Αφηρημένο

Side πληθυσμού (SP) και έκφραση μεταφορέα ABC εμπλουτισμό βλαστικών κυττάρων σε πολλούς ιστούς . Εμείς διερευνηθεί αν αυτό το φαινότυπο που χαρακτηρίζεται ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) και προσπάθησε να εντοπίσει ρυθμιστικών μηχανισμών. Εστιάζοντας στην μη-μυϊκή διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (NMIBC), πολλαπλές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν για να χαρακτηρίσουν SP και έκφραση μεταφορέα ABC.

In vitro

και

in vivo

φαινοτυπική και λειτουργική αξιολόγηση της συμπεριφοράς CSC έγιναν. Έκφραση των θεωρούμενων ABCG2 δείκτη CSC αξιολογήθηκε σε κλινικά δείγματα NMIBC (n = 148), και ένας ρόλος για σηματοδότηση ΜΑΡΚ, ένας κεντρικός μηχανισμός της ογκογένεσης ουροδόχου κύστης, διερευνήθηκε. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο μεταφορέας ABCG2 εκφράστηκε κυρίως και ήταν ρυθμισμένη στο κλάσμα SP κατά 3-φορές (ABCG2

hi) σε σχέση με το κλάσμα μη-SP (NSP) (ABCG2

χαμηλή). ABCG2

hi κύτταρα SP εμφανίζεται εμπλουτισμό των δεικτών των βλαστικών κυττάρων (Nanog, Notch1 και SOX2) και μία τριπλάσια αύξηση στο σχηματισμό αποικιών απόδοσης (CFE) σε σύγκριση με ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP.

In vivo

, ABCG2

hi κύτταρα SP εμπλουτισμένα για την ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP, σύμφωνα με ΚΕΠ. pERK ήταν συστατικά που δραστηριοποιούνται στην ABCG2

hi κύτταρα SP και η αναστολή ΜΕΚ ανέστειλε επίσης την ABCG2

hi φαινότυπο SP και κατέστειλε σημαντικά CFE. Επιπλέον, κατά την εξέταση των κλινικών NMIBC δείγματα, έκφραση ABCG2 συσχετίζεται με αυξημένη υποτροπή και μειωμένη επιβίωση χωρίς εξέλιξη. Επιπλέον, pERK έκφραση επίσης συσχετίζεται με μειωμένη επιβίωση χωρίς εξέλιξη, ενώ μια θετική συσχέτιση μεταξύ αποδεικνύεται περαιτέρω ABCG2 και pERK έκφρασης. Εν κατακλείδι, επιβεβαιώνουμε ABCG2

hi SP εμπλουτίζει για ΚΕΠ σε ανθρώπινο NMIBC και ΜΑΡΚ /μονοπατιού ERK είναι ένας κατάλληλος θεραπευτικός στόχος

Παράθεση:. Hepburn AC, Veeratterapillay R, Williamson SC, El-Sherif A, Sahay Ν, Thomas HD, et al. (2012) Πλευρά Πληθυσμός Ανθρώπινη μη-Muscle Επεμβατική καρκίνο της ουροδόχου κύστης εμπλουτίζει για καρκινικά βλαστικά κύτταρα που διατηρούνται από ΜΑΡΚ σηματοδότηση. PLoS ONE 7 (11): e50690. doi: 10.1371 /journal.pone.0050690

Συντάκτης: Dean G. Τανγκ, το Πανεπιστήμιο του Τέξας ΜΌ Anderson Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 του Ιούλη 2012? Αποδεκτές: 23η Οκτωβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 30 Νοεμβρίου, 2012

Copyright: © 2012 Hepburn et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από JGW Ίδρυμα Patterson και NHS Trustees. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνωμα από μεταβατικό επιθήλιο (TCC) της ουροδόχου κύστης έχει παγκόσμια ετήσια επίπτωση πάνω από 350.000 νέα κρούσματα και 145.000 θάνατοι [1]. Στις ΗΠΑ, είναι η πέμπτη πιο συχνή κακοήθεια που αντιπροσωπεύουν πάνω από 70.000 νέες περιπτώσεις ετησίως και υπολογίζεται ετήσια δαπάνη των 3,5 δισ $ για τη θεραπεία του καρκίνου [2], [3]. Παρά το γεγονός ότι το 85% των ασθενών παρουσιάζουν λιγότερο επιθετικές μη μυϊκή διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (NMIBC), έχουν υψηλό κίνδυνο υποτροπής και τα άτομα με δυσμενή χαρακτηριστικά, όπως η πολυεστιακή νόσος, υψηλή όγκους ποιότητας, με ή χωρίς ταυτόχρονη καρκίνωμα in situ (CIS) , διατρέχουν ιδιαίτερο κίνδυνο εξέλιξης της νόσου. Ενδοκυστική Βάκιλλο Calmette-Guérin (BCG) μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο ανάπτυξης κατά 27% σε ασθενείς με υψηλό κίνδυνο NMIBC [4], αλλά εκείνοι που δεν μπορούν να ανταποκριθούν συνήθως υποβάλλονται σε νοσηρή χειρουργική επέμβαση για την αφαίρεση της κύστης. Για τους ασθενείς που παρουσιάζουν με, ή προόδου, μυϊκή διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (MIBC), η πιθανότητα επιβίωσης πάνω από 5 έτη μετά τη θεραπεία είναι περίπου 50-60% [5], [6]. Αυτό φόντο υποδεικνύει ότι νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις κατά NMIBC χρειάζονται επειγόντως για την εξάλειψη της ασθένειας πριν αναπτύσσει μια επεμβατική φαινότυπο [7].

