Αφηρημένο

ευαίσθητες και ειδικές βιοδείκτες της αναστολής της πρωτεϊνικής κινάσης μπορεί να λειτουργήσει ως μοχλός για την επιτάχυνση μελέτες ανάπτυξης φαρμάκων στην ογκολογία συσχετίζοντας νωρίς μοριακή ανταπόκριση με αναστολή στόχου. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε αμερόληπτη κυνηγετικό όπλο φωσφοτυροσίνης (ρΥ) πρωτεϊνωματική να ανακαλύψουν νέες βιοδείκτες της απάντησης στο dasatinib, ένα μικρό μόριο Src-εκλεκτικός αναστολέας, σε προκλινικά μοντέλα καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC). Πραγματοποιήσαμε αμερόληπτη μάζας πρωτεομική φασματομετρία κυνηγετικό όπλο ρΥ να αποκαλύψει την proteome ρΥ των καλλιεργημένων κυττάρων του παχέος εντέρου καρκινώματος HCT-116, και στη συνέχεια να επεκταθεί αυτή την ανάλυση σε όγκους ξενομοσχεύματος HCT-116 για να διαπιστώσετε ρΥ βιοδείκτες του dasatinib-απόκρισης in vivo. Σημαντικές dasatinib-απόκρισης sites ρΥ στο ξενομόσχευμα όγκων που περιλαμβάνονται sites στο πρωτεϊνική κινάση δέλτα τύπου C (ΡΚΟδ), πρωτεΐνη CUB-περιοχή που περιέχουν 1 (CDCP1), τύπου ΙΙ SH2-περιοχή που περιέχουν ινοσιτόλη 5-φωσφατάση (SHIP2), και άλφα φωσφατάσης πρωτεΐνη-υποδοχέα τυροσίνης (RPTPα). Η περιοχή pY313 ΡΚΟδ περαιτέρω υποστήριξη στο σχετικό βιοδεικτών του dasatinib μεσολάβηση της αναστολής Src σε ξενομοσχεύματα HCT-116 με ανοσοϊστοχημεία και ανοσοκηλίδωση με ένα αντίσωμα phosphospecific. Μείωση του ΡΚΟδ pY313 περαιτέρω σχετίζεται με dasatinib μεσολάβηση αναστολή της Src και μειωμένη ανάπτυξη ως σφαιροειδή ενός πάνελ ανθρώπινων κυτταρικών σειρών CRC. Αυτές οι μελέτες αποκαλύπτουν ΡΚΟδ pY313 ως μια πολλά υποσχόμενη ανάγνωση της αναστολής Src στη CRC και ενδεχομένως άλλων στερεών όγκων και μπορεί να αντανακλά την ανταπόκριση στο dasatinib σε ένα υποσύνολο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. McKinley ET, Liu Η McDonald WH, Luo W, Zhao P, Coffey RJ, et al. (2013) Παγκόσμια φωσφοτυροσίνη Πρωτεομική Αναγνωρίζει ΡΚΟδ ως δείκτης της ανταπόκρισης στις Src Αναστολή στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (11): e80207. doi: 10.1371 /journal.pone.0080207

Επιμέλεια: Laszlo Buday, Ουγγρική Ακαδημία Επιστημών, Ουγγαρία

Ελήφθη: 19 Ιούλη του 2013? Αποδεκτές: 30 του Σεπτεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Νοεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 McKinley et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτές οι μελέτες υποστηρίζονταν από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου: R25 CA136440, P50-951903? R01-CA140628? K25-CA127349? RC1-CA145138? R01-CA46413? και το Ίδρυμα Kleberg. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η τυροσίνη φωσφορυλίωση είναι ένας βασικός μηχανισμός σηματοδότησης που ρυθμίζουν κεντρικές πτυχές της συμπεριφοράς των κυττάρων θηλαστικών συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού, της κινητικότητας, του μεταβολισμού και της διαφοροποίησης [1]. Οι πρωτεϊνικές κινάσες της τυροσίνης πρώτα αναγνωρίζονται ως προϊόντα των ιικών ογκογονιδίων, συμπεριλαμβανομένων v-src και v-abl, και ως υποδοχείς για παράγοντες ανάπτυξης, συμπεριλαμβανομένων EGF. Η παρεκκλίνουσα σηματοδότηση από πολλά από τα ενενήντα συμβατικών κινάσες τυροσίνης που κωδικοποιείται από το ανθρώπινο γονιδίωμα έχει συνδεθεί με διεργασίες ασθένειας, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης και της εξάπλωσης του καρκίνου [1,2].

Η στοχευμένη θεραπεία με αναστολείς της τυροσινικής κινάσης (TKIs) είναι μια συνεχώς διευρυνόμενη μορφή που επιτρέπει την εξατομικευμένη θεραπεία του καρκίνου [3,4]. Landmark παραδείγματα περιλαμβάνουν το μικρό imatinib αναστολέα μόριο που αντιμετωπίζει αποτελεσματικά χρόνια μυελογενή λευχαιμία που κινείται από τον BCR-ABL ογκοπρωτεϊνης [5,6], καθώς και θεραπείες για την αναστολή μεταλλαγμένου BRAF σε καρκίνους όπως μελάνωμα [7,8]. Μικρό μόριο TKIs και εξουδετερωτικά μονοκλωνικά αντισώματα που στοχεύουν τον υποδοχέα EGF (EGFR) και /ή το στενά συνδεδεμένα ERBB2 (HER2 /neu) είχαν επιτυχία στη θεραπεία του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα και καρκίνωμα του μαστού [9,10].

Σε καρκίνωμα του παχέος εντέρου (CRC), η μεγάλη πλειονότητα των περιπτώσεων εμφανίζουν αυξημένη δραστικότητα της Src οικογένειας μη υποδεκτικές κινάσες τυροσίνης [11,12], η οποία αυξάνει προοδευτικά σε δραστηριότητες όπως οι όγκοι να εξελιχθεί σε μεταστατική νόσο [13]. Η ανώμαλη δραστικότητα Src μπορεί να συμβάλει στην κακοήθεια με πρόσκρουση πολλαπλά συστήματα υποδοχέων, συμπεριλαμβανομένων κόμβων καντερίνη μεσολάβηση κυττάρου-κυττάρου, διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη συμφύσεις κυττάρων-ECM, και ενεργοποιημένα συμπλέγματα υποδοχέων συμπεριλαμβανομένων EGFR [14-16]. Αυξημένη δραστικότητα Src σε CRC προβλέπει φτωχή κλινική πρόγνωση [17]. Κατά συνέπεια, υπήρξε σημαντικό ενδιαφέρον στην Src ως θεραπευτικός στόχος σε CRC και άλλων καρκίνων [18-21]. Dasatinib, η πιο κλινικά μελετηθεί Src-εκλεκτικός αναστολέας, είναι ένας αποτελεσματικός κυτταροστατικός παράγοντας αναστολής της ανάπτυξης του όγκου, εισβολή, και μετάσταση [22]. Εκτός από την Src-οικογένειας κινασών, dasatinib αναστέλλει αποτελεσματικά BCR-ABL και δείχθηκε πρόσφατα να είναι ανώτερη από imatinib ως θεραπεία για τη χρόνια μυελογενή λευχαιμία [23].

Κατά την αξιολόγηση στοχευμένη TKIs στην κλινική ογκολογία, υπάρχει η ανάγκη για τον εντοπισμό σχετικών βιοδεικτών που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να καθοδηγήσει την επιλογή της δόσης σε προκλινικές ανάπτυξη και να παρακολουθούν τη δραστηριότητα κατά των όγκων σε κλινικές δοκιμές. Βιοδείκτες μπορεί επίσης να είναι χρήσιμος στην πρόβλεψη για το αν ένας ασθενής είναι πιθανό να επωφεληθούν από μια συγκεκριμένη θεραπεία. Αρκετές μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει διάφορες προσεγγίσεις σε μια προσπάθεια να εντοπίσουν τέτοιες δείκτες [24-26]. Λογικά, όπως βιοδείκτες θα μπορούσε επίσης να είναι συγκεκριμένες θέσεις τυροσίνης που φωσφορυλιώνονται από την κινάση (ες) που αναστέλλεται. Έτσι, είναι ενδιαφέρον να χαρακτηρίζουν τα μονοπάτια σηματοδότησης κινάσης τυροσίνης που λειτουργούν στα κύτταρα του όγκου. Η φωσφορυλίωση της τυροσίνης σε κύτταρα όγκου μπορεί συστηματικά και περιεκτικά να σκιαγραφείται χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας για την ανάλυση πεπτιδίων εμπλουτισμένο για φωσφοτυροσίνη (ΡΥ) με ανοσοσυγγένεια [27]. Έχουμε εφαρμόσει στο παρελθόν αυτή την αμερόληπτη προσέγγιση πρωτεομική κυνηγετικό όπλο για να αποκτήσουν μια σε βάθος ανάλυση της φωσφορυλίωσης της τυροσίνης σε κανονικά έναντι Src-μετασχηματισμένες ινοβλάστες ποντικού, χαρακτηρίζοντας έτσι την παγκόσμια επίπτωση των ογκογόνων Src [28]. Σε μια άλλη εφαρμογή αυτής της προσέγγισης, ρΥ σηματοδότηση σε ένα μεγάλο δειγματοληψία του μη μικροκυτταρικού καρκίνου κυτταρικές σειρές πνεύμονα και συμπαγών όγκων αποκάλυψε ενεργοποιούνται κινασών τυροσίνης [29].

Οι στόχοι της παρούσας μελέτης ήταν να χρησιμοποιήσει καραμπίνα ρΥ πρωτεϊνωματική να αποκτήσουν μια συνολική εικόνα της φωσφορυλίωσης τυροσίνης στο γνωστό ανθρώπινου παχέος εντέρου αδενοκαρκινώματος κυτταρική γραμμή HCT-116, και να επεκταθεί η ανάλυση σε HCT-116 όγκους ξενομοσχεύματος που έλαβαν θεραπεία με dasatinib για τον εντοπισμό dasatinib-απόκρισης βιοδείκτες ρΥ. Εντοπίσαμε τοποθεσίες ρΥ σε πρωτεΐνες σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων ΡΚΟδ CDCP1, και RPTPα ως σημαντικές dasatinib-απόκρισης χώρων σε όγκους ξενομοσχεύματος HCT-116 που μπορεί να είναι χρήσιμες ως προγνωστικοί βιοδείκτες της αναστολής SRC. Τέλος, χρησιμοποιώντας καλλιέργειες σφαιροειδές εγκατεστημένος από έναν αριθμό ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών CRC, παρατηρήσαμε μια συσχέτιση μεταξύ datatinib μεσολάβηση αναστολή του πολλαπλασιασμού και της μείωσης του ΡΚΟδ pY313. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ΡΚΟδ pY313 ως υποψήφιο βιοδείκτη για την πρόβλεψη της ανταπόκρισης στο dasatinib στο CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και επεξεργασίας των ναρκωτικών

HCT-116 (ATCC CCL- 247), Caco-2 (ATCC HTB37), ΟοΙο205 (ATCC CCL-222), ϋΚΟ-1, DLD-1 (ATCC CCL-221) ελήφθησαν από την ATCC και τα κύτταρα Lim1215 [30] ελήφθησαν από τον Robert Whitehead, Ludwig Institute για την Έρευνα του Καρκίνου. Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC διατηρήθηκαν ως μονοστρωματική καλλιέργεια σε πυκνότητα ταπήτιο σε ένα 5%

2, 37 ° C ατμόσφαιρα CO. μέσο αύξησης συνίστατο από Τροποποιημένο Μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM? Mediatech) για όλες τις κυτταρικές σειρές εκτός ΟοΙο205 που αναπτύχθηκε σε RPMI (Cellgro). Μέσα ανάπτυξης συμπληρώθηκε με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Atlanta Biologicals), 1% αντιμυκητικό αντιβιοτικά (Mediatech), και 100 μΜ μη-απαραίτητα αμινοξέα (Gibco-Invitrogen). Όλα τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας 0,25% EDTA-τρυψίνης (Gibco).

Το dasatinib (BMS-354825) παρασχέθηκε ευγενώς από τον Richard Smykla από την Bristol-Myers Squibb Oncology (Princeton, NJ). Το dasatinib διαλύεται σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) σε ένα διάλυμα απόθεμα 10 mM. HCT-116, Caco-2, ΟοΙο205, ϋΚΟ-1, και τα κύτταρα DLD-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με κλιμακούμενη συγκεντρώσεις του dasatinib (0, 10, 100, 1000, 5000 ηΜ) για 24 ώρες. Στο τέλος της θεραπείας, το μέσο καλλιέργειας απομακρύνεται και τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση.

Ζωικό μοντέλο

Όλες οι μελέτες εγκρίθηκαν από το Θεσμικό Animal Care and Use Επιτροπής του Πανεπιστημίου Vanderbilt και έγιναν όλες οι προσπάθειες για την ελαχιστοποίηση της ταλαιπωρίας των ζώων. Ξενομοσχεύματα HCT-116 παρήχθησαν σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς (Harlan Sprague-Dawley) μετά από υποδόρια ένεση 2-4 × 10

6 κύτταρα. Ψηλαφητά νεοπλάσματα ανιχνεύθηκαν εντός 2 έως 4 εβδομάδων. Το dasatinib ανασυστάθηκε εντός DMSO. Αμέσως πριν από τη θεραπεία, εννέα μέρη αποστειρωμένο αλατούχο προστέθηκε στο διάλυμα του φαρμάκου. Ποντικοί που φέρουν όγκο (0,5-1 εκατοστά μακρύτερη διάσταση) χορηγήθηκαν 100 μL dasatinib (60 mg /kg) ή ϋΜδΟ /αλατούχο όχημα από του στόματος καθετηριασμό. Τα ζώα έλαβαν είτε μια μονή δόση ή αγωγή ημερησίως για 5 διαδοχικές ημέρες. Για κάθε θεραπευτική αγωγή, ομάδες από ζώα θυσιάστηκαν και οι όγκοι εκτμήθηκαν 4 ώρες και 24 ώρες μετά την τελική χορήγηση του φαρμάκου.

Παρασκευή των δειγμάτων πεπτιδίου φωσφοτυροσίνης εμπλουτισμένο

τρυπτικών πεπτιδίων εμπλουτισμένο σε φωσφοτυροσίνης ήταν παρασκευάστηκε από HCT-116 καλλιέργειες μονοστοιβάδας (εκθετικά αυξανόμενη κατά 70% περίπου συρροή) και από HCT-116 όγκους ξενομοσχεύματος. Η κυτταρική λύση, πέψη των πρωτεϊνών, και τον εμπλουτισμό με ανοσοσυγγένεια για ρΥ περιέχουν τρυπτικών πεπτιδίων επιτεύχθηκε με τη χρήση του PhosphoScan Kit (P-Tyr-100? Cell Signaling Technology) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για καλλιεργημένα κύτταρα, κάθε γύρος ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ολικής κυτταρικής πρωτεΐνης 60 mg (που ελήφθη από οκτώ 150 πιάτα mm). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας BCA (Thermo Scientific), με αλβουμίνη βόειου ορού (BSA? Sigma) ως πρότυπο. προϊόντα λύσης του όγκου παρασκευάστηκαν με ομογενοποίηση επί πάγου για να διαλύσει το κατεψυγμένου ιστού (περίπου 400 mg όγκου με υγρό βάρος σε 9 mL σε PhosphoScan Lysis Buffer), που ακολουθείται από σύντομη κατεργασία με υπερήχους και φυγοκέντριση (20.000 χ

g

για 15 λεπτά) για να σαφές αδιάλυτο υλικό. Διαυγασμένα λύματα όγκων που περιέχουν περίπου 40 mg πρωτεΐνης (όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία BCA) χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση. Τρυπτικά πεπτίδια παράχθηκαν με κατεργασία λύματα όλη τη νύκτα στους 25 ° C με θρυψίνη-TPCK (60: 1 κυτταρικής πρωτεΐνης: τρυψίνη).

φασματομετρία μάζας

LC-MS /MS ανάλυση των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός οργάνου υβριδικό γραμμική παγίδα ιόντων /Orbitrap (LTQ-Orbitrap, Thermo-Fisher) εξοπλισμένο με Eksigent nanoLC-AS1 Αυτόματος δειγματολήπτης, Eksigent nanoLC-1D συν υγρή χρωματογραφία (HPLC) αντλία υψηλής απόδοσης (Eksigent), νανο-ηλεκτροψεκασμού πηγή, και το λογισμικό Xcalibur ελέγχου του οργάνου. Τα πεπτίδια διαχωρίστηκαν σε μία τριχοειδή στήλη (100 μm χ 18 cm) συσκευασμένη με ρητίνη ανάστροφης φάσης (Jupiter C18, 3 μm, 300 Α? Phenomenex), και σε συνδυασμό με ένα εν σειρά, τηγμένο (που παράγεται με υγρό πυριτικό Kasil) παγίδευση στήλη (100 μm χ 4 cm) επίσης γεμάτη με C18 ρητίνη (Jupiter C18, 5 μm, 300 Α, Phenomenex) [31]. Διφασική κλίση χρωματογραφική έκλουση χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με την οποία κινητή φάση Α αποτελείτο από 0.1% μυρμηκικό οξύ και κινητή φάση Β συνίσταται από 0.1% μυρμηκικό οξύ σε ακετονιτρίλιο. Ο ρυθμός ροής κατά την διάρκεια της φάσης φόρτωσης και αφαλάτωση της κλίσης ήταν 1.5 μL /min και κατά τη διάρκεια της φάσης διαχωρισμού ήταν 500 ηΙ /λεπτό. Ένα 184 min βαθμίδωση εκτελέστηκε με μια περίοδο πλύσης 10 λεπτών εκτρέπονται προς τα απόβλητα μετά την προ-στήλη (διαλύτης Α 100% για τα πρώτα 10 λεπτά ακολουθούμενο από μια βαθμίδα έως 98% διαλύτη Α, ν /ν, στα 15 λεπτά) για να επιτρέπουν την απομάκρυνση των τυχόν υπολειμματικών αλάτων. Μετά την περίοδο έκπλυσης, η βαθμίδα αυξήθηκε σε 35% Β 125 min, ακολουθούμενη από μία αύξηση έως 90% Β 140 min και διατηρήθηκε για 9 λεπτά πριν από την επιστροφή στις αρχικές συνθήκες. Tandem φάσματα αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας μια λειτουργία σάρωσης δεδομένων που εξαρτώνται από τον οποίο ένα πλήρες MS σάρωσης (m /z 300-2000) αποκτήθηκε από την Orbitrap σε ανάλυση 60.000. Μέγιστος χρόνος έγχυσης ήταν 1 δευτερόλεπτο. εξαρτάται από τα δεδομένα σαρώσεις MS /MS αποκτήθηκαν για τα πέντε πιο έντονη ιόντα από την πλήρη σάρωση χρησιμοποιώντας ένα πλάτος απομόνωση των 2 m /z, ένα χρόνο ενεργοποίησης των 30 ms, 30% κανονικοποιημένη ενέργεια σύγκρουσης, και ένας μέγιστος χρόνος έγχυσης των 150 ms .

Για να βελτιωθεί η ανίχνευση φωσφοπεπτιδίων, ένα επιπλέον δεδομένα που εξαρτώνται αλγόριθμος στο λογισμικό Xcalibur ήταν ενεργοποιημένη κατά την οποία η παρουσία ενός ουδέτερου απώλεια κυρίαρχο φωσφορικό (97.97, 48.99, 32.66 και m /z μονάδες) θα προκαλούσε η απόκτηση ενός MS /MS /MS [32]. Για να είναι δυνατή η συλλογή των MS /MS φάσματα από τις χαμηλότερες πεπτίδια αφθονία, πρώην ιόντα στόχο έχουν επιλεγεί για MS /MS δυναμικά αποκλειστεί με μήκος λίστα με 150 ιόντα και χρόνο 60 s. «Επιλογή πρόδρομος Μονοϊσοτοπική» έχει ενεργοποιηθεί και τα κράτη υπεύθυνος 1+ και & gt? 4+ αποκλείστηκαν από την εξέταση για MS /MS. Το όργανο λειτούργησε σε λειτουργία προεπισκόπησης, για να καταστεί δυνατή η ταυτόχρονη συλλογή MS /MS φάσματα κατά τη διάρκεια της σάρωσης Orbitrap. Γενικοί όροι φασματομετρίας μάζας ήταν ως εξής: Τάση ψεκασμού, 2,2 kV? Δεν θηκάρι και βοηθητικό ροής αερίου? θερμοκρασία του σωλήνα μεταφοράς ιόντων, 200 ° C? και ο φακός σωλήνα τάσης 80 V.

αναζήτηση βάσεων δεδομένων, το φιλτράρισμα, και ψευδώς ανακάλυψη καθορισμό ποσοστού

Οι μέθοδοι ήταν παρόμοιες με τις στρατηγικές έρευνα σε βάσεις δεδομένων που περιγράφηκε προηγουμένως [28], με μικρές τροποποιήσεις. αρχεία Θέρμο RAW μετατράπηκαν σε DTA αρχεία χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο ScanSifter (Vanderbilt University), στη συνέχεια αναζήτηση από TurboSEQUEST V.27 (rev. 12) αλγόριθμο (Thermo Electron) κατά του ποντικού /ανθρώπου υποσύνολο της βάσης δεδομένων UniRef100, η ​​οποία αντιστράφηκε για τον υπολογισμό του ποσοστό ψευδώς ανακάλυψη. Οι έρευνες διεξήχθησαν επιτρέποντας τη διαφορική τροποποιήσεις: 57 για κυστεΐνη (για carboxyimidomethylation από ιωδοακεταμίδιο), 16 επί μεθειονίνη (οξείδωση), και 80 σε Ser, Thr, ή Tyr (φωσφορυλίωση). Η MS /MS /MS φάσματα επίσης αναζήτησαν έναν -18 μετατόπιση μάζας σε Ser, Thr, ή Tyr να λογοδοτήσει για την απώλεια του νερού, το οποίο προκύπτει από την ουδέτερη απώλεια του φωσφορικού οξέος. Πεπτίδιο και θραύσμα ιόντος ανοχές τέθηκαν σε 2,5 Da και 1.0 Da, αντίστοιχα.

ποσοστό False-ανακάλυψη στη συνέχεια υπολογίζεται από το πεπτίδιο αγώνες στους αντίστροφη ακολουθίες πολλαπλασιάζεται με δύο και διαιρείται με το συνολικό αριθμό των πεπτιδικών επιτυχίες. Πεπτίδια που προέρχονται από αλγορίθμους αναζήτησης της βάσης δεδομένων με 5% ποσοστό ψευδώς ανακάλυψη περαιτέρω φιλτράρεται από τρία επιπλέον στάδια. Πρώτον, το όριο βαθμολογίας ορίστηκε ανάλογα με την κατηγορία του πεπτιδίου. Για επιβάρυνση 1 πεπτίδια, τα πεπτίδια επιλέχθηκαν με xcorr μεγαλύτερο ή ίσο προς 1, RSP μικρότερη ή ίση με 5, και Sp μεγαλύτερη από ή ίση με 350? για χρέωση 2 πεπτίδια, το όριο ορίστηκε σε xcorr 1.8, ΕΠΣ 5, και Sp 350? για χρέωση 3 πεπτίδια, κατώφλι ορίστηκε σε xcorr 2.5, RSP 5, και Sp 350. Δεύτερον, μόνο τα πεπτίδια με τουλάχιστον έναν τυροσίνης και φωσφορυλίωση διατηρήθηκαν. Τέλος, από τις υπόλοιπες επιτυχίες πεπτιδίου, μόνο ρΤγΓ περιέχουν πεπτίδια με τουλάχιστον ένα από τα τρία συμπληρωματικά κριτήρια επελέγησαν: (1) τουλάχιστον δύο φασμάτων να ταιριάζουν είχε xcorr τιμές πάνω από υψηλού ορίου (3,3 για χρέωση των 3, 2.2 για χρέωση 2 , και 1,5 για την χρέωση του 1), (2) η περιοχή ρΤγΓ ήταν ανεξάρτητα προσδιορίζονται από δύο ή περισσότερα διακριτά πεπτίδια, ή (3) η περιοχή ρΤγΓ είχε ανεξάρτητα προσδιορίζονται αλλού και που περιλαμβάνονται στο ηλεκτρονικό πόρο PhosphoSite του

in vivo

θέσεις φωσφορυλίωσης, έκδοση 1.5 (https://www.phosphosite.org), διατηρείται από Cell Signaling Technology, Inc.

Όλα τα αρχικά δεδομένα φασματομετρία μάζας από τα πειράματα του όγκου ξενομοσχεύματος έχει γίνει δημόσια διαθέσιμα μέσω η σε απευθείας σύνδεση πόρος Χορωδία φασματομετρία μάζας δεδομένων (https://chorusproject.org/). Με ένα λογαριασμό χρήστη Χορωδίες, οποιοδήποτε υποσύνολο αυτών των πρώτων δεδομένων μπορεί να κατεβάσει ή να προβληθούν σε απευθείας σύνδεση. Εναλλακτικά, τα δεδομένα αυτά μπορούν να μεταφορτωθούν άμεσα ως ένα αρχείο 2,8 GB χωρίς εγγραφή στη διεύθυνση:. Https://chorusproject.org/anonymous/download/experiment/-2997969850554343767)

Αντισώματα και ανοσοαποτύπωση

δείγματα κυττάρων συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες έκθεσης dasatinib. Ξενομοσχεύματος δείγματα όγκου συλλέχθηκαν 4 ώρες ή 24 ώρες μετά την τελική χορήγηση του dasatinib. Οι όγκοι καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και, στη συνέχεια ομογενοποιήθηκαν και αραιώθηκαν σε 1 μg /μl σε ρυθμιστικό λύσης. Μεταξύ 20 και 40 μg ολικής πρωτεΐνης από κάθε δείγμα φορτώνεται σε 7,5 έως 12% πηκτώματα SDS PAGE και αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση πριν από τη μεταφορά σε μεμβράνες PVDF (PerkinElmer). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν για όλη τη νύχτα σε 4 ° C σε ισοτονικό ρυθμιστικό διάλυμα Τπδ 0,1% Tween-20 (TBST) που περιέχει 5% β /ο άπαχο ξηρό γάλα σε σκόνη. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα προς π-Src Y416 (Cell Signaling # 6943S), συνολικός Src (Cell Signaling # 2107), ρ-ΡΚΟδ Y313 (Cell Signaling # 2055S), συνολικός PKC (Cell Signaling # 2058), ρ- ΚΡΤΡ Y789 (Cell Signaling # 4481S), συνολικός ΚΡΤΡ (Upstate # 07-472), β-ακτίνη (Cell Signaling # 4967), και β-τουμπουλίνης (Cell Signaling # 2128). Σχολαστικά τητα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με αντισώματα αραιώνονται όπως προτείνεται από τους προμηθευτές σε TBST με αλβουμίνη 3% βόειου ορού (BSA) και ακολούθησε επώαση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με το υπεροξειδάση αρμορακίας δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο είδος κατάλληλο (Jackson ImmunoReserach) αραιωμένο 1: 5000 σε TBST που περιείχε 3% BSA. Δυτική Lightning

TM Plus-ECL (PerkinElmer) υπόστρωμα που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση σε Xenogen IVIS 200. Πυκνότητας διεξήχθη χρησιμοποιώντας Ζώντας Εικόνα 3.2 του λογισμικού (δαγκάνα).

σφαιροειδές ανάλυση της ανάπτυξης

Serial μικροσκοπικές εικόνες των κυττάρων σφαιροειδή από 0, 24, 48 και 72 ώρες μετά τη θεραπεία με dasatinib εισήχθησαν στο πακέτο λογισμικού ImageJ (ΝΙΗ). Εικόνες μετατράπηκαν αυτόματα σε διμερή και τρύπες στο δυαδική εικόνα έκλεισαν χρησιμοποιώντας τη λειτουργία Τρύπες Συμπληρώστε ImageJ. Το εργαλείο Wand επιλογής χρησιμοποιήθηκε για όλες τις συνδεδεμένες τμήμα εικονοστοιχεία από την σφαιροειδές, και ο αριθμός των pixel σε αυτήν την περιοχή καταγράφηκε. Συνολική έκταση για κάθε σφαιροειδούς κανονικοποιήθηκε προς το χρονικό σημείο 24 ώρες.

Ανοσοϊστοχημεία

Αμέσως μετά τη θυσία, τα δείγματα όγκων του αποκομμένου όγκου μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη για 24 ώρες και μεταφέρθηκε σε 70% αιθανόλης. Τα δείγματα στη συνέχεια σε επεξεργασία για εμβάπτιση σε παραφίνη και τομές πριν την ανοσοχρώση. Μετά τομής, δείγματα ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν, και το βήμα ανάκτηση αντιγόνου διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα (ρΗ 6.0) διάλυμα εφαρμόστηκε επί 20 λεπτά στους 105 ° C που ακολουθείται από 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 3% Η

20

2 για την εξάλειψη της ενδογενούς δραστηριότητας της υπεροξειδάσης. Οι τομές στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με αντιδραστήριο αποκλεισμού πρωτεΐνη χωρίς ορό για 20 λεπτά. Διαδοχικές τομές επωάστηκαν όλη τη νύχτα με αραίωση 1: 100 αντισώματος (Cell Signaling # 2055S) p-ΡΚΟδ pY313 ή ρ-SHIP2 Y986 /987 (Cell Signaling # 2008). Ανίχνευση των πρωτογενών αντισωμάτων χρησιμοποιείται Envision + Systems (Dako) με ραφανιδική υπεροξειδάση σημασμένο πολυμερές (30 λεπτά επώασης) που ακολουθείται από προσθήκη υποστρώματος DAB (5 λεπτά επώασης). Χρωματισμένο δείγματα απεικονίστηκαν σε μεγέθυνση 40x και αναλύθηκαν για έκφραση των ιστολογικών δεικτών.

Αποτελέσματα

Η φωσφοτυροσίνης proteome των καλλιεργημένων HCT-116 ανθρώπινου παχέος κύτταρα

Έχουμε ήδη διεξαχθεί μια ολοκληρωμένη ανάλυση της φωσφοτυροσίνης proteome του SRC-ινοβλαστών μετατραπεί το ποντίκι

στο vitro

[28]. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να εκτελέσει μια παρόμοια ανάλυση για να χαρακτηρίσει την proteome ρΥ της ανθρώπινης CRC κυτταρική γραμμή και στη συνέχεια να επεκτείνει την προσέγγιση να αναζητήσουν πιθανούς βιοδείκτες ρΥ του dasatinib-ανταπόκρισης σε όγκους ξενομοσχεύματος HCT-116.

Αρχικά, επιδιώξαμε να χαρακτηρίσει το πρωτεώματος ρΥ καλλιεργημένων κυττάρων HCT-116, εν απουσία θεραπείας dasatinib. Από τις 15 ανεξάρτητες διαδρομές LC-MS /MS (5 βιολογική αντίγραφα, το καθένα υποστηρίζεται από 3 τεχνικά αντίγραφα), εντοπίστηκαν 249 διακριτές ρΥ πεπτίδια. Αυτά τα πεπτίδια αντιπροσωπεύουν 162 διακριτές θέσεις ρΥ σε 116 διαφορετικές πρωτεΐνες. Κριτήρια για τη διατήρηση πεπτίδιο που περιλαμβάνονται αξίας xcorr υψηλού κατωφλίου και αναγνώρισης & gt? 1 βιολογικών επανάληψη. Πίνακας S1 δείχνει τις διατηρούνται πεπτίδια ομαδοποιούνται σύμφωνα με μια λειτουργική ταξινόμηση, θέση οξύ ιστοσελίδα αμινοξέων ρΥ, ο αριθμός των ανεξάρτητων ταυτοποιήσεις (φασματική μετράει), και υψηλότερες τιμές xcorr. Ο κατάλογος των διατηρούμενων πεπτιδίων ρΥ και φασματικά δεδομένα μέτρηση παρέχει μια συνολική εικόνα των δραστηριοτήτων σηματοδότησης ρΥ των HCT-116 κυττάρων κάτω από τις συνθήκες της μονοστρωματική καλλιέργεια κυττάρων. Περίπου τα μισά από τα sites ρΥ αναφέρονται αντιπροσωπεύουν πρωτεϊνικών κινασών (44/162) και άλλες πρωτεΐνες σηματοδότησης (38/162), ενώ ένα άλλο 25% των sites είναι στις πρωτεΐνες που συνδέονται με την κυτταρική προσκόλληση και του κυτταροσκελετού της ακτίνης (40/162) (Σχήμα 1Α).

Σε καλλιεργημένα κύτταρα HCT-116, 162 θέσεις ρΥ πιστοποιήθηκαν που αντιπροσωπεύουν 116 διακριτές πρωτεΐνες (Α). Πρωτεΐνες που ταξινομούνται σύμφωνα με τις γενικές κατηγορίες της πρόσφυσης και Κυτταροσκελετός, πρωτεϊνικών κινασών, και άλλες Σηματοδότηση αντιπροσωπεύουν περίπου τα τρία τέταρτα του συνόλου. Από τις θέσεις ρΥ επί πρωτεϊνικών κινασών, η συντριπτική πλειοψηφία είναι συμβατικές κινάσες τυροσίνης και «ομάδα CMGC» πρωτεϊνικών κινασών που περιλαμβάνει CDKs, ΕΚΚ /ΜΑΡΚ, η GSK-3, και άλλες κινάσες διπλής εξειδίκευσης. Βλέπε Πίνακα 1 και Πίνακα 2 για μία λίστα με τις πιο συχνά εντοπίζονται περιοχές με φασματική μέτρηση σε HCT-116 κύτταρα. Όλα τα 162 τοποθεσίες που παρουσιάζονται στον Πίνακα S1 μαζί με βασικές πληροφορίες συμπεριλαμβανομένου του αριθμού UniProt εισόδου, φωσφοπεπτίδια ανιχνεύεται στην ανάλυση LC-MS /MS, και η συνολική φασματική αναγνωριστικά. Σε όγκους ξενομοσχεύματος HCT-116, 71 θέσεις ρΥ ταυτοποιήθηκαν που αντιπροσωπεύουν το 58 διακριτές πρωτεΐνες (Β). κριτήρια διατήρησης για τις περιοχές ήταν 7 ή περισσότερες φασματικές αναγνωριστικά σε όγκους και ανίχνευση και σε HCT-116 καλλιεργημένα κύτταρα. Οι 71 περιοχές ρΥ αντιπροσωπεύουν 58 διαφορετικές πρωτεΐνες. καρκινικές περιοχές που πληρούν τα κριτήρια διατήρησης έχουν μια λειτουργική διανομή πολύ παρόμοια με εκείνη των περιοχών που προσδιορίζονται σε καλλιεργημένα κύτταρα. Βλέπε Πίνακα 3 και Πίνακα 4 για μια λίστα των κορυφαίων χώρων από φασματική μέτρηση σε ξενομοσχεύματα HCT-116. Όλα τα 71 sites που παρουσιάζονται στον Πίνακα S2 μαζί με βασικές πληροφορίες, συμπεριλαμβανομένων UniProt αριθμό ταυτότητας, φωσφοπεπτίδια ανιχνεύεται στην ανάλυση LC-MS /MS, και ο αριθμός των φασματικών αναγνωριστικά από μη επεξεργασμένο

έναντι

όγκους dasatinib-θεραπεία.

Η

Από τους χώρους της πρωτεϊνικής κινάσης ρΥ, εντοπίσαμε 24 ιστότοπους σε 14 διαφορετικές κινάσες τυροσίνης και 15 τοποθεσίες σε 14 διαφορετικές κινάσες CMGC. CMGC κινάσες (μια ευρεία ομάδα κατάταξης, η οποία περιλαμβάνει CDKs, ΕΚΚ /ΜΑΡΚ, η GSK-3, και τις οικογένειες των κινασών διπλής ειδικότητας) ήταν η σημαντικότερη από τις πιο συχνά εντοπίζονται HCT-116 τοποθεσίες (Πίνακας 1). CDK1 pY15 ήταν η πιο ανιχνεύεται site με 146 φασματικές μετρήσεις. Ένα site βρόχο ενεργοποίησης τομέα κινάσης (pY1234) σχετικά με το ΚΟΑ, την ανάπτυξη των ηπατοκυττάρων τυροσινικής κινάσης του υποδοχέα του παράγοντα, ήταν η δεύτερη πιο συχνά εντοπίζονται ιστοσελίδα στο προφίλ καλλιεργημένο κύτταρο HCT-116 με 74 φασματικές μετρήσεις. Άλλα κορυφαία sites στο κινάσες CMGC (συμπεριλαμβανομένων PRP4, ERK2, DYRK1, και GSK-3) κατοικούν επίσης και στον τομέα της κινάσης ενεργοποίησης βρόχους όπου φωσφορυλίωση δείχνει την ενεργοποιημένη κατάσταση. Εμείς εντόπισε ορισμένες περιοχές στην HCT-116 κύτταρα που δεν παρατηρήθηκαν σε προηγούμενες εκτενή ανάλυσή μας των ΠΜΑ [28], Πίνακας 2.

Πρωτεΐνη

Λειτουργική Κατηγορία Ιστοσελίδα

αναγνωριστικά

CDK1Protein κινάσης: CMGCY15146METProtein κινάσης: Τυροσίνη * Y123474PRP4Protein κινάσης: CMGC * Y84969CDCP1Adhesion: τηλέφωνο /ECM Y70747PaxillinAdhesion: τηλέφωνο /ECMY11841ERK2Protein κινάσης: CMGC * Y18736SHBOther SignalingY24632Annexin A2Other SignalingY2429DYRK1AProtein κινάσης: CMGCY32126SHBOther SignalingY26824LAP2 /ErbinOther SignalingY110424Catenin δ-1Adhesion: τηλέφωνο /CellY22824GSK-3Protein κινάσης: CMGC * Y27922Table 1. Όλες οι τοποθεσίες φωσφοτυροσίνης εντοπίζονται συχνότερα σε HCT-116 καλλιεργημένα κύτταρα

* ιστοσελίδας στο Συντομογραφίες βρόχο ενεργοποίησης τομέα της πρωτεϊνικής κινάσης:. CDCP1, CUB τομέα πρωτεΐνη που περιέχει 1? CDK1, πρωτεΐνες ελέγχουν την κυτταρική διαίρεση 2 ομόλογο? DYRK1A, διπλή ειδικότητα τυροσίνης φωσφορυλίωση ρυθμιζόμενη κινάση 1Α? ERK2, ενεργοποιούμενες από μιτογόνα πρωτεϊνικής κινάσης 1? GSK-3, κινάση συνθετάσης γλυκογόνου-3 (άλφα και βήτα)? ΚΟΑ, ηπατοκυττάρων υποδοχέα αυξητικού παράγοντα? PRP4, Σερίνη /θρεονίνη πρωτεΐνη κινάση PRP4 ομόλογο? SHB, SH2 τομέα που περιέχουν πρωτεΐνη προσαρμογέα Β CSV CSV Κατεβάστε Πρωτεΐνη

Λειτουργική Κατηγορία Ιστοσελίδα

αναγνωριστικά

CDCP1Adhesion: τηλέφωνο /ECMY70747DCBLD2MiscellaneousY75019PKCδProtein κινάσης: AGCY31318FAT1Adhesion: τηλέφωνο /CellY424416MST1R /RONProtein κινάσης: Τυροσίνη * Y123815Annexin A2Other SignalingY3014DCBLD2MiscellaneousY73214TYK2Protein κινάσης: TyrosineY29213FYNProtein κινάσης: Τυροσίνη ** Y21311LYNProtein κινάσης: Τυροσίνη ** Y19311Table 2. sites φωσφοτυροσίνη δεν βρέθηκε στην προηγούμενη εκτενή ανάλυση των καλλιεργημένων ΠΜΑ

(28)

* ιστοσελίδας στο βρόχο ενεργοποίησης τομέα της πρωτεϊνικής κινάσης ** Site στην Src-οικογένεια κινάσης SH2 domainAbbreviations: CDCP1, CUB τομέα πρωτεΐνη που περιέχει 1? DCBLD2, Δισκόίδίνη, CUB και LCCL τομέα πρωτεΐνη που περιέχει 2? FAT1, πρωτοκαδερίνη Fat 1? Fyn, κινάση τυροσίνης-πρωτεΐνης Fyn? LYN, κινάση τυροσίνης-πρωτεΐνης Lyn? MST1R /RON? Μακροφάγων διέγερσης του υποδοχέα της πρωτεΐνης? ΡΚΟδ, πρωτεΐνη κινάση τύπου C δέλτα? ΤΥΚ2, μη-υποδοχέα ΤΥΚ2 κινάσης τυροσίνης-πρωτεΐνης. CSV Λήψη CSV

Η φωσφοτυροσίνης proteome των HCT-116 όγκους ξενομοσχεύματος

Αφού έλαβε το προφίλ ρΥ των HCT-116 κυττάρων σε καλλιέργεια, η στρατηγική πρωτεομική ρΥ στη συνέχεια για τον εντοπισμό των HCT-116 sites ρΥ που είναι εξέχοντα σε όγκους ξενομοσχεύματος και ότι έχουν τη δυνατότητα να χρησιμεύσει ως βιοδείκτες για το dasatinib ανταπόκριση. Υποδόρια όγκους ξενομοσχεύματος HCT-116 καθορίστηκαν σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς και Ργ εμπλουτισμένα τρυπτικών πεπτιδίων παρασκευάστηκαν από κάθε μία από 3 όγκους από ποντικούς υπό αγωγή με όχημα και από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή 4 ώρες νωρίτερα με 60 mg /kg dasatinib. Κάθε παρασκεύασμα πεπτίδιο αναλύθηκε μέσω τριών επαναληπτικές LC-MS /MS τρέχει για να ληφθούν τα καρκινικά προφίλ ρΥ. Από αυτήν την ανάλυση, 71 ρΥ θέσεις, που εκπροσωπούν 58 διαφορετικές πρωτεΐνες, αναγνωρίστηκαν ως προεξέχων στους όγκους ξενομοσχεύματος καθώς και να ανιχνεύεται σε καλλιεργημένα κύτταρα (Πίνακας S2). Παρόμοιο με το προφίλ καλλιεργημένου κυττάρου, οι περισσότερες από αυτές τις περιοχές ήταν σε πρωτεΐνες (συμπεριλαμβανομένων πολλών κινασών πρωτεΐνης) και /πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού που σχετίζεται με προσκόλληση (Εικόνα 1Β) σηματοδότησης. Οι κινάσες τυροσίνης και τις κινάσες πρωτεΐνης CMGC ήταν και πάλι εξέχουσα στο προφίλ του όγκου. Sites για CMGC κινάσες κυριάρχησαν στην λίστα των πιο συχνά εντοπίζονται περιοχές των όγκων, συμπεριλαμβανομένων CDK1 Tyr15, και οι θέσεις βρόχο ενεργοποίησης της p38 MAPK, PRP4, ERK1, ΕΚΚ2, και GSK-3 (Πίνακας 3).

Πρωτεΐνη

Λειτουργική Κατηγορία Ιστοσελίδα

αναγνωριστικά (χωρίς θεραπεία, 4 ώρες Das)

CDCP1Adhesion: τηλέφωνο /ECM Y70790, 14CDK1Protein κινάσης: CMGCY1585, 80PKCδProtein κινάσης: AGCY31372, 10p38α MAPKProtein κινάσης: CMGC * Y18259 , 35PRP4Protein κινάσης: CMGC * Y84949, 45ERK2Protein κινάσης: CMGC * Y18735, 31ERK1Protein κινάσης: CMGC * Y20430, 27RPTPαOther SignalingY79827, 1β-actinCytoskeletonY5522, 24GSK-3Protein κινάσης: CMGC * Y27919, 22Annexin A2Other SignalingY3019, 5Histone H4MiscellaneousY8919, 17Table 3. sites φωσφοτυροσίνη πιο συχνά εντοπίζονται στο μη επεξεργασμένο όγκους ξενομοσχεύματος HCT-116: σύγκριση με τα ζώα dasatinib έλαβαν

* ιστοσελίδα στον βρόχο ενεργοποίησης συντομογραφιών τομέα της πρωτεϊνικής κινάσης:. CDCP1? CUB τομέα που περιέχουν πρωτεΐνη 1? CDK1, πρωτεΐνες ελέγχουν την κυτταρική διαίρεση 2 ομόλογο? ERK1, ενεργοποιούμενες από μιτογόνα πρωτεϊνικής κινάσης 3? ERK2, ενεργοποιούμενες από μιτογόνα πρωτεϊνικής κινάσης 1? GSK-3, κινάση συνθετάσης γλυκογόνου-3 (άλφα και βήτα)? ρ38α ΜΑΡΚ, ενεργοποιούμενες από μιτογόνα πρωτεϊνικής κινάσης 14? ΡΚΟδ, πρωτεΐνη κινάση τύπου C δέλτα? PRP4, Σερίνη /θρεονίνη πρωτεΐνη κινάση PRP4 ομόλογο? RPTPα, τύπου υποδοχέα άλφα-τυροσίνης πρωτεΐνης φωσφατάση. CSV Λήψη CSV

CDCP1 pY707 (90 φασματικές μετρήσεις), ΡΚΟδ pY313 (72 φασματικές μετρήσεις), και ΡΚΟδ pY334 (14 φασματικές μετρήσεις) ήταν ανάμεσα στις πιο συχνά εντοπίζονται περιοχές στην χωρίς θεραπεία όγκων ξενομοσχεύματος. θεραπείας με dasatinib μείωσε σημαντικά τη συχνότητα εντοπισμό των τριών τόπων (Πίνακας 3, Πίνακας 4), σύμφωνα με την ευημερία τους στόχους της Src-οικογένειας κινασών. Αντίθετα, οι θέσεις επί CMGC κινάσες (δεν θεωρείται ότι φωσφορυλιώνεται από dasatinib ευαίσθητα κινάσες) εντοπίστηκαν σε παρόμοιες συχνότητες σε μη επεξεργασμένα και επεξεργασμένα dasatinib όγκους. Άλλες προφανείς dasatinib αποκρίνονται θέσεις μεταξύ των πιο συχνά εντοπίζονται στους όγκους υποστεί αγωγή με έκδοχο περιλαμβάνονται pY798 επί RPTPα και pY30 επί αννεξίνη Α2 (Πίνακας 3). RPTPαpY798 εντοπίστηκε σε 27 φάσματα από μη επεξεργασμένο όγκους, αλλά μόνο μία φορά σε δείγματα dasatinib-θεραπεία.

Πρωτεΐνη

Λειτουργική Κατηγορία Ιστοσελίδα

αναγνωριστικά (χωρίς θεραπεία, 4 ώρες Das)

RAIG-1Λοιπές SignalingY34715, 1PKCδProtein κινάσης: AGCY33414, 0SHC1Other SignalingY42713, 0α-enolaseMetabolic EnzymeY4413, 3SHIP2Other SignalingY98611, 0Table 4. Άλλα αξιοσημείωτα sites dasatinib αποκρίνονται φωσφοτυροσίνης προσδιορίζονται στο μη επεξεργασμένο HCT-116 όγκοι ξενομοσχεύματος: σύγκριση με τα ζώα που έλαβαν dasatinib

Συντομογραφίες: ΡΚΟδ, τύπος πρωτεΐνη C δέλτα κινάσης?. PRP4, Σερίνη /θρεονίνη πρωτεΐνη κινάση PRP4 ομόλογο? RAIG-1, οξύ επαγόμενη πρωτεΐνη Ρετινοϊκό 3? SHC1, SHC-μετασχηματισμού πρωτεΐνη 1? SHIP2, φωσφατιδυλινοσιτόλη-3,4,5-τριφωσφορική 5-φωσφατάση 2. CSV Λήψη CSV

Ανοσοαποτύπωσης επικυρώνει το dasatinib ανταπόκριση των ΡΚΟδ pY313 και RPTPα pY798 sites στο HCT-116 όγκους ξενομοσχεύματος

Από τα πιο γνωστά dasatinib -responsive sites ρΥ προσδιορίζονται από την ανάλυση των phosphoproteomic HCT-116 όγκοι ξενομοσχεύματος (Πίνακας 3, Πίνακας 4), φωσφο-ειδικά αντισώματα είναι εμπορικώς διαθέσιμα για ΡΚΟδ pY313, SHIP2 pY986 /987 και RPTPα pY798. Αυτά τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση dasatinib ανταπόκρισης από αυτές τις περιοχές σε σχέση με την αναστολή Src (που προσδιορίζεται με τη χρήση ενός phosphospecific αντίσωμα ενάντια στην τοποθεσία αυτοφωσφορυλίωσης Src pY416). Για τις περιοχές τόσο η ΡΚΟδ pY313 και RPTPα pY798, ανοσοστύπωμα με φωσφο-ειδικά αντισώματα έδειξαν μια αξιοσημείωτη μείωση στην φωσφορυλίωση σε 4 ώρες όγκους dasatinib αγωγή ταυτόχρονα με αναστολή Src (Εικόνα 2Α). Η κατάσταση φωσφορυλίωσης αυτών των καταλοίπων επέστρεψε στο εγγύς επίπεδα της βασικής γραμμής 24 ώρες μετά τη θεραπεία, γεγονός που υποδηλώνει την αντοχή της αναστολής Src σε αυτό το μοντέλο ήταν παροδική με μία μόνο χορήγηση.

Immonoblot ανάλυση του ΡΚΟδ pY313 και RPTPα pY798 σε ξενομοσχεύματος όγκους σε σχέση με Src pY416 μετά από μία απλή φαρμακολογική δόση (Α) ή 5 ημερήσιες δόσεις dasatinib (Β). Ξενομοσχεύματος ιστοί αξιολογήθηκαν 4 ώρες και 24 ώρες μετά την έκθεση dasatinib. Τόσο ΡΚΟδ pY313 και RPTPα pY798 συσχετίζονται με αναστολή Src σε ξενομοσχεύματα HCT-116. Εκτός από μία μόνο δόση, σταθερής κατάστασης θεραπευτικά σχήματα (Β) οδήγησε σε παρατεταμένη αναστολή της Src όπως μετράται 24 ώρες μετά την έκθεση στο dasatinib και συσχετίζονται με μειωμένα επίπεδα ΡΚΟδ pY313 και RPTPα pY798.

Η

Για την αξιολόγηση η επίδραση της διάρκειας της θεραπείας dasatinib στην ανθεκτικότητα της αναστολής Src, ΗΟΤ-116 όγκων σε επεξεργασία με 5 ημερήσιες δόσεις dasatinib αξιολογήθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western για να προσδιοριστεί η απόκριση των ταυτοποιημένων υπολειμμάτων υπό διαχείριση σταθερής κατάστασης του φαρμάκου.