα

Μετά τη διαλογή των δύο υποπληθυσμό (Ι και ΙΙ), αναλύουμε. οποιαδήποτε μετατόπιση του κυτταρικού πληθυσμού (Σχήμα 2Α)? μετά από 7 ημέρες καλλιέργειας. CXCR4

+ μικρά κελιά που αντιστοιχούν σε υποπληθυσμό που έχουν δημιουργήσει οι ίδιοι, CXCR4

– μικρά κύτταρα, και CXCR4

– μεγάλα κύτταρα (11%, 62% και 21%, αντίστοιχα), ενώ CXCR4

– μικρά κύτταρα που αντιστοιχούν σε υποπληθυσμού II ήταν σε θέση να προκαλέσει κυρίως για τον εαυτό τους (80%) με ορισμένες μεγάλα κύτταρα (17%) και πολύ λίγα CXCR4

+ μικρά κύτταρα (2%). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι CXCR4

+ μικρά κύτταρα έχουν τη δυνατότητα διαφοροποίησης και παράγουν CXCR4

– μεγάλα κύτταρα, ενδεχομένως, από ένα στάδιο CXCR4

-. Μικρά κύτταρα στο καθεστώς της διαφοροποίησης των κυττάρων

(Α ) και οι δύο CXCR4

+ και CXCR4

– κύτταρα 60As6 ταξινομήθηκαν με FACS (αριστερή στήλη). Τα κύτταρα από κάθε κλάσμα καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες και στη συνέχεια αναλύθηκαν για τα επίπεδα έκφρασης του CXCR4 (δεξιά στήλη). (Β) Η ανοσοκυτταροχημεία για MUC5AC (πράσινο) μιας αποικίας που προέρχεται από ένα μόνο CXCR4

+ μικρών κυττάρων. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 50 μm. (C) Δοκιμασία Κυττάρων-συγγενικής με δύο διαφορετικά χρώματα. Ταξινομημένο μόνο CXCR4

+ μικρά κύτταρα βάφτηκαν με αντίσωμα αντι-MUC5AC (κόκκινο) και CellTracker Green (Invitrogen, πράσινο) και για τον εντοπισμό των βιώσιμων κυττάρων για 7 ημέρες. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 50 μm. (D) RT-PCR του

LGR5

σε φυσιολογικά γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα (αριστερό πάνελ), CXCR4

+ μικρά κύτταρα και CXCR4

– μικρά κύτταρα (δεξιά πάνελ). μικροδιατομής λέιζερ χωρίζει το φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνο σε τρεις περιοχές:. pit, το λαιμό, και αδένα

Η

Επιπλέον, CXCR4

+ μικρό μόνο κύτταρο παράγεται μια αποικία που περιέχει MUC5AC

+ διαφοροποιημένα κύτταρα μετά 7 ημέρες σε καλλιέργεια (Σχήμα 2Β). Το εύρημα αυτό υποστηρίζεται από μια δοκιμασία κύτταρο-συγγενικής σε συνδυασμό με ζωντανή χρώση των κυττάρων και ανοσοχρώση MUC5AC (Σχήμα 2C). Επιπλέον, CXCR4

+ μικρά κύτταρα δείχθηκαν να εκφράζουν ένα υψηλό επίπεδο

LGR5

, η οποία είναι γνωστή ως δείκτης του γαστρικού επιθηλίου βλαστικών κυττάρων βρίσκεται στο αδένα του φυσιολογικού βλεννογόνου [32] (Σχ 2D ).

Στη συνέχεια, θα επικυρωθούν το αγκυροβόλιο ανεξαρτησία και την ικανότητα των όγκων-κίνηση των δύο μικρών κυττάρων υποπληθυσμό (Ι και ΙΙ). Στην δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, CXCR4

+ μικρά κύτταρα που σχηματίζονται πολλές περισσότερες αποικίες από ό, τι το CXCR4

– μικρά κύτταρα (σχήμα 3Α). Serial πειράματα αραίωση ενδοπεριτοναϊκή εμβολιασμό σε ανοσοανεπάρκεια ποντίκια αποκάλυψε ότι CXCR4

+ μικρά κύτταρα είχαν επίσης υψηλότερο ογκογόνο ικανότητα (ανάπτυξη του όγκου σε 4/5 και 1/5 ​​ποντίκια μετά από εμβολιασμό του 10

5 και 10

4 κύτταρα, αντίστοιχα) σε σύγκριση με το CXCR4

– μικρά κύτταρα (1/10 και 0/10 ποντικούς μετά από 10

5 και 10

4 κύτταρα, αντίστοιχα) (Εικ 3Bi). Αξίζει να σημειωθεί ότι και οι πέντε ποντικοί που φέρουν όγκο μετά τον εμβολιασμό του CXCR4

+ μικρό κύτταρα είχαν πολλαπλούς οζίδια όγκου (Σχ 3Bii), και άρχισε να αναπτύσσει αιματηρή ασκίτη μέσα σε 3 εβδομάδες (Εικ 3Biii).

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες της αγκύρωσης ανεξάρτητη ανάπτυξη του CXCR4

+ μικρά κύτταρα και CXCR4

– μικρά κελιά σε δοκιμασία σχηματισμού αποικιών (αριστερά). Ποσοτική ανάλυση της κυτταρικής ανάπτυξης χρησιμοποιώντας CyQuant GR χρωστικής (δεξιά) (n = 3, μέσος όρος + SE? *** Ρ & lt? 0.001). Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 200μm. συχνότητα σχηματισμού (Β) του όγκου των CXCR4

+ μικρά κύτταρα και CXCR4

– μεγάλα κύτταρα σε ξενομόσχευμα ποντικούς (Bi). Τα χαμηλότερα πλαίσια δείχνουν αντιπροσωπευτικές μακροσκοπικά ευρήματα πολλαπλών οζιδίων όγκου (ΒΙΙ, κεφαλή βέλους) μαζί με το έντερο και αιματηρές ασκίτη (ΒΙΙΙ) σε ένα ποντίκι SCID /SCID. (Γ) RT-PCR (αριστερό πάνελ) και ανοσοκυτταροχημική χρώση (δεξιά πάνελ) του CXCR4 (πράσινο) και CXCR7 (πράσινο) σε πρωτογενή καλλιεργημένα κύτταρα GC (NSC-20C). μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 200μm. (Δ) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής σε πρωτογενή καλλιεργημένα κύτταρα GC (NSC-20C) (Di) και κατατάσσονται

+ κυττάρων CXCR4 μετά από καλλιέργεια για 14 ημέρες (Ντίι). δοκιμασία σχηματισμού αποικίας των CXCR4

+ και CXCR4

– μικρά κύτταρα που προέρχονται από κύτταρα NSC-20C (n = 3, σημαίνει + SE? **

σ

& lt? 0.005). (ΔΙΙΙ)

Εκτός από διάχυτη-κυτταρικό τύπο GC γραμμές, διερευνήσαμε επίσης το ρόλο του CXCR4 σε ένα κλινικό δείγμα (NSC-20C): μιας κύριας καλλιέργειας εγκατεστημένος από τον ασκίτη ενός ασθενούς GC διάχυτου τύπου με PD. Στην RT-PCR και τα πειράματα ανοσοχρώση, επιβεβαιώθηκε ότι η κύρια καλλιέργεια εκφράζουν

CXCR4

αλλά όχι

CXCR7

(Σχήμα 3C). Είναι σημαντικό, CXCR4

+ μικρά κελιά ταξινομούνται από NSC-20C διέθετε τόσο την ικανότητα αποκατάστασης του πληθυσμού (Εικ 3Di και 3Dii) και ικανότητα σχηματισμού αποικιών υψηλή (Εικ 3Diii).

Συμμετοχή του CXCR4 /CXCR7 /SDF -1 άξονα στο PD

σε έξι άλλα που προέρχονται GC κυτταρικές σειρές διάχυτη τύπου (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9 και ΚΑΤΩ III), ερευνήσαμε περαιτέρω τη σχέση μεταξύ της κατάσταση έκφρασης δύο CXCL12 SDF-1 υποδοχείς /(CXCR4 και CXCR7) και τη συσσώρευση ασκίτη σε ποντίκια που εμβολιάστηκαν με καρκινικά κύτταρα ενδοπεριτοναϊκώς. Τα πειράματα RT-PCR αποκάλυψε ότι δύο κυτταρικές σειρές GC (HSC-39 και ΚΑΤΩ III) εκφράζεται έντονα

CXCR4

(Σχήμα 4Α). Επιπλέον, και οι δύο αυτές ξενομοσχευθέντος ποντίκια είχαν πολλαπλούς οζίδια όγκων και συσσωρευμένα ασκίτη (Σχήμα 4Β). Σε αντίθεση, οι άλλες δύο κυτταρικές σειρές (HSC-44 και HSC-58) έδειξε καθόλου ή πολύ χαμηλή έκφραση CXCR4, ένα μονό ή μερικά περιτοναϊκή οζιδίου όγκου και δεν συσσωρεύονται ασκίτη (Σχήμα 4Β). Επιβεβαιώσαμε επίσης τη συσσώρευση ασκίτη σε άλλο εξαιρετικά περιτοναϊκή-μεταστατική υποσειρά 58As9 (που προέρχεται από HSC-58), η οποία εκφράζεται

CXCR7

σε υψηλό επίπεδο, αλλά όχι

CXCR4

. Μία εξαιρετική περίπτωση ήταν 44As3 προέρχεται από HSC44 που είχε πολλαπλά οζίδια όγκου και συσσωρευμένη ασκίτη, χωρίς την έκφραση και των δύο

CXCR4

και

CXCR7

. Συνολικά, βρήκαμε μια υψηλή συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης του

CXCR4

ή

CXCR7

και οι επιθετικές φαινοτύπων σε επτά από τις οκτώ κυτταρικές σειρές εκτός 44As3.

(Α) RT-PCR του

CXCR4

και

CXCR7

σε 6 διάχυτη τύπου GC προέρχεται κυτταρικές σειρές. (Β) μακροσκοπικά ευρήματα των αιματηρών ασκίτη και πολλαπλά οζίδια όγκου (βέλος ή διακεκομμένη κύκλο) σε SCID /SCID ποντίκια που σχηματίζεται μέσα σε 3 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό κάθε κυτταρική σειρά.

Η

Στην κλινική πρακτική, περιτοναϊκή πλύση κυτταρολογία (CY) παρέχει σημαντικές προγνωστικές πληροφορίες για τους ασθενείς GC, διότι μπορεί να ανιχνεύσει το «σπόροι» του Π.Δ. πριν μακροσκοπική εκδήλωση του. Ακόμη και στις περιπτώσεις που δεν PD (P0), CY-θετικούς ασθενείς που έχουν φτωχή πρόγνωση [33], υποδηλώνοντας ότι αρκετά μεταστατικά CSCs είναι παρόντες στην περιτοναϊκή πλύση των ασθενών αυτών. Ως εκ τούτου, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε η παρουσία κυττάρων GC CXCR4

+ σε περιτοναϊκή εκπλύματα από τους ασθενείς χωρίς κλινικά εμφανή ασκίτη.

CXCR4

mRNA σπανίως ανιχνεύονται στα πλυσίματα σε 9 από 10 CY-αρνητικούς ασθενείς? Ωστόσο, το mRNA ανιχνεύθηκε στα πλυσίματα σε 19 από 34 CY-θετικούς ασθενείς (S5A Εικ). Επιβεβαιώσαμε επίσης την παρουσία του CXCR4 και κυτοκερατίνη διπλά θετικά μικρά κύτταρα GC στα mesothelial κύτταρα λιθόστρωτους σχήμα που συνδέονται με την επιφάνεια του τρυβλίου καλλιέργειας σε βραχυπρόθεσμη (7 ημέρες) καλλιέργειας του ασκίτη του ασθενούς (Εικ S5B). Στα πειράματά μας, τα περιτοναϊκή mesothelial κύτταρα συνήθως εξαφανίστηκε στη μακροχρόνια καλλιέργεια μετά από περίπου ένα μήνα. Σε μια τέτοια μακροχρόνια καλλιέργεια, βρήκαμε επίσης την παρουσία κάποιου CXCR4- ή CXCR7-πολύ θετικά κύτταρα GC η οποία έδειξε χαρακτηριστικά για επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης, βιμεντίνη (VIM) -θετικό (κεφαλή βέλους στο S5c σχήμα), αλλά κυτοκερατίνης (PAN )-αρνητικός. Ως εκ τούτου, CXCR4 κυττάρων

+ GC είναι παρούσες στα κακοήθη ασκίτη όχι μόνο στο αρχικό στάδιο της περιτοναϊκής διάδοσης (P0 /CY

+), αλλά και σε πιο προοδευτικές φάσεις χαρακτηρίζονται από μια συσσώρευση εμφανή ασκίτη. Εν ολίγοις, η παραπάνω πειραματικά και κλινικά στοιχεία δείχνουν ότι ένα μέρος του CXCR4

+ ή CXCR7

+ κύτταρα GC έχει ένα δυναμικό για την ανάπτυξη περιτοναϊκή μετάσταση.

Είμαστε δίπλα διερευνηθεί ο λειτουργικός ρόλος του CXCR4 μονοπάτι στο PD σηματοδότησης. Η έκφραση του

CXCL12

/

SDF-1

στην περιτοναϊκή μεσοθήλιο ανθρώπου και ποντικού επιβεβαιώθηκε με RT-PCR (Σχήμα 5Α). Ως εκ τούτου, η συμμετοχή του CXCL12 /SDF-1 για την κυτταρική εισβολή διερευνήθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, ο αριθμός των μεταστατικών κυττάρων 60As6 δραστικά αυξήθηκε κατά SDF-1, δεικνύοντας ότι αυτά τα κύτταρα έχουν την ικανότητα να χημειοταξία SDF-1. Λεντοϊών shRNA επαγόμενη knockdown του CXCR4 σε 60As6 εξασθενημένος SDF-1-μεσολαβούμενη εισβολή, αλλά δεν επηρεάζεται το σχηματισμό οζιδίων όγκου στην περιτοναϊκή κοιλότητα ποντικών (δεν φαίνεται). Επιπλέον, η αναγκαστική έκφραση CXCR4 σε γονική κυτταρική γραμμή HSC-60 ποτέ αύξησε την ογκογονικότητα (δεν φαίνεται).