Αφηρημένο

Ιστορικό

Η πολυανθεκτικότητα (MDR) είναι ένας από τους σημαντικότερους λόγους χημειοθεραπείες με βάση αποτύχει. Η υποξία συνδέεται γενικά με χημειοαντίσταση όγκου. Ωστόσο, η συσχέτιση μεταξύ της ετεροδιμερικής υποξία παράγοντα-1 (HIF-1) και η αντίσταση σε πολλά φάρμακα (MDR1) γονίδιο /μεταφορέα Ρ-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp) παραμένει ασαφής. Η μελέτη αυτή έχει ως στόχο να διερευνήσει τις μοριακών μηχανισμών της αναστροφής MDR καρκίνου του παχέος εντέρου, εστιάζοντας στην γονιδίου στόχου HIF-1α.

Μέθοδοι

Ένα χημειοθεραπευτικών δοκιμασία ευαισθησίας χρησιμοποιήθηκε για να παρατηρήσουμε την αποτελεσματικότητα της αναστροφής MDR στην LoVo πολυκύτταρων σφαιροειδή (MCS). Η αποπτωτική επίπεδο που προκαλείται από διάφορα φάρμακα εξετάστηκε με κυτταρομετρία ροής (FCM). Η σύνδεση του HIF-1α προς το γονίδιο υποκινητή MDR1 αξιολογήθηκε από χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας). Η σχέση μεταξύ του HIF-1α /P-gp έκφραση και ευαισθησία στη χημειοθεραπεία αναλύθηκε.

Αποτελέσματα

Η ευαισθησία των LoVo MCS σε όλα τα τέσσερα φάρμακα χημειοθεραπείας μειώθηκε σε διαφορετικούς βαθμούς κάτω από συνθήκες υποξίας. Μετά την αποσιώπηση του γονιδίου του HIF-1α, οι ευαισθησίες των LoVo MCS σε όλα τα τέσσερα φάρμακα χημειοθεραπείας αποκαταστάθηκαν. Τα αποπτωτικά επίπεδα που όλα τα φάρμακα που επάγεται ήταν όλοι μειώθηκαν σε διάφορους βαθμούς στην υποξική ομάδα. Μετά φίμωση HIF-1α, το επίπεδο απόπτωσης που επάγεται από τα τέσσερα φάρμακα χημειοθεραπείας αυξηθεί. Η έκφραση του HIF-1α και P-gp ήταν σημαντικά αυξημένη σε LoVo MCS μετά από θεραπεία με υποξία. Η αναστολή HIF-1α μείωσε σημαντικά την έκφραση του mRNA ή πρωτεΐνης /P-gp MDR1 σε αμφότερες τις μονοστιβάδες LoVo και LoVo MCS. Η δοκιμασία έδειξε ότι ChIP HIF-1α συνδέθηκε με το γονίδιο υποκινητή MDR1. ασθενείς προχωρημένο καρκίνωμα του παχέος εντέρου με έκφραση τόσο HIF-1α και P-gp ήταν πιο ανθεκτικά στην χημειοθεραπεία από ότι με μη έκφρασης.

Συμπεράσματα

HIF-1α αναστολή αντιστρέφει πολυφαρμακευτικής αντίστασης σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου μέσω αρνητική ρύθμιση της MDR1 /P-gp. Η έκφραση του HIF-1α και MDR1 /P-gp μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικό δείκτη για την αντίσταση χημειοθεραπεία στον καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Chen J, Ding Ζ, Peng Υ, Pan F, Li J, Ζου L, et al. (2014) HIF-1α Αναστολή Αντιστρέφει πολυφαρμακευτική αντίσταση στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα μέσω Ελάττωση του MDR1 /Ρ-γλυκοπρωτεΐνη. PLoS ONE 9 (6): e98882. doi: 10.1371 /journal.pone.0098882

Επιμέλεια: Michal Zmijewski, Ιατρικό Πανεπιστήμιο του Γκντανσκ, Πολωνία

Ελήφθη: 7 Δεκ 2013? Αποδεκτές: 8 Μαΐου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Ιουνίου του 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (No.30973430 και No.81101629). (https://isisn.nsfc.gov.cn/egrantweb/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθεις όγκους σε όλο τον κόσμο, και χημειοθεραπεία παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη θεραπεία του. Ωστόσο, η ευαισθησία σε διαφορετικές χημειοθεραπευτικές αγωγές ποικίλλει ευρέως από άτομο σε άτομο. Πολλοί ασθενείς με καρκίνο αναπτύσσουν αντοχή φαρμάκου, οδηγώντας σε κακή αποτελέσματα της θεραπείας. Επιπλέον, αντοχή φαρμάκου εμφανίζεται κυρίως σε συμπαγείς όγκους in vivo, αλλά όχι σε μονοστιβάδες in vitro [1]. Το μικροπεριβάλλον του όγκου διαδραματίζει έναν κεντρικό ρόλο στην αποτυχία χημειοθεραπείας και αντοχής φαρμάκου [2] – [4].

Η υποξία είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό πολλών κακοηθών όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου. Μία υποξική μικροπεριβάλλον του όγκου θεωρείται όλο ένα κρίσιμο συστατικό στον καθορισμό της αντίστασης στα φάρμακα [5], [6]. Υποξία παράγοντα-1 (HIF-1) είναι ένας βασικός παράγοντας για την τροποποίηση των βιολογικά χαρακτηριστικά των όγκων. πρωτεΐνη HIF-1α υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκίνου στον άνθρωπο και συνδέεται με χειρότερη πρόγνωση σε πολλούς καρκίνους. Αν και πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η υποξία ενισχύει την αντίσταση του όγκου σε χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία [7], [8], το πώς η υποξική μικροπεριβάλλον συμβάλλει σε αντικαρκινικά ανθεκτικότητα στο φάρμακο δεν έχει ακόμη καθιερωθεί.