Οι πρόσφατες εξελίξεις στη βιολογία του καρκίνου έχουν συμπεριλάβει τον χαρακτηρισμό των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ), ένα μικρό υποπληθυσμό των κυττάρων του όγκου που είναι κίνησης του όγκου και οδηγούν την παραγωγή του το υπόλοιπο του καρκίνου. Οι CSCs έχουν περιγραφεί σε έναν αυξανόμενο αριθμό περιοχών όγκου συμπεριλαμβανομένων αιμοποιητικό, του μαστού, του παχέος εντέρου, του μελανώματος και του προστάτη [8] – [12]. Καθίσταται σαφές ότι είναι απαραίτητο να στοχεύουν αυτά τα κύτταρα, καθώς καθορίζουν την απόκριση στη θεραπεία [13]. Η κατηγοριοποίηση και η επιλογή μιας πλευρικής πληθυσμού (SP) φαινοτύπου με κυτταρομετρία ροής [14] εμπλουτίζει για CSCs σε πολυάριθμες όγκους [15] – [18]. Πρόσφατες επίδειξη του SP στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση του εν δυνάμει ρόλο της στον χαρακτηρισμό ΚΕΠ [19].

Η παθογένεση καρκίνου της ουροδόχου κύστης εμφανίζεται στενά συνδεδεμένη με διακριτές μοριακών οδών [20], [21]. Πάνω από το 70% των NMIBCs φιλοξενούν ενεργοποιούμενες μεταλλάξεις του υποδοχέα αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών 3 (FGFR3) που οδηγεί σε ιδιοσυστατική ενεργοποίηση του ΜΑΡΚ σηματοδότηση [22], [23]. Επιπλέον, πάνω ρύθμιση του EGFR /ErbB οικογένεια υποδοχέων συσχετίζεται με την αύξηση της ποιότητας και τα στάδια του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [24], [25]. Από τη συνάφεια, SP φαινότυπος προκαλείται από την κασέτα σύνδεσης ΑΤΡ (ABC) οικογένεια πρωτεϊνών μεταφορέων [14], και ο καρκίνος του μαστού ανθεκτική πρωτεΐνη-1 (BCRP1) /ABCG2 μεταφορέας έχει αποδειχθεί ότι είναι ο κύριος μεσολαβητής αυτού του φαινοτύπου [26]. Ειδικότερα, ABCG2 είναι με τη σειρά της ρυθμίζεται από ΜΑΡΚ [27] και ένα ρόλο για ΜΑΡΚ μονοπατιού σηματοδότησης /ERK στη ρύθμιση του SP έχει προταθεί (Tsichuda et al 2008).

Ως πρώτο βήμα για την ενημέρωση του σχεδιασμό νέων θεραπειών για NIMBC, έχουμε ως στόχο να χαρακτηρίσει ΚΕΠ στον ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης, χρησιμοποιώντας την επιλογή SP και να εξερευνήσετε ρύθμιση μέσω της ΜΑΡΚ /ΕΚΚ άξονα σηματοδότησης.

RT112, RT4, J82 και 253JB-V κύτταρα βάφτηκαν με Hoechst 33342 βαφή μόνο του ή σε παρουσία ρεζερπίνης και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής μετρώντας Hoechst μπλε vs Hoechst κόκκινο φθορισμό. Το SP ήταν περιφραγμένο και εκπροσωπείται ως ποσοστό του συνόλου του πληθυσμού των ζωντανών κυττάρων μετά από αποκλεισμό ΡΙ (μέση τιμή ± SE).

Η

Σχετική έκφραση του mRNA της ABCA2, ABCG2, MRP1 και Ρ-γλυκοπρωτεΐνη προσδιορίστηκε σε SP και τα κλάσματα του NSP RT112 (Α) και τα κύτταρα RT4 (Β) με τη χρήση πραγματικού χρόνου PCR. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων κάθε εκτελέστηκαν εις τριπλούν (μέση ± SE). * P & lt? 0,05 (μαθητή δίπλευρη

t

-τεστ). κύτταρα Μελέτες αναστολής εκτελέστηκαν σε RT112 (C) και RT4 (D) χρησιμοποιώντας ABCG2-ειδικός αναστολέας fumitremorgin C (FTC) και Ρ-γλυκοπρωτεΐνη αναστολέα βεραπαμίλης.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και κυτταρική καλλιέργεια

κυττάρου Ανθρώπινα καρκίνο ουροδόχου κύστης RT4, RT112 και J82 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Sigma) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και 1 % Ε-γλουταμίνη – που αναφέρονται ως πλήρες μέσο (FM). Η ιδιαίτερα μεταστατική ανθρώπινη κυτταρική γραμμή TCC 253JB-V προβλέφθηκε γενναιόδωρα από τον καθηγητή Colin Dinney [28] και καλλιεργήθηκαν σε MEMalpha μέσα συμπληρωμένα με 5% FBS. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C υπό την παρουσία 5% CO

2. ΜΕΚ1 /2 ειδικός αναστολέας, U0126 (Cell Technology σηματοδότηση), και rEGF (Sigma) χρησιμοποιήθηκαν σε μελέτες για να διαμορφώνει σηματοδότηση ΜΑΡΚ. Τα κύτταρα ελέγχου για σύγκριση περιλαμβάνονται οι καλλιέργειες σε βασικό μέσο (ΒΜ) λείπει FBS και FM.

Δοκιμασία εκροής Hoechst Dye

Τα κύτταρα βάφτηκαν με βαφή Hoechst 33342 χρησιμοποιώντας τροποποίηση ενός προηγουμένως περιγραφέν πρωτόκολλο [14] . Εν συντομία, χρωστική Hoechst 33342 (2,5 μg /ml) προστέθηκε μόνο του ή σε παρουσία ρεσερπίνης (50 μΜ), βεραπαμίλη (50 μΜ) ή fumitremorgin C (10 μΜ) και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 90 λεπτά και αναταράσσεται κάθε 30 λεπτά. δείκτη επιφάνειας κυττάρων αναλύσεις εξής Hoechst 33342 χρώσης χρωστικής πραγματοποιήθηκαν με αντι-ABCG2-FITC (κλώνος 5D3, Millipore) συν-επισήμανση σε πάγο για 20 λεπτά. Κανονική IgG ποντικού-ΡΙΤΟ χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος ισοτύπου (Upstate). Ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (2 μg /ml) με περίφραξη βιώσιμων κυττάρων. Ανάλυση και διαλογής διεξήχθησαν σε FACSDIVA κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson).

