Αφηρημένο

γαστρικός καρκίνος είναι μία από τις πιο κοινές αιτίες της θνησιμότητας του καρκίνου που σχετίζονται με όλο τον κόσμο. Η έκφραση της πρωτεΐνης καταστολέα όγκου, προμυελοκυτταρική λευχαιμία (PML), μειώνεται ή καταργείται σε γαστρικά καρκινώματα, σε συνδυασμό με ένα αυξημένο επίπεδο του λεμφικού εισβολή, ανάπτυξη υψηλότερων στάσης pTNM, και δυσμενή πρόγνωση. Εδώ, ερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ της έκτασης του ογκο-διηθητικά λεμφοκύτταρα και την κατάσταση της έκφρασης πρωτεΐνης PML σε προχωρημένο γαστρικό καρκίνωμα. Παρατηρήσαμε μεγαλύτερους αριθμούς από διηθητικά Τ-κυττάρων σε ιστούς γαστρικού καρκινώματος στο οποίο PML έκφρασης μειωθεί ή καταργηθεί, σε σύγκριση με τους ιστούς θετικά για PML. Η έκταση της μετανάστευσης των Τ-κυττάρων προς υπερκείμενα καλλιέργειας ελήφθησαν από ιντερφερόνη-γ (ΙΡΝ-γ που διεγείρεται κυτταρικές σειρές γαστρικού καρκινώματος επηρεάστηκε επιπλέον από την έκφραση της PML

in vitro

. Ιντερφερόνη-γάμμα-επαγώγιμη πρωτεΐνη 10 (ΙΡ -10 /CXCL10) εκφράσεως είναι αυξημένο σε ιστούς γαστρικό καρκίνωμα που εμφανίζουν μειωμένα επίπεδα PML. Επιπλέον, τόσο

PML

νοκ-άουτ και knockdown κύτταρα εμφάνισαν ενισχυμένη ΙΡ-10 mRNA και η πρωτεΐνη έκφρασης στην παρουσία του IFN-γ. PML knockdown αυξημένη ΙΡΝ-γ με τη μεσολάβηση Signal Transducer και ενεργοποιητής της μεταγραφής-1 (STAT-1) δέσμευση στην ΙΡ-10 υποκινητή, με αποτέλεσμα την αυξημένη μεταγραφή του ΙΡ-10 γονίδιο. Αντιστρόφως, η έκφραση της πρωτεΐνης PML IV κατέστειλε την ενεργοποίηση προαγωγού ΙΡ-10 . με βάση αυτά τα αποτελέσματα, προτείνουμε ότι η απώλεια της έκφρασης πρωτεΐνης PML σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα συμβάλλει στην αύξηση της ΙΡ-10 μεταγραφή

μέσω

ενίσχυση της δραστικότητας STAT-1, το οποίο, με τη σειρά του, προωθεί την διακίνηση των λεμφοκυττάρων εντός των περιοχών του όγκου .

Παράθεση: Kim HJ, Τραγούδι DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) Απώλεια της πρωτεΐνης προμυελοκυτταρική λευχαιμία σε γαστρικό καρκίνο: Συνέπειες για IP-10 Έκφραση και ογκο-διηθητικά λεμφοκύτταρα. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10.1371 /journal.pone.0026264

Επιμέλεια: Yoshio Yamaoka, παλαιμάχων Ιατρικό Κέντρο Υποθέσεων (111d), Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Απρ, 2011? Αποδεκτές: 23 Σεπτεμβρίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 12 Οκτωβρίου 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Πρόγραμμα βασική επιστημονική έρευνα, μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας (2.010 έως 0.015.506) για την Υ-HC, από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από την κυβέρνηση της Κορέας (MEST) (2010 – 0.029.353) για να JLK, και από RO1 NS50665 να ΕΝΒ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου είναι μια από τις πιο συχνές αιτίες των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο. Οι πρόσφατες πρόοδοι στη γενετική έχουν διευκολύνει την ανίχνευση των γεγονότων που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια της γαστρικής καρκινογένεσης, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης ογκογονιδίων, αποσιώπηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, και μετάλλαξης των γονιδίων που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA [1]. Μεταξύ αυτών των γενετικά γεγονότα, είναι γνωστό ότι η έκφραση ογκοκατασταλτικών προμυελοκυτταρική λευχαιμία πρωτεΐνη (PML) μειώνεται ή καταργείται σε γαστρικό καρκίνο, και ότι αυτό σχετίζεται με πιο εκτεταμένη λεμφικού εισβολή, υψηλότερη στάσης pTNM, και δυσμενή πρόγνωση, γεγονός που υποδηλώνει ότι η απώλεια PML είναι που συνδέονται με την εξέλιξη της καρκινογένεσης και γαστρικού καρκινώματος [2]. Προγενέστερες μελέτες ενοχοποιείται