αντίσταση σε πολλαπλά φάρμακα (MDR) είναι ένας από τους σημαντικότερους λόγους για τους οποίους συμβαίνει χημειοθεραπεία με βάση την αποτυχία της θεραπείας. Από τα πολλά μηχανισμοί MDR, η υψηλή έκφραση του ανθρώπινου γονιδίου MDR1 και την P-γλυκοπρωτεΐνη (P-gp) μεταφορέα που κωδικοποιείται από MDR1 είναι μια σημαντική εστίαση της έρευνας [9]. Νεοπλασματικών κυττάρων που υπερεκφράζουν MDR1 /P-gp δείχνουν συνήθως αντίσταση σε διάφορους χημειοθεραπευτικά [10], [11]. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι η έκφραση πρωτεΐνης HIF-1α συσχετίζεται με MDR1 /P-gp έκφραση σε ιστό καρκινώματος κόλου και μια κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου, και τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του HIF-1α και MDR1 είναι σημαντικά υψηλότερες στον ίδιο τύπο κυττάρων σε υποξικές συνθήκες από ό, τι σε νορμοξικά συνθήκες [12]. Παραμένει ασαφές εάν και πώς HIF-1α εμπλέκεται σε MDR στον καρκίνο του παχέος εντέρου μέσω της αλληλεπίδρασης των MDR1 /P-gp.

Εξερευνώντας την επίδραση της υποξίας για τον καρκίνο του παχέος εντέρου MDR θα συμβάλει στη βελτίωση της επίδρασης της χημειοθεραπείας. Σε υποξικά μικροπεριβάλλον, υποθέτουμε ότι HIF-1α μπορεί να επάγει άμεσα την έκφραση του MDR1 /P-gp η οποία οδηγεί σε MDR, και η αντιστροφή του καρκίνου του παχέος εντέρου MDR μπορεί να επιτευχθεί όταν HIF-1α έκφραση είναι ειδικά αναστέλλεται. Στην παρούσα μελέτη, στόχος μας είναι να διερευνήσει τις πιθανές μοριακών μηχανισμών και τη σκοπιμότητα της αναστροφής του παχέος εντέρου MDR καρκίνου με επίκεντρο το γονίδιο στόχο HIF-1α. Περιμένουμε να παρέχουν μια θεωρητική βάση και πειραματικές αποδείξεις για αργότερα που σχετίζονται με εφαρμογές στην κλινική θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Η άνω και κάτω τελεία καρκίνου ανθρώπινη κυτταρική σειρά LoVo λήφθηκε από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) και καλλιεργήθηκαν σε υψηλής γλυκόζης τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ, Gibco, USA), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (HyClone, USA) και αντιβιοτικά (1% πενικιλλίνη και 1% στρεπτομυκίνη). Για έκθεση υποξία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες σε ένα θάλαμο διαμορφωτή επωαστήρα στους 37 ° C με 1% O

2, 5% CO

2, και 94% Ν

2. Πολυκυτταρική σφαιροειδή (MCS) ελήφθησαν με τη χρήση της τεχνικής υγρού επικάλυψης [13]. Εν συντομία, εκθετικώς αναπτυσσόμενα κύτταρα LoVo προστέθηκαν σε τρυβλία μέσο καλλιέργειας που είχαν προηγουμένως επικαλυφθεί με 2% αγαρόζης. Οι πλάκες απαλά και οριζόντια στροβιλίζεται για 10-15 λεπτά ανά 2-3 ώρες κατά τις πρώτες 24 ώρες, και στη συνέχεια για 10 λεπτά κάθε 4 ώρες. Κατάλληλες μέσο ανανεώθηκε κάθε δεύτερη μέρα. Για τα πειράματα υποξία, κατάλληλο MCS ιδρύθηκαν το νορμοξίας για 48 ώρες και στη συνέχεια καλλιεργούνται σε υποξία για άλλες 24 ώρες.

Χημικά

αδριαμυκίνη (ADR, Hisun Pharmaceutica, Κίνα), βινκριστίνη (VCR, Hisun Pharmaceutica, Κίνα), 5-φθοριοουρακίλη (5-FU, Sigma, ΜΟ, USA), ή ιρινοτεκάνη (CPT-11, Hengrui Medicine, Κίνα) έχουν όλα πρόσφατα παρασκευασμένο από την ημέρα της χρήσης με διαλυτοποίηση της απαιτούμενης συγκέντρωσης σε ϋΜΕΜ με 10% ορό εμβρύου μόσχου.

χημειοθεραπευτικής ευαισθησίας Δοκιμασία

LoVo κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν, επαναιωρήθηκαν και μετρήθηκαν, και 1000 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων προηγουμένως επικαλυμμένα με 2% αγαρόζη για να ληφθεί MCS σε φυσιολογική οξυγόνωση. Για πειράματα υποξίας, τα κατάλληλα MSC μεταφέρθηκαν σε υποξία για 24 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με κλίση συγκεντρώσεις φαρμάκων για άλλες 24 ώρες σε υποξία. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με την 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-Ζ-υλ) -3, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ, BD Biosciences, NJ, USA) δοκιμασίας. Οι πλάκες επωάστηκαν με ΜΤΤ στους 37 ° C για 4 ώρες, και η απορρόφηση στα 490 nm μετρήθηκε με Model 550 Microplate Reader (Bio-Rad, CA, USA).

