Αφηρημένο

Ιστορικό

Το

ARID1A

γονίδιο κωδικοποιεί αδενίνη-θυμίνη (AT ) πλούσια σε διαδραστικά πρωτεΐνη 1A που περιέχει την περιοχή, η οποία συμμετέχει στην αναδιάταξη της χρωματίνης.

ARID1A

έχει έδειξε να λειτουργεί ως καταστολέας όγκων σε διάφορους τύπους καρκίνου. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε την έκφραση και την πρόγνωση αξίας

ARID1A

στην πρωτοβάθμια καρκίνο του στομάχου. Εν τω μεταξύ, ο βιολογικός ρόλος του

ARID1A

ερευνήθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας το μοντέλο των κυττάρων in vitro.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Για να διερευνήσουν το ρόλο του

ARID1A

γονιδίων σε πρωτογενή γαστρικού παθογένεση του καρκίνου, σε πραγματικό χρόνο ποσοτική PCR και κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκαν για να εξεταστεί η

ARID1A

έκφραση σε ζεύγη καρκινικούς και μη καρκινικούς ιστούς. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν μειωμένη

ARID1A

mRNA (

P

= 0.0029) και πρωτεΐνες (

P

= 0,0015) έκφραση στους περισσότερους ιστούς που φέρουν όγκο σε σύγκριση με την συμφωνημένα παρακείμενο μη-όγκου ιστούς, και σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις κλινικοπαθολογοανατομικών και προγνωστική τους ρόλους των

ARID1A

έκφρασης, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις των 224 τεμάχια ιστού καρκίνο του στομάχου παραφίνη-ενσωματωμένες. Δεδομένων αποκάλυψε ότι η απώλεια του

ARID1A

έκφραση συσχετίστηκε σημαντικά με το στάδιο Τ (

P

= 0,001) και του βαθμού (

P

= 0,006). Συνεπής με αυτά τα αποτελέσματα, βρήκαμε ότι η απώλεια του

ARID1A

έκφραση συσχετίστηκε σημαντικά με κακή επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου (

P

= 0,003). αναλύσεις Cox παλινδρόμησης έδειξε ότι

ARID1A

έκφραση ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης της συνολικής επιβίωσης (

P

= 0,029). Επιπλέον, οι λειτουργίες του

ARID1A

στον πολλαπλασιασμό και αποικία σχηματισμό γαστρικών κυτταρικές σειρές αναλύθηκαν με επιμόλυνση κυττάρων με πλήρους μήκους

ARID1A

φορέα έκφρασης ή siRNA που στοχεύει

ARID1A

. Αποκατάσταση

ARID1A

έκφραση σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα αναστέλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών. Φίμωση

ARID1A

έκφραση σε γαστρική επιθηλιακή κυτταρική γραμμή ενισχυθεί σημαντικά ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι

ARID1A

μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στον καρκίνο του στομάχου και του μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα πολύτιμο προγνωστικό δείκτη και πιθανός στόχος για γονιδιακή θεραπεία στη θεραπεία του καρκίνου του στομάχου

Παράθεση:. Wang dd, Chen Yb, Pan Κ, Wang W, Chen Sp, Chen Κρ , et al. (2012) μειωμένη έκφραση του

ARID1A

γονιδίου σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε πρωτοπαθή καρκίνο του στομάχου. PLoS ONE 7 (7): e40364. doi: 10.1371 /journal.pone.0040364

Επιμέλεια: Patrick Tan, Duke-Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σιγκαπούρης Πτυχιούχος Ιατρικής Σχολής, Σιγκαπούρη

Ελήφθη: 19 Ιαν, 2012? Αποδεκτές: 6 Ιούν, 2012? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουλίου 2012 |

Copyright: © 2012 Dandan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30973398) και του Ιδρύματος Guangdong Φυσικών Επιστημών (925.100.890). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου είναι η τέταρτη πιο συχνή κακοήθεια σε όλο τον κόσμο και η δεύτερη πιο κοινή αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με κάθε έτος (10,4% των θανάτων από καρκίνο) [1]. Θεραπεία του γαστρικού καρκίνου περιλαμβάνει ένα συνδυασμό χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία, ή ακτινοθεραπεία. Ωστόσο, σχεδόν το 60% των ασθενών που πάσχουν υποκύπτουν γαστρικού καρκίνου, ακόμη και μετά από μόνη μια θεραπευτική εκτομή ή μετά από επικουρική θεραπεία [2]. Από καιρό ήταν γνωστό ότι γαστρικό καρκίνο προέρχεται από το συνδυασμό των περιβαλλοντικών παραγόντων και τη συσσώρευση των γενικευμένων και των ειδικών γενετικών αλλαγών. Πολλές από τις γενετικές ή επιγενετικές μεταβολές που σχετίζονται με γαστρικό καρκίνο, συμπεριλαμβανομένης της απώλειας της ετεροζυγωτίας, μικροδορυφόρων και χρωμοσωμική αστάθεια και υπερμεθυλίωση, έχουν αναφερθεί [3]. Η κατανόηση αυτών των αλλαγών και των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην γαστρική καρκινογένεση θα είναι κρίσιμης σημασίας για τη βελτίωση της διάγνωσης, της θεραπείας και πρόβλεψη της πρόγνωσης της ασθένειας αυτής.

