Αφηρημένο

Έχουμε αποδείξει ότι ο αποκλεισμός CXCR4 μπορεί να είναι ένα ισχυρό αντι-μεταστατική θεραπεία για CXCR4 που σχετίζονται με τον καρκίνο του στόματος. Ωστόσο, όπως CXCR4 ανταγωνιστές είναι σε κλινική χρήση για την επαγωγή της κινητοποίησης των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων, η συνεχής χορήγηση ως αναστολέας για την μετάσταση μπορεί να οδηγήσει σε επίμονη λευκοκυττάρωση. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την νέα θεραπευτική κατάντη στόχου (ων) του συστήματος SDF-1 /CXCR4, χρησιμοποιώντας B88-SDF-1 κύτταρα, τα οποία έχουν ένα αυτοκρινή /σύστημα SDF-1 CXCR4 και εμφανίζουν μακρινό μεταστατικό δυναμικό

στο vivo

. ανάλυση μικροσυστοιχιών αποκάλυψε ότι 418 γονίδια ρυθμίζεται προς τα πάνω στο B88-SDF-1 κύτταρα. Έχουμε εντοπίσει ένα γονίδιο που ρυθμίζεται προς τα πάνω είναι ιδιαίτερα σε κύτταρα 1 B88-SDF-, μεταβοτροπικού υποδοχέα γλουταμικού 5 (mGluR5), η οποία ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά από θεραπεία με 1,1 ‘- [1,4-φαινυλενοδισ (μεθυλενο)] δις-1,4 , 8,11-τετρα octahydrochloride (AMD3100), ένας ανταγωνιστής CXCR4. Η ρύθμιση προς τα άνω του mGluR5 mRNA στο σύστημα SDF-1 /CXCR4 ήταν κυρίως ρυθμίζεται από τη Ras-εξωκυτταρικό σήμα κινάση ρυθμιζόμενη (ERK) 1/2 οδό. Επιπλέον, η ανάπτυξη του B88-SDF-1 κύτταρα δεν επηρεάστηκε από τον αγωνιστή mGluR5 (S) -3,5-DHPG (DHPG) ή οι ανταγωνιστές του mGluR5 2-μεθυλ-6- (φαινυλαιθυνυλ) πυριδίνη (ΜΡΕΡ) και 3- ((2-μεθυλο-1,3-θειαζολ-4-υλ) αιθυνυλ) πυριδίνη (Mtep). Ωστόσο, παρατηρήσαμε ότι DHPG προωθείται B88-SDF-1 κυτταρική μετανάστευση, ενώ τόσο MPEP και Mtep ανέστειλε B88-SDF-1 κυτταρική μετανάστευση. Για την εκτίμηση της τοξικότητας του φαρμάκου, οι ανταγωνιστές εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς σε ανοσοεπαρκείς ποντικούς για 4 εβδομάδες. Ποντικοί ενέθηκαν με ΜΡΕΡ (5 mg /kg) και Mtep (5 mg /kg) δεν παρουσίασαν παρενέργειες, όπως hematotoxicity, αλλεργικές αντιδράσεις ή απώλεια βάρους. Η χορήγηση ανταγωνιστών ανέστειλε σημαντικά την μετάσταση των κυττάρων B88-SDF-1 στους πνεύμονες γυμνών ποντικών. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή mGluR5 με ανταγωνιστές, όπως MPEP και Mtep θα μπορούσε να αποτρέψει τη μετάσταση στο CXCR4 που σχετίζονται με τον καρκίνο του στόματος χωρίς να προκαλεί παρενέργειες

Παράθεση:. Kuribayashi Ν, Uchida D, Kinouchi Μ, Takamaru Ν, Tamatani Τ, Nagai Η, et al. (2013) Ο ρόλος των Μεταβοτροπικοί υποδοχέα 5 γλουταμικού για την στρωματικά που προέρχεται από κύτταρα Factor-1 /Σύστημα CXCR4 σε καρκίνο του στόματος. PLoS ONE 8 (11): e80773. doi: 10.1371 /journal.pone.0080773

Επιμέλεια: Α Ε Μ Ruhul Amin, Winship Cancer Institute του Πανεπιστημίου Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Ιουλ 2013? Αποδεκτές: 6, Οκτωβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Νοεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Kuribayashi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση-in-ενισχύσεις για Νέους επιστήμονες (Β? 24.792.225? https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/grants01.html). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Δείξαμε προηγουμένως ότι B88 κυττάρων, τον καρκίνο του στόματος κύτταρα που εκφράζουν τον υποδοχέα χημειοκινών CXCR4, συγκεκριμένα. μεταστάσεις σε τραχηλικούς λεμφαδένες μέσω στρωματικών κυττάρων προερχόμενο παράγοντα (SDF) -1 κλίση που παράγεται από το λεμφικό στρώμα [1-3]. Η αναγκαστική-έκφραση του SDF-1 σε B88 κύτταρα (ονομάζονται κύτταρα 1 B88-SDF-) ανατίθενται αυξημένη κυτταρική κινητικότητα και τις μεταστάσεις στους πνεύμονες μετά από ενδοφλέβια εμβολιασμό [4]. Πρόσφατα, αποδείξαμε επίσης ότι η έκφραση CXCR4 συμβάλλει στην μεταστατικό δυναμικό των σιελογόνων αδένων καρκίνων [5]. Επιπλέον, έχουμε επίσης καταδείξει ότι δέσμευση CXCR4 με 1,1 ‘- [1,4-φαινυλενοδισ (μεθυλενο)] δις-1,4,8,11-τετρα octahydrochloride (AMD3100), ένας ανταγωνιστής CXCR4, μπορεί να είναι ένα ισχυρό αντι -metastatic θεραπεία για το κεφάλι CXCR4 που σχετίζονται με τον καρκίνο του τραχήλου και [5,6].