RNA Extraction και Real-time PCR ανάλυση

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το High κιτ καθαρό RNA (Roche) και αντιστραφεί μεταγράφηκε χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές (Promega) και Superscript αντίστροφη III ένζυμο μεταγραφάσης (Invitrogen). Real time PCR πραγματοποιήθηκε με SYBR Green βασικού μείγματος που περιέχει Rox ™ και UDG (Invitrogen) χρησιμοποιώντας το ΑΒΙ Prism 7900HT Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems). Για αλληλουχίες εκκινητών βλέπε Πίνακα S1. Τα επίπεδα της έκφρασης κανονικοποιήθηκαν προς γονίδιο GAPDH οικοκυρικής.

(Α) FACS ταξινομημένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

2 κύτταρα /φρεάτιο και οι αποικίες μετρήθηκαν μετά από 2 εβδομάδες . αποτελεσματικότητας σχηματισμού αποικίας (CFE) υπολογίστηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι η μέση (± SE) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων κάθε εις τριπλούν. * P & lt? 0,05 (μαθητή δίπλευρη

t

-τεστ). (Β) προφίλ κυτταρικού κύκλου των RT112 ABCG2

hi SP και ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP παρουσιάζοντας αύξηση στην S-φάση στην ABCG2

hi κλάσμα SP. (C) Serial επιλογή, υπο-κουλτούρα και κυτταρομετρίας κλασματοποίηση μεταξύ RT112 SP και κύτταρα NSP. SP και NSP κύτταρα ταξινομημένο από RT112 καλλιεργήθηκαν για δύο εβδομάδες, restained με χρωστική Hoechst 33342 και να αναλυθούν εκ νέου με κυτταρομετρία ροής. Αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε 4 φορές.

Η

(Α) 1 × 10

3 ABCG2

hi SP και ABCG2

χαμηλή NSP ταξινομημένα κύτταρα RT112 υποδόρια ένεση σε γυμνά ποντίκια και να παρακολουθείται για την ανάπτυξη του όγκου. (Β) Ανοσοϊστοχημική χρώση των διαδοχικών τομών, των όγκων που προέρχονται από ποντικούς που έχουν εγχυθεί με 1 × 10

3 ABCG2

hi SP και υπολειμματική κυττάρων σφαιρίδια από ποντικούς που έχουν εγχυθεί με 1 × 10

3 ABCG2

χαμηλή NSP διαλεγμένα κύτταρα RT112, με Η &? Ε και ABCG2 και σε μεγαλύτερη μεγέθυνση (20χ). Σημαντικά αυξημένη ανοσολογική αντίδραση για ABCG2 φαίνεται στο ABCG2

HISP προέρχεται όγκους. (C) Σχετική έκφραση του mRNA της ABCG2 σε όγκους που σχηματίζονται μετά την ένεση του 1 × 10

3 ABCG2

hi SP και ABCG2

χαμηλή NSP ταξινομημένα κύτταρα RT112 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας PCR σε πραγματικό χρόνο. (D-F) έκφραση Σχετική mRNA του Nanog, Notch1 και SOX2 σε όγκους που σχηματίζονται μετά την ένεση του 1 × 10

3 ABCG2

hi SP και ABCG2

χαμηλή NSP ταξινομημένα κύτταρα RT112 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας PCR σε πραγματικό χρόνο. (G) Ανοσοϊστοχημική χρώση των διαδοχικών τομών, των όγκων που σχηματίζονται μετά την ένεση του 1 × 10

3 ABCG2

hi SP και ABCG2

χαμηλή NSP ταξινομημένα κύτταρα RT112, με Nanog, Notch1 και SOX2.

Δοκιμασία Σχηματισμού αποικίας

FACS ταξινομημένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε πυκνότητα 100 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από 14 ημέρες οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με στερεωτικό Carnoy και χρωματίστηκαν με 0.4% κρυσταλλικό ιώδες (w /v) για μέτρηση αποικίας χρησιμοποιώντας ColCounter (Oxford Optronix), παραλείποντας & lt? 64 αποικίες κυττάρων καθώς αντιπροσωπεύουν νωρίς άκαρπη αποικίες. Αποικία αποδοτικότητα σχηματισμού (CFE,%) υπολογίστηκε ως [(αρ. Αποικίες καταμετρώνται /όχι. Κύτταρα σπάρθηκαν) × 100].

Κύκλου Κυττάρου

FACS ταξινομημένα κύτταρα χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ για την κυτταρική ανάλυση του κύκλου με τη χρήση κιτ 2step CyStain DNA (Partec). Ιωδιούχο προπίδιο (2 μg /ml) με περίφραξη βιώσιμων κυττάρων. Να κάνουν διακρίσεις κατά των πυρηνικών συντρίμμια και διπλές, κύτταρα με περίφραξη σε FSC και SSC. Η κυτταρομετρία ροής λογισμικό του κυτταρικού κύκλου (CellQuest Pro, BD Biosciences) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του περιεχομένου του DNA και τον υπολογισμό των στατιστικών subG1, G1, S-φάση και φάση G2M.

In vivo

ογκογόνο

τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν και διεξάγονται σύμφωνα με κανονιστικές κατευθυντήριες γραμμές. Είκοσι τρία θηλυκά αθυμικά CD1 γυμνά ποντίκια (Charles River, Ηνωμένο Βασίλειο) εγχύθηκαν με RT112 SP και NSP ταξινομημένα κύτταρα στο δεξί πλευρό του υποδόριου ιστού. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε από δύο διαστάσεων μέτρηση με ηλεκτρονικό δαγκάνες με τον όγκο του όγκου υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τον τύπο

μια

2

×

b /2

, όπου

μια

είναι η μικρότερη μέτρηση και

β

το μεγαλύτερο. τερματιστεί Τα πειράματα ποντίκια όταν οι όγκοι αυξήθηκαν σε ένα μέγιστο 750 mm

3. Οι όγκοι αφαιρέθηκαν και κατά το ήμισυ για ανοσοϊστοχημικές μελέτες και μελέτες σε πραγματικό χρόνο PCR.