Η ευκαρυωτικά συντηρημένες SWI /SNF συμπλόκου χρωματίνη αναδιαμόρφωση παίζει ουσιαστικό ρόλο σε μια ποικιλία κυτταρικών διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένης της διαφοροποίησης, του πολλαπλασιασμού και την επιδιόρθωση του DNA [4]. Απώλεια SWI /SNF υπομονάδες έχει αναφερθεί σε περισσότερους όγκους, και ένας μεγάλος αριθμός πειραματικών παρατηρήσεων προτείνουν ότι αυτό το συγκρότημα είναι κρίσιμη για την καταστολή του όγκου [5]. Τα σύμπλοκα περιέχουν επτά ή περισσότερα μη καταλυτικές υπομονάδες που πιθανώς βοηθούν ρυθμίζουν την στόχευση και τη δραστηριότητα του ΑΤΡάσης [6]. Μία υπομονάδα αυτού του συμπλέγματος, hSNF5 /Ini1 /BAF47, έχει ταυτοποιηθεί ως καταστολέας όγκου [7], [8]. Το άλλο μη καταλυτικές υπομονάδα, P270 /ARID1A /BAF250a (αδενίνη-θυμίνη ΑΤ-πλούσιες διαδραστικές περιέχει περιοχή πρωτεΐνης 1Α), έχει αποδειχθεί ότι είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική διακοπή του κυτταρικού κύκλου [9]. Knockdown του

ARID1A

σε μία κυτταρική γραμμή λευχαιμίας προσδίδει αντίσταση σε Fas απόπτωση που διαμεσολαβείται [10].

Πρόσφατα,

ARID1A

μεταλλάξεις και απώλεια BAF250a πρωτεΐνης έχουν βρεθεί να συσχετίζονται έντονα με την καρκίνωμα ωοθηκών σαφής-κυττάρου και καρκίνωμα ενδομητριοειδές μήτρας χαμηλού βαθμού [11] – [13]. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι

ARID1A

είναι ένας πιθανός υποψήφιος γονίδιο καταστολής όγκων. Ωστόσο, η κλινική σημασία της εν λόγω διαφορικής έκφρασης και η λειτουργία της πρωτεΐνης ARID1A παραμένουν απροσδιόριστες λόγω της έλλειψης μελετών χρησιμοποιώντας φρέσκα δείγματα ανθρώπινου όγκου. Στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε το επίπεδο έκφρασης του

ARID1A

στο γαστρικό καρκίνο, χρησιμοποιώντας σε πραγματικό χρόνο ποσοτική RT-PCR, Western και ανοσοϊστοχημεία. Εν τω μεταξύ, εντοπίσαμε τη σχέση μεταξύ των

ARID1A

έκφρασης και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά και να αξιολογούνται προγνωστική αξία του σε μετα-εκτομή επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του στομάχου. Επιπλέον, αξιολογήσαμε το λειτουργικό ρόλο των

ARID1A

στην ογκογένεση του πρωτογενούς καρκίνου του στομάχου με την εξέταση της in vitro σχηματισμό αποικιών πολλαπλασιασμό και στο γαστρικό κυτταρικές σειρές.

Αποτελέσματα

ARID1A

έκφραση mRNA αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR

το επίπεδο του mRNA της

ARID1A

προσδιορίστηκε με πραγματικού χρόνου ποσοτικές αναλύσεις RT-PCR σε 66 ζεύγη καρκινικών και τα συμφωνημένα παρακείμενο φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνο ιστούς. Η

ARID1A

επίπεδο έκφρασης ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε 43 (65,15%) σε ιστούς που φέρουν όγκο σε σύγκριση με τις παρακείμενες μη καρκινικούς ιστούς (

P

= 0,0029, Σχήμα 1).

Η σχετική έκφραση του mRNA του

ARID1A

μειώθηκε σημαντικά σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τα συμφωνημένα παρακείμενα nontumorous ιστούς (n = 66,

P

= 0,0029). Οι οριζόντιες γραμμές αντιπροσωπεύουν την μέση.

Η

ARID1A Protein Expression αναλύθηκαν με κηλίδωση Western

κηλίδωση Western εκτελέστηκε σε 25 δείγματα γαστρικού καρκίνου και αντίστοιχες παρακείμενες μη-καρκινικές γαστρικό βλεννογόνο ιστούς από το 66 ζεύγη δείγματα. Τα αποτελέσματα έδειξαν μία ταινία ARID1A στο αναμενόμενο μέγεθος των 242 kDa και η ποσότητα της πρωτεΐνης που υπάρχει ARID1A περαιτέρω μετρήθηκε με πυκνομετρία. Σύμφωνα με τις ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR, μια μείωση στην έκφραση ARID1A παρατηρήθηκε σε 13 (52%) των γαστρικών καρκινικών ιστών σε σύγκριση με συμφωνημένα γειτονικούς ιστούς μη-όγκου (

P

= 0,0015, Σχήμα 2Α και Σχήμα 2Β). Ομοίως, η έκφραση της πρωτεΐνης ARID1A ήταν σημαντικά μειωμένη σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, SGC7901, AGS, ιδιαίτερα σε MGC803, σε σύγκριση με την κανονική κυτταρική σειρά γαστρικού GES1 (Σχήμα 2C).