SDF-1 σύστημα /CXCR4 κυρίως λειτουργεί ως χημειοτακτικός παράγοντας σε καρκινικά κύτταρα για να φτάσει μεταστατικές θέσεις. Ωστόσο, προκειμένου να καθοριστεί η μετάσταση, αρκετές σημαντικές διεργασίες, όπως εισβολή, ενδαγγείωση, εξαγγείωση και έκτοπη δυναμικό ανάπτυξης, είναι απαραίτητα. Έτσι, είναι ζωτικής σημασίας να διερευνηθεί η λειτουργία του κατάντη στόχου (ων) υπεύθυνη για τη σύσταση της μετάστασης σε SDF-1 σύστημα /CXCR4. Επιπλέον, πρόσφατες κλινικές δοκιμές έχουν δείξει ότι μία μόνο χορήγηση του AMD3100 είναι αποτελεσματική στην κινητοποίηση αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων, παρά το γεγονός ότι AMD3100 απομακρύνεται γρήγορα με εκτιμώμενη κατανομή χρόνου ημίσειας ζωής του 0,3 ώρες και τελική ημιζωή του 5,3 ωρών [7, 8]. Ωστόσο, η αποτελεσματική CXCR4 που σχετίζονται με αντι-μεταστατική θεραπείες μπορεί να απαιτούν την ημερήσια χορήγηση για την πρόληψη AMD3100 συνεχώς τη μετανάστευση των κυττάρων σε προ-μεταστατικούς μεταστατικές θέσεις, η οποία μπορεί να προκαλέσει χρόνια λευκοκυττάρωση. Εάν εντοπίστηκαν ο μεταγενέστερος γονίδιο (ες) στόχος του SDF-1 σύστημα /CXCR4 ειδικά εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα, αναμένεται ότι τα αντι-μεταστατική θεραπεία θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί με μεγαλύτερη ασφάλεια και αποτελεσματικότητα. Ωστόσο, το γονίδιο (α) στόχος του SDF-1 σύστημα /CXCR4 δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Έτσι, σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την νέα θεραπευτική κατάντη στόχου (ων) του συστήματος SDF-1 /CXCR4 σε κύτταρα B88-SDF-1, που έχουν ένα αυτοκρινή /σύστημα SDF-1 CXCR4 και εμφανίζουν μακρινή μεταστατικό δυναμικό in vivo, χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες cDNA [4].

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Τα ποντίκια αντιμετωπίζονται σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Πανεπιστημίου της Τοκουσίμα (Αριθμός Άδειας: 10084). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

cDNA μικροσυστοιχιών ανάλυση

Το συνολικό RNA για ανάλυση cDNA μικροσυστοιχιών εξήχθη από B88-mock κύτταρα στερούνται ορού και τα κύτταρα B88-SDF-1. Η Applied Biosystems χημιφωταύγειας RT-IVT Labeling Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για να μετατρέψει το συνολικό RNA σε διγοξιγενίνη (DIG) -σημασμένου cRNA. Ένα μg ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία του διπλού κλώνου cDNA. Το cDNA μεταγράφηκε με DIG-σημασμένων νουκλεοτιδίων (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland), κατακερματισμένη και υβριδοποιήθηκε σε Ανθρώπινου Γονιδιώματος Έρευνα Array (Life Technologies) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από πλύσιμο κάθε συστοιχία, το σήμα αναπτύχθηκε με τη χρήση ενός κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Life Technologies). Επεξεργασμένα συστοιχίες σαρώθηκαν με ένα χημιφωταύγειας αναλυτή μικροσυστοιχία 1700 (Life Technologies). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση του GeneSpring GX 12.5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) και την εφευρετικότητα Ανάλυση Pathway (ΜΠΒ? Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com, Redwood City, CA), το λογισμικό. Λειτουργική ανάλυση του ΜΠΒ προσδιορίζονται βιολογικές λειτουργίες ή ασθένειες που ήταν πιο σημαντικό για το σύνολο δεδομένων. exact test Fischer χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό μιας ρ-τιμή προσδιορισμό της πιθανότητας ότι κάθε βιολογική λειτουργία ή ασθένεια που διατίθενται για το σύνολο δεδομένων οφειλόταν στην τύχη και μόνο. Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών πρώτες κατατεθεί στη γονιδιακή έκφραση Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) σύμφωνα με τις ελάχιστες πληροφορίες σχετικά με το πείραμα μικροσυστοιχιών (MIAME) κατευθυντήριες γραμμές. Ο αριθμός ένταξη είναι GSE50507.

Κύτταρα και κυτταρική καλλιέργεια

B88 κύτταρα αρχικά ιδρύθηκε από έναν ασθενή με καρκίνο του γλώσσα [1] και θεωρείται απαλλαγμένη από μυκόπλασμα και βακτηριακά μολυσματικά. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε Μέσο Eagle Τροποποιημένο Μέσο (DMEM? Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS), 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, και 100 U /mL πενικιλίνη σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95 % αέρα και 5% CO2 στους 37 ° C

δοκιμασία Γλουταμινικό

Ένα σύνολο από 5 x 10

6 κύτταρα, σπάρθηκαν σε δίσκους των 100 mm (Falcon?. Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA). Μέσο αντικαταστάθηκε με ϋΜΕΜ χωρίς L-γλουταμίνη και FCS μετά από 24 ώρες. Μετά επιπλέον καλλιέργεια 24 ώρες, το ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε και 100 μΐ αναλύθηκε με ένα Amplex® Red Γλουταμικό Οξύ /γλουταμικό Οξειδάσης Assay Kit (ϋίβ Technologies) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο φθορισμός μετρήθηκε με ένα Varioskan Flash Πολύτροπες Reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) με 530 nm διέγερση και 590 nm ανίχνευση φθορισμού.

Ποντίκια και in vivo μελέτη

C3H /HeN ποντίκια και BALB /c γυμνά ποντίκια αγοράστηκαν από CLEA Japan (Osaka, Japan) και διατηρήθηκαν υπό συνθήκες χωρίς παθογόνα. Στην πειραματική χημειοθεραπεία, ποντικοί C3H /HeN χρησιμοποιήθηκαν ως ποντίκια ανοσοεπαρκείς ελέγχου [9], και υπέστησαν αγωγή ημερησίως είτε με υποδόριες (sc) ενέσεις AMD3100 (2,5 mg /kg? Sigma) [5,6] ή ενδοπεριτοναϊκές (ίρ) ενέσεις από 2-μεθυλ-6- (φαινυλαιθυνυλ) πυριδίνη (5 mg /kg? MPEP? Tocris Bioscience, Bristol, UK) [10], 3 – ((2-μεθυλο-1,3-θειαζολ-4-υλ) αιθυνυλ ) πυριδίνη (5 mg /kg? Mtep? Calbiochem, San Diego, CA, USA) [10], ή ο ίδιος όγκος φυσιολογικού ορού. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με AMD3100 θυσιάστηκαν κατά την ημέρα 1, 14 και 28, και τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με MPEP ή Mtep θυσιάστηκαν κατά την ημέρα 1, 7, 14, 21, και 28. Όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν με αφαίμαξη υπό αναισθησία με πεντοβαρβιτάλη νατρίου και ένα πλήρες αίμα μετράνε εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα ADVIA120 (Siemens Healthcare Diagnostics KK, Τόκιο, Ιαπωνία) σε Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. (Tokyo, Japan). Για τη δοκιμασία μετάστασης, 1 χ 10

6 B88-SDF-1 κύτταρα εμβολιάσθηκαν ενδοφλεβίως (i.v.) πριν από τη θεραπεία με παράγοντες. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν 30 ημέρες μετά τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων, και οι πνεύμονες εκριζώνεται και διχοτομείται. Το μισό του πνεύμονα ορίστηκε για ιστοπαθολογική ανάλυση και χρωματίστηκαν με Η-Ε και η άλλη λύθηκε για ποσοτική ανάλυση με τη χρήση Alu-PCR. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για Alu-PCR ήταν hAlu-UP: ACGCCTGTAATCCCAGCACTT, hAlu-DN: TCGCCCAGGCTGGAGTGCA [11]. Gene-ειδικά προϊόντα μετρήθηκαν συνεχώς από έναν ΑΒΙ PRISM 7000 Sequence Detection System για 35 κύκλους χρησιμοποιώντας THUNDERBIRD SYBR® qPCR Mix (ΤΟΥΟΒΟ, Osaka, Japan).

RT-PCR

Cells καλλιεργήθηκαν όπως μονοστιβάδες συλλέχθηκαν σε υπο-συρροή. Μετά από 24 ώρες, RNA απομονώθηκε με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Life Technologies) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RT-PCR για mGluR5 και αφυδρογονάση 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH) πιΚΝΑ διεξήχθη υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 94 ° C για 2 λεπτά? ακολούθως 30 κύκλοι των 94 ° C για 1 λεπτό, 60 ° C για 1 λεπτό και 72 ° C για 1 λεπτό? και μία τελική επέκταση στους 72 ° C για 1 λεπτό. Primer αλληλουχίες για την ανθρώπινη mGluR5 και GAPDH ήταν ως ακολούθως: mGluR5-UP: 5′-TGGCCACCCTGTTTGTTACT-3 ‘, mGluR5-DN: 5′-GCACTGAGGCTGACCGAGAA-3′, GAPDH-UP: 5’-GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG-3 ‘, και GAPDH- DN: 5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3 ‘. Για την ποσοτική RT-PCR, εξετάσαμε την έκφραση του mGluR5 και GAPDH από

Δ

ΔCt μέθοδο. mGluR5 και GAPDH mRNA ταυτοχρόνως ανιχνεύθηκαν με Taqman

TM Gene Expression Δοκιμασίες (Life Technologies) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Gene συγκεκριμένα προϊόντα συνεχώς μετρηθεί με ένα ΑΒΙ StepOnePlus PCR Πραγματικού χρόνου Σύστημα κατά 40 κύκλους PCR.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

λογαριθμικά αναπτυσσόμενα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη (V /V) σε πάγο για 10 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν με αντι-mGluR5 mAb (αραίωση 1: 100? Ε & amp? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με D-PBS (-), στη συνέχεια επωάστηκαν με φυκοερυθρίνη (ΡΕ), γίδινη αντι-ποντικού IgG (Serotec, Sapporo, Ιαπωνία) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής EPICS (Coulter, San Jose, CA, USA)

ανοσοφθορισμού ανάλυση

τα κύτταρα σπάρθηκαν στην Falcon CultureSlides (Falcon?. Becton Dickinson Labware). Είκοσι ώρες αργότερα, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση των κυττάρων με PBS, μη ειδική δέσμευση παρεμποδίστηκε με 1% BSA σε PBS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα πρωτογενές μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι mGluR5 (Genway Biotech, San Diego, CA, USA). Alexa Fluor 488 αντίσωμα συζευγμένο με αντι-κουνελιού IgG (Life Technologies) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση. Διαφάνειες Ακολούθησε χρώση με DAPI (Life Technologies) και τοποθετείται με Αντιδραστήριο αντιξεθωριάσματος παρατείνει Gold (Life Technologies). σήματα φθορισμού παρατηρήθηκαν με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο (Nikon, Tokyo, Japan). Για την ανίχνευση του F-ακτίνη, B88-SDF-1 κύτταρα επωάστηκαν είτε με 100 μΜ mGluR5 αγωνιστή, (S) -3,5-DHPG (DHPG? TOCRIS) [12], 20 μΜ ΜΡΕΡ ή 20 μΜ Mtep. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Alexa Fluor 488 συζευγμένο με φαλλοειδίνη (Life Technologies) και ανοσοφθορισμού ανιχνεύθηκε με ένα μικροσκόπιο επιφθορισμού (Nikon, Tokyo, Japan).

ΜΤΤ δοκιμασία

Ένα σύνολο 5 χ 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96-φρεατίων (Falcon? Becton Dickinson Labware) σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FCS . Μετά από 24 ώρες καλλιέργειας, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με είτε 100 μΜ DHPG, 20 μΜ ΜΡΕΡ ή 20 μΜ Mtep για 48 ώρες. Ο αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου, Sigma].

Wound

δοκιμασία

Μετά την 24 ώρες καλλιέργειας, μια γραμμική πληγή παρήχθη με απόξεση ένα συρρέουσες μονοστιβάδες κυττάρων με το ρύγχος μιας πιπέτας με την παρουσία είτε 100 μΜ DHPG ή 20 μΜ ΜΡΕΡ ή 20 μΜ Mtep. Τα μη συνδεδεμένα κύτταρα ξεπλένονται με ανάδευση. Τα κύτταρα απεικονίζεται στην ίδια θέση πλέγμα μετά από 48 ώρες. Κάθε γραμμή απλώθηκε και τραυματίστηκε στο τριπλούν.

In vitro μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Το

in vitro

μετανάστευση από του στόματος καρκινικών κυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο φρεατίων (Corning, Corning, Νέα Υόρκη, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Τα κύτταρα μέσα στους πόρους της μεμβράνης ή των κυττάρων που συνδέονται με την κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μετρήθηκαν σε 10 οπτικά πεδία σε υψηλή μεγέθυνση (χ 400). Σε μερικά πειράματα, 100 μΜ DHPG, 20 μΜ ΜΡΕΡ ή 20 μΜ Mtep προστέθηκε στα κύτταρα σπάρθηκαν επί του άνω θαλάμου.

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές διαφορές μεταξύ των τιμών μέσω των διαφόρων ομάδων αγωγής εκτιμήθηκαν με StatView 4.5 (Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA) χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA με το σετ σημασία στο

σ

& lt? 0.05.

Αποτελέσματα

νέα θεραπευτική κατάντη στόχος Απομόνωση του γονιδίου στόχου, μεταβοτροπικού υποδοχέα γλουταμικού 5, η οποία προκαλείται από το σύστημα SDF-1 /CXCR4

Ερευνήσαμε ( s) του συστήματος SDF-1 /CXCR4 χρησιμοποιώντας τις προφορικές καρκινικά κύτταρα, B88-SDF-1, που έχουν ένα αυτοκρινές σύστημα SDF-1 /CXCR4 και επιδεικνύουν μακρινό μεταστατικού δυναμικού

in vivo

. ανάλυση μικροσυστοιχιών απεκάλυψε ότι 418 γονίδια ρυθμίζεται αυξητικά σε B88-SDF-1 κύτταρα σε σύγκριση με mock κύτταρα, και ότι η έκφραση του υποδοχέα μεταβοτροπικού γλουταμικού 5 (mGluR5) αυξήθηκε 46 φορές (5η από την κορυφή) σε B88-SDF-1 κύτταρα, με την υψηλότερη βαθμολογία που αντιστοιχεί στην οδό mGluR5 όπως φαίνεται από ΙΡΑ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, Park και συνεργάτες έδειξαν ότι η ισχυρή έκφραση του mGluR5 σχετίζεται με την επιβίωση των ασθενών και ότι mGluR5 ανταγωνιστές αναστέλλουν τη μετανάστευση των από του στόματος καρκινικών κυττάρων

in vitro

[13]. Έτσι, αναλύσαμε mGluR5 ως πιθανό υποψήφιο γονίδιο που εμπλέκονται στο σύστημα SDF-1 /CXCR4. Για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα της ανάλυσης των μικροσυστοιχιών, η έκφραση του mRNA του mGluR5 επιβεβαιώθηκε με RT-PCR. Παρόμοια με τα αποτελέσματα μικροσυστοιχιών, η έκφραση του mRNA του mGluR5 ρυθμίζεται αυξητικά σε B88-SDF-1 κύτταρα, σε σύγκριση με ψευδο κύτταρα (Σχήμα 1Α) και αναστέλλεται από τη θεραπεία με AMD3100 (Σχήμα 1Α). Έχουμε προηγουμένως αποδείξει ότι το σύστημα /CXCR4 SDF-1 ενεργοποιεί τόσο το Ras-εξωκυτταρικό σήμα κινάση ρυθμιζόμενη (ERK) 1/2 και η φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) -Akt πορείες [1]. Ως εκ τούτου, το επόμενο εξέτασε τη συμμετοχή αυτών των οδών στην προς τα πάνω ρύθμιση του mGluR5. Η έκφραση του mGluR5 πλήρως καταργήθηκε με επεξεργασία με U0126, έναν αναστολέα ΜΕΚ και μερικώς ανέστειλαν με ουορτμαννίνη, έναν αναστολέα ΡΙ3Κ (Σχήμα 1Β). Λάβαμε επίσης τα παρόμοια αποτελέσματα του ποσοτικού RT-PCR (Σχήμα 1 C). Επιπλέον, η προς τα πάνω ρύθμιση του mGluR5 πρωτεΐνης παρατηρήθηκε επίσης σε κυτταρομετρία ροής και τα αποτελέσματα ανοσοκυτταροχημεία (Σχήμα 1 D, Ε).

(Α) Εκφραση του mGluR5 mRNA επιβεβαιώθηκε σε B88-B88 mock και-SDF-1 κύτταρα, τόσο παρουσία όσο και απουσία του AMD3100 (1 μg /ml). Ανθρώπινα πλακούντα χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος (PC). (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με U0126 (10 ηΜ) ή wortmannin (50 ηΜ) για 48 ώρες και η έκφραση του mRNA του mGluR5 αναλύθηκε με RT-PCR. (Γ) έκφραση του mGluR5 mRNA επιβεβαιώθηκε από την PCR πραγματικού χρόνου. **?

σ

& lt? 0.01 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα B88-SDF-1 με μονόδρομη ANOVA. ΝΔ? δεν είναι ανιχνεύσιμη. (Δ) Η πρωτεϊνική έκφραση του mGluR5 αξιολογήθηκε σε B88-mock και τα κύτταρα B88-SDF-1 χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Λογαριθμικά αναπτυσσόμενα κύτταρα επωάστηκαν με ή χωρίς αντι-mGluR5 mAb και χρωματίστηκαν με ΡΕ-επισημασμένο αντι-ποντικού κατσίκας IgG. Λευκό και κόκκινο ζώνες υποδεικνύουν κύτταρα χρωματίστηκαν με τον ισότυπο αναφοράς και του αντι-mGluR5 mAb, αντίστοιχα. (Ε) Η πρωτεϊνική έκφραση του mGluR5 ανιχνεύθηκε με ανοσοκυτταροχημεία. Ο πυρήνας χρωματίστηκε με ϋΑΡΙ (μπλε)

Η

Η έκφραση των υποδοχέων γλουταμικού σε κύτταρα 1 B88-SDF-

Οι υποδοχείς Γλουταμινικό χωρίζονται σε δύο κατηγορίες.? mGluRs και GluRs ιονοτροπικοί (iGluRs), οι οποίες περαιτέρω χαρακτηρίζονται ως είτε Ν-μεθυλο-D-ασπαρτικό (NMDA), a-αμινο-3-υδροξυ-5-μεθυλισοξαζολο-4-προπιονικό οξύ (ΑΜΡΑ) ή καϊνικού (ΚΑ) υποδοχείς [14,15]. Εμείς επικύρωσε την έκφραση των υποδοχέων γλουταμικού που εμπλέκονται στο σύστημα SDF-1 /CXCR4 χρησιμοποιώντας μια μικροσυστοιχία cDNA. Από τους 8 τύπους mGluRs που εξετάστηκαν, μόνο η έκφραση του mGluR5 αξιοσημείωτα ρυθμισμένη προς τα πάνω σε B88-SDF-1 κύτταρα (Πίνακας 1). Περαιτέρω, από τα 14 είδη των iGluRs που εξετάστηκαν, η έκφραση GluR1, ενός υποδοχέα ΑΜΡΑ, αυξημένη 6-φορές σε B88-SDF-1 κύτταρα (Πίνακας 2).

Ομάδα

mGluRs

Διπλώστε induction

*

ImGluR11.27mGluR546.13IImGluR20.98mGluR30.67mGluR40.19IIImGluR61.54mGluR71.06mGluR80.46Table 1. Έκφραση των mGluRs στην ανάλυση cDNA μικροσυστοιχιών.

* Προς τα πάνω ρύθμιση B88-SDF-1 κύτταρα vs B88-mock κύτταρα CSV Κατεβάστε Ομάδα CSV

iGluRs

Διπλώστε επαγωγής

*

AMPAGluR16.05GluR21.42GluR3NDGluR41.04KAGluR50.46GluR60.47GluR70.84KA10.41KA20.39NMDANMDA12.34NMDA2A2.21NMDA2B0.71NMDA2C0.12NMDA2D1.23Table 2. Έκφραση των iGluRs στην ανάλυση cDNA μικροσυστοιχιών.

* Προς τα πάνω ρύθμιση B88-SDF-1 κύτταρα vs B88-mock κύτταρα CSV Λήψη CSV

Η παραγωγή του γλουταμινικού στον καρκίνο του στόματος κύτταρα

Στη συνέχεια εξετάσαμε η παραγωγή του γλουταμινικού, ένας συνδέτης mGluR5, σε B88 και μορφομετατροπείς της, B88-B88 mock και-SDF-1 κύτταρα. Το γλουταμινικό παραγωγή ανιχνεύθηκε στο ρυθμισμένο μέσο που προέρχεται από αυτά τα κύτταρα σε μια συγκέντρωση περίπου 12 μΜ (Πίνακας 3). Ωστόσο, η παραγωγή γλουταμικού δεν εξαρτιόταν από είτε το σύστημα SDF-1 /CXCR4 ή το επίπεδο έκφρασης του mGluR5.

κύτταρα

B88

B88-παρωδία

B88-SDF-1 απελευθέρωσης

Γλουταμινικό (μΜ) 12.23 ± 0.3012.17 ± 0.1712.21 ± 0.29Table 3. Παραγωγή του γλουταμινικού στον καρκίνο του στόματος κύτταρα.

CSV Λήψη CSV

ο ρόλος του mGluR5 για την ανάπτυξη των κυττάρων

Εξετάσαμε την επίδραση του mGluR5 για την ανάπτυξη των κυττάρων με τη χρήση ενός ειδικού αγωνιστή mGluR5, DHPG, και δύο ανταγωνιστές, MPEP και Mtep. Ο αγωνιστής και ανταγωνιστών δεν επηρέασε την ανάπτυξη είτε του B88-mock ή τα κύτταρα B88-SDF-1 (Σχήμα 2).

Μια συρρέουσα μονοστιβάδα κυττάρων υποβλήθηκε σε επεξεργασία με είτε 100 μΜ DHPG, 20 μΜ ΜΡΕΡ (Α) ή 20 μΜ Mtep (Β). Η επίδραση της mGluR5 στην κυτταρική ανάπτυξη εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των τριών ομάδων με μονόδρομη ANOVA.

Η

Ο ρόλος του mGluR5 επί SDF-1 /CXCR4-εξαρτώμενη κυτταρική μετανάστευση

Στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση του mGluR5 για το SDF-1 /CXCR4-εξαρτώμενη μετανάστευση των κυττάρων. ανιχνεύσεις πληγών επούλωσης αποκάλυψαν ότι η ενισχυμένη κινητικότητα του B88-SDF-1 κυττάρων επιταχύνεται περαιτέρω με κατεργασία DHPG, αλλά ήταν σημαντικά μειωμένη από MPEP και θεραπεία Mtep (Σχήμα 3Α, Β). Ανταγωνιστές του mGluR5 ανέστειλαν επίσης τη μετανάστευση των κυττάρων B88-SDF-1, όπως φαίνεται από μια δοκιμασία θαλάμου μετανάστευση (Σχήμα 3C). Επιπλέον, DHPG ενισχυμένη F-ακτίνης πολυμερισμού που βρίσκονται στην αιχμή, ενώ MPEP και Mtep ανέστειλε F-ακτίνης πολυμερισμού (Εικόνα 3D-G). Παρατηρήσαμε επίσης την αναστολή της Matrigel εισβολής με θεραπεία Mtep σε B88-SDF-1 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) B88-B88 mock ή-SDF-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε συρροή. Μία δοκιμασία επούλωσης τραύματος διεξήχθη παρουσία είτε 100 μΜ DHPG, 20 μΜ ΜΡΕΡ ή 20 μΜ Mtep. (Β) Τα ποσοτικά δεδομένα που προκύπτουν από το (Α). *?

σ

& lt? 0.05 σε σύγκριση με DHPG-κατεργασμένα κύτταρα με μονόδρομη ANOVA. (Γ) Η κινητικότητα των B88-SDF-1 κύτταρα παρουσία είτε 100 μΜ DHPG, 20 μΜ ΜΡΕΡ ή 20 μΜ Mtep εξετάστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία μετανάστευσης transwell. *?

σ

& lt? 0.05 σε σύγκριση με μη επεξεργασμένο έλεγχο ή DHPG-επεξεργασμένα κύτταρα με μονόδρομη ANOVA. (D-G) F-ακτίνης πολυμερισμού στην αιχμή της B88-SDF-1 κύτταρα εξετάστηκε από την ανοσοκυτταροχημεία εξής (D) χωρίς θεραπεία, θεραπεία (Ε) DHPG, (στ) η επεξεργασία MPEP και (Ζ) θεραπεία Mtep. Nucleus βάφτηκε με ϋΑΡΙ (μπλε).

Η

δράση των ανταγωνιστών του mGluR5 για ανοσοϊκανά ποντίκια

Επειδή mGluR5 μπορεί να είναι μία νέα μεταστατικό στόχος στον καρκίνο του στόματος, αξιολογήσαμε τις παρενέργειες των ανταγωνιστών του mGluR5 σε ποντικούς C3 /HeN. Αριθ απώλεια βάρους ή ανωμαλίες μακροσκοπική όργανο ανιχνεύθηκαν σε ποντίκια που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ανταγωνιστές του mGluR5 MPEP και Mtep (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, αυτοί οι ανταγωνιστές δεν προκάλεσε hematotoxicities όπως αναιμία και λευκοκυττάρωση (Σχήμα 4Α-C). Αξιολογήσαμε επίσης τις παρενέργειες της AMD3100 σε ποντίκια C3H /HeN. Καμία απώλεια βάρους, ανωμαλίες μακροσκοπική όργανο ή αλλαγή στα ερυθρά αιμοσφαίρια μετρούν παρατηρήθηκε σε ποντικούς που χορηγείται με AMD3100 (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα)? Ωστόσο, σημαντικές και χρόνιες λευκοκυττάρωση παρατηρήθηκε μετά από καθημερινή υποδόρια χορήγηση του AMD3100 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

ποντίκια C3H /HeN υποβλήθηκαν σε αγωγή ε.π. με ΜΡΕΡ (5 mg /kg), Mtep (5 mg /kg) ή τον ίδιο όγκο φυσιολογικού ορού καθημερινά. Τα ποντίκια θανατώθηκαν την ημέρα 1, 7, 14, 21, και 28 με αφαίμαξη και WBC (

A

), τα ερυθρά αιμοσφαίρια (RBC? Β) και της αιμοσφαιρίνης? Επίπεδα (Hb C) μετρήθηκαν. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των τριών ομάδων με μονόδρομη ANOVA.

Η

Ο ρόλος του mGluR5 στο SDF-1 /CXCR4-εξαρτώμενη κυτταρική μετάσταση

Έτσι, προσδιορίστηκε η δράση των ανταγωνιστών του mGluR5 για πνευμονικών μεταστάσεων των κυττάρων B88-SDF-1. Πολυάριθμες μεταστατικά οζίδια ανιχνεύθηκαν στους πνεύμονες των ποντικών που εμβολιάστηκαν με B88-SDF-1 κύτταρα (Σχήμα 5Α, αριστερά). Ωστόσο, μια σημαντική μείωση των μεταστατικών οζιδίων του πνεύμονα παρατηρήθηκε σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με ΜΡΕΡ (Σχήμα 5Α, μέσο) και Mtep (Σχήμα 5Α, δεξιά), όπως φαίνεται από ιστοπαθολογική ανάλυση κατά τη διάρκεια μιας περιόδου παρατήρησης 4 εβδομάδων. Επιβεβαιώσαμε επίσης την παρουσία μεταστατικών καρκινικών κυττάρων σε εκχυλίζεται πνευμονικό ιστό με τη χρήση ποσοτικής Alu-PCR. Κατά συνέπεια, η έκφραση του ανθρώπινου DNA Alu σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ανταγωνιστές του mGluR5 ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι στα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με αλατούχο διάλυμα (Σχήμα 5Β).

Τα κύτταρα εμβολιάστηκαν εντός του αιμοφόρου αγγείου γυμνών ποντικών που θυσιάστηκαν την ημέρα 30. (Α) Αντιπροσωπευτική Η &? Ε χρώση των πνευμόνων από μάρτυρα (αριστερά), MPEP φάρμακο (μέση), Mtep-αγωγή (δεξιά) άτριχων ποντικών. (Β) Ποσοτική ανάλυση με Alu-PCR πραγματοποιήθηκε σε ιστούς εκριζώνεται-πνευμόνων. **

σ

& lt? 0.01 σε σύγκριση με τον έλεγχο φυσιολογικού ορού με μονόδρομη ANOVA.

Η

Συζήτηση

Το γλουταμινικό είναι ένας μοναδικός συνδετήρας για mGluR5, ένα μεταβοτροπικού υποδοχέα γλουταμινικού που ανήκουν στην οικογένεια των συζευγμένων με πρωτεΐνη υποδοχείς [16,17] που πανταχού βρεθεί στον εγκεφαλικό φλοιό, ιππόκαμπο, κερκοφόρος πυρήνας και πυρήνα επικλινή του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) [16,17]. Έχει προταθεί ότι mGluR5 εμπλέκεται σε διαταραχές του ΚΝΣ που προκαλούνται από την υπερέκκριση του γλουταμινικού, όπως η επιληψία, η νευρογενής ή φλεγμονώδη πόνο, ψύχωση, δυσκινησία, πονοκεφάλους και της τοξικομανίας [16,17]. Στο κυτταρικό επίπεδο, mGluR5 ρυθμίζει την ανάπτυξη και τη μετανάστευση των νευρογλοιακών κυττάρων [18], νευρικά πρόδρομα βλαστοκύτταρα [19], τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα [20] και κυττάρων γλοιώματος [21]. Αν και ο ρόλος του mGluR5 σε εξέλιξης του καρκίνου παραμένει ασαφής, πρόσφατες έρευνες δείχνουν ότι οι λειτουργίες του mGluR5 στο παχύ έντερο [22], του μαστού [22] και του καρκίνου του προστάτη κύτταρα [23]. Επιπλέον, Park και συνεργάτες έδειξαν ότι η ισχυρή έκφραση του mGluR5 σχετίζεται με την επιβίωση των ασθενών και ότι mGluR5 ανταγωνιστές αναστέλλουν τη μετανάστευση των από του στόματος καρκινικών κυττάρων

in vitro

[13]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι λειτουργίες του mGluR5 ως ογκογονίδιο σε στερεά καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του στόματος. Από την άλλη τα χέρια, πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει ότι το γλουταμινικό παράγεται από μεσεγχυματικά κύτταρα, όπως οστεοβλάστες και οστεοκλάστες, τα επιθηλιακά κύτταρα, όπως κύτταρα παγκρεατικών νησιδίων και κερατινοκύτταρα, του μαστού και του καρκίνου του προστάτη κύτταρα [24-27]. Επιπλέον, η παραγωγή του γλουταμικού σε κύτταρα γλοιώματος έχει αναφερθεί ότι σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή [21,28,29]. Επιπλέον, μπάνιο και οι συνεργάτες έδειξαν σημαντικά αυξημένες συγκεντρώσεις του γλουταμινικού στον ορό των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος, όπως μετράται με μεταβολισμική ανάλυση [30]. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι τα κύτταρα B88, και επιμολύνονται τα παράγωγά της, παράγει γλουταμινικού σε ρυθμισμένα μέσα τους σε μια συγκέντρωση περίπου 12 μΜ. Αυτές οι συγκεντρώσεις ήταν παρόμοιες με τις διαπιστώσεις που περιγράφονται από Seidlitz και συνεργάτες στην κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού, MDA-MB-231 [29]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το γλουταμινικό και του υποδοχέα του σχετίζονται με την εξέλιξη του καρκίνου. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά στην παραγωγή γλουταμικού μεταξύ του B88-mock και τα κύτταρα B88-SDF-1, αν και η έκφραση του mGluR5, έναν υποδοχέα για γλουταμικού, ρυθμίζεται αυξητικά σε B88-SDF-1 κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση του mGluR5, αντί γλουταμικού παραγωγής, απαιτείται για το σύστημα γλουταμινεργικό να συμμετέχουν στην SDF-1 σηματοδότηση /CXCR4.

Πρόσφατα, συνθετικά ανταγωνιστές του mGluR5 έχουν αναπτυχθεί ως πιθανά φάρμακα για διαταραχές του ΚΝΣ που προκαλούνται από την υπερέκκριση του γλουταμικού [11,31,32]. Έχει αναφερθεί ότι η χορήγηση του MPEP και Mtep έχει χρησιμοποιηθεί για την αποτελεσματική αντιμετώπιση των συμπτωμάτων του πόνου, της νόσου του Parkinson, διαταραχή της γνωστικής λειτουργίας, της κατάθλιψης, του άγχους, της σχιζοφρένειας και [16,17]. Αν και χρησιμοποιήθηκε αρχικά MPEP ως ανταγωνιστής mGluR5 σε αυτή τη μελέτη, σημαντική μη-ειδικές δράσεις του MPEP, περιλαμβανομένης της αναστολής του ΑΜΡΑ ή NMDA υποδοχείς, έχουν υποδειχθεί [10]. Επιπλέον, εντοπίσαμε μια 6-πλάσια αύξηση στην έκφραση GluR1, ενός υποδοχέα ΑΜΡΑ εμπλέκονται στην ανάπτυξη και την εισβολή των κυττάρων γλοιώματος, σε B88-SDF-1 κύτταρα [33,34]. Για να αποκλειστεί η μη-ειδική επίδραση του MPEP επί mGluR5, εμείς επαναξιολόγθςε το ρόλο του mGluR5 για το σύστημα SDF-1 /CXCR4 χρησιμοποιώντας το πρόσφατα αναπτύχθηκε mGluR5 ανταγωνιστής Mtep, η οποία είναι περισσότερο εντόνως εκλεκτική για mGluR5 και έχει λιγότερες επιπτώσεις εκτός- από MPEP [10]. Ωστόσο, τόσο MPEP και Mtep είχε παρόμοια αποτελέσματα για τη μετανάστευση και τη μετάσταση των κυττάρων B88-SDF-1, υποδεικνύοντας μια ειδική επίδραση του mGluR5 στο σύστημα SDF-1 /CXCR4.

Διαπιστώσαμε πρόσθετο επιδράσεις των αγωνιστών mGluR5 DHPG σε δοκιμασία μετανάστευσης, παρά περιέχει ένα μεγάλο ποσό του γλουταμινικού στα μέσα μαζικής ενημέρωσης. Αν και δεν παρατηρήσαμε την άμεση ενεργοποίηση του mGluR5, θεωρείται ότι DHPG πιθανόν ενεργοποιούν mGluR5 σε B88-SDF-1 κύτταρα επειδή DHPG δεν ενίσχυσε τη μετανάστευση σε mock κύτταρα, τα οποία δεν εκφράζουν mGluR5 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Cleva και Olive απέδειξαν ότι mGluR5 είναι φυσικά συζευγμένο με NMDA υποδοχείς με διάφορες πρωτεΐνες ικριώματα, και βιοχημικά σύζευξη με λειτουργία υποδοχέα NMDA μέσω PKC [35]. Επιπλέον, αυτή η αλληλεπίδραση mGluR5-NMDA έχει παρατηρηθεί σε πολλές παρασκευάσματα εγκεφάλου, σύμφωνα με την οποία η ενεργοποίηση του mGluR5 υποδοχέων με DHPG δυναμικοποιεί αποκρίσεις με τη μεσολάβηση υποδοχέων NMDA σε εφαρμοζόμενες εξωγενώς γλουταμικό ή NMDA [35]. Επειδή τα κύτταρα B88-SDF-1 εκφράζουν υποδοχείς NMDA σε ανάλυση μικροσυστοιχιών μας (Πίνακας 1), αυτή η αθροιστική επίδραση των DHPG ενδέχεται να οφείλεται στην ταυτόχρονη ενεργοποίηση του μονοπατιού υποδοχέα NMDA.

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε τη συμμετοχή του /2 μονοπατιού Ras-ERK1 για την ρύθμιση προς τα άνω του mGluR5 από το σύστημα SDF-1 /CXCR4. Παρά το γεγονός ότι μια ένωση μεταξύ mGluR5 και του συστήματος SDF-1 /CXCR4 δεν έχει αναφερθεί σε καρκινικά κύτταρα, Luo και οι συνεργάτες του απέδειξαν την επαγωγή του mGluR5 σε πρόδρομα κύτταρα Ε14.5 νευρικά διεγείροντας με SDF-1. Μπορούν επίσης πρότεινε ότι mGluR5 έκφραση από το σύστημα SDF-1 /CXCR4 επάγεται από τον παράγοντα μεταγραφής, Ets, η οποία ενεργοποιείται από την οδό ERK1 /2 σηματοδότηση [36]. Επειδή το

mGluR5

γονίδιο έχει θέσεις σύνδεσης Ets σε υποκινητές τους [37], ο /ERK1 /2 /Ets οδού CXCR4 μπορεί να εμπλέκονται στην επαγωγή mGluR5 που παρατηρήθηκε στο πείραμα μας.

Κάναμε το ίδιο πείραμα χρησιμοποιώντας μια προφορική κυτταρική σειρά SCC, HNT, στην οποία η έκφραση του CXCR4 είναι 7,5 φορές χαμηλότερη από ότι σε B88 κύτταρα [1]. HNT-SDF-1 κύτταρα επέδειξαν μικρή αλλά όχι σημαντική, φαινοτυπικές αλλαγές in vitro και in vivo [4], και η επαγωγή mGluR5 ανιχνεύθηκε μόνο σε ένα οριακό επίπεδο, πιθανώς λόγω της μειωμένης έκφρασης του CXCR4, σε σύγκριση με εκείνη του B88 κύτταρα. Έτσι, CXCR4 επίπεδο έκφρασης και ισχυρή κατάντη σηματοδότησης θα μπορούσε να είναι επίσης κρίσιμη για την ενεργοποίηση του mGluR5 οδού.

Ανακαλύψαμε ότι οι ανταγωνιστές του mGluR5 ανέστειλε σημαντικά SDF-1 /CXCR4 που εξαρτώνται από τη μετανάστευση και την μετάσταση. Αν και το σύστημα /CXCR4 SDF-1 κυρίως λειτουργεί ως χημειοτακτικός παράγοντας σε καρκινικά κύτταρα, είναι επίσης εμπλέκονται στις διάφορες μεταστατικό διεργασίες, όπως νεοαγγείωση, προσκόλληση κυττάρου, εισβολή, έκφυση και επιθηλιακών να μεσεγχυματικά μετάβαση [38-43]. Στην παρούσα μελέτη, mGluR5 ρύθμιζε την μετανάστευση κυττάρων που συνδέεται με το σύστημα SDF-1 /CXCR4? Ωστόσο, είναι απίθανο ότι mGluR5 ανταγωνιστές καταστέλλουν SDF-1 /CXCR4 εξαρτώμενη μετάσταση μόνο μέσω ανέστειλε την κυτταρική μετανάστευση. Αν και mGluR5 έχει αποδειχθεί ότι ενισχύει την προσκόλληση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων του στόματος [13] και την έκφυση των νευρικών κυττάρων [44], λίγες πληροφορίες είναι διαθέσιμες σχετικά με τις λειτουργίες της μετάστασης που σχετίζονται. mGluRs ενεργοποιούν τόσο τα μονοπάτια ΜΑΡΚ και Akt, που είναι δύο σφραγίδα μονοπατιών σηματοδότησης που προωθούν την ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση [45,46]. Έτσι, με στόχο mGluR5 μπορεί να καταστείλει αυτές τις κρίσιμες μεταστατικό μονοπάτια και αναστέλλουν τη μετάσταση του καρκίνου.

Σε προηγούμενη μελέτη μας, ανιχνεύσαμε την έκφραση CXCR4 σε περίπου 60% της πρωτογενούς μορφές καρκίνου του στόματος και κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι CXCR4-θετικών κρουσμάτων είχαν σημαντικά χειρότερη πρόγνωση από CXCR4-αρνητικών περιπτώσεις [3]. Παρά το γεγονός ότι δεν είχαμε εξετάσει την έκφραση του mGluR5 σε στοματική καρκινικούς ιστούς, Park και συνεργάτες έδειξαν ότι το 70% των καρκίνων του στόματος εκφράζουν mGluR5 και ότι η υπερέκφραση του mGluR5 μειώνει το ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο του στόματος [13]. Στο σύνολό τους, η σχέση μεταξύ CXCR4 και mGluR5 Συνιστάται έντονα να προωθήσει την εξέλιξη του καρκίνου του στόματος. Για τις γνώσεις μας, οι ανταγωνιστές του mGluR5 MPEP και Mtep δεν είναι ακόμη κλινικά διαθέσιμη, ακόμη και αν δεν υπάρχουν σημαντικές παρενέργειες αναφέρθηκαν στις μελέτες σε ζώα [10]. Στην παρούσα μελέτη, η χορήγηση των ανταγωνιστών του mGluR5 δεν προκάλεσε απώλεια βάρους ή hematotoxicity σε ανοσοεπαρκείς ποντικούς.