Immunohistochemitry

φορμόλη σταθερά ενσωματωμένα σε παραφίνη αρχειακό υλικό από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε ενδοσκοπική εκτομή του όγκου της κύστης ή ριζική κυστεκτομή ήταν προσβάσιμες για ανοσοϊστοχημικές μελέτες με την κατάλληλη ενημερωμένη συγκατάθεση και την ηθική κανονιστική έγκριση. Συνολικά, 148 NMIBC περιπτώσεις χρωματίστηκαν με αντι-ABCG2 (1:250? Κλώνος BXP-21, Millipore) και αντι-ρ-ΕΚΚ (1:100, Ε-4, Santa Cruz Biotechnology) πριν την επώαση με δευτερεύον βιοτινυλιωμένο κατσίκας αντι -mouse αντίσωμα IgG (DAKO). Η ανοσοαντιδραστικότητα οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Vectastain Αβιδίνης Βιοτίνης Complex Kit (Vector Laboratories) και 3’3′-diaminobenzidetetrahydrochloride. Βαθμολόγησης αρχικά εκτιμήθηκε από το ποσοστό και την ένταση λεκέ. Ωστόσο, η συντριπτική πλειοψηφία των πυρήνων εκφράζεται ομοιόμορφη χρώση επιθηλιακών με ένα μόνο ένταση, με ετερογενή χρώση παρόν μόνο σε λίγες περιπτώσεις. Σε αυτές τις πυρήνες, η ένταση με & gt? 50% περιοχή της χρώσης λήφθηκε ως το σκορ. Η ανοσοχρώση αναθεωρήθηκε και σκόραρε ανεξάρτητα από τρεις αξιολογητές που δεν γνώριζαν τα κλινικά δεδομένα να δώσει μέσες βαθμολογίες της χρώσης ένταση της απουσίας (0), αδύναμο (1), μέτρια (2) ή ισχυρή (3). Τα ξενομοσχεύματα επίσης χρωματίστηκαν με αντι-Nanog (1:5000, Cell σηματοδότηση), αντι-Notch 1 (1:500, C-20, Santa Cruz Biotechnology) και αντι-SOX2 (1:500, Millipore).

Western Blotting

τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό SDS δείγμα (0.125 Μ Tris ρΗ 6,8, 2% SDS, 10% γλυκερόλη, 10% β-μερκαπτοαιθανόλη και 0,01% κυανούν βρωμοφαινόλης) και αναλύθηκαν με SDS-PAGE σε 12% πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου, ακολουθούμενη από μεταφορά σε νιτροκυτταρίνη μεμβράνη Hybond ™ (Fisher Scientific). Αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν στις ακόλουθες αραιώσεις: αντι-ΕΚΚ 1:500 (Κ-23, Santa Cruz Biotechnology) και αντι-φωσφο-ΕΚΚ 1:500 (Ε-4, Santa Cruz Biotechnology). δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας (DAKO) χρησιμοποιήθηκαν σε 1:500 και ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ενισχυμένης χημειοφωταύγειας ανίχνευση (Fisher Scientific).

Στατιστική Ανάλυση

Για την PCR μελέτες σε πραγματικό χρόνο, τα δύο -ουράς ζεύγη

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα σε επίπεδο P & lt? 0,05. Για ανοσοϊστοχημεία, οι διαφορές στη συχνότητα και την έκφραση του ABCG2 εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας Mann-Whitney

U

δοκιμασία για την αξιολόγηση των συσχετίσεων με παθολογικά βαθμού του καρκίνου και το στάδιο. επιβίωση των ασθενών αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier με τη δοκιμή log-rank και πολυπαραγοντική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το μοντέλο Cox αναλογικών κινδύνων. συσχέτισης Pearson χρησιμοποιήθηκε για να συσχετίζονται ABCG2 και pERK έκφρασης. Όλες οι δοκιμές έγιναν με τη χρήση του SPSS έκδοση 11.0 του λογισμικού υπολογιστή (SPSS, Inc.). Όλες οι δοκιμασίες ήταν δύο όψεων και ένα

P

αξία του & lt?. 0,05 λήφθηκε για να δείξει στατιστική σημαντικότητα

(Α) ανάλυση κηλίδας Western διεξήχθη με φωσφο-ERK1 /2 και ERK1 /2 αντισώματα. (Β) κύτταρα RT112 τοποθετήθηκαν σε FM μόνα ή σε παρουσία U0126 (10 μΜ) για 30 λεπτά πριν από την χρώση με Hoechst 33342. Η επίδραση του U0126 για την «ουρά» και «άνω» άκρο διαμερίσματα ABCG2

HISP

+ διερευνήθηκε. (C) CFE της ABCG2

hi κύτταρα SP με αυξανόμενες συγκεντρώσεις των UO126 και διαφορετικού μεγέθους αποικίες (≥1 mm, ≥2 mm και ≥3 mm σε διάμετρο).

Η

(Α) ABCG2 έκφραση σε φυσιολογικό ουροθήλιο, χαμηλής ποιότητας (LG) και υψηλού βαθμού (HG) NMIBC είναι τυπικά μη-ειδική και μπορεί να δει τα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά. (Β) Συσχέτιση της ABCG2 ανοσοχρώση έντασης με το βαθμό και το στάδιο στο NMIBC. καμπύλες (C) Kaplan-Meier που απεικονίζουν τα αποτελέσματα της έντασης ABCG2 (0, 1, 2 και 3) με υποτροπή και επιβίωση χωρίς εξέλιξη (p & lt? 0.001, Log Rank αναλύσεις). καμπύλες (D) Kaplan-Meier που απεικονίζουν τα αποτελέσματα της pERK έντασης (0, 1, 2 και 3) με ελεύθερη εξέλιξης επιβίωση (p & lt? 0.001, αναλύει Log Rank). (Ε) Συσχέτιση της ABCG2 και pERK έκφραση (p = 0,005, r του Pearson = 0,99).