(Α) Σχετικά επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης σε ARID1A γαστρικό καρκινικούς ιστούς και noncancerous ιστούς (ARID1A /GAPDH, n = 25,

P

= 0,0015). Οι οριζόντιες γραμμές αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο. (Β) Εκπρόσωπος αποτέλεσμα της έκφρασης της πρωτεΐνης ARID1A σε 4 ζεύγη γαστρικό οιδηματώδης και τα συμφωνημένα δίπλα nontumorous ιστούς (C, γαστρικό καρκινικούς ιστούς? Ν, συνδυάζεται noncancerous γαστρικό βλεννογόνο). (Γ) Το επίπεδο της πρωτεΐνης ARID1A ήταν σημαντικά μειωμένη σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, SGC7901, AGS, ιδιαίτερα σε MGC803, σε σύγκριση με την κανονική κυτταρική γραμμή γαστρικού GES1.

Η

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης ARID1A στο γαστρικό καρκίνο Tissue δείγματα και η σχέση της με την κλινικοπαθολογικών παραμέτρων

Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις κλινικοπαθολογοανατομικών και προγνωστική τους ρόλους της έκφρασης ARID1A, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις των 224 τεμάχια ιστού καρκίνο του στομάχου παραφίνη-ενσωματωμένες. Συνολικά, 115 από 224 (51,3%) περιπτώσεις έδειξε αρνητική έκφραση ARID1A σε καρκινικούς ιστούς (Εικόνα 3Β), ενώ 109 (48,7%) περιπτώσεις εμφάνισαν θετική ανοσοχρώση (Σχήμα 3C & amp? D). Κανονική γαστρικό βλεννογόνο έδειξε την ισχυρότερη ARID1A θετική χρώση (Σχήμα 3Α). Οι συσχετισμοί μεταξύ της έκφρασης των ARID1A και διάφορα κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους που παρατίθενται στον Πίνακα 1. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η απώλεια της έκφρασης ARID1A συσχετίστηκε σημαντικά με το βάθος της διείσδυσης του όγκου (Τ στάδιο,

P

= 0,001) και του όγκου βαθμός (

P

= 0.006), αλλά όχι με την ηλικία, το φύλο, το μέγεθος του όγκου, μακρινή μετάσταση (στάδιο Μ), και θέση του όγκου ή τοπική μετάσταση στους λεμφαδένες (Ν στάδιο).

( Α) χρώση Ισχυρή ARID1A παρατηρήθηκε σε noncancerous γαστρικό βλεννογόνο. (Β) γαστρικό αδενοκαρκίνωμα ARID1A-αρνητικό, Grade 3. (C) Ασθενής χρώση ARID1A στο γαστρικό αδενοκαρκίνωμα, Grade 2 (D) Ισχυρή χρώση ARID1A στο γαστρικό αδενοκαρκίνωμα, Grade 1.

Η

έκφραση των ARID1A και της κλινικής έκβασης

Οι 5-ετή συνολική επιβίωση σε ασθενείς με θετική και αρνητική έκφραση ARID1A ήταν 68,8% και 52,2%, αντίστοιχα. Η συνολική επιβίωση των ασθενών με αρνητική έκφραση ARID1A ήταν σημαντικά χειρότερη από εκείνη των ασθενών ARID1A-θετικό (

P

= 0,003, δοκιμασία log-rank, Σχήμα 4). αναλύσεις παλινδρόμησης Cox μονοπαραγοντική έδειξαν ότι το βάθος της διείσδυσης του όγκου, η τοπική μετάσταση λεμφαδένα, απομακρυσμένη μετάσταση, το μέγεθος του όγκου και της έκφρασης ARID1A συσχετίζονταν σημαντικά με τη συνολική επιβίωση (Πίνακας 2). Επιπλέον, μια πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox επιβεβαίωσε το βάθος της διήθησης του όγκου, την τοπική μετάσταση στους λεμφαδένες, μακρινή μετάσταση και την έκφραση ARID1A ως ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες της συνολικής επιβίωσης των ασθενών με γαστρικό καρκίνο (Πίνακας 2).

Το ποσοστό επιβίωσης των ασθενών στην ARID1A-αρνητική ομάδα ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των ασθενών στην ARID1A-θετική ομάδα (δοκιμασία log-rank,

P

= 0,003).

Η

Η ο ρόλος του

ARID1A

στην κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της αποικίας Συγκρότηση σε MGC803 και GES1 Γραμμές κυττάρων

για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα των

ARID1A

στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, η

ARID1A

φορέα έκφρασης και ο φορέας ελέγχου αντίστοιχα διαμολύνθηκαν σε MGC803 κύτταρα.

ARID1A

έκφραση σε επιμολυσμένα κύτταρα ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western (Σχήμα 5Α). Η δοκιμασία κυτταρικής ανάπτυξης αποκάλυψε ότι ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων σε

ARID1A

επιμολυσμένα γαστρικά καρκινικά κύτταρα ήταν σημαντικά χαμηλότερα από τον έλεγχο του γαστρικού καρκινικά κύτταρα μορφομετατραπέντα με φορέα (Σχήμα 5C). Εν τω μεταξύ, η αποτελεσματικότητα του σχηματισμού αποικίας ήταν σημαντικά (

P

= 0,0379) αναστέλλεται σε

ARID1A

επιμολυσμένα γαστρικά καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τον έλεγχο του γαστρικού καρκινικά κύτταρα μορφομετατραπέντα με φορέα (Σχήμα 5D). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η λειτουργία καταστολή του πολλαπλασιασμού του

ARID1A

, θα σιγήσει η

ARID1A

έκφρασης σε κυτταρική σειρά GES1 με siRNA. Η

ARID1A

έκφραση σε επιμολυσμένα κύτταρα ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western (Σχήμα 5Β). Βρήκαμε ότι αποσιώπηση της έκφρασης του

ARID1A

σε GES1 σημαντικά ενισχυμένη τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σύγκριση με ψευδο θεραπεία siRNA (Σχήμα 5Ε).