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Ολικό RNA εκχυλίστηκε με το αντιδραστήριο TRIZOL (Invitrogen, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: 5′-GTTTGATTTTACTCATCCAT-3 ‘και 5′-TTCATAGTTCTTCCTCGG-3′ για HIF-1α? 5’-CTTGGCAGCAATTAGAAC-3 ‘και 5′-TCAGCAGGAAAGCAGCAC-3′ για MDR1? 5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA -3 ‘και 5′-GCGGCGCAATACGAATGCCCC -3’ για 18sRNA. Η σύνθεση του πρώτου κλώνου cDNA πραγματοποιήθηκε με κιτ σύνθεσης cDNA (Takara, Dalian, Κίνα). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την Πράσινη πραγματικού χρόνου PCR κιτ SYBR (Takara). Όλα την εξομάλυνση έγιναν χρησιμοποιώντας επίπεδα 18sRNA και οι φορές αλλαγές υπολογίστηκαν με τη μέθοδο δέλτα-δέλτα Ct. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε τρεις βιολογικούς επαναλήψεις.

Ανάλυση Western Blot

Η συνολική πρωτεΐνη (50 μg) διαχωρίστηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου με δωδεκυλοθειϊκό νάτριο. Μετά τη μεταφορά της πρωτεΐνης σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο μικροπορώδεις μεμβράνες (Bio-Rad), οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα και επωάστηκαν διαδοχικά με τα πρωτεύοντα αντισώματα (HIF-1α 1:500? Ακτίνη β-1? P-gp 1:200 :5000), ακολουθούμενη από επώαση με το φλουορεσκεΐνη-συνδεδεμένη αντι-ποντικού (αντι-κουνέλι) IgG (1:1000) και στη συνέχεια επώαση με αντι-φλουορεσκεΐνη αντίσωμα συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση (1:5000). Όλα τα αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz, CA, USA. Τα ανοσοσύμπλοκα ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια αντιδραστήριο (Pierce, USA). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, τα σήματα ήταν πυκνομετρικώς κανονικοποιούνται σε β-ακτίνης από Ποσότητα λογισμικό ανάλυσης Μία εικόνα (Bio-Rad).

HIF-1α siRNA Κατασκευή και διαμόλυνση

Pre-miRNA ακολουθίες RNAi για τον στόχο γονίδια HIF-1α και MDR1 σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν. Μετά τις δύο ειδικές φορείς έκφρασης miRNA RNAi με το γονίδιο αναφοράς EmGFP στοχεύουν το ανθρώπινο HIF-1α και γονιδίων MDR1, αντίστοιχα, κατασκευάστηκαν και εντοπίστηκαν με πέψη ενζύμου περιορισμού και αλληλούχιση, τα πλασμίδια RNAi του HIF-1α και MDR1 διαμολύνθηκαν σε κύτταρα LoVo χρησιμοποιώντας το λιπόσωμα Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA). Σταθερό θετικοί κλώνοι επιλέχθηκαν χρησιμοποιώντας βλαστισιδίνη. Οι βαθμοί knockdown του HIF-1α και MDR1 ταυτοποιήθηκαν με PCR. Επιλέχθηκαν τα πλασμίδια RNAi με καλύτερα αποτελέσματα καταστολής για την μετέπειτα κατασκευή των κλώνων λεντοϊού έκφρασης των miRNAs. Δύο κλώνοι φακοϊό έκφραση miRNA, pLenti6 /V5-GW /EmGFP-miR-HIF-1α και pLenti6 /V5-GW /EmGFP-miR-MDR1, κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τεχνικές Πύλη ανασυνδυασμού (Invitrogen) και συν-επιμολύνεται σε 293FT κυττάρων με το μείγμα συσκευασίας ViraPower (Invitrogen). Ο τίτλος εξετάσθηκε μετά μόλυνση κυττάρων ΝΙΗ /3Τ3 με υπερκείμενο ιού. Στη συνέχεια, τα κύτταρα LoVo μολύνθηκαν με τους δύο λεντοϊού φορέα με τη μεσολάβηση συστημάτων miRNA RNAi και σταθερώς επιλέγονται από blasticidin.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας)

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε δίσκους 100 mm διαμέτρου και , μετά από 24 ώρες, επωάστηκαν με 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά στους 37 ° C για να συνδέσει εγκάρσια πρωτεΐνες στο DNA. Η αντίδραση εγκάρσιας σύνδεσης σβήστηκε με την προσθήκη ένα-δέκατο όγκου 1,25 mol /L γλυκίνη. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS 1 ×? επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό δοκιμασίας ραδιοανοσοκαταβύθισης και διατηρήθηκε σε πάγο για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα λύματα των κυττάρων σε υπερήχους σε πάγο με μια Hielscher UP200S υπερήχων υπερήχων (Hielscher Ultrasonics GmbH, Γερμανία) μέχρις ότου οι διασταυρωμένες χρωματίνη ήταν διασπασμένο ώστε να παραχθούν θραύσματα DNA μεταξύ 200 και 1000 bp. Τα υπερκείμενα επωάστηκαν με εναιώρημα αγαρόζης DNA σπέρματος σολωμού /πρωτεΐνης-50% για να μειωθεί η μη ειδική φόντο. Η ανοσοκαθίζηση εκτελέστηκε έπειτα επί μία νύκτα στους 4 ° C με 5 μg αντισώματος αντι-HIF-1α (Santa Cruz, CA, USA). Αυτά τα υπερκείμενα συμπληρωμένο με 5 mol /L NaCl και θερμάνθηκε όλη τη νύκτα στους 65 ° C για να αντιστρέψει πρωτεΐνη-DNA διασυνδέσεις. Τα ανοσοσύμπλοκα περαιτέρω σε επεξεργασία με ϋΝάση ελεύθερη ΚΝάσης και χωρίς πρωτεϊνάση Κ, και το DNA καθαρίστηκε με εκχύλιση φαινόλης /χλωροφορμίου και καταβύθιση αιθανόλης. Διεξήχθη PCR με εκκινητές ειδικούς για την περιοχή η οποία περιέχει την απαντητική περιοχή υποξία ενισχυτή (5′-GCGTG-3 ‘) του υποκινητή MDR1 [14]. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: 5’-GGAGCAGTCATCTGTGGTGA-3 ‘και 5′-CTCGAATGAGCTCAGGCTTC-3’. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [24], ανθρώπινου αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF, μια καθιερωμένη HIF-1 γονιδίου στόχου) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος και εναρκτήρες που πλευρίζουν την υποξία απόκριση ενισχυτή του υποκινητή του VEGF ήταν 5′-GCCTCTGTCTGCCCAGCTGC-3 ‘και 5 «-GTGGAGCTGAGAACGGGAAGC-3 ‘. Ανοσοκαταβύθιση με μη ειδική IgG (Santa Cruz) διεξήχθη ως αρνητικός έλεγχος. Ένα δείγμα που αντιπροσωπεύει γραμμική ενίσχυση του συνολικού DNA εισόδου χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος εισόδου.