Η

Αποτελέσματα

SP κύτταρα και ABC έκφραση μεταφορέα μπορούν να εντοπιστούν σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Ερευνήσαμε την παρουσία της SP στις δύο κυτταρικές σειρές NMIBC (RT112 και RT4) και δύο κυτταρικές σειρές MIBC (J82 και 253JB-V). Μετά κηλίδωση με Hoechst 33342, ένα SP ταυτοποιήθηκε και στους τέσσερις κυτταρικές σειρές ως διακριτή ουρά που εκτείνεται από το κύριο πληθυσμό με την χαρακτηριστική χαμηλή φθορισμού προφίλ σε ανάλυση διπλού μήκους κύματος (Σχήμα 1). Η στρατηγική περίφραξη αναλάβει ακολουθήθηκε όπως περιγράφεται από Golebiewska et. al. [29] (Εικόνα S1). Κατάλληλη διάκριση ενιαία και βιώσιμα κύτταρα είναι ζωτικής σημασίας για την επαρκή χαρακτηρισμό SP. Ο διάμεσος (± SE) ποσοστό κάθε συνολικού κυτταρικού πληθυσμού που ενοποιούνται με τη SP ήταν 12,8% (± 1,2%) σε RT112, 15,3% (± 1,1%) σε RT4, 2,7% (± 0,9%) σε J82 και 1.0 % (± 0,5%) σε 253JB-V. Το παν-ABC αναστολέας μεταφορέα ρεσερπίνη επαληθεύεται φαινότυπο SP μπλοκάροντας Hoechst εκροή και την αναστολή της χαμηλής κόκκινο /μπλε φαινότυπο χρώση που χαρακτηρίζει τα κύτταρα SP.

Εμείς αξιολογούνται πρότυπα έκφρασης ABC μεταφορέα των κυτταρικών σειρών καρκίνου της ουροδόχου κύστης, χρησιμοποιώντας σε πραγματικό χρόνο PCR. Ετερογενή εκφράσεις πολλαπλών γονιδίων ανθεκτικότητας σε πολλά φάρμακα έχουν αποδειχθεί στην MIBC κυτταρικές σειρές J82 και 253JB-V. Ωστόσο, στις κυτταρικές σειρές NMIBC RT4 και RT112 υψηλότερες εκφράσεις του ABCG2 παρατηρήθηκαν (Εικόνα S2).

ABCG2 είναι σημαντικά εμπλουτισμένη μέσα NMIBC SP κύτταρα και διατηρεί αυτόν τον φαινότυπο

επόμενο επικεντρώθηκε στην NMIBC ασθένεια και εξέτασαν την σχετική έκφραση του mRNA από τέσσερις μεταφορείς ABC (ABCA2, ABCG2, MRP1 και Ρ-γλυκοπρωτεΐνη) στα κλάσματα RT112 και RT4 SP και NSP χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου PCR (Σχήμα 2Α και 2Β) .Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, εκτός από την ABCG2 είναι ο κύριος μεταφορέας ABC σε NMIBC, η έκφραση της ήταν υψηλότερη σε κύτταρα SP συγκριτικά με κύτταρα NSP. Ο βασικός ρόλος των ABCG2 στη δημιουργία του φαινοτύπου SP επιβεβαιώθηκε με πλήρη απώλεια του πληθυσμού SP μετά τη θεραπεία με το ABCG2-ειδικό αναστολέα fumitremorgin C (FTC) σε σύγκριση με την έλλειψη επίδρασης της θεραπείας με το verapamil αναστολέα Ρ-γλυκοπρωτεΐνη (Σχήμα 2C και 2D). Σε αντίθεση, η Ρ-γλυκοπρωτεΐνη ήταν η πιο εκφράζονται διαφορικά και λειτουργικώς σχετικές ABC μεταφορέα στην κυτταρική γραμμή MIBC J82 (Σχήμα S3). Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε ότι στα κύτταρα NMIBC το κλάσμα SP συνδέθηκε μόνο με τα υψηλότερα επίπεδα της ABCG2 (ABCG2

hi) έκφρασης (Σχήμα S4).

SP κύτταρα Εμπλουτίστε για Λειτουργία Βλαστικών Κυττάρων

in vitro

η

Είμαστε δίπλα σε σύγκριση με το κλωνογόνο δυναμικό των RT112 ABCG2

hi SP και ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP. ABCG2

hi κύτταρα SP εμφανίζεται μια τριπλάσια αύξηση στη μέση (± SE) εμπλουτισμό σχηματισμού αποικιών σε 56,7% (± 1,6%) από 18,2% (± 0,2%) σε ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP (Εικόνα 3Α) . Παρόμοια αύξηση ABCG2

hi SP ικανότητας κλωνισμού σε σύγκριση με ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP αποδείχθηκε στη συμπληρωματική κυτταρική σειρά NMIBC RT4 (Σχήμα S5). Μετά την περίφραξη των μη βιώσιμων κυττάρων με χρήση ιωδιούχου προπιδίου, ανάλυση κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν ότι ένα μεγαλύτερο ποσοστό των ABCG2

hi κύτταρα SP ήταν στην S-φάση σε σύγκριση με ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP, με μέση (± SE) τιμές των 19% (± 5%) έναντι 5,5% (± 1) για την S-φάση και 68% (± 8%) έναντι 94% (± 1%) για G1-φάση, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β).

για να εξεταστεί η ικανότητα των ABCG2

hi κύτταρα SP για να ανασυστήσουν το αρχικό φάσμα φαινοτυπική της μητρικής κυτταρικής σειράς RT112, πραγματοποιήσαμε σειριακό πολιτισμούς και τις επιλογές του SP και κλάσματα NSP πριν από την εκ νέου χρώση με Hoechst 33342 και reanalysing από τη ροή κυτταρομετρίας (Σχήμα 3C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μετά τον πρώτο γύρο της επιλογής, τον πολιτισμό και την κυτταρομετρία ροής, καλλιέργειες που προέρχονται από τόσο SP και NSP κύτταρα καθένα έδωσε και πάλι αφορμή για μια παρόμοια κατανομή των SP και κυττάρων NSP. Εάν αυτή η διαδικασία στη συνέχεια συνεχίστηκε με επαναλαμβανόμενους κύκλους επιλογής, ξεχωριστή κουλτούρα και κυτταρομετρίας ροής διαλογή, η αναλογία των κυττάρων από SP υπο-καλλιέργειες που βρίσκονταν στο κλάσμα SP αυξάνεται με κάθε κύκλο, ενώ υπήρξε μια σημαντική μείωση στο κλάσμα SP κυττάρων που προέρχονται από NSP υπο-κουλτούρες.

Εμείς αξιολογούνται έκφρασης δείκτη βλαστικών κυττάρων σε RT112 ABCG2

hi SP και ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP με PCR σε πραγματικό χρόνο (Σχήμα S6a). ABCG2

hi κύτταρα SP έδειξαν αυξημένη έκφραση του Nanog, Notch1 και SOX2 σε σύγκριση με ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP. Επιπλέον, η έκφραση της ουροδόχου κύστης δεικτών των βασικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων CK14, CD44, CD49f (α6 ιντεγκρίνης) και CD104 (ιντεγκρίνης β4) σχετίζεται επίσης με τον εμπλουτισμό των ΚΕΠ, διερευνήθηκε (Σχήμα S6B). Όλες οι δείκτες βασικών κυττάρων εκφράστηκαν σε ABCG2

hi SP κύτταρα αλλά παρόμοια επίπεδα έκφρασης παρατηρήθηκαν επίσης σε ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP.

SP κύτταρα Εμπλουτίστε για μεγαλύτερη όγκου Κίνηση Δυνατότητα

in vivo

η

για να διερευνηθεί η συγκριτική ικανότητα ABCG2

hi SP και ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP για να σχηματίσουν βιώσιμη όγκους

in vivo,

ταξινομημένα κύτταρα από κάθε υπο-πληθυσμού ήταν χωριστά εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς CD1 και των θέσεων εμφύτευσης παρακολουθούνται για την ανάπτυξη. ταχεία αύξηση του όγκου παρατηρήθηκε σε 5 από 5, 5 5, και 3 από 3 ζώα μετά την εμφύτευση του 10

3, 10

4, και 10

5 ABCG2

hi κύτταρα SP αντίστοιχα. Ωστόσο, ABCG2 ανάπτυξη του όγκου

lowNSP είχε εξαντληθεί από την αραίωση των αριθμών σποράς σε 10

3 κύτταρα ενώ 5 από 5 ποντίκια μεταμοσχευμένα με 10

3 ABCCG2

hi κύτταρα SP μεγάλωσε όγκους (Πίνακας 1). Εξετάζοντας διάμεσο μέγεθος όγκου συναρτήσει του χρόνου αποκάλυψε εκθετική αύξηση μέσα στο ABCG2

hi SP ομάδα κυττάρων του εμβολίου, σε αντίθεση με εκείνα που λαμβάνουν ABCG2

χαμηλή NSP κύτταρα (Εικόνα 4Α).

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης ABCG2 σε όγκους , που σχηματίζεται μετά την ένεση του 1 × 10

3 ABCG2

hi SP κύτταρα σε σύγκριση με τα υπολειμματικά κυττάρων σφαιρίδια (που δεν συνδέονται με οποιαδήποτε ενεργή ανάπτυξη) συλλέχθηκαν από ποντικούς ένεση με ABCG2

χαμηλή NSP ταξινομημένο RT112 κύτταρα, έδειξαν αυξημένη έκφραση σε ABCG2

HISP σύγκριση με ABCG2

lowNSP προέρχονται όγκοι (Σχήμα 4Β).

μεταγενέστερα κατέδειξαν αυξημένη έκφραση του ABCG2 (Εικόνα 4C) και αναγνωρισμένο εμβρυϊκών δεικτών /πολυδύναμα βλαστοκύτταρα Nanog, Notch 1 και SOX2 (Εικόνα 4D-F), τα οποία έχουν συσχετιστεί με ογκογένεση [30], με τη χρήση πραγματικού χρόνου PCR στους όγκους που δημιουργούνται μετά την ένεση του ABCG2

hi κύτταρα SP σε σύγκριση με τις υπολειμματικές κυτταρικά ιζήματα συλλέχθηκαν από ποντίκια ένεση με ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP. Αυτά

in vivo

αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με εκείνα που ελήφθησαν με την μητρική

in vitro

καλλιεργημένα κύτταρα (Σχήμα S6a) με υψηλή έκφραση δεικτών των βλαστικών κυττάρων διατηρήθηκε σε όγκους που προέρχονται από ABCG2

hi SP κύτταρα σε αντίθεση με χαμηλή έκφραση στην υπολειπόμενη ABCG2

χαμηλή NSP. Αξίζει να σημειωθεί ότι η επιλογή των κυττάρων όγκου κίνηση από αυτό

in vivo δοκιμασία

οδήγησε σε εμπλουτισμό αυτών των δεικτών των βλαστικών κυττάρων, έναντι της βασικής γραμμής επίπεδα

in vitro

, όπου οι διαφορές ήταν 11-φορές, 80- φορές, 44 φορές και 140 φορές για ABCG2, Nanog, Notch1 και την έκφραση SOX2, αντίστοιχα (p & lt? 0,05). Επιπλέον, η αυξημένη Nanog, Notch1 και έκφραση SOX2 από τις ABCG2

ξενομοσχεύματα ποντίκι hi SP παρατηρήθηκε επίσης με ανοσοϊστοχημική ανάλυση (Σχήμα 4G).