(Α) Κηλίδωση Western ανάλυση της αποκατάστασης της

ARID1A

έκφραση σε MGC803 κύτταρα. (Β) κηλίδωση Western ανάλυση σιγήσει

ARID1A

έκφραση στα κύτταρα GES1. (Γ) Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού κυττάρων που δείχνει την κατασταλτική επίδραση της αποκατάστασης

ARID1A

έκφρασης στο in vitro πολλαπλασιασμό κυτταρικής γραμμής MGC803. (D)

ARID1A

ανέστειλε το σχηματισμό αποικίας των MGC803 κυττάρων. Οι εικόνες εμφανίζονται στα αριστερά και στα δεξιά, οι ποσοτικές αναλύσεις των αριθμών πλακών δείχνονται ως μέση τιμή ± SD. (Ε) δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων που δείχνουν σημαντικά αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού των

ARID1A

-silenced GES1 κύτταρα σε σύγκριση με τα mock κύτταρα siRNA θεραπεία GES1. *,

P

& lt? 0,05 έναντι του mock-ελέγχου? **

P

& lt?. 0,01 έναντι του mock-ελέγχου

Η

Συζήτηση

Παρά τις μεγάλες προόδους στη διάγνωση και τη θεραπεία, γαστρικός καρκίνος παραμένει μια από οι πιο θανατηφόρες νεοπλάσματα, με μια μελαγχολική πρόγνωση μετά από ριζική γαστρεκτομή [14], [15]. Η κλινική έκβαση του γαστρικού καρκίνου καθορίζεται από μια σειρά από χαρακτηριστικά όγκου, όπως τοποπεριοχική ανάπτυξη του όγκου και την εισβολή, βαθμός διαφοροποίησης, της αγγειογένεσης, μακρινή μετάσταση και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, τα οποία ρυθμίζονται από μία ποικιλία σχετικών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των ογκογόνων και ογκοκατασταλτικών γονίδια. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός των γαστρικού καρκίνου ειδικών βιοδεικτών που εμπλέκονται σε αυτές τις διαδικασίες είναι πολύ σημαντική για τη διάγνωση, τη θεραπεία και την πρόβλεψη της πρόγνωσης σε κλινικό περιβάλλον.

ARID1A

, ένα πρόσφατα ταυτοποιημένο γονίδιο καταστολέας όγκου που κωδικοποιεί ένα μέλος του συμπλόκου SWI /SNF, έχει μια υψηλή συχνότητα μετάλλαξης στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, της μήτρας ενδομητριοειδές καρκίνωμα, ωοθηκικό καρκίνωμα ενδομητριοειδές και σαφής κυττάρου [11] – [13], [16], [17]. Στην σαφές καρκίνωμα των ωοθηκών, αναφέρεται ότι

ARID1A

μετάλλαξη συνδέεται σημαντικά με ARID1A ανοσολογική αντίδραση [18]. Πρόσφατα, η μελέτη αλληλουχίας exome αποκάλυψε ότι

ARID1A

είναι επίσης συχνά μεταλλάσσεται σε καρκίνο του στομάχου [19], [23]. Ωστόσο, μέχρι στιγμής η έκφραση, η κλινική σημασία και βιολογικές λειτουργίες του

ARID1A

στο γαστρικό καρκίνο δεν έχουν διερευνηθεί. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε την έκφραση του

ARID1A

σε γαστρικό καρκίνο με πραγματικού χρόνου PCR, κηλίδωση Western και ανοσοϊστοχημεία, εκτός από την κλινικοπαθολογοανατομικών και προγνωστική σημασία της σε ένα μεγάλο ανθρώπινο δείγμα. Επιπλέον, με τη χρήση in vitro μοντέλο των κυττάρων, ερευνήσαμε επίσης το ογκοκατασταλτικό ρόλο του

ARID1A

στο γαστρικό κύτταρα λεπτομερώς.

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι

ARID1A

εκφράστηκε τόσο σε χαμηλότερο επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς από τα αντίστοιχα μη-καρκινικές βλεννογόνο. Σε συμφωνία με αυτές τις μοριακές βιολογικές ευρήματα, ανοσοϊστοχημεία με ένα αντίσωμα αντι-ARID1A έδειξε ότι

ARID1A

πλήρως σιγήσει σε 115 από 224 ασθενείς γαστρικό καρκίνο δείγματα, με θετική έκφραση σε άλλους 109 ασθενείς. Η παρατήρησή μας είναι σε συμφωνία με μια σειρά μελετών αποκαλυπτική που

ARID1A

έκφραση συχνά χάνεται ή μειώνεται σε ένα αριθμό ιστών καρκίνου και κυτταρικές σειρές, όπως ο καρκίνος του μαστού, καρκίνωμα της μήτρας ενδομητριοειδές, των ωοθηκών σαφής κυττάρου και καρκίνωμα ενδομητριοειδές [13,18,20, και 21].