Ανίχνευση απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής (FCM)

Τα κύτταρα παρασκευάστηκαν και κατεργάστηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω και στη συνέχεια χρωματίζονται με αλλοφυκοκυανίνη (APC), συζευγμένης αννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Annexin V-APC /ΡΙ Apoptosis Detection Kit? Jingmei Biotech, Κίνα). Ο πληθυσμός της αννεξίνης βιώσιμα και αννεξίνη V αποπτωτικών κυττάρων αρνητικών V-θετικά αξιολογήθηκε με FCM. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν σε ένα όργανο FACSCalibur (BD Biosciences) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest (BD Biosciences).

Ασθενείς και όγκου δείγματα

Εκατόν είκοσι ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένο προχωρημένο καρκίνωμα του παχέος εντέρου και οι οποίοι υποβλήθηκαν σε 5-FU χημειοθεραπεία με βάση την Νοτιοδυτικά Νοσοκομείο, Τρίτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Chongqing, Κίνα, μεταξύ 2004 και 2008 ήταν επιλέξιμα για τη μελέτη αυτή. Η μελέτη αυτή εξετάστηκε και εγκρίθηκε από την ηθική και το πρωτόκολλο κριτική επιτροπή του Νοσοκομείου Southwest, Τρίτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο και σε όλους τους ασθενείς που παρέχονται σε γραπτή μορφή συγκατάθεσης. Οι ασθενείς είχαν ηλικία 30-79 ετών (μέση ηλικία, 54 ετών)? 73 ήταν άνδρες και 47 ήταν γυναίκες. ανταπόκριση σε χημειοθεραπεία, αξιολογήθηκε με αξονική τομογραφία ή άλλες ακτινογραφικών μέσων μετά από δύο κύκλους θεραπείας, υιοθετώντας τα κριτήρια ανταπόκρισης αξιολόγησης σε Στερεά κριτήρια Ομάδα όγκοι. Ανάλογα με την ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία, οι ασθενείς ταξινομήθηκαν ως ανταποκρινόμενοι ή μη ανταποκρινόμενοι. Δείγματα ιστού μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη, και κόπηκαν σε 4-μm διαδοχικές τομές. Η έκφραση του HIF-1α και P-gp εξετάστηκε με ανοσοϊστοχημεία, όπως περιγράφεται προηγουμένως [12]. Clear καφέ-κίτρινο χρώση περιορίζεται στην πυρήνες, κυτταρόπλασμα, ή κυτταρική μεμβράνη υποδεικνύεται θετική έκφραση του HIF-1α ή P-gp. Θετική έκφραση καταγράφηκε ως (+) και αρνητικό έκφρασης όπως (-).

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα που παρέχονται ως ο μέσος όρος ± SD. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με το τεστ chi-square, t δοκιμή Student, και μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA).

σ

& lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS έκδοση 13.0 για Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Αποτελέσματα

LoVo MCS είναι πιο ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία από Μονοστοιβάδες σε συνθήκες υποξίας

Για να μιμούνται την υποξική μικροπεριβάλλον του όγκου in vivo [15], [16], LoVo MCS ελήφθησαν με τη χρήση της τεχνικής υγρού επικάλυψης. κύτταρα LoVo συσσωματωμένα μεταξύ τους και πολλαπλασιάστηκαν ραγδαία. Αφού καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες, LoVo MCS αποτελούνταν από έναν αριθμό συσσωματωμένα κύτταρα (Εικόνα 1Β). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου έδειξε ότι η έκφραση του HIF-1α ήταν σημαντικά υψηλότερη σε LoVo MCS ό, τι σε LoVo μονοστιβάδες, όχι μόνο σε συνθήκες υποξίας, αλλά και σε φυσιολογική οξυγόνωση (

ρ

& lt? 0,05) (Σχήμα 1 C). ευαισθησίες Drug προς 5-FU αξιολογήθηκαν, και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι LoVo MCS ήταν πιο ανθεκτικά στην 5-FU από ήσαν μονοστοιβάδες σε υποξία (

ρ

& lt? 0,05). Επιπλέον, τόσο LoVo MCS και μονοστοιβάδες ήταν πιο ανθεκτικά στην 5-FU σε υποξικές συνθήκες από ό, τι σε νορμοξία (Σχήμα 1 D).

(Α) Η μορφολογία του LoVo μονοστοιβάδες. μπαρ κλίμακας = 50 μm. (Β) Η μορφολογία των LoVo MCS. μπαρ κλίμακας = 50 μm. (Γ) Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου ανιχνεύθηκε έκφραση mRNA HIF-1α σε LoVo MCS και σε μονοστοιβάδες υπό νορμοξικές και υποξικές συνθήκες. Τα επίπεδα 18sRNA χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικός έλεγχος και τις πολλαπλές μεταβολές υπολογίσθηκαν με τη μέθοδο δέλτα-δέλτα Ct. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε τρεις βιολογικούς επαναλήψεις και PCR για κάθε γονίδιο πραγματοποιήθηκε εις διπλούν (*

ρ

& lt? 0,05). (D) ευαισθησίες Drug (μέση ± SD, η = 3) των LoVo MCS και LoVo μονοστιβάδες σε 5-FU σε υποξία ή νορμοξία (*

ρ

& lt? 0,05, Ν: νορμοξία, Η: υποξία).

Η

HIF-1α Αναστολή Αντιστρέφει πολυφαρμακευτική αντίσταση στην LoVo MCS

Επειδή LoVo MCS έδειξαν μεγαλύτερη αντίσταση στη χημειοθεραπεία από μονοστιβάδες έκανε στην υποξία, θελήσαμε να διερευνήσουμε αν η αντίσταση των ναρκωτικών άλλαξαν όταν HIF- έκφραση 1α ήταν ειδικά αναστέλλεται. Έχουμε δημιουργήσει με επιτυχία ένα μοντέλο LoVo MCS και σταθερή LVV-HIF-1α και LVV-MDR1 miR-μολυσμένες ομάδες. Σε υποξικές συνθήκες, η ευαισθησία των LoVo MCS στη χημειοθεραπεία με κάθε ένα από τα τέσσερα φάρμακα μειώθηκε σε διάφορους βαθμούς. Η ανασταλτικές συγκέντρωση 50% (IC

50) τιμές στην υποξική ομάδα ήταν όλα υψηλότερα από εκείνα στην ορθοξικές ομάδα (ADR, VCR, και 5-FU,

σ

& lt? 0,01? CPT- 11,

σ

& gt? 0,05) (Σχήμα 2). Μετά επιβάλλει σιωπή στο γονίδιο HIF-1α, οι ευαισθησίες των LoVo MCS σε όλες τις τέσσερις φάρμακα χημειοθεραπείας αποκαταστάθηκαν σε διαφορετικό βαθμό. Η σχετική αναλογία μεταξύ αντιστροφή LVV-HIF-1α miR μολυσμένα ομάδα (υποξία) και η MCS (υποξία) για κάθε φάρμακο ήταν ως ακολούθως: ADR, 82,8% (

ρ

& lt? 0,01)? VCR, 83,8% (

σ

& lt? 0,01)? 5-FU, 70,7% (

σ

& lt? 0,01)? και CPT-11, 48,5% (

σ

& gt? 0,05). Μετά φίμωση το γονίδιο MDR1, η σχετική αναλογία μεταξύ αντιστροφή LVV-MDR1 miR μολυσμένα ομάδα (υποξία) και η MCS (υποξία) για κάθε φάρμακο ήταν ως ακολούθως: ADR, 74,2% (

ρ

& lt? 0,01) ? VCR, 70,9% (

σ

& lt? 0,01)? 5-FU, 58,1% (

σ

& lt? 0,05)? και CPT-11, 15,2% (

σ

& gt? 0,05)

(Α) ADR.. (Β) VCR. (Γ) 5-FU. (D) CPT-11. (Ε) IC50 των διαφόρων ομάδων LoVo MCS να χημειοθεραπευτικά (μέση ± SD, η = 3, **

ρ

& lt? 0,01, *

ρ

& lt? 0,05, Ν: νορμοξία, Η :. υποξία)

η

HIF-1α Αναστολή Ενισχύει την απόπτωση που προκαλείται από χημειοθεραπεία ναρκωτικά στο LoVo MCS

στη συνέχεια, παρατήρησε την απόπτωση που προκαλείται από φάρμακα χημειοθεραπείας στην LoVo MCS όταν η έκφραση του HIF-1α ήταν ειδικά αναστέλλεται. Η ανάλυση απόπτωσης από FCM έδειξε ότι (Σχήμα 3), σε σύγκριση με LoVo MCS υπό νορμοξικές συνθήκες, τα αποπτωτικά επίπεδα που επάγονται από τα τέσσερα φάρμακα ήταν όλα κάτω σε διάφορους βαθμούς στην υποξική ομάδα (ADR, VCR, και 5-FU,

σ

& lt? 0,01? CPT-11,

σ

& gt? 0,05). Μετά αποτελεσματικά φίμωση του γονιδίου στόχου HIF-1α, την επαγόμενη επίπεδο απόπτωσης από ADR, VCR και 5-FU ήταν σημαντικά αυξημένη (

σ

& lt? 0,01) και ήταν 9,2 φορές, 7,4 φορές, και 2,6 φορές αντίστοιχα, σε αντίθεση με εκείνη των LoVo MCS (ομάδα υποξία). Παρ ‘όλα αυτά, το επίπεδο απόπτωσης που επάγεται με CPT-11 ήταν μόνο 1,1 φορές στην ομάδα υποξία, χωρίς στατιστική σημασία (

σ

& gt? 0,05).

Το ποσοστό των αννεξίνης ν-θετικής αποπτωτικά κύτταρα (κάτω δεξιά τεταρτημόριο) αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας αννεξίνη V αλλοφυκοκυανίνη (APC) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση των LoVo MCS μετά από θεραπεία με (Β) ADR (25 μg /ml), (Γ) VCR (25 μg /ml), (D) 5-FU (200 μg /ml) και (Ε) CPT-11 (200 μg /ml). Μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. Δεδομένα από κάθε στατιστικό γράφημα της χρώσης /ΡΙ αννεξίνης V-APC εκφράζεται σε% των κυττάρων στο κατώτερο δεξιό τεταρτημόριο και αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Τα διαγράμματα γραμμή στο κάτω μέρος της κυτταρομετρίας ροής scatterplots αντιπροσωπεύουν το% των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση στην κάτω δεξιά τεταρτημόριο. (**

ρ

& lt? 0,01, Ν: νορμοξία, Η: υποξία)

MDR1 /P-gp Έκφραση πρωτεΐνης μειώνεται στο LoVo MCS μετά LVV-HIF-1α miR η επιμόλυνση στη υποξία

για να διερευνήσει τις πιθανές μοριακών μηχανισμών της αναστροφής MDR εστιάζοντας στο γονίδιο-στόχο HIF- 1α, ανιχνεύσαμε την έκφραση του MDR-σχετικών γονιδίων σε LoVo MCS όταν η έκφραση του HIF-1α ήταν ειδικά αναστέλλεται. κηλίδα Western έδειξε ότι η έκφραση του HIF-1α και P-gp σε LoVo MCS ήταν σημαντικά αυξημένη μετά από θεραπεία για 24 ώρες σε υποξία (

ρ

& lt? 0,01). Όταν HIF-1α χτυπήθηκε κάτω στο LVV-HIF-1α miR μολυνθεί MCS, τόσο HIF-1α και την έκφραση της P-gp πρωτεΐνης ρυθμίζεται προς τα κάτω σε σχέση με την ομάδα αρνητικού ελέγχου (

σ

& lt? 0,01). Και, στην LVV-MDR1 miR μολυσμένα MCS, το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης του HIF-1α δεν έδειξε διαφορά ενώ P-gp μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με την ομάδα αρνητικού ελέγχου (Σχήμα 4). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι MDR1 ήταν το κατάντι γονίδιο του HIF-1α και MDR1 /έκφραση P-gp θα μειωθεί σε LoVo MCS ενώ HIF-1α ανεστάλη.

(Α) διεξήχθησαν αναλύσεις κηλίδος Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Β) Τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης (μέση τιμή ± SD, η = 3) του HIF-1α και P-gp προσδιορίστηκαν σε κάθε ομάδες (**

ρ

& lt? 0,01, Ν: νορμοξία, Η: υποξία) .

η

MDR1 /P-gp mRNA και η έκφραση πρωτεΐνης μειωμένη σε LoVo Μονοστιβάδες μετά LVV-HIF-1α miR η επιμόλυνση στη υποξία

Επειδή MDR1 έκφραση της πρωτεΐνης /P-gp μειώθηκε σε LoVo MCS μετά LVV-HIF-1α miR επιμόλυνση, ανιχνεύσαμε περαιτέρω την έκφραση του MDR-σχετικών γονιδίων στα μονοστιβάδες LoVo στην υποξία. Μετά σταθερώς μολύνοντας LoVo μονοστιβάδες με LVV-HIF-1α miR και LVV-MDR1 Mir, ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR και αποτύπωμα Western (Σχήμα 5) έδειξαν ότι σε υποξία, τα επίπεδα mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης του HIF-1α και MDR1 στην LVV -HIF-1α ομάδα miR ήταν σημαντικά χαμηλότερες από εκείνες των μη επεξεργασμένων και αρνητικές ομάδες ελέγχου miR (

σ

& lt? 0,01). Ωστόσο, στην ομάδα LVV-MDR1 Mir, μόνο τα επίπεδα του mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης του γονιδίου MDR1 ήταν στατιστικά χαμηλότερες από εκείνες των ομάδων μη-επεξεργασμένα και αρνητικό έλεγχο miR σε υποξία (

ρ

& lt? 0,01) , ενώ δεν υπάρχουν διαφορές στην HIF 1α-mRNA και πρωτεΐνης παρατηρήθηκαν (

σ

& gt? 0,05).

(Α, Β) Ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανιχνεύεται HIF-1αor έκφραση MDR1 mRNA σε LoVo μονοστιβάδες (υποξία) με LVV-HIF-1α miR (Α) ή LVV-MDR1 miR (Β) σταθερή μεταγωγή. Μη επεξεργασμένων μονοστιβάδες σε νορμοξία χρησιμοποιήθηκαν ως ορθοξικές ελέγχου. Τα επίπεδα 18sRNA χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικός έλεγχος και τις πολλαπλές μεταβολές υπολογίσθηκαν με τη μέθοδο δέλτα-δέλτα Ct. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε τρεις βιολογικούς επαναλήψεις και PCR για κάθε γονίδιο πραγματοποιήθηκε εις διπλούν (**

ρ

& lt? 0,01). (C-F) κηλίδα Western ανιχνεύθηκε HIF-1α και έκφραση P-gp πρωτεΐνης σε LoVo μονοστιβάδες (υποξία) με LVV-HIF-1α miR (C) ή LVV-MDR1 miR (Ε) σταθερή μεταγωγή. Μη επεξεργασμένων μονοστιβάδες σε νορμοξία χρησιμοποιήθηκαν ως ορθοξικές ελέγχου. (D, F) Σύγκριση των επιπέδων έκφρασης (μέση ± SD, η = 3) του HIF-1α και πρωτεΐνη MDR1 κάθε ομάδας (**

ρ

& lt? 0,01).

Η

η σύνδεση του HIF-1α προς το MDR1 προαγωγός γονιδίου

στη συνέχεια χρησιμοποιείται μία δοκιμασία τσιπ για να αξιολογεί LoVo MCS (τόσο σε φυσιολογική οξυγόνωση και υποξία) αν HIF-1α συνδεδεμένο με την περιοχή προαγωγέα του γονιδίου MDR1. Μετά την καταβύθιση των κυτταρολυμάτων με ένα ειδικό αντι-HIF-1α αντίσωμα, το γονίδιο υποκινητή και το γονίδιο MDR1 υποκινητή του VEGF (ένας καθιερωμένος HIF-1 γονιδίου στόχου) ενισχύθηκαν με PCR με ειδικούς εκκινητές. Τα αποτελέσματα (Σχήμα 6) έδειξαν ότι HIF-1α συνδέθηκε με το γονίδιο υποκινητή MDR1 σε LoVo MCS όχι μόνο σε συνθήκες υποξίας, αλλά και σε νορμοξικά συνθήκες.

Η σύνδεση του HIF-1α στο MDR1 και γονίδιο VEGF προαγωγούς μετρήθηκε με chip. Η ανάλυση PCR για την περιοχή του γονιδίου υποκινητή MDR1 διεξήχθη επί δειγμάτων ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) με αντίσωμα αντι-HIF-1α και με καθαρισμένο συνολικό DNA εισόδου από το LoVo MCS (νορμοξία και υποξία). Ο υποκινητής του γονιδίου του VEGF (ένας καθιερωμένος HIF-1 γονιδίου στόχου) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Ανοσοκαταβύθιση με μη ειδική IgG διεξήχθη ως αρνητικός έλεγχος. Ένα δείγμα που αντιπροσωπεύει γραμμική ενίσχυση του συνολικού DNA εισόδου χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος εισόδου.

Η

Ασθενείς με HIF-1α (+) /P-gp (+) είναι πιο ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία

προηγούμενη μελέτη μας έχει δείξει ότι HIF-1α και τα επίπεδα έκφρασης MDR1 /P-gp συσχετίζονται σε ιστούς όγκων του καρκινώματος του κόλου [12]. Για να καθοριστεί εάν η έκφραση του HIF-1α και MDR1 /P-gp σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου διαφέρει, όπως επίσης και το σχετικό ευαισθησία στη χημειοθεραπεία, ανοσοϊστοχημικές τεχνικές χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της έκφρασης του HIF-1α και P-gp στους ιστούς του όγκου 120 ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου που έλαβαν χημειοθεραπεία 5-FU βάση. Βρήκαμε ότι 73 120 περιπτώσεις (60,8%) εκφράζεται τόσο HIF-1α και P-gp, και αυτό το HIF-1α (+) /P-gp (+) πληθυσμό ασθενών ήταν περισσότερο ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία απ ​​’ότι ήταν ο HIF-1α ( -) /P-gp (-). πληθυσμό (

σ

= 0.001, OR 5.647, 95% CI 1,920 έως 16,606) (Πίνακας 1)

Η

Συζήτηση

προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι η έκφραση πρωτεΐνης HIF-1α συσχετίζεται με P-gp έκφραση σε ιστούς καρκινώματος του κόλου και καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, και HIF-1α και MDR1 mRNAs βρέθηκαν να είναι σημαντικά υψηλότερα στα ίδια κύτταρα υπό συνθήκες υποξίας από υπό ορθοξικές συνθήκες [12]. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι HIF-1α μπορεί να επηρεάσει άμεσα την έκφραση του MDR1 /P-gp σε υποξικά μικροπεριβάλλον και, στη συνέχεια, μεσολαβεί αντίσταση χημειοθεραπεία όχι μόνο στο καλλιεργημένο μονοστιβάδες κυττάρων αλλά και σε πολυκύτταρους σφαιροειδή, και HIF-1α αναστολής μπορεί να αναστρέψει πολυφαρμάκου αντίσταση μέσω αρνητική ρύθμιση της MDR1 /P-gp. Πολλά στοιχεία έχουν καταδείξει ότι ένα υποξικό μικροπεριβάλλον είναι ευνοϊκό για την ανάπτυξη και τη συντήρηση των καρκίνων [17]. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα σε υποξικές συνθήκες δείχνουν μεγαλύτερη αντίσταση σε αντινεοπλασματικά φάρμακα [18], [19]. Ορισμένες μελέτες που προσπάθησαν να εξηγήσουν αυτό το φαινόμενο έχουν ανακαλύψει ότι τα κύτταρα σε συνθήκες υποξίας γενικά χωρίζουν πιο αργά από ό, τι εκείνες ορθοξικές συνθήκες, καθιστώντας τις θεραπείες που στοχεύουν ταχέως αναπτυσσόμενα κύτταρα είναι λιγότερο αποτελεσματική [17]. Εν τω μεταξύ, μια μελέτη έδειξε ότι η υποξία θα μπορούσε να προκαλέσει έναν αριθμό γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των MDR1 /P-gp, σε πολυκύτταρους σφαιροειδή [16]. Στη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι HIF-1α συνδεδεμένο με το γονίδιο υποκινητή της MDR1 στην LoVo MCS όχι μόνο σε συνθήκες υποξίας, αλλά και σε ορθοξικές συνθήκες.

Έχουμε δημιουργήσει με επιτυχία ένα μοντέλο LoVo MCS να μιμηθούν το υποξικό μικροπεριβάλλον των όγκων in vivo. Η ευαισθησία χημειοθεραπεία και αποπτωτικά αλλαγές LoVo MCS να ADR, VCR, 5-FU, και CPT-11 εξετάστηκαν σε νορμοξία και υποξία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ευαισθησίες χημειοθεραπεία και την απόπτωση των LoVo MCS σε απόκριση προς τις τέσσερις φάρμακα ήταν όλοι μειώθηκαν σε διαφορετικό βαθμό σε συνθήκες υποξίας. Από τα τέσσερα κυτταροτοξικών φαρμάκων, 5-FU και CPT-11 είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη στον καρκίνο του παχέος εντέρου, ενώ αντίσταση στην ADR και VCR πιστεύεται ότι σχετίζεται στενά με MDR1 /P-gp [20]. Φίμωση το γονίδιο HIF-1α αποκατέστησε τις ευαισθησίες των LoVo MCS με τον ADR, VCR, και 5-FU και προκάλεσε μία αξιοσημείωτη αύξηση της απόπτωσης επίπεδο κάθε αντίστοιχου φαρμάκου (

P

& lt? 0,01). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η αντίσταση του φαρμάκου LoVo MCS μπορεί να αντιστραφεί με ένα συνδυασμό του συστήματος LVV-HIF-1α miR και τα παραπάνω φάρμακα. Αυτό το εύρημα συμφωνεί με τις προηγούμενες διαπιστώσεις που αναστέλλουν HIF-1α μπορεί να ενισχύσει την ευαισθησία σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες σε καρκινικά κύτταρα, όπως ινοσάρκωμα, γαστρικό καρκίνο, και καρκίνωμα του μαστού [21] – [23]. Από Unruh

et

al.

[24] βρήκαν ότι η αντιπολλαπλασιαστική αποτελεσματικότητα καρβοπλατίνης και ετοποσίδης ενισχύεται σημαντικά από την αδρανοποίηση του HIF-1α σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού, η συμβολή του HIF-1α για αντοχή φαρμάκου έχει παρατηρηθεί σε διάφορους τύπους νεοπλασματικών κυττάρων κατά τα τελευταία έτη [21], [25] – [29]. Ωστόσο, τα διαθέσιμα στοιχεία σχετικά με τη σχέση μεταξύ HIF-1α και την χημειοαντίσταση των καρκινικών κυττάρων είναι αντικρουόμενες. Για παράδειγμα, μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι η αδρανοποίηση του HIF-1α σε φυσιολογική οξυγόνωση δεν έχει καμία επίδραση επί των αποκρίσεων φαρμάκου σε νευροβλάστωμα και το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα κυττάρων [30], [31]. Πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης υποστήριξαν την αντίσταση-μεσολάβηση επίδραση του HIF-1α, τουλάχιστον σε ορισμένες ανθρώπινους καρκίνους [4]. Επιπλέον, βρήκαμε υπήρχε μια τάση προς μεγαλύτερη ευαισθησία μετά HIF-1α ή την αναστολή MDR1, αλλά οι ευαισθησίες χημειοθεραπεία για CPT-11 δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές στις ομάδες LoVo MCS. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι ο μηχανισμός του χημειοαντίσταση να CPT-11 δεν εξαρτάται από P-gp αλλά μάλλον πέρασε μέσω άλλης οδού, όπως είναι το προϊόν CPT-11 μεταβολικές SN-38 [32] – [34].

Ο μηχανισμός με τον οποίο HIF-1α συμβάλλει στην MDR είναι πολύπλοκη και παρέμεινε ασαφής. HIF-1α μπορεί να μεσολαβεί MDR ρυθμίζοντας αποβολής του φαρμάκου, αλλάζοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση, την αναστολή της βλάβης του DNA, ή επαναπρογραμματισμό του μεταβολισμού. Ως ένα από τα κύρια μέλη της οικογένειας μεταφορέα ABC, MDR1 /P-gp μειώνει τις ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις των κυτταροτοξικών φαρμάκων με την ενεργό άντληση των φαρμάκων έξω από τα κύτταρα και επομένως, την προστασία από τα καρκινικά κύτταρα κατά του όγκου αποτελέσματά τους [35]. MDR1 είναι ένα γονίδιο στόχος του HIF-1. Κατά τα τελευταία έτη, η συνεισφορά του HIF-1-μεσολαβούμενη έκφραση Ρ-σρ σε αντίσταση στο φάρμακο προκαλείται από υποξία έχει παρατηρηθεί σε πολλά κύτταρα όγκου, όπως γαστρικό καρκίνο, γλοίωμα, και καρκίνωμα του μαστού [14], [21], [26 ], [36]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η έκφραση του HIF-1α και P-gp ήταν σημαντικά ενισχύθηκε LoVo MCS μετά τη θεραπεία σε υποξία. HIF-1α αναστολή από επιμόλυνση κυττάρων με ένα ειδικό siRNA για HIF-1α μείωσε σημαντικά την έκφραση του MDR1 /mRNA P-gp και πρωτεΐνη στα δύο μονοστιβάδες LoVo και LoVo MCS. Επιπλέον, ο HIF-1α συνδέθηκε με το γονίδιο υποκινητή MDR1 άμεσα. Εμείς ανέφερε ότι η ενεργοποίηση του HIF-1α μπορεί να προκαλέσει άμεσα την έκφραση του MDR1 /P-gp και στη συνέχεια να οδηγήσει σε MDR.

Για να καθοριστεί εάν η έκφραση του HIF-1α και MDR1 /P-gp στον καρκίνο του παχέος εντέρου ασθενών διαφέρει , καθώς και η σχετική ευαισθησία σε χημειοθεραπεία, ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της έκφρασης του HIF-1α και P-gp στους ιστούς του όγκου των 120 ασθενών με προχωρημένο καρκίνωμα του παχέος εντέρου που έλαβαν χημειοθεραπεία 5-FU με βάση. Βρήκαμε ότι 73 120 περιπτώσεις (60,8%) εκφράζεται τόσο HIF-1α και P-gp, και αυτό το HIF-1α (+) /P-gp (+) πληθυσμό ασθενών ήταν περισσότερο ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία απ ​​’ότι ήταν ο HIF-1α ( -) /P-gp (-) του πληθυσμού. Ως εκ τούτου, ο HIF-1α /MDR1 μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη στόχος στη θεραπεία καρκίνου του παχέος εντέρου, και η αντιστροφή της MDR καρκίνου του παχέος εντέρου μπορεί να επιτευχθεί όταν HIF-1α έκφρασης /MDR1 ειδικά αναστέλλεται. Προτείνουμε ότι η έκφραση του HIF-1α και MDR1 /P-gp μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστική δείκτη για αντίσταση χημειοθεραπεία στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Εν κατακλείδι, αναφέρουμε ότι HIF-1α αναστολή αναστρέφει MDR σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, τα οποία συνδέεται με ρύθμιση προς τα κάτω του MDR1 /P-gp. Τα αποτελέσματά μας μπορεί να έχουν ευρείες κλινικές επιπτώσεις για τους ασθενείς του παχέος εντέρου με HIF-1α (+) /P-gp (+) μοτίβα έκφρασης, και θεραπείες συνδυασμού με σκοπό την διαμόρφωση HIF-1α έκφραση σε συνεννόηση με το πρότυπο σχήματα χημειοθεραπείας μπορεί να παρέχει μία στρατηγική για να ξεπεραστεί όγκου αντίσταση.