Η αναστολή της ERK σηματοδότησης μειώνει τον καρκίνο SP Stem Κυτταρικής Λειτουργίας

Θα διερευνηθεί ο πιθανός ρόλος της ΜΑΡΚ στη ρύθμιση του φαινοτύπου SP στα κύτταρα NMIBC RT112. Έκφραση των ERK, JNK και ρ38 καθώς και οι /Akt και STAT μονοπάτια σηματοδότησης ΡΙ3Κ καθορίστηκε με πραγματικού χρόνου PCR (Σχήμα S7A). EGFR, ERK1 και την έκφραση ERK2 τόσο ABCG2

hi SP και ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP τεκμηριώθηκε σε πολύ υψηλότερα επίπεδα από ό, τι τα άλλα συστατικά σηματοδότησης, υποδηλώνοντας ότι αυτά τα ένζυμα ήταν πιθανό να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ΜΑΡΚ σηματοδότησης κύτταρα RT112. Ενζυμική ενεργοποίηση συνέχεια διερευνηθεί και pERK επιβεβαιώθηκε να εκφράζεται συντακτικά σε υψηλότερο επίπεδο σε ABCG2

hi κύτταρα SP (Εικόνα 5Α). Επιπλέον, αυξημένα pERK έκφραση παρατηρήθηκε επίσης στις ABCG2

hi ξενομοσχεύματα SP (Σχήμα S7B). Για να ελέγξετε περαιτέρω τη σημασία της οδού /ERK MAPK ως πιθανός στόχος στην RT112 ABCG2

hi SP,, αξιολογήθηκαν οι λειτουργικές επιδράσεις της U0126, ένας ειδικός αναστολέας για ΜΕΚ1 και ΜΕΚ2. Τα κύτταρα προ-αγωγή με U0126 για 30, 60 ή 120 λεπτά δεν είχε ανιχνεύσιμη φωσφορυλιωμένη έκφραση ERK, επιβεβαιώνοντας έτσι την αναστολή της ενεργοποίησης ERK ακόμη και παρουσία της διέγερσης EGF (Σχήμα S7C). Επιπλέον, δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή στην ΡΙ θετικών κυττάρων με την αγωγή του U0126 (p = 0.38) μετά από χρώση με Hoechst 33342 (Σχήμα S7D). Εμείς υποδιαιρείται το κλάσμα ABCG2

HISP σε κύτταρα που βρίσκονται στην κορυφή της ουράς και των κυττάρων που βρίσκονται στο τέλος της ουράς (Εικόνα 5Β), όπως έχει αναφερθεί ότι τα κύτταρα στην άκρη της ουράς SP, τα οποία έχουν το υψηλότερη Hoechst 33342 ικανότητα εκροής (Hoechst

χαμηλή), εμπλουτισμένο ο πληθυσμός των βλαστικών κυττάρων [31]. Η θεραπεία με τον αναστολέα ΜΕΚ είχε σημαντική ανασταλτική επίδραση στα κύτταρα που βρίσκονται στο τέλος της ουράς του ABCG2

HISP, μειώνοντας την ABCG2

HISP κατά 2,5 φορές (5,8% έως 2,3%). Αντίθετα, ο αναστολέας μειωθεί μόνο το ABCG2

HISP στην μη-ουρά τέλος κατά 1,5 φορές (2,8% έως 1,9%). Τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η U0126 είναι επίσης ασκεί την επίδρασή της στην ABCG2

hi Hoechst

χαμηλή κύτταρα. Η θεραπεία με U0126 προκάλεσε επίσης μια δοσοεξαρτώμενη αναστολή της CFE σε RT112 ABCG2

hi SP και ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP (Σχήμα S7E). Όπως έχουμε δείξει ότι ABCG2

hi SP κύτταρα μπορούν να προκαλέσουν τόσο SP και κύτταρα NSP (Σχήμα S7F) και ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP έχουν πολύ χαμηλά επίπεδα pERK, την καταστολή των ABCG2

χαμηλή κυττάρων NSP CFE φαίνεται να είναι έμμεση μέσω των επιπτώσεων της U0126 για ABCG2

hi κύτταρα SP. Αξίζει να σημειωθεί ότι, κατά προτίμηση αναστολή μεγαλύτερες αποικίες, πιο ενδεικτική της αύξησης CSC, θεωρήθηκε ως η παρουσία των αποικιών ≥3mm ανεστάλη συνολικά σε 10

-6 Μ (Σχήμα 5C). Τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η ABCG2

κλάσμα SP hi είναι, τουλάχιστον εν μέρει, συντηρείται από την οδό ΜΑΡΚ /ΕΚΚ οποία με τη σειρά έχουμε δείξει να διατηρήσει τα ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP.

Έκφραση της ABCG2 στην κλινική καρκίνο της ουροδόχου κύστης συσχετίζεται με Grade, Stage, υποτροπής και ελεύθερη εξέλιξης επιβίωση και pERK Έκφραση

Για να προσδιοριστεί η κλινική σημασία της μας

in vitro

και

in vivo

ευρήματα κυτταρική γραμμή, ερευνήσαμε την έκφραση του ABCG2 σε τμήματα του ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Τομές ιστού από ένα πάνελ 148 NMIBC (Πίνακας S2- απεικονίζει κλινικά χαρακτηριστικά) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανοσοαντιδραστικότητα προς ABCG2 (Σχήμα 6Α). ABCG2 θετικότητα ανιχνεύθηκε σε 143 (97%) περιπτώσεις, και για σύγκριση ένα τμήμα της κανονικής ουροθηλίου περιλαμβάνεται η οποία επιδεικνύει μία μεγαλύτερη ένταση βασικής έκφρασης ABCG2, η οποία είναι σύμφωνη με την αναδυόμενη στοιχεία για μια βασική βλαστικών κυττάρων [32]. Μέσες βαθμολογίες έντασης ανοσοβαφή για ABCG2 αποδείχθηκε ότι συνδέεται με πρώιμες επεμβατικές στάδιο, ΡΤ (n = 87) έναντι ρΤ1 (n = 61), και την αύξηση της ποιότητας του όγκου, χαμηλής ποιότητας (n = 93) έναντι υψηλού βαθμού (n = 55) (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 6Β). Η διάμεση παρακολούθηση ήταν 59 μήνες (εύρος μεταξύ τεταρτημόριο = 48,3 έως 96,3 μήνες), και 31 περιπτώσεις (21%) εμφάνισαν υποτροπή της νόσου και 23 περιπτώσεις (16%) παρουσίασαν εξέλιξη της νόσου. Συσχετίσεις με το χρόνο υποτροπής και επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS) αποκάλυψε χειρότερα αποτελέσματα που σχετίζονται με την αύξηση της έκφρασης ABCG2 όπως απεικονίζεται με καμπύλες Kaplan-Meier και Log-Rank αναλύσεις (p & lt? 0.001) (Σχήμα 6C). Αυτοί οι συσχετισμοί παρέμειναν στατιστικά σημαντικές όταν στρωματοποιημένη για το βαθμό, το στάδιο και την παρουσία της ΚΑΚ (p & lt? 0.001). Χρησιμοποιώντας Cox πολυπαραγοντική ανάλυση, η οποία περιελάμβανε τις μεταβλητές της ποιότητας, το στάδιο και την ένταση των ABCG2 ανοσοχρώση, αποκάλυψε ότι η έκφραση ABCG2 παρέμεινε ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα της εξέλιξης της νόσου (p & lt? 0.001? RR = 5,1? 95% CI = 2.6 – 9.9). Επιπλέον, η αύξηση pERK έκφραση συσχετίστηκε επίσης με χειρότερα αποτελέσματα (log-rank p = 0,001) (Σχήμα 6D). Επιπλέον, ένας θετικός συσχετισμός μεταξύ καταδείχθηκε ABCG2 και pERK έκφραση (p = 0,005, r του Pearson = 0,99) (Σχήμα 6Ε).

Συζήτηση

Πρόσφατες πρόοδοι στην απομόνωση και τον χαρακτηρισμό του υποτιθέμενου ΚΕΠ παρείχαν συναρπαστικές γνώσεις σχετικά με την βάση της καρκινογένεσης και οδήγησε στην αύξηση αισιοδοξία για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικά στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου. Μελέτες έχουν παρουσιαστεί αναγκάζοντας στοιχεία που αποδεικνύουν ότι ένας αριθμός ανθρώπινων καρκίνων ακολουθήσει το μοντέλο CSC, όπου ένα μικρό υποπληθυσμό κυττάρων εντός ενός όγκου είναι ικανή για την έναρξη του όγκου και υπεύθυνος για την ανάπτυξη του όγκου και την επανάληψη [8], [9]. Η ύπαρξη των κυττάρων με αυξημένο όγκο έναρξη δυναμικού έχει πρόσφατα περιγραφεί στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης του ανθρώπου [33] – [35] και SP έχει αποδειχθεί σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης δείγματα ασθενών [19]. Σε αυτή τη μελέτη, η οποία χαρακτηρίζεται ΚΕΠ της ουροδόχου κύστης χρησιμοποιώντας SP και διερεύνησε τη διαφοροποίηση τους από την οδό ΜΑΡΚ /σηματοδότησης ERK.

Σε αναζήτηση μιας ιεραρχίας CSC στον ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης,

in vitro

μελέτες μας έδειξαν ABCG2

hi κύτταρα SP εμφανίζεται μια τριπλάσια αύξηση στην απόδοση σχηματισμού αποικιών. Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζονται περαιτέρω από

in vivo

μελέτες μας σύμφωνα με την οποία ABCG2

hi κύτταρα SP ήταν όγκου κίνηση σε σύγκριση με ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP που εμφανίζεται απώλεια της ανάπτυξης του όγκου σε 1 × 10

3 αραίωση των κυττάρων. Αυτές οι παρατηρήσεις τονίζουν εμπλουτισμό των ΚΕΠ, εντός των ABCG2

επιλογές hi SP. Μεταγενέστερες σειριακό μεταμοσχεύσεις θα υποστηρίξει περαιτέρω μια ιεραρχική σχέση CSC σε αυτούς τους όγκους. Ωστόσο, έχουμε λάβει μια ανάλογη προσέγγιση με την εκτέλεση σειριακής επιλογές και

in vitro

καλλιέργειες ABCG2

hi SP και ABCG2

χαμηλή πολιτισμών NSP αποδείξει την ικανότητά της ABCG2

hi κύτταρα SP για να ανασυστήσουν η αρχική φάσμα φαινοτυπική της μητρικής κυτταρικής γραμμής RT112. Serial επιλογές της ABCG2

χαμηλή κύτταρα NSP έδειξαν αποδυνάμωση του δυναμικού για την αναγέννηση των δύο πληθυσμών δείχνει αραίωση του τη δυνατότητα να επιλέξετε ή να δημιουργήσετε ΚΕΠ.

ABCG2 έχει αποδειχθεί ότι είναι ο κύριος καθοριστικός παράγοντας μοριακή του φαινοτύπου SP [26]. Πράγματι, βρήκαμε το SP της NMIBC RT112 και τα κύτταρα RT4 είχαν υψηλότερη έκφραση του mRNA ABCG2, ήταν εντελώς καταργήθηκε από ABCG2 ειδικός αναστολέας του FTC και περιείχε το top 5% των ABCG2

hi κύτταρα που εκφράζουν. Συσχέτιση με τα αποτελέσματα κλινικών NMIBC αποκάλυψε ABCG2

hi ανοσοχρώση να σχετίζεται με χειρότερα κλινικά αποτελέσματα της υποτροπής και εξέλιξης του καρκίνου, υποδεικνύοντας ένα ρόλο για CSCs στην ανάπτυξη καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Είναι ενδιαφέρον ότι η SP της κυτταρικής γραμμής MIBC J82 είχαν υψηλότερη έκφραση Ρ-γλυκοπρωτεΐνη και ανεστάλη με βεραπαμίλη, έναν αναστολέα Ρ-ειδικό. Οι Ρ-γλυκοπρωτεΐνης επίπεδα mRNA έχουν βρεθεί να είναι αυξημένα σε όγκους υψηλού βαθμού κύστη [36]. Επιπλέον, η μοριακή παθολογία του NMIBC είναι διακριτή από MIBC [20].