PML

δυσλειτουργία σε πρόοδο μιας ποικιλίας καρκίνων, και μειώνεται ή καταργείται η έκφραση της PML έχει αναφερθεί σε προστάτη, του μαστού, του κεντρικού νευρικού συστήματος, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, και γαστρικούς καρκίνους [2], [3] .

Ο

PML

γονίδιο ταυτοποιήθηκε αρχικά με σύντηξη με τον υποδοχέα ρετινοϊκού οξέος που εμπλέκονται στην t (15? 17) χρωμοσωμική μετάθεση που σχετίζονται με οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML είναι μια πρωτεΐνη καταστολέας όγκου που ρυθμίζει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, τη μεταγραφή γονιδίων, καταστολή μετασχηματισμού, και την απόπτωση.

PML

knockout ποντικών είναι πολύ πιο ευαίσθητα σε σχηματισμό όγκων μετά από έκθεση σε καρκινογόνους παράγοντες από ό, τι είναι οι έλεγχοι φυσικού τύπου, και

PML

ελλιπή ως κύτταρα είναι λιγότερο πιθανό να υποστούν απόπτωση μετά την εφαρμογή των συγκεκριμένων τύπων κυτταρικό στρες [9]. Εκτός από τις εκθέσεις εστιάζοντας στο ρόλο ογκοκατασταλτικό παίζεται από PML, αρκετές μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι η πρωτεΐνη δρα ως μεταγραφικός ρυθμιστής,

μέσω

σύνδεση με την πρωτεΐνη συν-ενεργοποιητή CREB-δεσμευτική? συν-καταστολείς, συμπεριλαμβανομένων HDAC, Ν-ΕτΠ, και mSin3A? και τους παράγοντες μεταγραφής Nur77, ΑΡ-1, myc, ρ53, και STAT-1α [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].

Προοδευτική μετάλλαξης και γενετικών αλλοιώσεων σε διάφορα ογκοκατασταλτικά γονίδια προώθηση της ανάπτυξης και της εξέλιξης [18] του όγκου. Εκτός από γενετικές μεταβολές εντός καρκινικών κυττάρων, τόσο φλεγμονώδη κύτταρα και μεσολαβητές συνεισφέρουν στο σχηματισμό ιδιαίτερα μικροπεριβάλλοντα όγκου [19], [20]. Tumor-σχετίζεται ινοβλάστες (TAFs) και μακροφάγα (ΤΑΜ) εμπλέκονται επίσης στην διαμόρφωση της μικροπεριβάλλον του όγκου

μέσω

παραγωγή κυτοκινών, χημειοκινών, ιντερφερόνες, και άλλα βιολογικώς δραστικά παράγοντες [21], [22]. Cross-talk μεταξύ των κυττάρων του όγκου, TAFs, ΤΑΜ, και λεμφοκύτταρα, είναι σημαντική στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου, και συμβάλλει στην εγκαθίδρυση μικροπεριβάλλοντα όγκου εμπλουτισμένο σε έκφραση μιας ποικιλίας βιολογικώς δραστικών παραγόντων [23], [24], [25] , [26], τα [27].

ΤΑΜ βρέθηκε να συσχετίζεται με την αγγειογένεση και δυσμενή πρόγνωση σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του γαστρικού καρκίνου [22], [28]. Mast κύτταρο παράγει πολλούς αγγειογενετικούς παράγοντες και μια ποικιλία κυτοκινών, και η πυκνότητα του έχει αναφερθεί σε εξαιρετικά συσχετίζονται με την έκταση της νεοαγγειογένεσης όγκου και κακή πρόγνωση [29], [30]. Τα CD4

+ και CD8

+ λεμφοκυττάρων βρέθηκε επίσης σε μια ποικιλία στερεών καρκινικών ιστών. Μέχρι τώρα, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους ρυθμίζονται ο τύπος και ο αριθμός των διηθούν όγκο κύτταρα είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Υπάρχουν αρκετές αμφιλεγόμενες εκθέσεις όσον αφορά τον αριθμό και τη λειτουργία των λεμφοκυττάρων που διηθούν όγκο. Ειδικά, CD8

+ Τ λεμφοκύτταρα, ενώ η λειτουργία τους είναι γνωστή για την εξάλειψη των εν τω γεννάσθαι μετασχηματισμένα κύτταρα και συμβάλλουν στην ανοσοεπιτήρηση [31], αναφέρεται ότι τα CD8

+ διηθούν όγκο Τ κύτταρα είναι ελαττωματικά σε συνάρτηση φάση τελεστή κατά την επαφή με κύτταρα όγκου [32], και η διείσδυση τους συνδέεται με δυσμενείς πρόγνωση σε ορισμένους τύπους καρκίνου, όπως καρκίνο μη μικρού κυττάρου πνεύμονα και καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα [33], [34].

Οι χημειοκίνες εκκρίνονται από στρωματικά κύτταρα ή καρκινικά κύτταρα επηρεάζουν τη μετανάστευση καρκινικών κυττάρων, εισβολή, πολλαπλασιασμό, αγγειογένεση και διείσδυση ανοσοκυττάρων στην μάζα του όγκου [35]. IFN-γ-επαγώγιμη πρωτεΐνη-10 (ΙΡ-10, CXCL10) είναι μία από τις χημειοκίνες CXC η οποία παίζει πολλαπλούς ρόλους στην φλεγμονώδη νοσήματα και τον καρκίνο [36], [37]. Από ΙΡ-10 προάγει προτίμηση Th1 ανοσοαποκρίσεων με σθένος την προσέλκυση κυττάρων ΝΚ και Τ, προτείνεται ως ένα των πιθανών μηχανισμών της διείσδυσης Τ κυττάρων σε όγκους.

Είτε απώλεια των ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε κύτταρα όγκου επάγει την πρόσληψη λεμφοκύτταρα και διαμόρφωση των λειτουργιών των κυττάρων αυτών μέσα μικροπεριβάλλοντα όγκου είναι προς το παρόν ασαφές. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τη λειτουργία PML όσον αφορά την πρόσληψη των λεμφοκυττάρων και τη διαφοροποίηση της έκφρασης των παραγόντων που προέρχονται από όγκους. Η έκφραση της PML ήταν αντιστρόφως ανάλογη με την έκταση της διείσδυσης του CD8

+ Τ-κυττάρων σε γαστρικά καρκινώματα. απώλεια PML περαιτέρω σχετίζεται με αυξημένη έκφραση του ΙΡ-10, ένα από τα λεμφοκύτταρα προσέλκυση χημειοκίνες CXC, σε γαστρικό κύτταρα καρκινώματος και τους ιστούς. PML knockdown προωθείται ΙΡΝ-γ με τη μεσολάβηση STAT-1 σύνδεση με το ΙΡ-10 υποκινητή, με αποτέλεσμα την αύξηση της μεταγραφής του ΙΡ-10 γονίδιο. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν την άποψη που εμπλέκεται PML στη στρατολόγηση των λεμφοκυττάρων σε όγκους,

μέσω

διαμόρφωση των επιπέδων έκφρασης των παραγόντων που προέρχονται από όγκους, συμπεριλαμβανομένων ΙΡ-10, παρέχοντας περαιτέρω απόδειξη ότι η απώλεια των ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε όγκο κύτταρα συμμετέχει ενεργά στην ίδρυση της μικροπεριβάλλοντα όγκου.

Αποτελέσματα

Απώλεια της PML πρωτεΐνης σχετίζεται με αυξημένη διείσδυση των CD8

+ Τ-κύτταρα σε προηγμένα ιστό του γαστρικού καρκινώματος

η ανοσοϊστοχημική χρώση για το PML και CD8 διεξήχθη για να διερευνήσει κατά πόσον η έκταση της διείσδυσης των λεμφοκυττάρων που σχετίζονται με PML κατάσταση έκφρασης σε προχωρημένο γαστρικό καρκίνο. CD8-ανοσοθετικών κυττάρων καταμετρήθηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Συνολικά, 35 δείγματα (71,4%) έδειξε μερική προς πλήρη απώλεια της PML σε ένα καρκινικό κύτταρο πυρήνες του σταδίου IV προχωρημένου γαστρικού καρκινώματος. Δείγματα από 14 ασθενείς προχωρημένο γαστρικό καρκίνωμα ήταν διάχυτα θετικά για PML, και περιείχε κατά μέσο όρο 32.7 CD8

+ Τ-κυττάρων ανά πεδίο (Σχήμα 1Α). Εμείς εντοπίστηκαν 19 περιπτώσεις προχωρημένου γαστρικού καρκινώματος εμφανίζουν εστιακή θετικότητα για PML, με μέσο όρο 47,2 CD8

+ Τ-κύτταρα ανά πεδίο. Επιπλέον, η πλήρης απώλεια της PML παρατηρήθηκε σε 16 ασθενείς προχωρημένο γαστρικό καρκίνωμα? Τα δείγματα περιείχαν ένα μέσο αριθμό 52.8 CD8

+ Τ-κύτταρα ανά πεδίο. Τα δείγματα που εμφανίζουν εστιακή θετικότητα ή πλήρη απώλεια για PML έδειξε μια πιο σημαντική αύξηση σε CD8

+ αριθμός Τ-κυττάρων από ό, τι τα δείγματα που παρουσιάζουν διάχυτη θετικότητα για PML. Αντιπροσωπευτικές εικόνες παρουσιάζονται στο Σχήμα 1Β. Αν και η έκφραση PML πρωτεΐνης μειωθεί ή καταργηθεί σε καρκινικά κύτταρα, το σύνολο των κανονικών γαστρικού βλεννογόνου αδένες, στρωματικών ιστών, και λεμφοκύτταρα, εμφάνισαν διάχυτη μέτρια έως ισχυρή πυρηνική ανοσοθετικότητα για PML.

(Α) Ανοσοϊστοχημική χρώση για PML πρωτεΐνης και CD8 πραγματοποιήθηκε για 49 περιπτώσεις σταδίου IV προχωρημένου γαστρικού καρκινώματος. Ανοσοθετικότητα για PML πρωτεΐνη κατηγοριοποιήθηκε ως διάχυτη θετικότητα (DP? Πυρηνική ανοσοδραστικότητα σε ≥50% των καρκινικών κυττάρων, η = 14), εστιακή θετικότητα (FP? Σε ≥10% αλλά & lt? 50%, n = 19), ή ολική απώλεια (CL? σε & lt? 10%, n = 16). Ο αριθμός των ανοσοθετικών κυττάρων CD8 σε ένα πεδίο υψηλής ισχύος (HPF, χ40) από 0,25 mm

2 για πέντε τυχαία επιλεγμένα όγκου διηθητική σύνορα μετρήθηκαν για κάθε δείγμα, που ακολουθείται από υπολογισμό της μέσης τιμής και SD. (Β) Εκπρόσωπος εικόνες που δείχνουν έκφραση PML πρωτεΐνης και διείσδυση CD8

Τ-κυττάρων + σε προχωρημένο ιστούς γαστρικό καρκίνωμα. Μπαρ, SD. *

P

& lt?. 0.05

Η

PML επιρροές διείσδυση Τ-κυττάρων /μετανάστευση

in vitro

Η

Εν όψει της απώλειας της PML έκφραση της πρωτεΐνης και η αύξηση στην διείσδυση του CD8

+ Τ-λεμφοκυττάρων σε προχωρημένο ιστούς γαστρικό καρκίνωμα, υποθέσαμε ότι PML συνέβαλαν στην Τ-κυτταρική διήθηση /μετανάστευση σε γαστρικό καρκίνο. Για να διερευνηθεί κατά πόσον το επίπεδο PML σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα επηρεάζεται μετανάστευση των Τ-κυττάρων, ρυθμισμένα μέσα από SNU-638 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με είτε

PML

siRNA ή φορέα έκφρασης PML IV, στη συνέχεια κατεργάζεται με ΙΡΝ-γ χρησιμοποιήθηκε σε φρεατίων δοκιμασίες μετανάστευσης. SNU-638 γαστρικά καρκινικά κύτταρα εξέφρασαν υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης PML, σύμφωνα με προηγούμενα ευρήματα [2], ενώ SNU-638 κύτταρα επιμολυσμένα με

PML

siRNA που αναγράφεται μειωμένα επίπεδα ενδογενούς PML έκφρασης (~46-56%) , όπως επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωση (σχήμα 2Α). IFN-γ που προκαλείται από μια μέτρια αύξηση στην έκφραση της πρωτεΐνης PML, σε συμφωνία με προηγούμενα αποτελέσματα [38]. Η μετανάστευση των Jurkat Τ-κυττάρων προς ρυθμισμένο μέσο από

pML

siRNA επιμολυσμένα κύτταρα SNU-638 ήταν σημαντικά αυξημένη, σε σύγκριση με εκείνη του ελέγχου κυττάρων siRNA επιμολυσμένα, μετά από θεραπεία με IFN-γ (Σχήμα 2Β). Μετά την επιμόλυνση του SNU-638 με φορέα έκφρασης PML IV, η μετανάστευση των Jurkat Τ-κυττάρων προς ρυθμισμένο μέσο από PML IV υπερεκφράζεται κύτταρα μειώθηκε σε σύγκριση με εκείνη του κενού φορέα (Σχήμα 2C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι PML ρυθμίζει τα επίπεδα της εκκριτικής μόρια που παράγονται από και απελευθερώνεται από ΙΡΝ-γ που διεγείρεται γαστρικού καρκινικά κύτταρα, και επηρεάζει επίσης την μετανάστευση των Τ λεμφοκυττάρων.

(Α) SNU-638 γαστρικά καρκινικά κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με το

PML

siRNA ή τον έλεγχο siRNA. Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς ιντερφερόνη-γ (ΙΡΝ-γ (10 ng /ml) για 8 ώρες και λύθηκαν και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. Η αποτελεσματική siRNA μεσολάβηση καταστολή της έκφρασης πρωτεΐνης PML επαληθεύτηκε για κάθε προσδιορισμό με ανοσοκηλίδωση . (Β) κύτταρα Jurkat και τα υπερκείμενα καλλιέργειας από SNU-638 κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν παροδικά είτε με siRNA ελέγχου ή

PML

siRNA αναλύθηκαν με μία δοκιμασία μετανάστευσης transwell. Μετά την επιμόλυνση, SNU-638 κύτταρα επωάστηκαν με IFN -γ (10 ng /ml) για 8 ώρες ή αφεθεί χωρίς θεραπεία, και τα συλλεχθέντα υπερκείμενα τοποθετήθηκαν στα κάτω θαλάμους. τα άνω θάλαμοι έλαβε 5 × 10

5 κυττάρων Jurkat σε έναν όγκο 100 μΐ και τις μονάδες μετανάστευση transwell επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 ώρες. η μετανάστευση των κυττάρων Jurkat από το ανώτερο προς κατώτερο θάλαμο αναλύθηκε με εξέταση κύτταρα που συλλέγονται από τους κατώτερους θαλάμους με φθορίζουσα μέτρηση-χάντρα μεσολάβηση καταμέτρηση σε έναν κυτταρομετρητή ροής. Σχετική κυτταρική μετανάστευση προσδιορίστηκε από τον αριθμό του μετανάστευσαν κυττάρων κανονικοποιήθηκαν προς τον αριθμό των κυττάρων που μεταναστεύουν σε υπερκείμενα από SNU-638 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με siRNA μάρτυρα χωρίς ΙΡΝ-γ, και την τιμή από γονικά κύτταρα αυθαίρετα καθορίστηκε σε 1. (C) SNU-638 γαστρικά καρκινικά κύτταρα ήταν παροδικά επιμολυσμένα είτε με κενό φορέα (Mock) ή φορέα έκφρασης PML IV (PML IV). Ημέρα μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς ΙΡΝ-γ (10 ng /ml) για 8 ώρες και τα υπερκείμενα της καλλιέργειας ελήφθησαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία μετανάστευσης Transwell όπως περιγράφεται στην έκφραση της πρωτεΐνης PML Β επαληθεύτηκε για κάθε ανάλυση με ανοσοκηλίδωση. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών πειραμάτων. Μπαρ, SD. *

P

& lt?. 0.05

Η

Απώλεια της PML ενισχύει την IFN-γ που προκαλείται IP-10 έκφρασης

χημοκίνες, μια οικογένεια χημειοτακτικών κυτοκινών, την προώθηση της μετανάστευσης των κυκλοφορούντων λευκοκυττάρων /λεμφοκυττάρων σε θέσεις φλεγμονής και της ζημίας. Για να διερευνήσουν κατά πόσο τα επίπεδα των χημειοκινών επλήγησαν από

PML

γενετική κατάσταση, τη γονιδιακή έκφραση χημειοκινών εξετάστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία προστασίας ριβονουκλεάσης (RPA).

PML

+ /+ και

PML

– /- ποντικού εμβρυϊκά κύτταρα ινοβλάστης (MEF) επωάστηκαν απουσία ή παρουσία της ΙΡΝ-γ για 0-24 h , ολικό mRNA συλλέχθηκε σε διάφορα χρονικά σημεία, και υποβλήθηκε σε RPA. Στις

PML

– /- MEFs, ΙΡ-10 mRNA επίπεδα αυξήθηκαν κατά 1,5 φορές σε 2 ώρες, και έγινε έντονα αυξημένα (8 φορές) με 4 ώρες (Σχήμα 3Α). επίπεδα RANTES mRNA αυξήθηκαν 3,2 φορές στις 0,5 ώρες, και παρέμειναν αυξημένα, αλλά σε μικρότερο βαθμό (1,3 φορές), επεξεργασία μετα-IFN-γ 8 ώρες σε

PML

– /- MEFs . Άλλα γονίδια χημειοκίνης, συμπεριλαμβανομένων των ΜΙΡ-1, ΜΙΡ-2, και MCP-1, δεν είχαν ανιχνεύσιμα εκφράζονται σε

PML

+ /+ ή

PML

– /- Οι MEF (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). STAT-1 εκφράσεως είναι αυξημένο μετά την έκθεση σε ΙΡΝ-γ στους δύο τύπους κυττάρων, αλλά καμία διαφορά ήταν εμφανής όταν συγκρίθηκαν τα επίπεδα ΙΡΝ-γ μεταξύ

PML

+ /+ και

PML

– /- κύτταρα. Όπως μεταγραφή του IP-10 γονίδιο σημαντικά αυξημένα σε IFN-γ που διεγείρεται

PML

– /- ΠΜΑ, μετρήσαμε τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης σε υπερκείμενα καλλιεργειών του

PML

+ /+ και

PML

– /- MEFs, χρησιμοποιώντας ένα ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα RPA, τα υψηλότερα επίπεδα του ΙΡ-10 πρωτεΐνης ήταν εμφανής σε ρυθμισμένο μέσο από ΙΡΝ-γ που έλαβαν

PML

– /- MEFs (Σχήμα 3Β). Επίσης, ΙΡ-10 mRNA έκφραση σε

pML

siRNA επιμολυσμένα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 ενισχύθηκε, σε σύγκριση με εκείνη του ελέγχου κυττάρων siRNA επιμολυσμένα, μετά ΙΡΝ-γ θεραπεία (Σχήμα 3C). Η μείωση στην έκφραση της PML πρωτεΐνης στο

PML

siRNA επιμολυσμένα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 επιβεβαιώθηκε με ανοσοαποτύπωση

-. /- ΠΜΑ σε σύγκριση με το

PML

+ /+

κύτταρα άγριου τύπου. (Α) RNA από

PML

+ /+ και PML

– /- MEFs αγωγή με IFN-γ (10 ng /ml) για 0-24 ώρες υποβλήθηκε σε δοκιμασία προστασίας ριβονουκλεάσης ( RPA). Ποσοτικοποίηση των IP-10, RANTES και STAT-1 mRNA (φορές αύξηση) υπολογίστηκε διαιρώντας την πυκνομετρική αξία της κάθε λωρίδας από την αντίστοιχη τιμή GAPDH. (Β)

PML

+ /+

και

PML

– /- MEFs κύτταρα επωάστηκαν απουσία ή παρουσία ΙΡΝ-γ (10 ng /ml) για 12 h. ΙΡ-10 πρωτεΐνης από τα υπερκείμενα καλλιέργειας αναλύθηκαν με ELISA και ομαλοποιήθηκε η συγκέντρωση πρωτεΐνης κυττάρου. Η σχετική συγκέντρωση υπολογίστηκε ως η κανονικοποιημένη ποσό διαιρείται δια της κανονικοποιημένης ποσό του μη επεξεργασμένου

PML

– /- MEFs κύτταρα. (Γ) ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες διαμολύνθηκαν παροδικά είτε με

PML

siRNA ή ελέγχουν siRNA. Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς ΙΡΝ-γ για 0-24 ώρες, και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση για την ανίχνευση της έκφρασης της πρωτεΐνης PML και RT-PCR για ΙΡ-10 mRNA. Ποσοτικοποίηση (Quant) του ΙΡ-10 mRNA υπολογίστηκε διαιρώντας την πυκνομετρική τιμή κάθε λωρίδας από την αντίστοιχη τιμή mRNA ακτίνης. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών πειραμάτων. Μπαρ, SD. *

P

& lt?. 0.01

Η

Μειωμένη έκφραση PML είναι αντιστρόφως ανάλογη με IP-10 επίπεδα πρωτεΐνης σε γαστρικό καρκινικό ιστό και SNU-638 κύτταρα

Στη συνέχεια, εξετάσαμε τη σχέση μεταξύ IP-10 και την έκφραση της πρωτεΐνης PML σε προχωρημένο ιστό του γαστρικού καρκινώματος. καρκινικούς ιστούς ανοσοϊστοχημικά χρωματίστηκαν για PML και ΙΡ-10, και η ένταση του ΙΡ-10 ανοσοθετικότητα μετρήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Η μέση ένταση του IP-10 ήταν 1,2 σε 14 δείγματα που δείχνει διάχυτη θετικότητα (DP) για PML, 2.2 σε 19 περιπτώσεις εστιακό θετικότητας (FP), και 2,0 σε 16 δείγματα στα οποία δεν υπήρχε πλήρης απώλεια (CL) της PML έκφρασης ( Εικόνα 4Α, αριστερό πάνελ). Σημαντικές αυξήσεις στην έκφραση IP-10 παρατηρήθηκαν σε δείγματα που δείχνει εστιακή θετικότητα της PML (

P

= 0,034), σε σύγκριση με εκείνα που δείχνουν διάχυτη θετική PML έκφρασης. Μια αύξηση της IP-10 έκφραση παρατηρήθηκε όταν πλήρη απώλεια της PML ήταν εμφανής, σε σύγκριση με ό, τι παρατηρήθηκε όταν PML ήταν διάχυτα εξέφρασε? Ωστόσο, η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα των μεταβολών στην κατάσταση πρωτεΐνη PML που συσχετίζονται με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης ΙΡ-10 σε καρκινικά κύτταρα από προχωρημένο γαστρικό καρκίνωμα εμφανίζονται (Σχήμα 4Α, δεξιά). Για να εξεταστεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ της έκφρασης πρωτεΐνης ΙΡ-10 και PML σε γαστρικό κυτταρικές σειρές καρκινώματος, IP-10 επίπεδα πρωτεΐνης μετρήθηκαν σε υπερκείμενα καλλιέργειας από SNU-638 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με είτε

PML

siRNA ή PML IV exression διάνυσμα. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε απουσία ή παρουσία της ΙΡΝ-γ για 8 ώρες, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν, και ΙΡ-10 επίπεδα ποσοτικοποιούνται εκεί (με ELISA). IFN-γ επαγόμενη έκκριση ΙΡ-10 ήταν σημαντικά αυξημένη σε SNU-638-

pML

siRNA-επιμολυσμένα κύτταρα, σε σύγκριση με εκείνη του SNU-638 κύτταρα επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA (Σχήμα 4Β). Η επιμόλυνση του SNU-638 με φορέα έκφρασης PML IV κατέστειλε ΙΡΝ-γ που επάγεται ΙΡ-10 έκκριση (σχήμα 4Γ). Τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι η έκκριση του ΙΡ-10 από γαστρικά καρκινικά κύτταρα αυξάνεται όταν PML έκφραση μειώνεται.

(Α) Ανοσοϊστοχημική χρώση για PML και η έκφραση πρωτεΐνης ΙΡ-10 εκτελέστηκε για 49 περιπτώσεις σταδίου IV προηγμένη γαστρικά καρκινώματα. Ανοσοθετικότητα για PML πρωτεΐνης κατηγοριοποιούνται ως διάχυτη θετικότητα (DP? Πυρηνική ανοσολογική αντίδραση σε ≥50% των καρκινικών κυττάρων), εστιακή θετικότητα (FP? Σε ≥10% αλλά & lt? 50%), ή ολική απώλεια (CL? Στο & lt? 10% ). Για την ποσοτική ανάλυση της ανοσοαντιδραστικότητας του ΙΡ-10, θετικώς χρωματισμένο περιοχές μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα πρόγραμμα λογισμικού ImageJ όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Αντιπροσωπευτικές εικόνες δείχνουν PML και η έκφραση πρωτεΐνης ