Abstract

DRAM είναι μία πρωτεΐνη μεμβράνης λυσοσωματικής και είναι κρίσιμης σημασίας για τη μεσολάβηση του ρ53 αυτοφαγία και την απόπτωση. DRAM έχει δυνατότητα λειτουργίας όγκου-κατασταλτική και ρυθμίζεται μειωτικά σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους. Ωστόσο, η ρύθμιση της έκφρασης των DRAM είναι ελάχιστα περιγράφεται μέχρι τώρα. Εδώ, δείξαμε ότι η στέρηση ορού προκαλεί έντονα έκφραση DRAM σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος και μια αλληλουχία DNA πυρήνα στον υποκινητή DRAM είναι απαραίτητη για την ανταπόκριση της σε στέρηση ορού. Παρατηρήσαμε επίσης ότι ευχρωματίνη δείκτες για τις δραστικές μεταγραφές που αντιπροσωπεύεται από διακετυλο-H3, τετρα-ακετυλο-Η4 και το τριμεθυλ-H3K4 στην περιοχή υποκινητή πυρήνα του γονιδίου DRAM προφανώς αυξήθηκε με χρονο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από στέρηση ορού, και ταυτόχρονα το διμεθυλο -H3K9, ένα herterochromatin δείκτη που σχετίζεται με σιγήσει γονίδια, ήταν καιρός εξαρτώμενο από τη μειωμένη. Επιπλέον, ο παράγοντας αναδιαμόρφωσης χρωματίνης Brg-1 είναι εμπλουτισμένη στην περιοχή υποκινητή πυρήνα του γονιδίου DRAM και απαιτείται για στέρηση ορού έκφραση επάγεται DRAM. Αυτές οι παρατηρήσεις προετοιμάσει το έδαφος για την περαιτέρω διερεύνηση της έκφρασης των γονιδίων των DRAM

Παράθεση:. Ni P, Xu Η, Chen C, Wang J, Liu Χ, Χου Y, et al. (2012) του ορού λιμός Προκαλεί DRAM έκφραση στα κύτταρα του καρκίνου του ήπατος μέσω της ιστόνης Τροποποιήσεις στο υποστηρικτής του Locus. PLoS ONE 7 (12): e50502. doi: 10.1371 /journal.pone.0050502

Επιμέλεια: Austin John Cooney, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 του Μαρτίου, 2012? Αποδεκτές: 24 Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 12, Δεκεμβρίου του 2012

Copyright: © 2012 Ni et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Επιτροπή Επιστήμης και Τεχνολογίας της Σαγκάης Metropolitan (11ZR1423100)? το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας (δεν χορηγούν .: 30772233, 30873057 με το Υ Lu και 81172028 έως το Ω Χου)? Βασικά βασικό σχέδιο της Σαγκάης Δημοτική Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής (αριθ .: 08JC1413600)? Σαγκάη Επιτροπή Επιστήμης και Τεχνολογίας (11DZ2260200)? και 985 όγκων Κοινή Ιδρύματος. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η αδρανοποίηση των οδών κυτταρικού θανάτου είναι ένα κεντρικό στοιχείο της εξέλιξης του καρκίνου [1]. Υπάρχουν διάφοροι μηχανισμοί σε φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα να κινήσει τον κυτταρικό θάνατο και την εξάλειψη κατεστραμμένα κύτταρα που μπορούν να αναπτυχθούν με παρεκκλίνοντα να σχηματίσουν όγκους [2] – [4]. Υπό κανονικές συνθήκες μακροαυτοφαγία (εφεξής «αυτοφαγία») είναι μια αυστηρά ελεγχόμενη διεργασία μεμβράνης-εμπορίας για την αποδόμηση και την ανακύκλωση των κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών και οργανιδίων σε βασικά επίπεδα. Μπορεί να επάγεται πάνω από το βασικό επίπεδο σε απόκριση προς διαφορετικές διεγέρσεις, συμπεριλαμβανομένων θρεπτικών συστατικών πείνα, μόλυνση, γονοτοξικούς παράγοντες, κυτοκίνες ή [5] – [8]. Autophagy μπορεί να λειτουργούν σε διαφορετικά πλαίσια είτε προάγουν ή αναστέλλουν την κυτταρική επιβίωση [1], [5], [7], [9] – [11], υποδηλώνοντας ότι μπορεί να παίζει έναν σημαντικό παθολογικό ρόλο στην καρκινογένεση

Ανθρώπινο

DRAM

γονίδιο (βλάβη ρυθμίζεται autophagy διαμορφωτής) αναγνωρίστηκε ως ένα γονίδιο ρ53-ενεργοποιημένη η οποία κωδικοποιεί μια εξαιρετικά διατηρημένη πρωτεΐνη λυσοσωμιακή μεμβράνη και αποτελείται από 238 αμινοξέα σε μήκος [12]. DRAM είναι απαραίτητη όχι μόνο για την ικανότητα της ρ53 υπερεκφράζεται ή DNA βλάβη που ενεργοποιείται ρ53 να ρυθμίζουν autophagy [13], αλλά επίσης για την ικανότητα της ρ53 να επάγει απόπτωση [9]. Η DRAM είναι ειδικά εντοπισμένες στις λυσοσώματα, ένα οργανίδιο που συμμετέχουν στο τελευταίο βήμα της autophagy [12]. Συνεπώς, είναι εύλογο ότι DRAM μπορεί να ρυθμίζει την autophagosome-λυσόσωμα σύντηξης, μια διαδικασία που απαιτείται για την παραγωγή του autophagolysosomes.

Έχει αποδειχθεί ότι DRAM έχει δυνατότητα λειτουργίας όγκου-κατασταλτική και ρυθμίζεται μειωτικά σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους [ ,,,0],12]. Η ρύθμιση προς τα κάτω των DRAM mRNA σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα λαμβάνει χώρα τόσο με άμεση υπερμεθυλίωση εντός της νησίδος CpG στην περιοχή προαγωγού αυτού του γονιδίου και από άλλα, ακόμη άγνωστα, μηχανισμοί όπως επιγενετικών τροποποιήσεων των βασικών ιστονών κοντά στο γονίδιο DRAM [12]. Στην έκθεση αυτή, που χαρακτηρίζεται το γονίδιο DRAM υποκινητή του ανθρώπινου και προσδιόρισε το DNA αλληλουχίες απαραίτητη για τη ρύθμιση του.

Αποτελέσματα

Ορός πείνα διεγείρει την έκφραση των DRAM σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος

Η στέρηση ορού επάγει την απόπτωση και αυτοφαγία σε πολλούς τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων HepG2 και HepB3. Αυτές οι παρατηρήσεις μας ώθησε να εξετάσει κατά πόσον ασιτία ορού θα μπορούσε να προκαλέσει την έκφραση των DRAM σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος. HepG2 και Hep3B κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70% συρροή σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS. Αυτά τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS τρεις φορές και τροφοδοτήθηκαν με μέσο παραλείποντας FBS για διάφορες χρονικές περιόδους. Τα προκύπτοντα κύτταρα συλλέχθηκαν και οι συνολικές RNAs εκχυλίσθηκαν. Η έκφραση του mRNA DRAM εξετάστηκε με ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR). Σε αμφότερες κύτταρα HepG2 και Hep3B το mRNA της DRAM ήταν σημαντικά επάγεται 24 ώρες στέρηση μετα-ορού, και έφθασε το υψηλότερο επίπεδο στις 48 h (Σχήμα 1Α, Β) με παρόμοιο τρόπο, γεγονός που υποδηλώνει ότι η στέρηση ορού επάγει την έκφραση DRAM σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος . Το επίπεδο των πρωτεϊνών DRAM σε κύτταρα HepG2 σε διάφορα χρονικά σημεία, εξετάστηκε με δοκιμασίες κηλίδος Western. Συνεπής με την έκφραση του mRNA DRAM παρατηρήθηκαν από qRT-PCR, DRAM πρωτεΐνη ανιχνεύτηκε ασθενώς στο 3 ώρες μετά την στέρηση ορού και έφθασε σε υψηλά επίπεδα στις 24 και 48 ώρες στέρησης ορού (Σχήμα 1 C).

(Α) επίπεδο του mRNA του γονιδίου DRAM κατά στέρηση ορού σε διαφορετικά χρονικά σημεία ποσοτικοποιήθηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR σε κύτταρα HepG2. (Β) έκφραση DRAM σε κύτταρα Hep3B είναι παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε σε κύτταρα HepG2. (C) Ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης DRAM σε κύτταρα HepG2. CD166 χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος για στέρηση ορού έκφραση επάγεται πρωτεΐνης. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70% συρροή σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS. Αυτά τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και τροφοδοτήθηκαν με μέσο DMEM παραλείποντας FBS για διάφορα χρονικά σημεία. Τα προκύπτοντα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα συνολικά RNAs και λύματα ολόκληρων κυττάρων εκχυλίστηκαν και η έκφραση των DRAM mRNA και της πρωτεΐνης εξετάσθηκε με qRT-PCR ή στύπωμα Western. GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικός έλεγχος. (D) Αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης δεν επηρεάζει την πείνα επαγόμενη έκφραση DRAM ορού σε κύτταρα HepG2. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CHX (10 mM) υπό στέρηση ορού για 24 ώρες, και το ολικό RNA εκχυλίστηκε για την ανάλυση της έκφρασης DRAM με πραγματικού χρόνου PCR. Όλα τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± Τ.Α. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. **

σ

& lt?. 0.01 επίπεδο με τη χρήση t-test

Η

Για να προσδιορίσετε αν τα νέα σύνθεση πρωτεΐνης που απαιτείται για την στέρηση ορού για να προκαλέσει την έκφραση DRAM, Κυκλοεξιμίδιο (CHX) εφαρμόστηκε στα ελεύθερα ορού μέσα ενημέρωσης για 30 λεπτά για να αναστείλει σύνθεση νέας πρωτεΐνης. Προκατεργασία των κυττάρων HepG2 με CHX δεν ανέστειλε την στέρηση ορού επαγόμενη έκφραση DRAM (Σχήμα 1D), γεγονός που υποδηλώνει ότι η προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης DRAM είναι ανεξάρτητη από τη σύνθεση πρωτεϊνών σε κύτταρα HepG2.

Η εγγύς περιοχή του προαγωγέα DRAM είναι ευαίσθητη σε πέψη με νουκλεάση

για να προσδιορίσει τα ρυθμιστικά στοιχεία τα οποία την αντιμετώπιση της στέρησης ορού στον προαγωγό DRAM, πρέπει πρώτα έθεσε ως στόχο να προσδιοριστεί η θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS) του γονιδίου DRAM χρησιμοποιώντας 5 ‘RACE δοκιμασίες . της αλληλουχίας του DNA επιβεβαίωσε ότι τα τρία προϊόντα PCR που χαρακτηρίζονται ως προϊόν 1 (~216 bp), το προϊόν 2 (~172 bp), και το προϊόν 3 (~ 106 bp) ήταν άμεσες ενισχύσεις από το 5 ‘UTR του γονιδίου DRAM (Εικόνα 2Α). Η χαμηλότερη ζώνη (~47 bp) στο πήκτωμα ήταν μη-ειδική ενίσχυση των ίδιων των εκκινητών. Τα πρώτα νουκλεοτίδια για προϊόντων 1, 2, και 3 ταυτοποιήθηκαν ως Α, Τ και Α, αντίστοιχα (Σχήμα 2Β). Προϊόν 1 και το προϊόν 2 ήταν 65 bp και 20 bp ανοδικά, ενώ προϊόντων 3 ήταν 107 bp καθοδικά του πρώτου νουκλεοτιδίου της αλληλουχίας DRAM cDNA βρέθηκε στο Gene Bank του National Center for Biotechnology Information (ID Gene: 728655). Για εύκολη περιγραφή εξής θεωρούμε αναφέρεται αυθαίρετα το νουκλεοτίδιο Α στο προϊόν 1 ως TSS (1).

(Α) σε πήκτωμα αγαρόζης έδειξε πολλαπλά προϊόντα PCR 5 ‘RACE. (Β) Χαρτογράφηση του δυναμικού TSS του

DRAM γονίδιο

. Το βέλος δείχνει την ένθετη ανάστροφο εκκινητή 5 ‘RACE. Η GeneRacer PCR, με βάση την RNA λιγάση μεσολάβηση και ολιγο-πωματισμό ταχεία ενίσχυση cDNA, διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε γέλη αγαρόζης, και πιθανές ζώνες συλλέχθηκαν και επιβεβαιώθηκε με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA. * Υποδηλώνει μια μη-ειδική ενίσχυση των ροοστάτες αστάρι.

Η

Για να παρέχουν περαιτέρω ενδείξεις στην αναζήτηση των ρυθμιστικών στοιχείων στον υποκινητή DRAM, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις διάγραμμα-PCR για την αξιολόγηση της προσβασιμότητας του υποκινητή DRAM DNA για πέψη με νουκλεάση. Πυρήνες απομονώθηκαν από HepG2 και τα κύτταρα Hep3B υποβλήθηκαν σε πέψη με ϋΝάση Ι ή MNase και τα προκύπτοντα θραύσματα γενωμικού DNA μεταξύ -7216 και + 289 bp (σε σχέση με τη θέση του TSS) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτικές αναλύσεις PCR (Σχήμα 3Α). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η εκατοστιαία μεταξύ άθικτου DNA από τα δείγματα νουκλεάση επεξεργασμένου και του μη επεξεργασμένου, και ήταν αντιστρόφως αντανακλούσε την αναλογία του προστατευόμενου DNA. Τα θραύσματα του DNA που εκτείνονται σε εγγύς υποκινητή (R5, R6 και R7) ήταν πιο ευαίσθητα στην DNase Ι και πέψη MNase, με ιδιαίτερα R6 (από -144 έως 72) εμφανίζουν το χαμηλότερο προστασία των -35% και στις δύο κύτταρα που εξετάστηκαν, ενώ υψηλότερα επίπεδα προστασίας κατά ϋΝάσης Ι ή πέψη MNase παρατηρήθηκαν στο R1 και R2 της περιοχής, υποδεικνύοντας ότι η ϋΝάση Ι και MNase προσβασιμότητα περιορίζονται στην περιοχή εγγύς υποκινητή, ειδικά στην περιοχή R6 (Σχήμα 3Β).

(Α) Σχηματική αναπαράσταση των συνόλων εναρκτήρα που χρησιμοποιούνται για ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ-PCR. (Β) R6 περιοχή του υποκινητή DRAM είναι πιο ευαίσθητα στην DNase Ι και πέψη MNase. Το γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από τα κύτταρα Hep3B και HepG2 και αναλύθηκαν με ποσοτική PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ποσοστό των πέψη DNAs να αχώνευτος DNAs. (Γ) Η στέρηση ορού αυξάνει την προσβασιμότητα των R5, R6 και R7 περιφέρειες να πέψη με νουκλεάση σε κύτταρα Hep3B και HepG2.

Η

Για να εξεταστεί η επίδραση της στέρησης ορού στο DNA προσβασιμότητα του υποκινητή DRAM στην DNase Ι και πέψη MNase, πυρήνες απομονώνονται από HepG2 και Hep3B κύτταρα αναπτύσσονται σε μέσο ελεύθερο ορού για 48 ώρες υποβλήθηκαν σε πέψη με νουκλεάση και ανάλυση ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ-PCR. Η δυνατότητα πρόσβασης σε όλες τις περιοχές R5, R6 και R7 να πέψη με νουκλεάση αυξήθηκε σημαντικά σε αμφότερες κύτταρα κατά στέρηση ορού με την περιοχή R6 εμφάνιση του τουλάχιστον επίπεδο προστασίας (Σχήμα 3C). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα εμπλέκουν ότι η εγγύς περιοχή του προαγωγέα DRAM περιέχει υποθετικό cis-ρυθμιστικών στοιχείων αποκρίνεται σε στέρηση ορού.

στέρηση ορού προκαλεί αλλαγές στο τροποποίηση ιστονών στους τόπους DRAM υποκινητή

Για περαιτέρω ενισχύσει την παρατήρηση ότι η εγγύς περιοχή του προαγωγέα DRAM περιέχει υποθετικό cis-ρυθμιστικών στοιχείων σε στέρηση ορού, εξετάσαμε την κατάσταση τροποποίηση ιστόνης σε αυτό το τόπο χρησιμοποιώντας τις δοκιμασίες chip. Οι ακετυλιώσεις ιστόνης όπως ακετυλίωση λυσίνης επί Η3 και Η4 γενικά γνωστό ότι σχετίζονται με ενεργά γονίδια μεταγράφονται και δομή χρωματίνης ανοιχτό [14] – [16]. Αντισώματα ειδικά για διακετυλιωμένης Η3 (Κ9 και Κ14) και τετρα-ακετυλιωμένης Η4 (Κ5, Κ8, Κ12 και Κ16) χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση της ανάλυσης τσιπ για να προσδιοριστεί το πρότυπο των τροποποιήσεων ιστονών στον τόπο προαγωγό DRAM με ή χωρίς ορό. Σε κύτταρα Hep3B τόσο Η3 και Η4 ακετυλιώθηκαν στην περιοχή R1, R6 και R7, με τον τόπο R6 δείχνει το υψηλότερο επίπεδο ακετυλίωσης. Η ακετυλίωση της ιστόνης ήταν προφανώς αυξήθηκε σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από στέρηση ορού στις περιοχές R6 και R7, αλλά όχι την περιοχή R1 (Εικόνα 4Α, Β)

Hep3B κύτταρα παρασκευάστηκαν για χρωματίνη ΙΡ (μάρκας) δοκιμασίες . Τα DNA της χρωματίνης ανοσοκατακρημνίσθηκαν με αντισώματα ειδικά προς H3K4me3 (Α), αντι-δι-ακετυλο-H3 (Β), αντι-H3K9me2 (C) και αντι-τετρα-ακετυλο-H4 (D), και τα εμπλουτισμένα θραύσματα DNA που πλαισιώνει την DRAM υποκινητή αναλύθηκαν με ποσοτική PCR. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως η ποσότητα του DNA που ανακτήθηκε από ειδικά αντισώματα σε σχέση με το DNA εμπλουτίζεται από τα κατάλληλα IgG ελέγχου. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως το μέσο ± τυπικές αποκλίσεις από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *: P & lt? 0,05

Η

Στη συνέχεια, εξετάσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης των ιστονών στη θέση του υποκινητή DRAM.. Η τριμεθυλο-H3K4, ένα ευχρωματινικούς δείκτης [17] – [18], εμφανίζεται ένα παρόμοιο μοτίβο με διακετυλ-Η3 και Tetra-ακετυλο-H4 σε Hep3B κυττάρων (Σχήμα 4C), ενώ η διμεθυλο-H3K9 βαθμολογήθηκε χαμηλότερα στην περιοχή R6 στο βασικό επίπεδο και μειώθηκε μαζί με την παρατεταμένη στέρηση ορού (Εικόνα 4D). Η διμεθυλο-H3K9 χρησιμεύει ως ένα σήμα για χρωματίνης αποσιώπηση με την πρόσληψη των πρωτεϊνών Θ1 (πρωτεΐνη ετεροχρωματίνη 1) και είναι αμοιβαία αποκλειόμενες με Η3-Κ9 ακετυλίωση [19]. Στο σύνολό τους, αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου DRAM συσχετίζεται με την αύξηση της τοπικής ευχρωματινικούς δείκτες και ταυτόχρονα μειώθηκε heterochromatic δείκτες.

ΝΡ-κΒ δεν είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση του προαγωγού DRAM

για να προσδιοριστούν οι ελάχιστες ρυθμιστικά στοιχεία για στέρηση ορού στον προαγωγό DRAM, διάφορα θραύσματα του εγγύς υποκινητή DRAM εισήχθησαν ανοδικά της πυγολαμπίδας φορέα αναφοράς λουσιφεράσης. Η μεταγραφική δραστηριότητα αυτών των κατασκευασμάτων δοκιμάσθηκαν σε κύτταρα Hep3B και HepG2. Ο δημοσιογράφος που περιέχει -1741 /+ 299 κομμάτι μόνο ασθενώς ανταποκρίθηκαν στην στέρηση ορού, ενώ οι δημοσιογράφοι που περιέχουν -863, -75, 19 /+ 299 τεμάχια εμφανίζονται σημαντικές δραστηριότητες υψηλής λουσιφεράσης σε ανταπόκριση σε στέρηση ορού. Εντυπωσιακά, ο ανταποκριτής που περιέχει το θραύσμα + 28 /+ 299 δεν δείχνουν δραστικότητα σε ορό στέρηση (Σχήμα 5Α). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα cis ρυθμιστικά στοιχεία για στέρηση ορού στον υποκινητή DRAM κατοικείται η περιοχή που πλευρίζουν -19 /+ 28 νουκλεοτίδια (Σχήμα 5Β). Η ρεπόρτερ προωθητής που περιέχει το βραχύτερο τμήμα DNA που περιέχει -19 /+ 28 περιοχή ονομάστηκε ως Luc-DCP εφεξής.

(Α) Hep3B και HepG2 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδια ανταποκριτές που περιέχουν περικομμένες εκδοχές της περιοχής του υποκινητή του η

DRAM

γονιδίου όπως υποδεικνύεται. Luc-DCP ορίζεται ως η ρεπόρτερ που περιέχει την περιοχή υποκινητή συντομότερη (-19~ + 28). (Β) Η περιοχή προαγωγέα πυρήνας περιέχει μία υποθετική θέση δέσμευσης NF-κΒ. παράγοντας μεταγραφής θέσεις που παρουσιάζονται στην περιοχή υποκινητή πυρήνα (-19~ + 28) δέσμευσης στηρίζεται από TFSEARCH λογισμικό ιστού και MatInspector και η μετάλλαξη ή διαγραφή πλασμίδια παράχθηκαν χρησιμοποιώντας την μέθοδο μεταλλαξογένεσης κατευθυνόμενης σε θέση. (C) μετάλλαξη ή διαγραφή της θέσης δέσμευσης NF-κΒ δεν επηρεάζει τη δράση του υποκινητή πυρήνα.

Η

Σε μια προσπάθεια να αναζητήσουν πιθανούς παράγοντα μεταγραφής θέσεις πρόσδεσης στο -19 /+ 28 περιοχή, επόμενη πραγματοποιηθεί ολοκληρωμένη βιοπληροφορική ανάλυση και βρήκε μια κανονική ιστοσελίδα NF-κΒ-δέσμευσης κατοικούσαν σε αυτή την περιοχή. Για να επιβεβαιωθεί εάν αυτή η υποθετική θέση ΝΡ-κΒ-δέσμευσης είναι λειτουργικό, κάναμε διαγραφή και μετάλλαξης σε αυτήν την περιοχή (σχήμα 5Β). Παραδόξως, η διαγραφή ή μετάλλαξη αυτής της ιστοσελίδας ΝΡ-κΒ-δέσμευσης δεν είχε εμφανή επίδραση στην δραστικότητα προαγωγέα σε αποκρίνεται σε στέρηση ορού (Σχήμα 5C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι άλλοι παράγοντες, δεν NF-κΒ είναι απαραίτητη για την επαγωγή DRAM από τη στέρηση ορού.

Τα βασικά εξαρτήματα του συγκροτήματος μηχανημάτων μεταγραφής δεσμεύεται στην εγγύς περιοχή του υποκινητή DRAM

Brg Ι και RNA πολυμεράση II είναι βασικά συστατικά του holoenzymes II οι οποίες συμμετέχουν στην γονιδιακή μεταγραφή [20] RNA πολυμεράση. Η χρωματίνη από κύτταρα Hep3B και HepG2 συλλέχθηκαν και κατακρημνίστηκαν με αντι-Brg Ι και II αντισώματα αντι-Pol. Τα καταβυθισθέντα DNAs αξιολογήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR. Brg Ι δεσμεύεται στο έπακρο με το DNA στην περιοχή R6 και στα δύο κύτταρα, ενώ Pol II συνδέεται με τις περιφέρειες τα R6 και R7 με υψηλότερη συγγένεια από εκείνη της περιοχής R4 (Σχήμα 6Α). Εντυπωσιακά, στέρηση ορού οδήγησε σε αυξημένη δέσμευση του Brg Ι και ροΙ II στο DNA στην περιοχή R6 και τέτοιες αυξήσεις παρατηρήθηκαν ήδη από 5 λεπτά μετά την στέρηση ορού και έφθασε το υψηλότερο επίπεδο στα 30 λεπτά και στα δύο κύτταρα αντιστοίχως (Σχήμα 6Β).

(Α) Brg-1 δεσμεύεται στο εγγύς περιοχή του προαγωγέα DRAM. δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν σε κύτταρα Hep3B και HepG2. (Β) στέρηση ορού ενισχύει Brg-1 και Ροΐ II δεσμευτικός στον τόπο DRAM υποκινητή. (Γ) Μείωση των Brg-1 με τη χρήση συγκεκριμένης στόχευσης shRNA καταργεί στέρηση ορού που προκαλείται από την έκφραση DRAM.

Η

Brg-1 απαιτείται για την επαγωγή στέρηση ορού της έκφρασης DRAM

Για να εξεταστεί ο ρόλος του Brg Ι σε επαγωγή της έκφρασης DRAM, κύτταρα HepG2 επιμολύνθηκαν με siRNA ολιγονουκλεοτίδια ειδικά εναντίον Υπνοδωμάτια, ή Brg Ι για 24 ώρες που ακολουθείται από ποσοτικούς προσδιορισμούς RT-PCR (Σχήμα 6C, αριστερό πάνελ). Η επαγωγή της έκφρασης DRAM με στέρηση ορού καταργήθηκε από την εξάντληση των Brg I. Πάντως, νοκ ντάουν του Υπνοδωμάτια, δεν επηρέασε την έκφραση των DRAM (Σχήμα 6C). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι Brg-Ι είναι απαραίτητη για την επαγωγή DRAM σε αποκρίνεται σε στέρηση ορού.

Συζήτηση

DRAM έχει δυνατότητα λειτουργίας όγκου-κατασταλτική και είναι κρίσιμη για ρ53 να διαμορφώνει αυτοφαγία και την απόπτωση [ ,,,0],12]. Ως εκ τούτου, η ανακάλυψη των ρυθμιστικών παραγόντων που ρυθμίζουν την έκφραση των DRAM θα ​​παρέχει στόχους για νέα θεραπευτικά μέσα. Ωστόσο, η ρύθμιση της έκφρασης των DRAM είναι ελάχιστα περιγράφεται μέχρι τώρα. Εδώ, δείξαμε για πρώτη φορά ότι η στέρηση του ορού που επάγεται ισχυρά έκφραση DRAM σε καρκίνο του ήπατος HepG2 και Hep3B κύτταρα και προσδιορίζονται μια αλληλουχία DNA πυρήνα στον προαγωγό DRAM, η οποία είναι απαραίτητη για την ανταπόκριση της σε στέρηση ορού.

Προηγουμένως DRAM ταυτοποιήθηκε ως γονίδιο επάγεται ρ53 και ένα λειτουργικό στοιχείο απόκρισης της ρ53 βρίσκεται στο 2,3 kb ανοδικά του προαγωγέα DRAM [21]. Εδώ, αποδείξαμε ότι ασιτία ορού επάγει την έκφραση DRAM σε HepG2, ένα ρ53 θετικού κυττάρου, και Hep3B, ρ53 αρνητικά κύτταρα με παρόμοιο τρόπο, υποδηλώνοντας ρ53 μπορεί να μην είναι ένας βασικός παράγοντας που εμπλέκονται σε αυτή την επαγωγή [22]. Ωστόσο, αυτό είναι ένα μεγάλο ενδιαφέρον να δούμε αν υπάρχει κάποια συνεργασία μεταξύ στέρηση p53and ορού στη ρύθμιση της έκφρασης των DRAM.

Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι το μεγαλύτερο κομμάτι (-1714) ασθενώς ανταποκρίθηκαν στο ορού πείνα. Εμείς υποθέσουμε ότι στο μεγαλύτερο κομμάτι υπάρχουν κατασταλτικές cis στοιχεία τα οποία θα μπορούσε να μειώσει την βασική δραστηριότητα των DRAM υποκινητή. Η σύντομη εκδοχή του υποκινητή δεν περιέχει τέτοια στοιχεία, και εμφανίζουν υψηλή μεταγραφική δραστηριότητα

ακετυλίωση και μεθυλίωση σχετικά με τα κατάλοιπα λυσίνης των ουρών πυρήνα των ιστονών είναι κρίσιμης σημασίας για την μεταγραφή γονιδίων [23] – [24].. Οι ακετυλιώσεις λυσινών σε Η3 και Η4 γενικά γνωστό ότι σχετίζονται με ενεργά γονίδια μεταγράφονται και δομή χρωματίνης ανοιχτό [15] – [16], [25]. Σταθερά, παρατηρήσαμε ότι σε κύτταρα Hep3B και HepG2 λυσίνης ακετυλίωση σε Η3 και Η4 προφανώς αυξήθηκε σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από στέρηση ορού στην περιοχή υποκινητή πυρήνα του γονιδίου DRAM. Η τριμεθυλο-H3K4, ένα ευχρωματινικούς δείκτη για την ενεργή μεταγραφή, εμφανίζεται ένα παρόμοιο μοτίβο με διακετυλο-H3 και Tetra-ακετυλο-Η4 σε Hep3B κυττάρων. Σε αντίθεση, η διμεθυλο-H3K9 βαθμολογήθηκε χαμηλότερα στην περιοχή R6 στο βασικό επίπεδο και ήταν χρονικά εξαρτώμενο μειώθηκε κατά στέρηση ορού. Η διμεθυλο-H3K9 χρησιμεύει ως ένα σήμα για χρωματίνης αποσιώπηση με την πρόσληψη των πρωτεϊνών ΗΡ1 και είναι αμοιβαία αποκλειόμενες με Η3-Κ9 ακετυλίωση. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η στέρηση ορού μπορεί να προκαλέσει συνέλευση συνεταιρισμός ακετυλτρανσφεράσες ιστονών, απακετυλάσες και μεθυλτρανσφεράσες, μεταγραφική συγκρότημα στην χρωματίνη στόχο να τροποποιήσει τους κωδικούς των ιστονών. Ωστόσο, δεν είμαστε σαφές ποιες είναι τροποποιητές των ιστονών προσληφθεί σε αυτό το τόπο. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ότι οι αλλαγές στην κατασταλτική στην ενεργό σημάτων ιστόνης λαμβάνει χώρα σε πρώτα 15 λεπτά, και δεν αλλάζουν σημαντικά καθόλου μέχρι 24 ώρες, ενώ το mRNA της DRAM σταδιακά αυξήθηκε και έφθασε το υψηλό επίπεδο μέχρι στις 24 ώρες και 48 ώρες. Αυτή η φαινομενική καθυστέρηση της έκφρασης DRAM mRNA μπορεί να οφείλεται στο χρόνο για τη συναρμολόγηση του μηχανισμού μεταγραφής για να οδηγήσει αποτελεσματικά την έκφραση του γονιδίου DRAM. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός θα πρέπει να διευκρινιστεί. Επί του παρόντος, προσπαθούμε να εντοπίσει τα πιθανά συμπλέγματα πρωτεϊνών που θα μπορούσαν να συνδέονται με αυτό το βασικό ακολουθία DNA χρησιμοποιώντας DNA pulldown και φασματομετρία μάζας προσεγγίσεις και εντόπισε πολλαπλές πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένων p300 που δυνητικά μπορεί να συνδέονται με τον πυρήνα υποκινητή των DRAM. τους ρόλους τους στη ρύθμιση της έκφρασης των DRAM τώρα ανακρίνονται καλά.

Το ογκοκατασταλτικό Brg-1 είναι ένα κεντρικό συστατικό της SWI /SNF chromatin- αναδιαμόρφωση συγκρότημα [26]. Αυτό το συγκρότημα μπορεί να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή γονιδίων με την αναδιαμόρφωση της δομής της χρωματίνης κατά την ενοχλητική αλληλεπιδράσεις DNA-ιστόνης στα νουκλεοσώματα. Έχουμε αποδείξει ότι Brg-1 είναι εμπλουτισμένη στην περιοχή υποκινητή πυρήνα του γονιδίου DRAM και απαιτείται για τη στέρηση ορού που προκαλείται από την έκφραση DRAM.

Η πρωτεΐνη Υπνοδωμάτια, (Brahma) μπορεί να υποκαταστήσει Brg-1 και να εκπληρώσει την ελικάση /ΑΤΡ λειτουργία του συμπλόκου in vitro. Ωστόσο, Brg-1 και Υπνοδωμάτια, δεν είναι λειτουργικά εναλλάξιμα in vivo. Ομόζυγο

Brg1

knockout έμβρυα πεθαίνουν πριν από την εμφύτευση και ετερόζυγα ποντίκια είναι επιρρεπείς στην ανάπτυξη επιθηλιακών όγκων [26] – [27], ενώ η

Υπνοδωμάτια,

knockouts είναι βιώσιμες και δεν αναπτύσσουν όγκους [28] – [29]. Συνέπεια, η εξάντληση των Brg-1 σε κύτταρα HepG2 καταργηθεί στέρηση ορού που προκαλείται από την έκφραση των DRAM, ενώ η εξάντληση των Υπνοδωμάτια, δεν επηρέασε την έκφραση DRAM. Brg-1 έχει αποδειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής απόπτωσης και αυτοφαγία, αλλά οι μηχανισμοί υποτακτικός είναι ασαφείς. Προσδιορισμός των DRAM αποτελεί άμεσο στόχο Brg-1 θα ρίξει νέο φως στη μοριακή ρύθμιση της αυτοφαγία.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια, επιμολύνσεις και πλασμίδια

HepG2 και τα κύτταρα Hep3B (ATCC) διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS (Gibco), 2 mM L-γλουταμίνη, και πενικιλλίνη (50 U /ml) /στρεπτομυκίνη (50 μg /ml) στους 37 ° C υπό 5% CO

2 σε υγροποιημένο θάλαμο.

επιμόλυνση τα κύτταρα εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα ολίγο siRNA που στοχεύουν ειδικά BrgI (CGCGCUACAACCAGAUGAATT), Υπνοδωμάτια, (GGAUUGUAGAAGACAUCCATT) ή αρνητικό μάρτυρα (αγωνίζομαι RNA, UUCUCCGAACGUGUCACGUTT) αγοράστηκαν (GenePharma Co., Ltd, Shanghai, Κίνα).

Η αντίστροφη μεταγραφή PCR (RT-PCR )

Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen). Το μίγμα της αντίδρασης (20 μΐ) που περιέχει 1 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA στη χρήση των PrimeScript RT-πολυμεράσης (Takara). Τα προκύπτοντα cDNAs αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR (Mx3000P πραγματικό ime PCR System, Stratagene, La Jolla, CA, USA) με ζεύγη εκκινητών ειδικά για DRAM και GAPDH. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως αναλογίες των συνολικών επιπέδων mRNA των DRAM κατά β-ακτίνης.

5′-RLM-RACE

Το σύστημα GeneRacer (Invitrogen), με βάση την RNA λιγάση μεσολάβηση και ολιγο -capping ταχεία ενίσχυση cDNA, διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το κιτ εξασφαλίζει την ενίσχυση του μόνο μεταγραφές πλήρους μήκους με την εξάλειψη κολοβωμένη μηνύματα από την διαδικασία ενίσχυσης. DRAM-ειδικούς εκκινητές (F, TGCGAAACGAGTGAAGTCACAAAGC? R, GCGAGCTCCAAGCGGACGCGACTAC) χρησιμοποιήθηκαν για ενίσχυση με PCR χρησιμοποιώντας το σύστημα LaTaq GC-Rich PCR (Takara, Inc., Dalian, Κίνα)

ανάλυση προσβασιμότητας χρωματίνης

.

προσβασιμότητα του DNA για την πέψη DNase Ι και MNase (Takara, Inc., Dalian, Κίνα) αναλύθηκαν με τη χρήση της χρωματίνης προσβασιμότητας μέσω ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ-PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30] – [31]. Οι δοκιμασίες επαναλήφθηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα. Primer ζεύγη για διαφορετικές περιοχές ως ακολούθως: R1 (F: TCCAACCCTCATGGATGGCTTTTAG? R: ATTCAGTCACATCTTCAGGCTCTAC)? R2 (F: ATGAATCAGTAGTAGGGCACGAAAG? R: CAGCCTGGTCAACAGATAGAG)? R3 (F: TTGCGGGTCTCACTATATTGTCCAG, R: GGGCAGACTAGTATTTCAAGAGATC)? R4 (F: TCCAGAACACAAATCCCTTTCACAG, R: GAGCCTTTATCACACCACTTCACTC)? R5 (F: CGCTCTCCTGGAAAGCAGCACAATG, R: AGTGTTCAATGAGGTTCGCCAGGTC)? R6 (F: ACCTCATTGAACACTTCTGCCCGAC? R: GCTCTTGCGCAACTCTGGAGAAAAG)? R7 (F: CGAGTGTCCAAACCAAAAGCGAAAG? R: TGCGAAACGAGTGAAGTCACAAAG).

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα

δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Active Motif, Carlsbad, CA, USA). Τα συμπλέγματα πρωτεϊνών-DNA ανοσοκαταβυθίστηκαν με 4 μg αντισώματα RNA πολυμεράση ΙΙ (SC-9001, Santa Cruz Biotechnology), και Brg1 (SC-10768)? διμεθυλο-Η3-Κ9 (ab1220, Abcam), τετρα-ακετυλο-H4 (06-866, Upstate) και διακετύλιο-H3 (07-593, Upstate)? και τριμεθυλο-H3-K4 (9751, Cell Signaling Technology). Real-time PCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν με 1 μΙ καταβυθισμένου DNA. DNA που ανακτήθηκε από δείγματα που περιέχουν ένα αντίσωμα συγκρίθηκε με ελέγχους IgG πραγματοποιήθηκε σε δείγματα από την ίδια χρωματίνη παρασκεύασμα. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως η ποσότητα του DNA που ανακτήθηκε σε σχέση με τον κατάλληλο έλεγχο IgG που παρέχονται από τους κατασκευαστές. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως το μέσο ± τυπικές αποκλίσεις από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Κατασκευή των DRAM υποκινητή-λουσιφεράση πλασμίδια ανταποκριτές και η δοκιμασία λουσιφεράσης

PCR δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση εκκινητή θέτει ειδικά για το

DRAM

υποκινητή (F-1714): AGGAACGCGTACTCCACGGCCACAGTGATCTCTTG? F (-863): TGGAACGCGTGGCCACATATGTTGGGCTCAGACTC? F (-75): TGACACGCGTGGTGGCCACTCTCACTGCTGCGAAG? F (-19): TGACACGCGTTCGGGGTGCGAGGCCCGGCACTC? F (+28): TGACACGCGTGTTGGGAGAAATAAATCCTTTTCTC? R (299): CGTACTCGAGCGGGCTTGTTGCGAAACGAGTGAAG). Αυτά τα PCR προϊόντα κλωνοποιήθηκαν εντός των θέσεων ΜΙυ Ι /Xho Ι του pGL3-Basic (Promega, Madison, WI, USA). μεταλλάξεις υποστηρικτής και διαγραφές δημιουργήθηκαν με ένα κιτ μεταλλαξογένεσης PCR-based τοποκατευθυνόμενη (Takara), χρησιμοποιώντας αντίστοιχο πλασμίδιο όπως τα πρότυπα. Για την υποκατάσταση νουκλεοτιδίων και τη διαγραφή του ελάχιστου προαγωγέα, οκτώ νουκλεοτιδίων αλληλουχία DNA GCGCGCGC χρησιμοποιήθηκε για να αντικαταστήσει το άγριου τύπου DNA στο ελάχιστο προαγωγέα, ή ο πυρήνας θέση δέσμευσης NF-kB διαγράφηκε με τη χρήση της μεθόδου τοποκατευθυνόμενης μεταλλαξογένεσης. πλασμίδια υποστηρικτής ρεπόρτερ επιμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). pTRL-TK πλασμίδιο (Promega) συν-επιμολύνθηκαν ως ένας εσωτερικός έλεγχος για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας μορφομετατροπής. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την διαμόλυνση, τα προκύπτοντα κύτταρα συλλέχθηκαν και προετοιμάστηκαν για ανάλυση δραστικότητα λουσιφεράσης. Οι λουσιφεράσης μετρήθηκαν με τη χρήση της διπλής λουσιφεράσης σύστημα προσδιορισμού ανταποκριτή (Promega) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με την illuminometer (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA, USA).

Ανάλυση Western Blot

τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (Beyotime Inc.). Τα κυτταρολύματα διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση στα 15.000 g για 10 λεπτά. 20 μα συνολικών πρωτεϊνών επιλύθηκε στις 8% γέλες SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνη Immobilon Ρ (Millipore). Τα στυπώματα Western που περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Τα αντισώματα DRAM (AP1825a, Abgent) και β-ακτίνη (SC-130656, Santa Cruz Biotechnology) αγοράστηκαν.

Η στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές εκτιμήσεις έγιναν με τη χρήση του t-test. P-τιμές & lt?.. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τον Δρ Kevin M. Ryan για τον επιμερισμό του πλασμιδίου DRAM