Μέχρι σήμερα, οι αιτίες της

ARID1A

σίγηση δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί. Οι υπάρχουσες μελέτες επικεντρώνονται σε μεταλλάξεις στο

ARID1A

, ιδιαίτερα σε γυναικολογικούς καρκίνους. Έχει αναφερθεί ότι ένα ανοησία ή Indel μετάλλαξη

ARID1A

συσχετίστηκε με απώλεια ή μείωση της έκφρασης πρωτεΐνης σε καρκίνωμα μήτρας ενδομητριοειδές, καρκίνωμα ωοθηκών και ενδομητριοειδές καρκίνωμα σαφής κυττάρου [11] – [13], [18]. Σε μια ολοκληρωμένη γονιδιωματική έρευνα, Mamo

et al

. βρέθηκε μόνο μία κολοβωμένη μετάλλαξη

ARID1A

στην κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού T47D, χωρίς καμία μετάλλαξη στα δείγματα καρκίνου του μαστού 11 η οποία έδειξε αντίγραφο DNA απώλεια αριθμό στην 1ρ36.11 τόπο πλησίον

ARID1A

[22]. Οκτώ από τα εννέα δείγματα με την απώλεια αριθμό αντιγράφων του DNA σε 1ρ36.11 έχουν επίσης χαμηλή έκφραση της πρωτεΐνης ARID1A, γεγονός που υποδηλώνει μια συμφωνία μεταξύ της απώλειας αριθμό αντιγράφων του DNA και

ARID1A

αδρανοποίηση. Στη μελέτη προσδιορισμού αλληλουχίας exome από τον Wang

κ.ά.

., Συνολικά 46 μεταλλάξεις βρέθηκε σε 32 από 109 (29%) γαστρικό καρκίνο δείγματα, με 39 (85%) περικόπτεται μεταλλάξεων [19]. Είκοσι τέσσερις (75%) από τις 32 γαστρικό δείγματα καρκίνου με

ARID1A

μεταλλάξεις δείχνουν είτε απώλεια ή σημαντικά μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης σε σύγκριση με εκείνους που δεν έχουν

ARID1A

μετάλλαξη. Σε αντίθεση, υπάρχουν μόνο 6 γαστρικό καρκίνο δείγματα που δείχνει απουσιάζει ή ασθενή έκφραση πρωτείνης απουσία ανιχνεύσιμων

ARID1A

μετάλλαξη, γεγονός που υποδηλώνει ότι άλλοι μηχανισμοί μπορούν να συμβάλουν στην

ARID1A

αδρανοποίηση. Πρόσφατα, μια άλλη έρευνα αλληλουχίας exome από Zang

et al

. Επίσης έδειξε

ARID1A

μεταλλάξεις στο 8% των γαστρικών δειγμάτων, των οποίων το 75% χάνεται ή μειώνεται η έκφραση της πρωτεΐνης [23]. Πιο ενδιαφέρον, οι δύο μελέτες έδειξαν υψηλότερη

ARID1A

αλλαγές στο γαστρικό δείγματα καρκίνου με μικροδορυφόρων αστάθεια (MSI) από εκείνες με τη σταθερότητα των μικροδορυφόρων (MSS). Επιπλέον, το φάσμα μετάλλαξη

ARID1A

είναι διακριτός μεταξύ των δύο γενετικών τύπων του καρκίνου του στομάχου, με τις περισσότερες indels στον τύπο MSI και περισσότερες παραλλαγές μονής neucliotide στον τύπο MSS. MSI ορίζεται ως μεταλλάξεις Indel εντός επαναλήψεις νουκλεοτιδίων (γνωστή ως μικροδορυφόρων περιφέρειες) προέκυψε από γονίδιο επιδιόρθωσης σφαλμάτων αντιγραφής αναντιστοιχία DNA απενεργοποίηση που προκαλείται από [24]. Προτείνεται ως έναρξη γονιδιωματικά γεγονότα του γαστρικού καρκίνου, MSI συχνά οδηγεί σε συσσώρευση επιπρόσθετων γενετικών αστάθειες σχετίζονται με τον καρκίνο, όπως αλληλικές απώλειες και μετατόπισης πλαισίου μεταλλάξεις σε γονίδια που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης και την επιδιόρθωση του DNA. Έχει αναφερθεί ότι MSI εμφανίζεται στο 25% έως 50% των σποραδικών γαστρικού καρκίνου, καθορίζοντας ένα μοναδικό ασθένεια γενετικού τύπου με διαφορετικά χαρακτηριστικά κλινικοπαθολογικά [24]. Στη μελέτη των Wang

et al

., Ο ρυθμός μετάλλαξης Indel (78%) του

ARID1A

στην MSI καρκίνο του στομάχου είναι συγκρίσιμη με εκείνη του

TGFBR2

το MSI του παχέος εντέρου καρκίνο, μια καλά οργανωμένη και λειτουργικά επικυρωθεί γονίδιο οδηγού αδρανοποιηθεί με MSI [25]. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η μετάλλαξη του

ARID1A

μαζί με MSI μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην γαστρική καρκινογένεση. Ως εκ τούτου, η σχέση μεταξύ του

ARID1A

αλλαγές και MSI κατάσταση στο γαστρικό καρκίνο, καθώς και κλινικοπαθολογοανατομικές σημασία του, χρειάζεται περαιτέρω έρευνα στο μέλλον της έρευνας.

Στη μελέτη των Wang

et al.

, η έκφραση του

ARID1A

ανιχνεύθηκε μόνο σε ένα δείγμα μικρού μεγέθους (32 περιπτώσεις), και δεν υπήρχε περαιτέρω διερεύνηση της κλινικής σημασίας της [19]. Εδώ, σε ένα μεγαλύτερο γαστρικό καρκίνο πληθυσμού (224 περιπτώσεις), βρήκαμε ότι η απώλεια του

ARID1A

έκφραση συσχετίστηκε σημαντικά με υψηλότερο στάδιο Τ του καρκίνου του στομάχου, πράγμα που σημαίνει ότι η απουσία του

ARID1A

έκφραση μπορεί να προάγει την ανάπτυξη του όγκου και την εισβολή. Επιπλέον, εντοπίστηκε κάτω ARID1A ανοσολογική αντίδραση σε φτωχά διαφοροποιημένο γαστρικό καρκινικούς ιστούς από ό, τι σε καλά διαφοροποιημένα αυτά, γεγονός που υποδηλώνει ότι μειώθηκε

ARID1A

έκφραση θα μπορούσε να διαδραματίσει κάποιο ρόλο στον όγκο de-διαφοροποίηση. Συνεπής με τα ευρήματά μας, άλλοι ερευνητές διαπίστωσαν επίσης ότι μειώθηκε

ARID1A

έκφραση συνδέεται σημαντικά με υψηλότερο βαθμό του καρκίνου του μαστού [22], καθώς και ένα ανώτερο στάδιο ΦΥΓΩ με σαφείς καρκίνωμα των ωοθηκών κυττάρων [21]. ARID1A προωθεί το σχηματισμό της BRG1 ή BRM-περιείχαν SWI /SNF συγκροτήματα αναδιαμόρφωσης χρωματίνης, τα οποία είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική σύλληψη του κυτταρικού κύκλου [9], [26].

Μια ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ η απώλεια του

ARID1A

έκφρασης και των φτωχότερων κλινική έκβαση των ασθενών με γαστρικό καρκίνο μετά από ριζική λειτουργία. Οι αναλύσεις Cox αναλογία κινδύνου παλινδρόμησης κατέδειξαν περαιτέρω ότι η

ARID1A

επίπεδο έκφρασης ήταν ένας ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για την επιβίωση, υποδεικνύοντας ότι μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα πολύτιμο προγνωστικό βιοδείκτη για ασθενείς με γαστρικό καρκίνο μετά από χειρουργική επέμβαση και ένα πιθανό στόχο για γονιδιακή θεραπεία σε η θεραπεία του καρκίνου του στομάχου. Στην σαφές καρκίνωμα των ωοθηκών, που αναφέρθηκε επίσης ότι οι ασθενείς με θετικό

ARID1A

έκφρασης είχε μια μεγαλύτερη επιβίωση χωρίς εξέλιξη από εκείνα με αρνητικές

ARID1A

έκφρασης [21]. Επιπλέον, η απώλεια του

ARID1A

έκφραση συσχετίστηκε σημαντικά με χημειοαντίσταση σε σαφή καρκίνωμα ωοθηκών κύτταρο, το οποίο συνδέεται επίσης με πτωχή πρόγνωση του καρκίνου. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το

έκφρασης και μετάλλαξη ARID1A

εξέταση μπορεί να είναι χρήσιμη στην καθοδήγηση κλινική διαχείριση. Στο σύνολό τους, οι παρατηρήσεις μας ότι η απώλεια του

ARID1A

έκφρασης σε καρκίνο του στομάχου συνδέεται με πιο κακοήθεις φαινοτύπους και χειρότερη πρόγνωση σημαίνει ότι μπορεί να παίξει ένα ογκοκατασταλτικό ρόλο στη γαστρική καρκινογένεση.

διερευνήθηκε περαιτέρω το λειτουργικό ρόλο του

ARID1A

στο γαστρικό κυτταρικές σειρές. Αποκατάσταση

ARID1A

έκφραση σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα αναστέλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών. Αποσιώπηση της έκφρασης του

ARID1A

σε γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα ενίσχυσε σημαντικά τον ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι

ARID1A

μπορεί να διαδραματίσει ρόλο κατά την εισαγωγή στην αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων. Πρόσφατα, λειτουργικές δοκιμασίες του

ARID1A

σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου από Zang

et al

. πρότεινε ότι

ARID1A

ασκούν ογκοκατασταλτικών δραστηριότητα [23]. Guan

et al

. έδειξαν ότι η αποκατάσταση της έκφρασης του άγριου τύπου

ARID1A

είναι επαρκής για να καταστείλει τον πολλαπλασιασμό και tumorigenecity ξενομοσχευμάτων με ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών που φιλοξενούν

ARID1A

μεταλλάξεις, ενώ παρεμβολή RNA με μεσολάβηση

ARID1A

σίγηση ενισχύει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και ογκογονικότητα σε δύο μη-μετασχηματισμένα ανθρώπινα επιθηλιακά ωοθηκών κυτταρικές σειρές, IOSE-80PC και OSE4 [27]. Τα στοιχεία αυτά, σε συνδυασμό με τη δική μας, δείχνουν ότι η απώλεια του

ARID1A

μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της καρκινογένεσης.

Εν κατακλείδι, έχουμε αποδείξει την απώλεια του

ARID1A

έκφραση σε καρκίνο του στομάχου και ο συσχετισμός της με μια πιο κακοήθη φαινότυπο και χειρότερη πρόγνωση σε μεγάλο αριθμό κλινικών δειγμάτων. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι

ARID1A

μπορεί να αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών in vitro. Για το καλύτερο της γνώσης μας, τα δεδομένα που παράγονται στην παρούσα μελέτη αντιπροσωπεύουν την πρώτη έκθεση συσχέτιση της παρουσίας του

ARID1A

με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά και τη συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του στομάχου. Σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα των Wang

et al.

Και Zang

et al

. [19], [23], θα επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι

ARID1A

θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως καταστολέας υποψήφιος όγκου και προγνωστικό βιοδείκτη σε γαστρική καρκινογένεση.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Η έρευνα εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Sun Yat-sen University Κέντρο Καρκίνου και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή που συμμετέχουν στη μελέτη.

Γραμμές κυττάρων και συνθήκες καλλιέργειας

Οι κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, SGC7901, AGS, MGC803, και το γαστρικό βλεννογόνο επιθηλιακά κυτταρική σειρά GES1 ελήφθησαν από την Επιτροπή των Type Culture Collection της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 που παρέχεται με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό θερμικά ανενεργός (FBS). Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο που περιέχει 5% CO

2.

Ανθρώπινα δείγματα ιστών

s

Η

Ένα σύνολο 66 ζεύγη καρκινικών και συμφωνημένα δίπλα noncancerous γαστρικό βλεννογόνο ιστοί συλλέχθηκαν από ασθενείς με γαστρικό καρκίνο που υποβάλλονται σε γαστρεκτομή στο Sun Yat-sen University Κέντρο καρκίνου μεταξύ 2009 και 2011, και η διάγνωση επιβεβαιώθηκε από παθολογική εξέταση. Το 25 ζεύγη καρκινικών και αντίστοιχων παρακείμενων ιστών noncancerous γαστρικό βλεννογόνο που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της έκφρασης πρωτεΐνης ARID1A σε κηλίδωση Western επιλέχθηκαν από τα 66 ζεύγη δειγμάτων. Μετά τη χειρουργική εκτομή, φρέσκο ​​ιστοί αμέσως βυθίζεται σε RNAlater (Ambion, Inc., USA) για να αποφευχθεί η υποβάθμιση του RNA, φυλαγμένο σε 4 ° C όλη τη νύκτα για να επιτρέψει διεξοδική διείσδυση του RNAlater εντός του ιστού και στη συνέχεια καταψύχθηκαν στους -80 ° C μέχρι RNA και εκχύλιση πρωτεΐνης εκτελέστηκε. Ένα άλλο 224 δείγματα παραφίνη-ενσωματωμένες πρωτογενή γαστρικού καρκινώματος τα οποία είχαν συλλεχθεί μεταξύ του 2003 και του 2005, ελήφθησαν από το Πανεπιστήμιο Κέντρο Καρκίνου Sun Yat-sen. Κανένας από αυτούς τους ασθενείς είχαν λάβει ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Τα δεδομένα παρακολούθησης των ασθενών γαστρικού καρκίνου σε αυτή τη μελέτη είναι διαθέσιμες και πλήρη. Μετεγχειρητική παρακολούθηση συνέβη σε εξωτερικά ιατρεία μας και συμπεριλαμβάνονται κλινικές και εργαστηριακές εξετάσεις κάθε 3 μήνες για τα πρώτα 2 χρόνια, κάθε 6 μήνες κατά το τρίτο έως το πέμπτο έτος, κάθε χρόνο για άλλα 5 χρόνια ή μέχρι το θάνατο του ασθενούς, όποιο από τα δύο συμβεί πρώτο. Η ιστοπαθολογική τύπο και το στάδιο του καρκίνου του στομάχου προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τα κριτήρια της κατάταξης της Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας και το στάδιο ΤΝΜ που ορίζονται από την Ένωση για τη Διεθνή Έλεγχο του Καρκίνου.

Εκχύλιση του ολικού RNA και πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR

το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η συνολική συγκέντρωση RNA εκτιμήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 260 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NANO DROP (ND-1000, Thermo Scientific, USA). Η αντίστροφη μεταγραφή (RT) για τη σύνθεση της πρώτης αλυσίδας του cDNA εκτελέστηκε με 2 μg ολικού RNA επεξεργάστηκε με Μ-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (Promega, USA) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Το προκύπτον cDNA στη συνέχεια υποβλήθηκε σε πραγματικό χρόνο ποσοτική PCR για την αξιολόγηση των επιπέδων σχετικής mRNA του

ARID1A

και

GAPDH

(αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης, ως ένας εσωτερικός έλεγχος) με τον παρακάτω εκκινητές:

ARID1A

προς τα εμπρός: 5′-CTTCAACCTCAGTCAGCTCCCA-3 ‘, και να αντιστραφεί: 5′-GGTCACCCACCTCATACTCCTTT-3’?

GAPDH

προς τα εμπρός: 5′-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ‘, και να αντιστραφεί: 5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3’. Gene-ειδική ενίσχυση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα πραγματικού χρόνου PCR ΑΒΙ 7900HT (Life Technologies, Carlsbad, California, USA) με 15 μΐ μείγματος PCR που περιείχε 0,5 μΙ cDNA, 7.5 μΐ 2 χ SYBR Green κύριο μείγμα (Invitrogen, Carlsbad , California, USA), και 200 ​​ηΜ των κατάλληλων ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών. Το μίγμα προθερμάνθηκε στους 95 ° C (10 λεπτά) και στη συνέχεια ενισχύεται στους 95 ° C (30 δευτερόλεπτα) και 60 ° C (1 λεπτό) για 45 κύκλους. Η καμπύλη ανάλυση μετρήθηκε στους 95 ° C για 15 sec, 60 ° C για 15 sec και 95 ° C για 15 sec. Η τιμή Ct (κύκλος όριο) κάθε δείγματος υπολογίστηκε από τους κύκλους όριο με το λογισμικό του οργάνου (SDS 2.3), και η σχετική έκφραση του

ARID1A

mRNA ομαλοποιήθηκε με την

GAPDH

αξία . Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη συγκριτική κύκλος κατωφλίου (2

-ΔCT) μέθοδο.

Ανάλυση Western Blotting

Τα ομογενοποιημένα δείγματα γαστρικού καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του όγκου και μη όγκου ιστών, καθώς επίσης και κυτταρικές γραμμές , λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης RIPA, και τα προϊόντα λύσης συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (12,000 rpm) στους 4 ° C για 30 λεπτά. Περίπου 50 μg δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν στη συνέχεια με ηλεκτροφόρηση σε ένα πηκτώματος δωδεκυλθειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου 12% και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη πολυβινυλιδενο φθορίδιο. Μετά τον αποκλεισμό των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης για 60 λεπτά με 5% άπαχο γάλα, οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι ARID1A (Abgent Primary Antibody Company, USA, σε αραίωση 1:1000) . Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με TBST (τρις-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με Tween-20) για 10 λεπτά και ανιχνεύθηκε με το υπεροξειδάση (HRP) αντίσωμα IgG συζευγμένο αντι-ποντικού κουνελιού (Immunology Consultants Laboratory, USA, σε ένα 1: 2000 αραίωση) στους 37 ° C για 1 ώρα. Μετά από τρεις πλύσεις, οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν με ένα ενισχυμένο σύστημα χημειοφωταύγειας (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA). Η ένταση της ζώνης μετρήθηκε με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας το λογισμικό Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, USA). Τα επίπεδα πρωτεΐνης κανονικοποιήθηκαν προς εκείνη του GAPDH ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπινο GAPDH μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού (Shanghai Kangchen, Κίνα, σε αραίωση 1:10000).

Ανοσοϊστοχημεία Ανάλυση

Τα τμήματα ιστών ήταν αποπαραφινοποιήθηκαν με διμεθυλοβενζόλιο και επανυδατώθηκαν μέσω της κατά 100%, 95%, 90%, 80% και 70% αιθανόλη. Μετά από τρεις πλύσεις σε PBS (αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό), τα πλακίδια υπέστησαν ζέση σε ρυθμιστικό ανάκτηση αντιγόνου που περιέχει 0.01 Μ κιτρικό νάτριο-υδροχλωρικό οξύ (ρΗ = 6.0) για 15 λεπτά σε φούρνο μικροκυμάτων. Μετά την έκπλυση με PBS, οι τομές ιστών επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα και οι πλάκες στη συνέχεια ξεπλύθηκαν σε 3% διάλυμα υπεροξειδάσης απόσβεσης (Invitrogen) για να εμποδίσει ενδογενούς υπεροξειδάσης. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι ARID1A (Abgent Primary Antibody Company, USA, σε αραίωση 1:300) στους 4 ° C όλη τη νύκτα και στη συνέχεια επωάστηκαν με υπεροξειδάση (HRP) (DAKO ChemMateTM EnVisionTM Detection Kit) στο δωμάτιο θερμοκρασία για 30 λεπτά. Μετά την πλύση σε PBS, το σήμα οπτικοποίηση αναπτύχθηκε με 3, 3′-διαμινοβενζιδίνη διάλυμα (DAB), και όλα τα πλακίδια με αιματοξυλίνη. Ως αρνητικοί έλεγχοι, γειτονικά τμήματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε παραπάνω εκτός του ότι αυτά επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C εντός διαλύματος αποκλεισμού χωρίς το πρωτεύον αντίσωμα.

Η συνολική ARID1A ανοσοχρώση βαθμολογία υπολογίστηκε ως το άθροισμα του ποσοστού των θετικά χρωματισμένα κύτταρα όγκου και η ένταση χρώσης. Εν συντομία, το ποσοστό των θετικών χρώση βαθμολογήθηκε ως 0 (0-9%, αρνητική), 1 (10% -25%, σποραδική), 2 (26% -50%, εστιακή) ή 3 (51% -100%, διάχυτη), και η ένταση ως 0 (καμία χρώση), 1 (ασθενής χρώση), 2 (μέτρια χρώση) και 3 (σκούρο χρώση). Η συνολική βαθμολογία ανοσοχρώση υπολογίστηκε με την τιμή της βαθμολογίας τοις εκατό θετικότητας × βαθμολογία ένταση χρώσης, που κυμαίνονταν από 0 έως 9. Το επίπεδο έκφρασης της ARID1A ορίστηκε ως εξής: «-» (αρνητικό, το σκορ 0), «+» (ασθενώς θετική, σκορ 1-3), «++» (θετική, σκορ 4-6), «+++» (έντονα θετικές, σκορ 7-9). Με βάση τα επίπεδα έκφρασης ARID1A, οι ασθενείς με γαστρικό καρκίνο χωρίστηκαν σε δύο ομάδες:. Αρνητικό ομάδα έκφρασης ARID1A (ARID1A-) και θετική ομάδα έκφρασης ARID1A (ARID1A +, ARID1A ++ ή ARID1A +++)

Έκφραση πλασμίδιο και παροδικές επιμολύνσεις

Ένα ευκαρυωτικό πλασμίδιο έκφρασης pCMV6-Έναρξη περιέχει το πλήρες μήκος του ανθρώπινου

ARID1A

cDNA ελήφθη από την Asbio Technology Company (Guangzhou, Κίνα). Άδειο φορέα χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος.