Abstract

καρκίνος

πνεύμονα ή πνευμονικό καρκίνωμα προέρχεται κυρίως από επιθηλιακά κύτταρα τα οποία είναι λεπτή και γραμμή για τα κυψελιδικά επιφάνειες του πνεύμονα για την ανταλλαγή αερίων. ANO1 /TMEM16A, αρχικά αναγνωρίστηκε από τα επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών, είναι ένα μέλος της Ca

2 + -ενεργοποιημένου Cl

– διαύλους (CaCCs) που λειτουργούν για να ρυθμίζουν την έκκριση των επιθηλιακών και τον όγκο των κυττάρων για τη συντήρηση των ιόντων και ομοιόσταση ιστού. ANO1 /TMEM16A έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι εκφράζεται υψηλά σε αρκετές επιθήλιο προήλθε καρκινώματα. Ωστόσο, ο ρόλος του ANO1 στον καρκίνο του πνεύμονα παραμένει άγνωστος. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η αναστολή του διαύλου χλωριούχου ασβεστίου που ενεργοποιείται ANO1 /TMEM16A καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου και εισβολή στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα. ANO1 ρυθμίζεται αυξητικά σε διαφορετικές καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου πνεύμονα. Χτύπημα κάτω ANO1 από μικρές RNAs φουρκέτα ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των GLC82 και NCI-H520 ακυρώσετε κύτταρα αξιολογήθηκαν από CCK-8, θα ήταν-ίασης, φρεατίων και μαλακό δοκιμασίες άγαρ 3D. ANO1 πρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε 77,3% των περιπτώσεων ανθρώπινου πνεύμονα ιστών αδενοκαρκινώματος ανιχνεύεται με ανοσοϊστοχημεία. Επιπλέον, η ανάπτυξη του όγκου σε γυμνά ποντίκια εμφυτεύθηκαν με κύτταρα GLC82 σημαντικά καταστέλλεται από ANO1 σίγηση. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας παρέχουν αποδείξεις ότι ANO1 υπερέκφραση συμβάλλει στην ανάπτυξη του όγκου και την εισβολή του καρκίνου του πνεύμονα? και καταστολή ANO1 υπερέκφραση μπορεί να έχει θεραπευτικές δυνατότητες στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Jia L, Liu W, Guan L, Lu Μ, Wang Κ (2015) Αναστολή των ενεργοποιημένων από ασβέστιο Χλωριούχο Κανάλι ANO1 /TMEM16A Καταστέλλει Tumor την ανάπτυξη και την εισβολή στο ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 10 (8): e0136584. doi: 10.1371 /journal.pone.0136584

Επιμέλεια: Shang-Zhong Xu, University of Hull, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 28, Απρ, 2015? Αποδεκτές: 5 του Αυγ, 2015? Δημοσιεύθηκε: 25 Αυγούστου του 2015

Copyright: © 2015 Jia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις έρευνας στην KWW από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας (2013CB531302 και 2014ZX09507003-006-004) και το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα ή πνευμονικό καρκίνωμα που προέρχεται από τα επιθηλιακά κύτταρα είναι γενικά κατηγοριοποιούνται σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Ως το πιο κοινό τύπο καρκίνου του πνεύμονα, NSCLC αντιπροσωπεύει το 84% των εκτιμώμενων περιπτώσεις με δύο μεγάλες υποκατηγορίες: αδενοκαρκίνωμα και το καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων [1]. Επί του παρόντος, η παθογένεια και η ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα δεν έχει καθοριστεί με σαφήνεια. Αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι τα κανάλια ιόντων διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και εισβολή, και στην οδήγηση εξέλιξης του καρκίνου σε όλα τα διαφορετικά στάδια [2, 3].

Οι δίαυλοι ιόντων είναι πόροι γεμάτη με νερό και διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που υπάρχουν στο όλα τα ζωντανά κύτταρα, που συμμετέχουν σε διάφορες φυσιολογικές δραστηριότητες αναπόσπαστο διεγερσιμότητα, συστολή, έκκριση, τον κυτταρικό κύκλο και μεταστατικών καταρράκτες [4, 5]. Κανονική έκφραση των διαύλων ιόντων είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση Ca

2 + και ιστών κατά τη διάρκεια της ομοιόστασης κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση μέσω διέπουν την κυτταρική ροές ιόντων, ρυθμίζοντας τον όγκο των κυττάρων, και παράγει δυναμικό μεμβράνης [6, 7]. κανάλια Chloride είναι σημαντικές για πολλές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της μεταφοράς των επιθηλίων για ροές ιόντων, ρύθμιση του όγκου των κυττάρων, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση [8, 9]. Σταθερό και σταθερό όγκο των κυττάρων και την ομοιόσταση ιόντων κατά τη διάρκεια πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων που απαιτούνται αυστηρά για τη λειτουργία των κυττάρων και την επιβίωση [10, 11]. Chloride ροή μέσω καναλιών χλωρίδιο σε απόκριση προς τη διόγκωση των κυττάρων είναι ένα από τα κρίσιμα μηχανισμούς με τους οποίους τα κύτταρα αποκατασταθεί ο όγκος τους ακόλουθους οσμωτική διαταραχές και άγχος που προκαλείται από την εντατική μεταβολικές δραστηριότητες προέκυψαν από το νερό, μη ηλεκτρολυτικές και ανταλλαγής ιόντων στις επιθηλιακές επιφάνειες [12-14]. Απορύθμιση της έκφρασης κανάλι ιόντων γίνεται επιγενετικώς ανώμαλη στα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα [15-17]. Για παράδειγμα, προς τα πάνω ρύθμιση του χλωριούχου ενδοκυτταρική κανάλι 1 (CLlC1) εμπλέκεται στη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου και εισβολής μέσω διαμεσολάβηση ρυθμιστικών μείωση του όγκου μηχανισμό (RVD) [18]? και η υπερέκφραση του channel3 χλωριδίου (ClC3) συμβάλλει σε πολλαπλούς ανθρώπινων καρκινωμάτων όπως γλοίωμα, πνεύμονα, μαστού, του τραχήλου της μήτρας και όγκους [19]. Έχει επίσης αναφερθεί ότι η αύξηση του ενδοκυτταρικού ασβεστίου που εμφανίζονται κατά υποτονικό πρόκληση σχετίζεται με RVD και εμπλέκονται με την απόπτωση καρκίνο, υποδεικνύοντας την αλληλεπίδραση μεταξύ ομοιόστασης ασβεστίου και της ομοιόστασης του όγκου [20, 21].

Ca

2 + -ενεργοποιημένου Cl

– κανάλια (CaCCs) είναι σημαντικοί ρυθμιστές της επιθηλιακής έκκρισης και της ρύθμισης του όγκου των κυττάρων [22, 23]. TMEM16A, επίσης γνωστή ως DOG1, ORAOV2, ή TAOS-2, ταυτοποιήθηκε από τα επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών ως καλόπιστη CACC που μεσολαβεί ενδογενής Ca

2 + -ενεργοποιημένου τρέχουσα χλωριούχο [24-26]. TMEM16A έχει επίσης αναφέρεται ως anoctamin 1 (ANO1) λόγω του ανιόντος επιλεκτικότητα και οκτώ (OCT) διαμεμβρανικών τμημάτων [25]. Η

ANO1 /TMEM16A

γονίδιο εντοπίζεται σε 11q13, μια από τις πιο συχνά ενισχυμένες περιοχές σε ανθρώπινους καρκίνους [27, 28] και σχετίζεται με κακή πρόγνωση [29]. Έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι ANO1 /TMEM16A ενισχύεται ή υπερεκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους όπως του γαστρεντερικού στρωματικών όγκων (GIST), ο καρκίνος του προστάτη, κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (HNSCC), ο καρκίνος του μαστού και του παχέος εντέρου κύτταρα [27, 30- 33]. ANO1 υπερέκφραση συσχετίζεται επίσης με κακή πρόγνωση των ασθενών HNSCC και καρκίνου του μαστού [30, 34], και φαρμακολογική αναστολή της δραστικότητας CACC ANO1 με CaCCinh-A01 και T16Ainh-A01 μπορούν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [32, 35, 36]. Αν και ο λόγος για την υψηλή έκφραση των ANO1 σε όγκους είναι ασαφής, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι ANO1 εμπλέκεται σε ογκογόνες σηματοδότηση ενεργοποιώντας οδούς EGFR και CaMK για την προώθηση του κυτταρικού κύκλου και την εξέλιξη του καρκίνου [30, 37]. Έχει αναφερθεί ότι ANO1-αλληλεπιδρώσες πρωτεΐνες όπως ρυθμιστικές πρωτεΐνες πρόσδεσης ακτίνης σηματοδότηση /ικριωμάτων εζρίνης, ραδιξίνη, μοεσίνη και RhoA μπορούν να συμμετέχουν στην ρύθμιση της λειτουργίας ANO1 [38, 39]. Πιο πρόσφατα, ANO1 και EGFR βρίσκονται να σχηματίσουν ένα λειτουργικό σύμπλεγμα που ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HNSCC [40]. Ωστόσο, αν ANO1 /TMEM16A παίζει ένα ρόλο στην γένεση του όγκου του καρκίνου του πνεύμονα παραμένει άγνωστη.

Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι CACC ANO1 είναι ιδιαίτερα ρυθμίζεται αυξητικά σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. ANO1 αυξητική ρύθμιση επιβεβαιώθηκε σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου πνεύμονα. Νοκ ντάουν της έκφρασης ANO1 από μικρή φουρκέτα RNA ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων GLC82 και NCI-H520. Αναστολή της ANO1 επίσης κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε γυμνά ποντίκια εμφυτεύθηκαν σταθερά επιμολυσμένα GLC82 κύτταρα. Τα ευρήματά μας παρέχουν ενδείξεις ότι η μεμβράνη ANO1 πρωτεΐνη μπορεί να χρησιμεύσει ως μια πιθανή βιοδεικτών και στόχος για τη διάγνωση και τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

2BS Κανονική πνεύμονα γραμμή , κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα Α549 και Η1299 ήταν δώρα από τον Dr. Hongti Jia στο Τμήμα Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Science Κέντρο Υγείας. Α549 και Η1299 κύτταρα αρχικά ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). κύτταρα 2BS αρχικά ελήφθησαν από το Εθνικό Ινστιτούτο Βιολογικών Προϊόντων (Πεκίνο, Κίνα). Lung καρκινικές κυτταρικές γραμμές GLC82 και Calu-3 για αδενοκαρκίνωμα και NCI-H520 για καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Τα κύτταρα 2BS καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Invitrogen, Carlsbad, USA), και τα άλλα κυτταρικές γραμμές πολλαπλασιάζονται εντός RPMI 1640 (Invitrogen). Το μέσο συμπληρώθηκε με 10% ορό εμβρύου μόσχου και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2.

shRNA επιμολύνσεις και δημιουργία σταθερών κυτταρικών γραμμών

ANO1 Τα siRNAs και κωδικοποιημένα shRNA πλασμίδια κατασκευάστηκε από GeneChem Co, Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Η Τα siRNAs κλωνοποιήθηκαν εντός των θέσεων BamHI και HindIII του pGCsi-U6 /Neo /GFP vecor, και η αλληλουχία βρόχο στο TTCAAGAGA χρησιμοποιήθηκε. Η αλληλουχία στόχος τριών ANO1 Τα siRNAs ήταν ως ακολούθως: shRNA1, CGTGTACAAAGGCCAAGTA? shRNA2, GCATCTATTTGACTTGTCT? shRNA3, CGAAGAAGATGTACCACAT. Η ομελέτα ακολουθία ήταν CGAGTGGTCTAGTTGAGAA. Για την επιμόλυνση, 8 μg DNA χρησιμοποιήθηκε ανά πλάκα 60 mm, με Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και μέσο διαμολύνσεως αντικαταστάθηκε με μέσο καλλιέργειας 4 ώρες μετά την επιμόλυνση. Όλα τα επόμενα πειράματα διεξήχθησαν σε 48-72 ώρες μετά την επιμόλυνση και επαναλαμβανόμενη εις τριπλούν. Για να δημιουργηθούν σταθερές GLC82 κυτταρική γραμμή που εκφράζει ANO1 shRNA, επιμολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν υπό 800 μg /ml G418.

Ανοσοϊστοχημική χρώση

χειρουργικά δείγματα ανθρώπινου καρκινικού ιστού που αποτελείται από 44 περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και 40 περιπτώσεις πλακώδους καρκινώματος πνεύμονα ελήφθησαν εκ των υστέρων από το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Τρίτο Νοσοκομείο. Τα δείγματα ιστών ήταν πλήρως απο-προσδιορίζονται πριν την πρόσβαση από εμάς και όλοι οι ασθενείς ενημερώθηκαν και συναινέσει για τη χρήση του αποκομμένου ιστού τους για μελλοντική έρευνα. Οι τομές ιστού επωάσθηκαν σε ξηρό θάλαμο στους 60 ° C για μια ώρα πριν απο-παραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο τρεις φορές και ενυδατωμένο μέσω διαβαθμισμένης σειράς αιθανόλης. Επεξεργασμένα σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 10 λεπτά, οι ιστοί στη συνέχεια βράζεται σε 10 mM κιτρικού διαλύματος ανάκτησης αντιγόνου (ρΗ 6.0) για 20 λεπτά χρησιμοποιώντας ένα φούρνο μικροκυμάτων. Ανοσοϊστοχημική χρώση (IHC) διεξήχθη με επώαση των ιστών με το πρωτογενές αντίσωμα να ANO1 (1: 100? Ab53212, Abcam) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από επώαση των ιστών με κατσίκας αντι-κουνελιού IgG-HRP επί 30 λεπτά στους 37 ° C, DAB σύστημα χρωμογόνου χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση. Βαθμολογίες υπολογίστηκαν με πολλαπλασιασμό της έντασης (ακέραιος αριθμός μεταξύ 0 και 3).

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές σε ρυθμιστικό φωσφορικών διάλυμα παγωμένο και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA με 1 Χ Αλτ φωσφατάση και πρωτεάση κοκτέιλ αναστολέα (Pierce, Rockford, IL). Τα δείγματα μετρήθηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας BCA πρωτεΐνης (Thermo Scientific, USA). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (50 μg) διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας PAGE (8%) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Μετά μπλοκαρίστηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS) που περιέχει 5% γάλα, η κηλίδωση μεμβράνη επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντι-ANO1 (1: 1000? Abcam) και κουνελιού αντι -β-ακτίνη (1: 500? Σάντα Cruz, CA). Η μεμβράνη επωάστηκε με ένα αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα lgG-HRP (1: 5000, Santa Cruz) για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και οπτικοποιούνται χρησιμοποιώντας το Immobilon Western HRP Substrate

πολλαπλασιασμός των κυττάρων CCK8 δοκιμασία

.

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με την κυτταρική Μετρώντας Kit-8 (Dojindo Laboratories, Japan). 500 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. 10 μΐ του διαλύματος Kit Καταμέτρηση κυττάρων προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο σε 24, 48, 72 και 96 ώρες μετά την seeded. Στη συνέχεια, οι πλάκες των 96 φρεατίων επωάστηκαν για 2 ώρες στους 37 ° C πριν μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα (OD) στα 450 nm με ένα αναγνώστη μικροπλάκας.

Colony δοκιμασία σχηματισμού σε καλλιέργεια

Για σχηματισμό αποικίας σε καλλιέργεια, τα επιμολυσμένα κύτταρα (που έλαβαν θεραπεία με 800 μg /ml G418 για 2 ημέρες μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση) απλώθηκαν σε 200 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων και επωάζονται σε μέσο RPMI-1640 που περιείχε 10% ορό εμβρύου μόσχου για 12-15 ημέρες. Οι υπόλοιπες αποικίες βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν, και οι εικόνες λήφθηκαν μετά από χρώση.

μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας δοκιμασία

δοκιμασία σχηματισμού αποικίας σε μαλακό άγαρ διεξήχθη σε ένα 6- φρεατίων. Το στρώμα βάσης έγινε με ανάμιξη 1,2% αγαρόζη (Invitrogen) και ισοδύναμο όγκο 2 χ μέσου με 20% FBS. Στη συνέχεια τα κύτταρα από κάθε ομάδα συλλέχθηκαν και αιωρήθηκαν σε μέσο που περιέχει 0,4% αγαρόζη και απλώθηκαν πάνω από το στρώμα βάσης σε τριπλούν σε πυκνότητα 3000 κυττάρων ανά φρεάτιο. Μετά από 30 ημέρες, οι κλώνοι παρατηρήθηκαν προφανώς και τα κύτταρα παγωμένο για τέσσερις ώρες, και στη συνέχεια χρωματίζονται με 0,02% κρυσταλλικό ιώδες. Εικόνες ελήφθησαν μετά από χρώση.

επούλωση πληγών δοκιμασία

Για να μετρηθεί η δραστικότητα μετανάστευσης, τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων, αναπτύχθηκαν σε 90% συρροή σε μέσο RPMI-1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. Στη συνέχεια, τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής αλλάζοντας το μέσο σε ορό ελεύθερο RPMI-1640 και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα ξύστηκαν με 100 μΙ άκρες πλαστική πιπέττα και πλύθηκαν με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα. Εικόνες συλλέχθηκαν κάθε 24 ώρες με ένα μικροσκόπιο ανεστραμμένης αντίθεσης φάσης (Olympus? Μεγέθυνση: 10 ×). Η αναλογία του υπόλοιπου χώρου του τραύματος υπολογίστηκε σε σχέση με την αρχική περιοχή του τραύματος και ομαλοποιήθηκε ως προς κωδικοποιημένα ομάδα ή DMSO ομάδα shRNA.

Transwell δοκιμασία

δραστικότητα κυττάρων εισβολή αξιολογήθηκε σε 8,0 μm μέγεθος πόρων transwell θάλαμοι πλάκα 24-ένθετο (Corning, Acton, ΜΑ, USA) επικαλύφθηκαν με BioCoatMatrigel (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ, USA). Μετά την προ-πεινασμένο για 24 ώρες με καλλιέργεια σε μέσο ελεύθερο ορού, 3X10

4 (NCI-H520) ή 5X10

4 κύτταρα (GLC82) ανά φρεάτιο απλώθηκαν στους άνω θαλάμους με μέσο χωρίς ορό και επωάστηκαν για 48 (NCI-H520) ή 72 (GLC82) ώρες. Τα χαμηλότερα θάλαμοι πληρώθηκαν με 10% μέσο εμβρυϊκό βόειο ορό. Μετά το σκούπισμα των κυττάρων μακριά από την άνω πλευρά του άνω θαλάμου, η κάτω πλευρά του άνω θαλάμου σταθεροποιήθηκε με μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλιο (ϋΑΡΙ? Sigma). Οι εικόνες φωτογραφήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο. Η περιοχή χρώση DAPI στον κάτω θάλαμο ομαλοποιήθηκε στα ανακατωμένα ομάδα shRNA ή ομάδα DMSO, δείχνει σχετική εισβολής του.

In vivo

ξενομόσχευμα ανάπτυξη του όγκου

αγοράστηκαν από το Τμήμα Εργαστήριο ζώων Επιστημών του Πανεπιστημίου του Κέντρου Επιστημών Υγείας του Πεκίνου, 5-εβδομάδων θηλυκά BALB /c ηυ /ηυ ποντικοί τέθηκαν σε καραντίνα για 1 εβδομάδα πριν από τη χρήση τους στη μελέτη. Ζώα (8 ζώα ανά κλωβό) στεγάστηκαν σε microisolat με ελεύθερη πρόσβαση σε τυπική τροφή τρωκτικών και νερό υπό συνθήκες ελεγχόμενης θερμοκρασίας (23 ± 2 ° C) σε 70% υγρασία [33]. Τα ζώα διατηρήθηκαν σε ένα κύκλο φωτός /σκότους αντίστροφης 12 h /12 h φως (τα φώτα άναβαν στις 7:00 ΠΜ). Τα πειραματικά πρωτόκολλα των ζώων εγκρίθηκαν από την χρήση και τη συντήρηση Επιτροπής Ζώων του Πανεπιστημίου του Πεκίνου και ήταν σύμφωνες με τους ηθικούς κανόνες. GLC82 σταθερά κύτταρα (1 χ 10

7 κύτταρα ανά ποντικό) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). κύτταρα GLC82 επιμολύνθηκαν με κωδικοποιημένα shRNA, ANO1 shRNA1 και ANO1 shRNA2, αντίστοιχα, και επιλέγονται από G418 για δύο εβδομάδες πριν από τη χρήση. κύτταρα GLC82 εμβολιάστηκαν υποδόρια στα δεξιά πρόσθιων των γυμνών ποντικών, και σε κάθε ομάδα χρησιμοποιήθηκαν οκτώ ζώα. Την 7η ημέρα μετά την ένεση, τα μεγέθη όγκων μετρήθηκαν κάθε 2-4 ημέρες για μια περίοδο 2 εβδομάδων και υπολογίζεται με (L x Π

2) /2 (L και W αντιπροσώπευε το μεγαλύτερο διαμήκη και εγκάρσια διάμετρο, αντίστοιχα ). Το τελικό σημείο των πειραμάτων ήταν την 19η ημέρα μετά την ένεση των κυττάρων GLC82 για να βεβαιωθείτε ότι μάζα του όγκου δεν παρεμβαίνει σημαντικά με τις κανονικές λειτουργίες του σώματος των ποντικών ή αιτία του πόνου. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με ενδοπεριτοναϊκή ένεση πεντοβαρβιτάλης (120 mg /kg) σε συνδυασμό με 0.25% λιδοκαΐνη πριν απομακρύνθηκαν όγκους. Εκπρόσωπος φωτογραφίες λήφθηκαν πριν ζυγίστηκαν όγκων με τη βοήθεια ηλεκτρονικών ισορροπία.

Η στατιστική ανάλυση

Η GraphPad Prism 5 χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± s.e.m. Του Student

t-test

χρησιμοποιήθηκε στην ανάλυση των δεδομένων των πειραμάτων κυτταρικής μεταξύ δύο ομάδων. Η ANOVA εφαρμόστηκε για την ανάλυση των επιπέδων πρωτεΐνης του ANO1 σε αρκετές κυτταρικές σειρές, και να συγκριθεί η διαφορά στην ανάπτυξη του όγκου. Για την ανάλυση των συλλογών ανθρώπινης παθολογικού ιστού, η Chi-square τεστ εκτελέστηκε. Η αξία των

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Η υπερέκφραση του ANO1 στο ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα ιστούς των πνευμόνων

Για να εξεταστεί η επίπεδο έκφρασης των πρωτεϊνών ANO1 χλωριούχου διαύλου ασβεστίου που ενεργοποιείται, χρησιμοποιήσαμε ANO1 αντίσωμα για ανοσοϊστοχημική χρώση και ανιχνεύεται έκφραση σε πνεύμονα ANO1 δείγματα παθολογικού ιστού από 84 ασθενείς. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1, ANO1 πρωτεΐνη εντόνως εκφρασμένα σε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, ενώ ιστοί από καλοήθεις κυψελίδες δίπλα σε καρκίνωμα και το καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων έδειξε αρνητική χρώση του ANO1. Η ανάλυση των ανοσοϊστοχημική χρώση αποκάλυψε ότι η έκφραση πρωτεΐνης ANO1 ήταν θετική σε 34 από 44 (77,3%) δείγματα πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου ιστού (Πίνακας 1). Σε δείγματα ιστών από πλακώδες καρκίνωμα πνεύμονα, 6 από 40 (15%) βάφτηκαν ANO1 θετικές. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ANO1 πρωτεΐνη υπερεκφράζεται στην ογκογένεση του καρκίνου του ανθρώπινου πνεύμονα και ειδικότερα, το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα.

(Α) Καλοήθης κυψελίδες γειτονικά καρκίνωμα που δείχνει αρνητική χρώση ANO1. (Β) καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα δείχνει αρνητική χρώση ANO1. (C) Ανθρώπινο πνευμονικό αδενοκαρκίνωμα καρκινικό ιστό που δείχνει χρώση ANO1 (καφέ χρώμα) των νεοπλασματικών επιθηλίου. Η γραμμή κλίμακας δείχνει 50 μm.

Η

Προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης ANO1 σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα

Χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία, την αρχική μας διαπίστωση αποκάλυψε ότι ANO1 υπερεκφράστηκε σε καρκίνο ανθρώπινου πνεύμονα ιστών ειδικά σε αδενοκαρκίνωμα. Για να επιβεβαιωθεί η ανοσοϊστοχημική εύρημα και να εξακριβώσει αν ANO1 επίσης ρυθμίζεται αυξητικά σε διαφορετικές παθολογικές μορφές του καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών, επιλέξαμε και δοκιμάζονται 6 διαφορετικές κυτταρικές σειρές που περιλαμβάνουν τα κύτταρα 2BS για φυσιολογικό ανθρώπινο πνεύμονα κυτταρική γραμμή, GLC82 και Calu-3 κύτταρα για αδενοκαρκίνωμα , κύτταρα NCI-H520 για καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, και Α549 και Η1299 κυττάρων για ανεπιβεβαίωτες τύπο του καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 2). Πρωτεΐνες που εξάγεται από 2BS, NCI-H520, GLC82, Calu-3, Α549 ή Η1299 κύτταρα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα υπό αποδιατακτικές συνθήκες και ανιχνεύθηκαν με ειδικό αντίσωμα ANO1. Όπως φαίνεται στο κάτω τμήμα του Σχ 2, ποσοτική ανάλυση του επιπέδου έκφρασης πρωτεΐνης ANO1 έδειξαν μία ανύψωση περίπου 2.8-φορές σε NCI-H520, 6.9-φορές σε GLC82, 6.3-φορές σε Calu-3, 3.1 φορές σε Α549 και 8.0 φορές σε σε Η1299, σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα 2BS. Η αύξηση GLC82, Calu-3 και τα κύτταρα Η1299 ήταν στατιστικά σημαντική, αλλά όχι για NCI-H520 και κυττάρων Α549 (Ρ = 0.149 και Ρ = 0.238, αντίστοιχα), αν και υπήρχε μία τάση αύξησης στην έκφραση ANO1. Αυτό το αποτέλεσμα είναι συνεπές με την ανοσοϊστοχημική ανάλυση καρκινικών ιστών του πνεύμονα ελήφθησαν από ασθενείς (Πίνακας 1), επιβεβαιώνοντας περαιτέρω ότι η έκφραση ANO1 είναι υψηλότερη σε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα GLC 82 κύτταρα από καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων HCI-H520. Οι GLC82 και NCI-H520 κύτταρα που είχαν διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών ANO1 επιλέχθηκαν για περαιτέρω έρευνες

Επάνω πίνακας:. Αντιπροσωπευτική western blot εικόνες της έκφρασης ANO1 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές πνεύμονα. Κάτω πίνακα: στατιστική ανάλυση γράφημα bar (n = 3) των σχετικών επιπέδων ANO1 σε NCI-H520, GLC82, Calu-3, Α549 και κυτταρικές σειρές Η1299 (σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα 2BS). Η έκφραση του ANO1 κανονικοποιήθηκε με το επίπεδο έκφρασης του β-ακτίνης. ANO1 σημαντικά υπερεκφράζεται σε GLC82, Calu-3 και Η1299 κυτταρικές σειρές. Η στατιστική σημαντικότητα με ANOVA δίνεται ως *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01 και ***

σ

& lt? 0.001. Όλα τα δεδομένα δείχνονται ως μέση τιμή ± sem

Η

Αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων GLC82 και NCI-H520 με φίμωση ANO1

Για την αξιολόγηση του βιολογικού ρόλου της ANO1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα, χρησιμοποιήσαμε Τα siRNAs να knockdown την έκφραση ANO1 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Η αποτελεσματικότητα των τριών Τα siRNAs αξιολογήθηκε με στύπωμα Western σε GLC82 και NCI-H520 καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα. Σε σύγκριση με την επιμόλυνση του κωδικοποιημένα shRNA, ANO1 shRNA1 επιμόλυνσης ήταν πιο αποτελεσματική στην αποσιώπηση ενδογενούς έκφρασης των πρωτεϊνών ANO1 στα δύο κύτταρα GLC82 και NCI-H520 (Εικόνα 3Α) και έτσι χρησιμοποιήθηκε για το υπόλοιπο των πειραμάτων.

(Α) RNAi knockdown έκφρασης πρωτεΐνης ANO1 σε ANO1 κύτταρα που εκφράζουν δείχθηκε με εικόνες κηλίδος Western. Οι πρωτεΐνες της μεμβράνης εκχυλίζονται από κύτταρα GLC82 και NCI-H520 την 3η ημέρα μετά την επιμόλυνση διαφόρων ANO1 Τα siRNAs (shRNA1, shRNA2 και shRNA3) ανοσοστυπώθηκαν με ANO1 αντίσωμα. ANO1 shRNA1 έδειξε την πλέον αποτελεσματική αναστολή της έκφρασης ANO1, σε σύγκριση με τα άλλα δύο Τα siRNAs και το ανακατωμένο shRNA. τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Β) GLC82 ή NCI-H520 εκτιμήθηκε με δοκιμασία CCK8 με βάση το εξωκυτταρικό μείωση του WST8 του NADH που παράγονται στα μιτοχόνδρια. Χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας, ο αριθμός των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με τη μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm. Η επιμόλυνση του ANO1 shRNA1 οδήγησε σε σημαντική αναστολή της κυτταρικής βιωσιμότητας GLC82 και NCI-H529 σε χρονο-εξαρτώμενο τρόπο σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με περιπλεγμένο shRNA (n = 6). (C) Cell πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκινώματος αξιολογήθηκε με την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας σε καλλιέργεια υπό την παρουσία ANO1 shRNA1. Ποσοτική ανάλυση της ομάδας σιγαστήρα ANO1 έδειξε λιγότερο γένεση αποικιών, σε σύγκριση με τα ανακατωμένα ομάδα shRNA (n = 3). Αντιπροσωπευτικές εικόνες έδειξαν παρακάτω ιστογράμματα. (D) RNAi του ANO1 αναστέλλει την κλωνογονικότητας κυττάρων GLC82 σε μαλακό άγαρ (n = 3). NCI-H520 απέτυχε να σχηματίσει αποικίες σε μαλακό άγαρ. Η στατιστική σημαντικότητα από Φοιτητών

t-test

υποδεικνύεται ως *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01 και ***

σ

& lt? 0.001. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± s.e.m.

Η

Για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα και τον πολλαπλασιασμό, πραγματοποιήσαμε ποσοτικό προσδιορισμό του πολλαπλασιασμού των κυττάρων χρησιμοποιώντας κύτταρα CCK8 GLC82 και NCI-H520. Όπως φαίνεται στο Σχ 3Β, φίμωση ANO1 επιβραδυνθεί σημαντικά την ανάπτυξη του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα GCL82 και πνεύμονα πλακώδους καρκινώματος κύτταρα NCI-H520. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων GLC82 αναστάλθηκε σε χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο από 89,1% την ημέρα 2, 81,6% κατά την ημέρα 3 έως 75,0% την ημέρα 4. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων NCI-H520 ανεστάλη επίσης από 89,0% την ημέρα 2, 75,3% την ημέρα 3 να 71,7% την ημέρα 4. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αυτών των αποτελεσμάτων, χρησιμοποιήθηκαν δύο δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας τόσο δίσκο καλλιέργειας και μαλακό άγαρ. Όπως φαίνεται στο Σχ 3C, φίμωση ANO1 οδήγησε σε μείωση του σχηματισμού αποικιών 36,2% σε GLC82 κύτταρα και% σχηματισμού αποικίας 30.7 σε κύτταρα NCI-H520, σε σύγκριση με κωδικοποιημένα ελέγχου shRNA. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η επίδραση της αποσιώπησης ANO1 επί του πολλαπλασιασμού, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία σχηματισμού αποικίας μαλακό άγαρ που παρακολουθεί ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων. κύτταρα GLC82 θα μπορούσε να σχηματίσει αποικίες σε μαλακό άγαρ σε τριάντα ημέρες, αλλά τα κύτταρα NCI-H520 απέτυχε να σχηματίσει αποικίες. Όπως φαίνεται στο Σχ 3D, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε επεξεργασία με GLC82 ANO1 shRNA ήταν σημαντικά αναστέλλεται σε σύγκριση με την ομάδα περιπλεγμένο shRNA. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η φίμωση ενδογενούς ANO1 μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των GLC82 και NCI-H520 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Μείωση της μετανάστευσης και της εισβολής των κυττάρων GLC82 και NCI-H520 με φίμωση ANO1

Για τη διερεύνηση της μετανάστευσης του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε δοκιμασία επούλωση της πληγής που αξιολογεί το κλείσιμο του τραύματος. Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα φυτεύτηκαν σε μια πλάκα έξι φρεατίων μέχρι 90% συρροή πριν από την νηστεία για 24 ώρες. Η κυτταρική στιβάδα τραυματίστηκε προσεκτικά με στείρα συμβουλές, επωάστηκαν με μέσο χωρίς ορό. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Α και 4Β, επιμόλυνση GLC82 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα με ANO1 shRNA ανέστειλε την πληγή πλήρωσης περίπου 66,8% στις 24 ώρες, 67.5% στις 48 ώρες και 74.3% σε 72 ώρες, σε σύγκριση με τα ανακατωμένα shRNA. Σε NCI-H520 καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα (Σχ 4C και 4D), η επούλωση πληγών στην ομάδα knockdown ANO1 ήταν μόνο περίπου 29,1% στις 24 ώρες και 27.6% στις 48 ώρες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου περιπλεγμένο shRNA. Στις 48 ώρες, η επούλωση της πληγής ήταν σχεδόν πλήρης στην ομελέτα ομάδα ελέγχου shRNA. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενδογενής ANO1 προάγει μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, και φίμωση ANO1 αναστέλλει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα.

Η μετανάστευση των κυττάρων και GLC82 ΝΟΙ-H520 επιμολυσμένα με ANO1 shRNA1 ή ομελέτα shRNA εκτιμήθηκε με προσδιορισμό επούλωσης τραύματος . Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα φυτεύτηκαν σε μια πλάκα έξι φρεατίων μέχρι 90% συρροή και κατόπιν στερήθηκαν για 24 ώρες. Η κυτταρική στιβάδα τραυματίστηκε προσεκτικά με αποστειρωμένη άκρες, και επωάστηκαν με μέσο χωρίς ορό. (Α) φωτεινές εικόνες τομέα της πληγής στα χρονικά σημεία 0 ώρες, 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες (GLC82) έχουν δείξει υπό χαμηλή μεγέθυνση. (Β) Ποσοτικοποίηση για την αλλαγή στην επούλωση της πληγής των κυττάρων GLC82 είχε εμφανιστεί σε γράφημα γραμμής και κανονικοποιημένο σε κωδικοποιημένα ομάδα shRNA. (C) Φωτογραφίες του NCI-H520 πείραμα επούλωση της πληγής σε 0 h, παρουσιάστηκαν 24 ώρες και 48 ώρες. (D) Γραμμή γράφημα των κυττάρων NCI-H520 δείχνει κυτταρική μετανάστευση που αναστέλλεται από ANO1 shRNA1 knockdown (n = 3). Η στατιστική σημαντικότητα (Μαθητή

t-test

) υποδεικνύεται ως *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01 και ***

σ

& lt? 0.001. Όλα τα δεδομένα δείχνονται ως μέση τιμή ± s.e.m.

Η

Το πιο απειλητική χαρακτηριστικό της κακοήθειας στον καρκίνο του πνεύμονα είναι το δυναμικό για εισβολή και μεταστάσεις. Να εξετάσει περαιτέρω κατά πόσον φίμωση ANO1 επίσης επηρεάζει την κυτταρική διείσδυση, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία φρεατίων. Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση με ANO1 shRNA1 ή ομελέτα shRNA, GLC82 και τα κύτταρα NCI-H520 στερήθηκαν για 24 ώρες πριν από την περαιτέρω επώαση στον άνω θάλαμο. Μετά από 48 ώρες επώασης για τα κύτταρα NCI-H520 ή 72 ώρες επώασης για GLC82 κύτταρα, κύτταρα εισβάλλουν εντός του κατώτερου θαλάμου σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με DAPI. Όπως φαίνεται στο σχήμα 5, η πιθανή εισβολή των κυττάρων του όγκου ήταν δραματικά καταστέλλεται από ANO1 knockdown. Η περιοχή της ANO1 σιγήσει GLC82 κύτταρα που πέρασε από την άνω βουλή ήταν μόνο 4,0% της ομάδας ομελέτα shRNA (Σχήμα 5Α και 5Β). Όπως φαίνεται στο Σχ 5C και 5D, η σχετική επιφάνεια transwell των ANO1 knockdown σε κύτταρα NCI-H520 ήταν 12,2%, σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο shRNA. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι φίμωση ANO1 αναστέλλει τη μετανάστευση και εισβολή του καρκίνου του πνεύμονα GLC82 και τα κύτταρα NCI-H520.

GLC82 και NCI-H520 κύτταρα στερήθηκαν για 24 ώρες πριν από επωάζεται στον άνω θάλαμο με φίλτρα transwell Matrigel. Μετά από 48 ώρες (NCI-H520) ή 72 ώρες (GLC82), κύτταρα εισβάλλουν εντός του κατώτερου θαλάμου σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με DAPI. (Α) Εικόνες αντιπροσωπεύουν μικροσκοπικά πεδία των εισβάλλοντας GLC82 κύτταρα. (Β) Η εισβολής των κυττάρων που εκφράζουν ANO1 shRNA 1 ή ομελέτα shRNA ποσοτικά με λεκιασμένη περιοχή της εισβολής GLC82 κυττάρων. Η περιοχή εισβολή κανονικοποιούνται σε κωδικοποιημένα ομάδα shRNA. (C) Εκπρόσωπος φωτογραφίες των κυττάρων NCI-H520 εισέβαλαν μέσα από τα φίλτρα Matrigel φρεατίων. (D) Μπαρ συνομιλία κυττάρων NCI-H520 δείχνει τη μείωση του κυτταρικού εισβολής ANO1 shRNA1 knockdown (n = 3). Η στατιστική σημαντικότητα από Φοιτητών

t-test

υποδεικνύεται ως *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01 και ***

σ

& lt? 0.001. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± sem

Η

Καταστολή της ανάπτυξης ξενομοσχευμάτων όγκου σε γυμνούς ποντικούς με ANO1 knockdown

Για να διερευνηθεί η επίδραση της ANO1 knockdown επί της ανάπτυξης όγκου ξενομοσχεύματος

in vivo

, τρεις ομάδες κυττάρων GLC82 ατομικά επιμολυσμένα με ANO1 shRNA1, ANO1 shRNA2 και κωδικοποιημένα τα siRNAs, και νοκ ντάουν αποτελεσματικότητά τους επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western πριν από την ένεση για σχηματισμό ξενομοσχεύματος όγκου σε ποντικούς (Σχήμα 6Α). Εμείς εγχέονται 10

7 GLC82 κύτταρα ανά ποντικό σε δικαίωμα πρόσθιων 5 εβδομάδων γυμνά ποντίκια σε τέσσερις ομάδες για σχηματισμό ενός ξενομοσχεύματος όγκου. Το μέγεθος των όγκων μετρήθηκε πρώτα 7 ημέρες μετά την ένεση (ως ημέρα 0). Όπως φαίνεται στο σχήμα 6Β και 6C, ANO1 σίγηση οδήγησε σε σημαντική μείωση της ανάπτυξης του όγκου κατά 68,8% στην ομάδα shRNA1 και 42,1% στην ομάδα shRNA2, αντίστοιχα, σε σύγκριση με την ομάδα στο περιπλεγμένο την παρατήρηση του την ημέρα 12. Την ημέρα 12, οι όγκοι αφαιρέθηκαν από τα ποντίκια και σταθμίζονται. Μια αξιοσημείωτη μείωση του βάρους του όγκου σε ομάδες ANO1 shRNA παρατηρήθηκε (Σχ 6D και 6Ε). Σε σύγκριση με τον έλεγχο ομελέτα shRNA, το μέσο βάρος του όγκου των ANO1 shRNA1 και shRNA2 ομάδες ήταν περίπου 38,7% και 70,1%, αντίστοιχα (Σχήμα 6D και 6Ε). Περαιτέρω ανοσοϊστοχημική χρώση του ANO1 σε ξενομοσχεύματος όγκου επιβεβαίωσαν ότι η μείωση των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης ANO1 ήταν σύμφωνο με τον όγκο του όγκου στις ομάδες που θεραπεύτηκαν με ANO1 Τα siRNAs με διαφορετική ισχύ και στην ομάδα ελέγχου (Σχήμα 6F και 6G). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ANO1 φίμωση όχι μόνο αναστέλλει τη μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, αλλά επίσης καταστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου.

κύτταρα Κανονική GLC82 ή σταθερά κύτταρα που εκφράζουν GLC82 ANO1 shRNA 1, ANO1 shRNA 2 και κωδικοποιημένα shRNA εμβολιάστηκαν υποδερμικά στα δεξιά πρόσθιων 5 εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών (1×107 κύτταρα ανά ποντικό). (Α) ανάλυση Western των νοκ ντάουν απόδοσης για άγριου τύπου GLC82 κύτταρα και κύτταρα GLC82 σταθερή εκφράζουν ομελέτα shRNA, ANO1 shRNA 1 και ANO1 shRNA 2. (Β) αντιπροσωπευτική εικόνα των γυμνών ποντικών που φέρουν GLC82 εμφυτευθεί όγκοι σε τέσσερις ομάδες: κενή ομάδα (n = 7), ως κωδικοποιημένο ομάδα shRNA (n = 8), την ομάδα ANO1 shRNA1 (n = 8) και ANO1 shRNA2 ομάδα (n = 8). (Γ) Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε 2-4 ημέρες με Vernier δαγκάνα κατά την ανάπτυξή του, από την 7η ημέρα μετά την ένεση. Η ανάπτυξη των όγκων που εκφράζουν ANO1 shRNA1 και ANO1 shRNA2 ήταν σημαντικά ανέστειλε με τρόπο που εξαρτάται από το χρόνο, σε σύγκριση με την ομάδα περιπλεγμένο shRNA. (D) Αντιπροσωπευτική εικόνα όγκων συλλέχθηκαν από ποντίκια την 12η ημέρα της γενιάς. (Ε) Οι όγκοι ζυγίστηκαν και αναλύθηκαν μετά από χειρουργική αφαίρεση. Συγκρίνοντας με τα ανακατωμένα όγκους shRNA, ANO1 Τα siRNAs όγκοι ήταν ελαφρύτερο. Η στατιστική σημαντικότητα (ANOVA) παρουσιάζεται ως *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01 και ***

σ

& lt? 0.001. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± s.e.m. (F) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του ανοσοϊστοχημική χρώση της έκφρασης ANO1 σε ιστούς ξενομοσχεύματος όγκου. (G) Ανάλυση της έκφρασης ANO1 σε ιστούς όγκων ξενομοσχεύματος διεξήχθη με σκορ 0-3 ανάλογα με την ένταση και την έκταση της χρώσης.

Η

Συζήτηση

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί κατά πόσο Ca

2 + -ενεργοποιημένου Cl

– κανάλι (CACC) ANO1 ή TMEM16A, αρχικά προσδιορίζεται από τα επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών, εμπλέκεται στην εξέλιξη των μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα, που είναι χαρακτηριστικό των επιθηλιακών πνεύμονα του καρκίνου.

σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι ANO1 είναι ιδιαίτερα υπερεκφράζεται σε αρκετές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και δείγματα ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος ιστών. Αποσιώπηση ANO1 καταστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή, και την ανάπτυξη των εμφυτευμένων όγκων.