Αφηρημένο

Τα επιθηλιακά μετάβαση μεσεγχυματικά (EMT) είναι μια σημαντική διαδικασία στην ανάπτυξη του όγκου. Παρά τις προηγούμενες έρευνες, παραμένει ασαφές το πώς p120-κατενίνης (p120ctn) ισομορφών 1Α και 3Α επηρεάζουν την EMT των καρκινικών κυττάρων. Εδώ ερευνήσαμε την έκφραση του p120ctn, Ε-καδερίνης και βιμεντίνη σε 78 ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) δείγματα με ανοσοϊστοχημεία και διαπίστωσε ότι η έκφραση μεμβράνη p120ctn συσχετίζεται θετικά με την έκφραση Ε-καδερίνης (

P

& lt? 0,001) και συσχετίζεται αρνητικά με μετάσταση βιμεντίνη έκφραση και λεμφαδένα (

P

& lt? 0,05). Εν τω μεταξύ, p120ctn κυτταροπλασματική έκφραση συσχετίζεται αρνητικά με την έκφραση Ε-καδερίνης (

P

& lt? 0.001) και συσχετίζεται θετικά με την έκφραση βιμεντίνη και λεμφαδένα μετάσταση (

P

& lt? 0,05). Κύτταρα που εκφράζουν υψηλά (Η460 και SPC) και χαμηλής (Η1299 και LK2) επίπεδα p120ctn ήταν οθόνης για να διερευνήσει τις επιπτώσεις της στην EMT. E-cadherin περιορίστηκε στην κυτταρική μεμβράνη σε κύτταρα Η460 και Η1299, ενώ εκφράστηκε στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων SPC και LK2. Κατάλυση της ενδογενούς p120ctn ισομορφής 1Α σε κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης οδήγησε σε μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης, αυξημένη Ν-cadherin, βιμεντίνη και σαλιγκάρι έκφρασης και ενισχυμένη διεισδυτικότητα σε κύτταρα Η460. Εν τω μεταξύ, εντελώς αντίθετα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε SPC κύτταρα. Επιπλέον, η επιμόλυνση των εν Η1299 κύτταρα που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα p120ctn με το πλασμίδιο 1Α p120ctn ισομορφή είχε σαν αποτέλεσμα αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης, μειωμένη Ν-cadherin, βιμεντίνη και σαλιγκάρι έκφρασης και αποδυναμωθεί διεισδυτικότητα, ενώ τα κύτταρα LK2 έδειξε εντελώς αντίθετα αποτελέσματα. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα p120ctn και επιμολύνονται με το πλασμίδιο 3Α p120ctn ισομορφή δεν φάνηκε να έχει αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης, μειωμένη Ν-cadherin, βιμεντίνη και σαλιγκάρι έκφρασης και αποδυναμωθεί διεισδυτικότητα. Εν κατακλείδι, σε κύτταρα με μεμβράνη E-cadherin, τόσο p120ctn ισομορφές 1Α και 3Α αναστέλλεται EMT και μειωμένη κυτταρική εισβολής. Σε κύτταρα με κυτταροπλασματικά E-cadherin, p120ctn ισομορφή 1Α προωθείται EMT και την αύξηση των κυττάρων εισβολής, ενώ p120ctn ισομορφή 3Α ανέστειλε την EMT και μειωμένη κυτταρική εισβολής

Παράθεση:. Zhang Υ, Zhao Υ, Jiang G, Ζανγκ Χ, Zhao Η, Wu J, et al. (2014) Επίδραση του p120-κατενίνης ισομορφές 1Α και 3Α σε επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα Εκφράζοντας E-cadherin σε διαφορετικά υποκυτταρικά Τοποθεσίες. PLoS ONE 9 (2): e88064. doi: 10.1371 /journal.pone.0088064

Επιμέλεια: Frédéric André, Πανεπιστήμιο Aix-Marseille, Γαλλία

Ελήφθη: 21 Νοεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 6 Ιανουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: τέταρτης Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (επιχορηγήσεις 81071905 και 81272606 για την Ε-HW, χορηγεί 81.101.780 σε YZ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η μετάβαση επιθηλιακά μεσεγχυματικά (EMT) είναι μια ταχεία και συχνά αναστρέψιμη αλλαγή του φαινοτύπου των κυττάρων και παίζει ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων. Κατά τη διαδικασία της ΕΜΤ, επιθηλιακά κύτταρα υφίστανται μια φαινοτυπική αλλαγή για να σχηματίσουν μεσεγχυματικά κύτταρα που είναι παρόμοιες σε εμφάνιση με ινοβλάστες [1], [2]. Τέτοιες φαινοτυπικές αλλαγές προκαλούν τα επιθηλιακά κύτταρα να χάνουν χαρακτηριστικές δομές προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου τους, μεταβάλλουν την πολικότητα τους, να διαμορφώνει την οργάνωση των κυτταροσκελετικών συστημάτων τους, εναλλαγή έκφραση από keratin- να βιμεντίνη τύπου ενδιάμεσα νημάτια, καθώς και να γίνει απομονωμένα, κινητικά και ανθεκτικά σε anoikis [3], [4]. Τυπικά, τα κύτταρα υποβάλλονται σε ΕΜΤ παρουσιάζουν μειωμένη Ε-καδερίνης έκφραση [5], [6] και μειωμένη έκφραση των βιοδεικτών μεσεγχυματικών, όπως Ν-cadherin, βιμεντίνη, σαλιγκάρι, γυμνοσάλιαγκα και συστροφή [7], [8].

Προηγούμενες μελέτες σχετικά με τη σχέση μεταξύ p120-κατενίνης (p120ctn) και EMT έχουν περιοριστεί στην μετάβαση από απότομα πολύ ισομορφές p120ctn κατά τη διάρκεια της EMT που προκαλείται από την έκφραση της SIP1 /ZEB2 [9], συστροφή [10] ή Zeppo1 [11 ]. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο ρ120-κατενίνης ισομορφών 1Α και 3Α επηρεάζουν ΕΜΤ των καρκινικών κυττάρων παραμένει άγνωστη. Η πρωτεΐνη p120ctn έχει τέσσερις ισομορφές (1 έως 4) που προκύπτει από τέσσερα μεταγραφικές θέσεις εκκίνησης, και κάθε ισομορφή έχει ένα πλήρες κεντρικό επανάληψη τομέα Armadillo που μπορεί να αλληλεπιδράσει με την παραμεμβρανική περιοχή του Ε-καδερίνης, προκειμένου να συμμετέχουν στο σχηματισμό ενός συμπλόκου προσκόλλησης επί της κυτταρικής μεμβράνης [12]. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η υποκυτταρική εντόπιση και η λειτουργία του p120ctn μπορεί να επηρεαστεί από τον εντοπισμό του Ε-καδερίνης. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι μπορεί να παίζει p120ctn αντίθετους ρόλους ανάλογα με το αν βρίσκεται στη μεμβράνη ή στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων [13], [14]. Άλλοι έχουν επίσης βρει ότι p120ctn ισομορφών 1Α και 3Α έχουν διαφορετικές ρυθμιστικές λειτουργίες επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου, εισβολή και μετάσταση [15], [16],. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι αν p120ctn έχει αντίκτυπο στην EMT, είναι πιθανό να είναι διαφορετική μεταξύ p120ctn ισομορφών 1Α και 3Α.

Μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι η p120ctn μπορεί να προωθήσει ή να αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου και της εισβολής, ανάλογα με το αν E -cadherin εκφράζονται ή όχι [18], [19]. Yu και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν επίσης διαφορετικές επιπτώσεις της p120ctn ισομορφών 1Α και 3Α στον πολλαπλασιασμό και την εισβολή στα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν διαφορετικές τοπικές προσαρμογές της E-cadherin [20]. Έτσι, αν p120ctn ισομορφές 1Α και 3Α παίζουν επίσης διαφορετικούς ρόλους στη ρύθμιση της EMT σε καρκινικά κύτταρα με E-cadherin σε διαφορετικές θέσεις παραμένει άγνωστη.

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει τις πιθανές επιπτώσεις και στους ρυθμιστικούς μηχανισμούς των p120ctn ισομορφών 1Α και 3Α σε EMT σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Εμείς αποκάλυψε πρώτα ότι η μεμβράνη ή κυτταροπλασματική έκφραση του p120ctn συσχετίζεται με την έκφραση Ε-καδερίνης και βιμεντίνης ή λέμφου μετάσταση στους λεμφαδένες με ανοσοϊστοχημεία. Διαπιστώσαμε περαιτέρω τα επίπεδα έκφρασης του p120ctn, Ε-καδερίνης και βιμεντίνη σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα με κηλίδα Western και διαλογή κυτταρικών σειρών που εκφράζουν τόσο χαμηλά και υψηλά επίπεδα p120ctn και με Ε-καδερίνης στην μεμβράνη ή κυτταρόπλασμα. Αλλαγές στην έκφραση του ΕΜΤ-σχετικών μορίων και κυττάρων εισβολής ερευνήθηκαν επίσης με knockdown του ενδογενούς p120ctn-1Α ή υπερέκφραση με επιμόλυνση του p120ctn-1Α και 3Α πλασμιδίων σε κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

υλικά |

Αυτή η μελέτη διεξήχθη με την έγκριση του διοικητικού συμβουλίου θεσμικής αναθεώρησης σε Κίνα Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Γραπτή συγκατάθεση δόθηκε από τους συμμετέχοντες για τις πληροφορίες τους να αποθηκεύονται στη βάση δεδομένων του νοσοκομείου και για τα δείγματα τους για να χρησιμοποιηθεί σε αυτή τη μελέτη. Όλες οι κλινικές έρευνες διεξάγονται σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Τα δείγματα συλλέχθηκαν από 78 περιπτώσεις πλακώδους καρκίνου του πνεύμονα και το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα διαγιγνώσκονται στην Πρώτη συνδεδεμένες νοσοκομείο της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου (Sheny-ang, Κίνα). Τα δείγματα προέρχονταν από 46 άνδρες και 32 γυναίκες ασθενείς με μέσο όρο ηλικίας τα 57 έτη. Τα δείγματα ταξινομήθηκαν σύμφωνα με ιστολογικά κριτήρια όγκου πνεύμονα (2004) του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ) [21], όπως πλακώδες καρκίνωμα πνεύμονα (32 περιπτώσεις) ή των πνευμόνων αδενο-καρκίνωμα (46 περιπτώσεις). Τριάντα περιπτώσεις εξαιρετικά διαφοροποιημένες, και σαράντα οκτώ ήταν μετρίως ή φτωχά διαφοροποιημένα. Λεμφαδενικές μεταστάσεις ήταν παρόντα σε 43 περιπτώσεις, αλλά όχι στα άλλα 35. Έχουμε επιλεγμένες περιπτώσεις με μεταστάσεις λεμφαδένων να συγκρίνουν τις μεταστατικά οζίδια με τον πρωτογενή όγκο. Όγκου στάσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το σύστημα ο όγκος-κόμβο-μετάσταση (TNM) στάσης της Διεθνούς Ένωσης κατά του Καρκίνου (UICC) [22]. Υπήρξαν 39 περιπτώσεις στο στάδιο Ι-ΙΙ, και 39 περιπτώσεις στο στάδιο IIIa-IIIb. Κανένας από τους ασθενείς είχαν λάβει ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν την επέμβαση και τους δόθηκε η καθιερωμένη θεραπεία μετά την χειρουργική επέμβαση. Όλα τα δείγματα μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για παθολογική ανάλυση και διάγνωση.

κύτταρα

Κυτταροκαλλιέργεια

φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά (ΗΒΕ) και Α549, Η1299, Η460 και κυτταρικές γραμμές Η157 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Η ΕΚΠ-Α-1, κυτταρικές σειρές LK2 LTEP-Α-2 και αγοράστηκαν από τη Σαγκάη κυττάρων Τράπεζα της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών. Το ανθρώπινο πνεύμονα ADC κυτταρικές σειρές Anip973 και AGZY83a αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Bioleaf Biotech Co., Ltd (https://www.bioleaf.com) και αποθηκεύονται στο Τμήμα Παθολογίας, Harbin Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen), 100 IU /ml πενικιλλίνη (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) και 100 mg /ml στρεπτομυκίνη (Sigma) .

κατασκευή πλασμιδίου και επιμόλυνσης

η έκφραση πλασμιδίων για p120ctn ισομορφών 1Α και 3Α (δωρεά του Dr. Albert B. Τμήμα Reynolds Βιολογίας του Καρκίνου, Vanderbilt University School of Medicine, TN, USA) έχουν έχουν περιγραφεί προηγουμένως [16]. Ακολουθίες p120ctn-1A-siRNA (Guangzhou Ruibo Co. Ltd, Guangzhou, Κίνα) που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα ήταν τα εξής: SI-h-CTNND1: 5′-CACAAGAUGCCAACCCACU dTdT-3 ‘, 3′-dTdT GUGUUCUACGGUUGGGUGA-5’. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με p120ctn-1A-siRNA και πλασμίδια που εκφράζουν p120ctn ισομορφών 1Α και 3Α χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ή αντιδραστήριο επιμόλυνσης Attractene (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Η ανοσοϊστοχημεία

Τα ενσωματωμένα σε παραφίνη δείγματα κόπηκαν σειριακά σε 4-μm πάχους τομές. Κανονική βρογχικό επιθήλιο παρόν στα πλακίδια του όγκου χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός θετικός έλεγχος. Η ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε με τη στρεπταβιδίνης-υπεροξειδάσης (S-P) μέθοδο. Οι τομές ιστού επωάσθηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού p120ctn (1:100, cat 610134, BD Transduction Laboratories, Lexington, ΚΥ, ΗΠΑ.), Ε-καδερίνης μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (1:100, cat SC-7870?. Santa Cruz βιοτεχνολογία, Santa Cruz, CA, USA) ή vimentin μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (έτοιμο προς χρήση, γάτα. RMA-0547, MaiXin Bio, Fuzhou, Κίνα) στους 4 ° C για μια νύχτα. PBS χρησιμοποιήθηκε σαν ένας αρνητικός έλεγχος. Βιοτινυλιωμένο κατσίκας IgG ορού αντι-ποντικού ή IgG βιοτινυλιωμένο κατσίκας αντι-κουνελιού ορό (έτοιμο προς χρήση, cat. KIT-9922, MaiXin Βιο) χρησιμοποιήθηκε σαν το δευτερογενές αντίσωμα. Μετά την πλύση, οι τομές επωάστηκαν με στρεπταβιδίνη-βιοτίνη συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (Υπερευαίσθητα, MaiXin Βιο), και στη συνέχεια η αντίδραση υπεροξειδάσης εμφανίσθηκε με 3,3-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική (MaiXin Bio). Φως αντιχρωματισμός έγινε με αιματοξυλίνη, και στη συνέχεια οι τομές αφυδατώνονται σε αλκοόλ προτού τοποθετηθεί.

Δύο ερευνητές ανεξάρτητα εξέτασε όλες τις διαφάνειες των όγκων. Πέντε τυχαία πεδία εξετάστηκαν ανά διαφάνεια, και 100 κύτταρα παρατηρήθηκαν ανά πεδίο υψηλής μεγέθυνσης (400 ×). Το ποσοστό των θετικών κυττάρων βαθμολογήθηκε ως εξής: 0 = καμία χρώση? 1+ = 0-25%? 2+ = 26-50%? 3+ = 51-75%? και 4+ = 76-100%. Η ένταση χρώσης βαθμολογήθηκε ως εξής: 0 = καμία χρώση? 1 = ελαφρά κίτρινους κόκκους? 2 = σκούρο κίτρινο ή καφέ σε κόκκους. Το σκορ επισήμανση που ορίζεται από τον πολλαπλασιασμό του ποσοστού των θετικών κυττάρων από την ένταση χρώσης ήταν η τελική βαθμολογία για την ενότητα. Όταν η συνολική βαθμολογία ήταν ≥3, η υπόθεση ορίστηκε ως θετική. Όταν η συνολική βαθμολογία ήταν & lt? 3, η υπόθεση ορίστηκε ως αρνητική. Για βαθμολογίες μεγαλύτερη από 3 μονάδες, όταν περισσότερο από το 30% των κυττάρων του όγκου χρωματίζονται έντονα και συνεχώς για το σήμα p120ctn στην κυτταρική μεμβράνη, το δείγμα ορίστηκε ως μεμβράνη θετική. Όταν λιγότερο από το 30% των κυττάρων του όγκου εμφανίζεται έκφραση μεμβράνη αλλά χρωματίζονται έντονα και συνεχώς για p120ctn στο κυτταρόπλασμα, το δείγμα ορίστηκε ως κυτόπλασμα θετική.

Western ανάλυση κηλίδος

Πενήντα μικρογραμμάρια πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (10%). Μετά τη μεταφορά σε μία μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA), οι πρωτεΐνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντισώματα προς τα ακόλουθα: p120ctn (1:500, cat 610134.), Ε-καδερίνης ( 1:300, cat. 610181), Ν-cadherin (1:1000, cat. 610920) (BD Transduction Laboratories, Lexington, ΚΥ, ΗΠΑ), βιμεντίνη (1:1000, cat. 5741), σαλιγκάρι (1:500, γάτα. 3879) (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA) και twist (1:200, cat. SC-15193, Santa Cruz Biotechnology). Μετά από επώαση με αντι-ποντικού (1:2000, E030110-01) ή αντι-κουνελιού (1:2000, E030120-01) IgG (EarthOx LLC, San Francisco, CA, USA) στους 37 ° C για 2 ώρες, η πρωτεΐνη ζώνες έγιναν ορατές με τη χρήση ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) και ποσοτικά χρησιμοποιώντας bioimaging Συστημάτων (UVP, ορεινές, CA, USA). Σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης υπολογίστηκαν σε σχέση με GAPDH ως μάρτυρας φόρτωσης.

χρώση ανοσοφθορισμού

κύτταρα αναπτύσσονται σε γυάλινες καλυπτρίδες στερεώθηκαν με παγωμένο 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά, που ακολουθείται από διαπερατοποίηση με 0,2% Triton Χ-100 και επώαση με φυσιολογικό ορό κατσίκας για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύχτα με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού p120ctn (1:200, cat 610134?. BD Transduction Laboratories, Lexington, ΚΥ, ΗΠΑ) και Ε-καδερίνης αντίσωμα κουνελιού πολυκλωνικό (1:100, SC-7870? Santa Cruz Biotechnology). Πρωτογενή αντισώματα εφαρμόσθηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C, που ακολουθείται από επώαση με ροδαμίνη /φλουορεσκεΐνη-5-ισοθειοκυανικό (FITC) -σημασμένου δευτερεύον κατσίκας αντίσωμα αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού IgG TRITC-επισημασμένο κατσίκα (1:100, cat. E031210 -01 και E031320-01, EarthOx, San Francisco, CA, USA). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με ιωδιούχο προπίδιο /4, 6 διαμιδινο-2-phenylin-Dole. Επιφθορισμού μικροσκοπία διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο Nikon TE300 (Melville, ΝΥ, USA), και συνεστιακή μικροσκοπία διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα Radiance 2000 σάρωσης με λέιζερ συνεστιακό μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Thornwood, ΝΥ, USA).

Matrigel κύτταρο εισβολή δοκιμασία

Matrigel προσδιορισμούς κυτταρικής εισβολής διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Corning, Acton, ΜΑ, USA). Μια 100-μΙ κυτταρικού εναιωρήματος (5 × 10

5 κυττάρων) προστέθηκε στον άνω θάλαμο, ενώ ο κατώτερος θάλαμος γεμίστηκε με μέσο RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. Κάθε άνω και κάτω θάλαμος χωρίζονται από ένα 8-μm μεμβράνη πορώδους πολυανθρακικό. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C σε υγρή ατμόσφαιρα με 5% CO

2. Αφού το μέσο απορρίφθηκε, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη για 30 λεπτά και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη (Sigma). Για κάθε φίλτρο, οι αριθμοί των κυττάρων που εισέβαλαν στην κατώτερη επιφάνεια της πορώδους μεμβράνης σε πέντε διαφορετικά πεδία 400 χ μεγέθυνση μετρήθηκαν τυχαία χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Nikon Ε200. Η μέση υπολογίστηκε από δεδομένα που λαμβάνονται από κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Η στατιστική ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) για το λογισμικό των Windows . Η δοκιμή chi-square χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων ανοσοϊστοχημεία. Η ανεξάρτητη δοκιμή δειγμάτων Τ χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί Transwell πειραματικά δεδομένα.

P

τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

έκφραση μεμβράνης του p120ctn συσχετίζεται θετικά με την έκφραση Ε-καδερίνης και αρνητικά συσχετίζεται με την έκφραση της βιμεντίνης και λεμφαδένα μετάσταση

Κανονικό βρογχικών επιθηλιακών ιστών έδειξε p120ctn στη μεμβράνη (Εικόνα 1Α), ενώ το ποσοστό των ιστών καρκίνου του πνεύμονα που εκφράζουν p120ctn στη μεμβράνη ήταν σημαντικά χαμηλότερη (35%, 27/78) από εκείνη με p120ctn κυτταροπλασματική έκφραση (65 %, 51/78). Ε-καδερίνη εκφράζεται στη μεμβράνη σε φυσιολογικούς ιστούς βρογχικό επιθήλιο (Εικόνα 1Α), ενώ το ποσοστό των θετικών έκφραση μειώθηκε (28%, 22/78) και της αρνητικής έκφρασης ήταν σημαντικά αυξημένη (72%, 56/78) για Ε-καδερίνη σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. Βιμεντίνης αρνητικά εκφράζεται σε φυσιολογικά βρογχικά επιθηλιακά ιστούς (Σχήμα 1Α), ενώ το ποσοστό των θετικών έκφρασης αυξήθηκε σε 32% (25/78) στον ιστό καρκίνου του πνεύμονα. Φαίνεται καρκίνο του πνεύμονα ιστούς με κυτταροπλασματικό /πυρηνικό εντοπισμό του p120ctn έτεινε να εκφράσουν βιμεντίνη σε σύγκριση με εκείνους με τη μεμβρανώδη εντοπισμού (41,2% [21/51] έναντι 14.8 [4/27]) .. Κυτταροπλασματικά /πυρηνικό εντοπισμό του p120ctn έδειξαν αυξημένη λέμφος μετάσταση στους λεμφαδένες (29/51) σε σύγκριση με την μεμβρανώδη εντοπισμού (8/27). Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι ο εντοπισμός των p120ctn ήταν στενά συνδεδεμένη με την έκφραση Ε-καδερίνης, βιμεντίνη έκφρασης και λεμφαδένα μετάσταση (

P

& lt? 0,05) (Πίνακας 1). Με άλλα λόγια, η έκφραση μεμβράνη p120ctn συσχετίστηκε θετικά με την έκφραση Ε-καδερίνης και αρνητική συσχέτιση με την έκφραση βιμεντίνη και λεμφαδένα μετάσταση (Σχήμα 1Β)? Εν τω μεταξύ, p120ctn κυτταροπλασματική έκφραση σχετίστηκε αρνητικά με την έκφραση Ε-καδερίνης και συσχετίζεται θετικά με την έκφραση βιμεντίνη και λεμφαδένα μετάσταση (σχήμα 1 C).

(Α) Ε-καδερίνης και p120ctn είχαν μεμβράνη θετικά, και βιμεντίνης ήταν αρνητική σε φυσιολογικά βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα. (Β) Ε-καδερίνης ήταν μεμβράνη θετική, και βιμεντίνη ήταν αρνητική p120ctn θετικής μεμβράνης καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. (Γ) Ε-καντερίνη ήταν αρνητική, και βιμεντίνης ήταν θετική σε p120ctn κυτταροπλασματικό-θετικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων.

Η

Εντοπισμός p120ctn είναι συνεπής με E-cadherin στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων

θα εξεταστούν τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του p120ctn και E-cadherin στα φυσιολογικά κύτταρα ΗΒΕ και εννέα πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές σειρές με κηλίδα Western και διαπίστωσε ότι όλοι εξέφρασαν ισομορφές κυρίως 1Α (120 kDa) και 3Α (100 kDa) της p120ctn ( Σχήμα 2Α). Παρά το γεγονός ότι τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του p120ctn δεν είχαν σχέση με E-cadherin, ο εντοπισμός (μεμβράνη ή κυτταρόπλασμα) της p120ctn ήταν πάντα συνεπής με εκείνη της E-cadherin. Στη συνέχεια διαλογή κυττάρων που εκφράζουν υψηλά επίπεδα p120ctn και Ε-καδερίνης στην μεμβράνη (Η460 κύτταρα) ή κυτόπλασμα (κύτταρα SPC), καθώς και εκείνοι που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα p120ctn και Ε-καδερίνης στην μεμβράνη (H4299 κύτταρα) ή κυτταρόπλασμα ( κύτταρα LK2) για περαιτέρω μελέτη (Σχήμα 2Β).

(Α) αναλύσεις Western blot έδειξε έκφραση του p120ctn και Ε-καδερίνης σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα και εννέα HBE. (Β) με ανάλυση ανοσοφθορισμού, η έκφραση Ε-καδερίνης και p120ctn παρατηρήθηκαν περιορίζεται στην κυτταρική μεμβράνη σε κυττάρου-κυττάρου ενώσεις προσφύσεως σε Η460 και Η1299 κύτταρα, ενώ και οι δύο είχαν περιοριστεί στο κυτταρόπλασμα στα κύτταρα SPC και LK2.

Διαφορετικές λειτουργίες του p120ctn ισομορφής 1Α στο EMT εξαρτώνται από την E-cadherin υποκυτταρικό εντοπισμό

Νοκ ντάουν της ενδογενούς p120ctn ισομορφής 1Α με siRNA-p120ctn-1A οδήγησε σε μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης και την αύξηση της Ν-cadherin, σαλιγκάρι και βιμεντίνη έκφραση σε κύτταρα Η460 (Σχήμα 3Α). Ωστόσο, knockdown του ενδογενούς p120ctn-1A με siRNA-p120ctn-1Α έδειξε αντίθετα αποτελέσματα σε κύτταρα SPC, όπου βρήκαμε αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης και μειωμένη Ν-cadherin, σαλιγκάρι και έκφραση βιμεντίνης (Σχήμα 3Β). Σε σύγκριση με τον έλεγχο, η κατάλυση της p120ctn ισομορφής 1Α ενίσχυσε επίσης την ικανότητα εισβολής των κυττάρων Η460 (17.33 ± 1.25 έναντι 36.33 ± 1.70,

P

& lt? 0,01) (Σχήμα 3C), ενώ μειώνεται η διηθητικότητα κυττάρων SPC (23.0 ± 0.82 έναντι 13,0 ± 0,82,

P

& lt? 0,01) (Σχήμα 3D). Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η p120ctn ισομορφή 1Α παίζει ένα διαφορετικό ρόλο στην EMT και κυττάρων εισβολής σε διάφορες E-cadherin υποκυτταρικές θέσεις.

(Α) Κατάλυση της p120ctn ισομορφής 1A μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης και την αύξηση της Ν-cadherin, σαλιγκάρι και βιμεντίνης έκφραση σε κύτταρα Η460. (Β) κύτταρα SPC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο (Α) και τα αντίθετα αποτελέσματα αποκτήθηκαν. (Γ) Κατάλυση της p120ctn ισομορφής 1Α ενίσχυσε την ικανότητα εισβολής των κυττάρων Η460 (**

P

& lt? 0,01). (D) Κατάλυση της p120ctn ισομορφής 1Α μείωσε την ικανότητα εισβολής των κυττάρων SPC (**

P

& lt? 0,01).

Η

ανασταλτική λειτουργία της p120ctn ισομορφής 3Α στην EMT δεν επηρεάζεται από διαφορές στο E-cadherin υποκυτταρικό εντοπισμό

Για να επαληθευθεί αν p120ctn ισομορφών 1Α και 3Α παίζουν διαφορετικούς ρόλους στη ρύθμιση EMT, πλασμίδια έκφρασης τους επιμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα με χαμηλή έκφραση του p120ctn (Η1299 με μεμβράνη E-cadherin έκφραση και LK2 με κυτταροπλασματική έκφραση Ε-καδερίνης). Η ανάλυση δυτικού στυπώματος κατέδειξε ότι η υπερέκφραση του p120ctn ισομορφής 1Α οδήγησε σε αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης και μειωμένη Ν-cadherin, βιμεντίνη και σαλιγκάρι έκφρασης (Σχήμα 4Α)? αντιθέτως, η μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης και αυξημένη Ν-cadherin, βιμεντίνη και σαλιγκάρι έκφραση παρατηρήθηκε σε κύτταρα LK2 (Σχήμα 4Β). Η υπερέκφραση του p120ctn ισομορφής 1Α μείωσε επίσης το Η1299 κυττάρων εισβολής (52,0 ± 2,65 έναντι 33,33 ± 2,64,

P

& lt? 0,01) (Σχήμα 4C), ενώ ενίσχυσε την εισβολής κυττάρων LK2 (18,0 ± 0,82 vs. 39,66 ± 2,05,

P

& lt? 0,01) (Σχήμα 4D) .. Η υπερέκφραση του p120ctn ισομορφής 3Α οδήγησε σε αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης, μειωμένη Ν-cadherin, βιμεντίνη και σαλιγκάρι έκφρασης (Σχήμα 4Α, 4Β) και μειωμένη εισβολής κυττάρων (52,0 ± 2,65 έναντι 29,66 ± 1,53,

P

& lt? 0,01? 18.0 ± 0.82 έναντι 8.33 ± 0.47 έκφρασης,

P

& lt? 0,01) (Σχήμα 4C, 4D ) σε δύο από αυτές τις κυτταρικές σειρές. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι η περαιτέρω p120ctn ισομορφή 1Α είχε μια διαφορετική επίδραση επί EMT ανάλογα με τη υποκυτταρική εντόπιση της Ε-καδερίνης. Αποκάλυψαν επίσης ότι η p120ctn ισομορφή 3Α διατηρείται μια ανασταλτική ρόλο στην ΕΜΤ του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων είτε Ε-καδερίνης ήταν εντοπισμένη στην μεμβράνη ή στο κυτταρόπλασμα.

(Α, Β) Τόσο Η1299 (μεμβράνη Ε-καδερίνης εντοπισμός) και LK2 κύτταρα (Ε-καδερίνης κυτταροπλασματική εντόπιση) παροδικά επιμολυσμένα με το πλασμίδιο 3Α p120ctn ισομορφή έδειξαν αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης και μειωμένη Ν-cadherin, βιμεντίνη και σαλιγκάρι έκφρασης. (C, D) Παροδική επιμόλυνση των πλασμιδίων 3Α p120ctn ισομορφή σε κύτταρα Η1299 και LK2 οδήγησε σε μειωμένη κυτταρική διεισδυτικότητα (**

P

& lt? 0,01). (Ε) Ε-καδερίνης παρέμεινε εντοπισμένη επί της μεμβράνης σε Η1299 κύτταρα και στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων LK2 μετά την επιμόλυνση του πλασμιδίου p120ctn ισομορφή 3Α.

Η

Συζήτηση

Το φαινόμενο της ΕΜΤ σε κύτταρα όγκου συχνά οδηγεί σε μειωμένη κυτταρική προσκόλληση και την αύξηση της κινητικότητας, και αυτή η μετάβαση συνοδεύεται από μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης και αυξημένη έκφραση του Ν-καδερίνης, βιμεντίνη και άλλα μεσεγχυματικά βιοδεικτών [3], [4], [5], [ ,,,0],6], [7]. Ως ένα σημαντικό παράγοντα για τη σταθεροποίηση Ε-καδερίνης, p120ctn παίζει ένα ρόλο στην αναστολή ή την προαγωγή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και εισβολή που εξαρτάται από το αν Ε-καδερίνης εκφράζεται ή όχι [16], [17]. Επιπλέον, p120ctn ισομορφές 1Α και 3Α έχουν δείξει διαφορετικά αποτελέσματα επί της έκφρασης Ε-καδερίνης και διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων οι οποίες βασίζονται στις διαφορές στον εντοπισμό του Ε-καδερίνης [18]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι p120ctn πιθανότατα ρυθμίζει την EMT των καρκινικών κυττάρων επηρεάζοντας την έκφραση Ε-καδερίνης και ότι p120ctn ισομορφών 1Α και το παιχνίδι 3Α διαφορετικούς ρόλους στην EMT έκφραση Ε-καδερίνης σε διαφορετικές υποκυτταρικές θέσεις.

Πρέπει πρώτα βρεθούν ότι η έκφραση μεμβράνη p120ctn συσχετίστηκε θετικά με την έκφραση Ε-καδερίνης και αρνητική συσχέτιση με την έκφραση βιμεντίνη και μετάσταση λεμφαδένα, ενώ η κυτταροπλασματική έκφραση του p120ctn σχετίστηκε αρνητικά με την έκφραση Ε-καδερίνης και συσχετίζεται θετικά με την έκφραση βιμεντίνη και μετάσταση λεμφαδένα με ανοσοϊστοχημεία . Αν και αυτά τα αποτελέσματα ήταν συνεπή με προηγούμενες μελέτες [13], [14], πρότειναν περαιτέρω ότι p120ctn επηρεάζει πιθανώς την ΕΜΤ επηρεάζοντας την έκφραση της Ε-καδερίνης και βιμεντίνη και με αυτόν τον τρόπο την εισβολή κυττάρων και τη μετάσταση σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ( NSCLC).

για να επιβεβαιώσετε τις διαφορετικές επιπτώσεις της p120ctn ισομορφών 1Α και 3Α σε EMT σε κύτταρα που εκφράζουν Ε-καδερίνης σε διαφορετικές τοποθεσίες, επιλέξαμε κύτταρα Η460 και Η1299 με την έκφραση μεμβράνη E-cadherin και τα κύτταρα SPC και LK2 με E-cadherin κυτταροπλασματικής έκφρασης για περαιτέρω ανάλυση. Τα πλασμίδια που εκφράζουν το p120ctn ισομορφών 1Α και 3Α κατασκευάστηκαν, και ο πλήρους μήκους p120ctn siRNA συντέθηκε για αυτά τα πειράματα. Δεδομένου ότι η αλληλουχία πέραν των αμινοξέων 1-101 του p120ctn ισομορφής 1Α είναι παρόμοια με εκείνη του p120ctn ισομορφής 3Α [24], [25], δεν θα μπορούσαμε να σχεδιάσουμε μια αλληλουχία παρεμβολή ειδικά για p120ctn ισομορφή 3Α. Ως εκ τούτου, θα έπρεπε να μελετήσει περαιτέρω τον αντίκτυπο των δύο ισομορφών σε EMT και κυττάρων εισβολής στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων με διαφορετικές τοποθεσίες E-cadherin ειδικά από να χτυπήσει κάτω p120ctn ισομορφή 1Α σε Η460 και SPC κύτταρα με υψηλή έκφραση p120ctn και την επιμόλυνση των πλασμιδίων cDNA για εξωγενή p120ctn ισομορφών 1Α και 3Α σε κύτταρα Η1299 και LK2 με χαμηλή έκφραση του p120ctn.

Νοκ ντάουν της p120ctn ισομορφής 1Α στα κύτταρα Η460 κατέστρεψαν τα συγκροτήματα επιθηλιακά κυτταρική προσκόλληση. έκφραση Ε-καδερίνης επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω λόγω της απώλειας του σημαντικός παράγοντας σταθεροποιήσεως της, p120ctn ισομορφή 1Α, το οποίο ήταν σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες [20], [26]. Μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης και διασπάστηκαν προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου μπορεί να προκαλέσει ΕΜΤ [27], [28], [43], [44], η οποία οδηγεί σε αυξημένη Ν-cadherin, βιμεντίνη και σαλιγκάρι έκφρασης και ενισχυμένη κυτταρική διεισδυτικότητα. Από την άλλη πλευρά, υπερεκφράζεται p120ctn ισομορφές 1Α και 3Α δείχθηκε ότι δεσμεύεται E-cadherin που βρίσκεται στην μεμβράνη προληπτικά σε κύτταρα όγκου [29] και, στη συνέχεια, αναστέλλουν την αποδόμηση της Ε-καδερίνης και να σταθεροποιήσει την έκφρασή του, συμβάλλοντας στον σχηματισμό αποτελεσματικών επιθηλιακών σύμπλοκα προσκόλλησης κυττάρου [30], [31], [32]. Δεδομένου ότι αυτές οι σειρές των διεργασιών διατήρησε την κανονική σύνδεση προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου και ανέστειλαν EMT, υπήρχε αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης και μειωμένη Ν-cadherin, βιμεντίνη και σαλιγκάρι έκφρασης, όπως επίσης και αναστέλλει διεισδυτικότητα κυττάρων σε Η1299 κύτταρα.

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι αν και p120ctn ισομορφή 1A μπορούσε να δεσμεύσει Ε-καδερίνης στο κυτταρόπλασμα, δεν μπορούν να σχηματίσουν σύμπλοκα αποτελεσματική πρόσφυση επί της μεμβράνης μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων [33]. Επιπλέον, η κυτταροπλασματική Ε-καδερίνης είναι πιθανό να μην είναι το πλήρους μήκους Ε-καδερίνης, αλλά αντ ‘αυτού διασπασμένων θραυσμάτων Ε-καδερίνης, όπως Ε-cad /SE-CAD (80 kDa) και Ε-CAD /CTF2 (33 kDa) [34]. Το E-cad /CTF2 θραύσμα μπορεί να συνδεθεί με ρ120 στο κυτταρόπλασμα και στη συνέχεια μετατοπίζονται μέσα στον πυρήνα και δεσμεύουν την μεταγραφικός καταστολέας του Kaiso για την ενεργοποίηση της Wnt /β-κατενίνης μονοπάτι [35], [36], προωθώντας τελικά την EMT του όγκου κύτταρα και ενισχύοντας εισβολή κυττάρων και τη μετάσταση [37]. Επιπλέον, άλλοι έχουν δείξει ότι p120ctn-1A σχετίζεται με ανώμαλη έκφραση της Ε-καδερίνης και φτωχή πρόγνωση [38]. Οι μελέτες αυτές φαίνεται ότι η κυτταροπλασματική p120ctn ισομορφή 1Α μπορεί να διαδραματίσει ένα ρόλο στην προώθηση του όγκου των κυττάρων EMT, εισβολή και τη μετάσταση. Με βάση τα παραπάνω, παρατηρήσαμε τη μία πλευρά ότι το αποτέλεσμα της p120ctn ισομορφής 1Α για την προώθηση της EMT καρκινικών κυττάρων, εισβολή και μετάσταση, θα ανυψώνεται από την εκτομή του, με αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης, μειωμένη Ν-cadherin, βιμεντίνη και σαλιγκάρι έκφρασης και ανέστειλε εισβολής στα κύτταρα SPC. Από την άλλη πλευρά, η επιμόλυνση του πλασμιδίου 1Α p120ctn ισομορφή σε κύτταρα που εκφράζουν LK2 κυτταροπλασματική Ε-καδερίνης οδήγησε σε μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης, αυξημένη Ν-cadherin, βιμεντίνη και σαλιγκάρι έκφρασης και ενισχυμένη κυτταρική διεισδυτικότητα. Αν και ο ακριβής ρόλος της p120ctn κατά την επαγωγή EMT είναι ακόμα αδιευκρίνιστα, προηγούμενες μελέτες πρότειναν ότι νοκ ντάουν όλων των ισομορφών της p120ctn θα μπορούσε να προκαλέσει EMT έμμεσα [27], [28], [43], [44]. Όλες οι επαγωγές βασίστηκαν σε μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης και μεσοκυττάρια πρόσφυση σε προηγούμενες μελέτες, οι οποίες επιβεβαιώθηκαν και από τη μελέτη μας σε κύτταρα Η460 με εντόπιση μεμβράνης E-cadherin. Σε αντίθεση με τα κύτταρα Η460, knockdown του p120ctn ισομορφής 1Α σε κύτταρα SPC με Ε-καδερίνης κυτταροπλασματική έκφραση δεν θα μπορούσε να μειώσει την έκφραση Ε-καδερίνης και ενδοκυτταρικής προσκόλλησης. Αντ ‘αυτού, βρήκαμε αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης και μειωμένη κυτταρική διεισδυτικότητα, υποδεικνύοντας ότι η EMT δεν μπορούσε να προκληθεί από αυτή την οδό σε κύτταρα SPC.

Ήταν Αξίζει να σημειωθεί ότι το ίδιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε LK2 και Η1299 κύτταρα επιμολυσμένα με το πλασμίδιο 3Α p120ctn ισομορφή, τόσο δείχνει αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης, μειωμένη Ν-cadherin, βιμεντίνη και σαλιγκάρι έκφραση και ανέστειλε διεισδυτικότητα κυττάρων. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι p120ctn ισομορφή 3Α έχει τη λειτουργία αναστολής ΕΜΤ του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων, και αυτή η λειτουργία είναι ανεξάρτητη της κυτταρικής εντόπισης Ε-καδερίνης. Προηγούμενες έρευνες είχαν επιβεβαιώσει επίσης μια μετατόπιση από p120ctn ισομορφή 3Α για να p120ctn έκφραση 1Α ισομορφή μετά την επαγωγή της EMT [9], [10], [11], η οποία εμμέσως δείχνει ότι p120ctn ισομορφή 3Α μπορεί να αναστείλει την EMT ενώ p120ctn ισομορφή 1Α προωθεί EMT. Επιπλέον, έχουμε παρατηρήσει επίσης ότι τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης p120ctn και Ε-καδερίνης ήταν σημαντικά αυξημένα μετά την επιμόλυνση του πλασμιδίου p120ctn-3A εντός LK2 και Η1299 κύτταρα, αλλά p120ctn και Ε-καδερίνης ήταν ακόμη περιορίζεται κυρίως στην κυτταρική μεμβράνη στο κύτταρο-κύτταρο διασταυρώσεις adherens στα κύτταρα Η1299. Αντιθέτως, η Ε-καδερίνη και p120ctn ήταν σχεδόν αποκλειστικά βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα στα κύτταρα LK2 (Σχήμα 4Ε). Ως μόριο κυτταρικής προσκόλλησης, Ε-καδερίνης είναι γνωστό ότι βρίσκεται μόνο στην κυτταρική μεμβράνη με δυνατότητα να αναστέλλει EMT, ενώ στο κυτταρόπλασμα, συχνά διασπάται σε τεμάχια και ως εκ τούτου λειτουργεί διαφορετικά από τα μόρια που βρίσκονται στην κυτταρική μεμβράνη [ ,,,0],34]. Έτσι, η κυτταροπλασματική Ε-καδερίνης θα θεωρητικά δεν παίζουν ρόλο στην αναστολή της EMT. Με βάση την ανωτέρω ανάλυση, εικάζουν ότι μπορεί να υπάρχει κάποια αλληλεπίδραση μεταξύ p120ctn ισομορφή 3Α και σαλιγκάρι που παίζει ρόλο στην καταστολή ΕΜΤ στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα που εκφράζουν κυτταροπλασματική Ε-καδερίνης, αλλά η υπόθεση αυτή απαιτεί περαιτέρω μελέτη.

Σημαντικά, βρήκαμε επίσης ότι knockdown του p120ctn-1Α σε SPC κύτταρα με κυτταροπλασματικά Ε-καδερίνης οδήγησε σε μειωμένη έκφραση συστροφή (Σχήμα 3Β). Εν τω μεταξύ, η επιμόλυνση των κυττάρων LK2, η οποία έδειξε επίσης κυτταροπλασματική εντόπιση της Ε-καδερίνης, με το πλασμίδιο 1Α p120ctn ισομορφή οδήγησε σε αυξημένη έκφραση συστροφή (Σχήμα 4Β). Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στην έκφραση συστροφή στο υπόλοιπο των πειραμάτων (Σχήμα 3Α, 4Α). Ως παράγοντας μεταγραφής και κύριο γονίδιο του ρυθμιστή της EMT [39], [40], στρίψιμο να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση Ε-καδερίνης [41] και upregulate Ν-cadherin και άλλων βιοδεικτών μεσεγχυματικά [42].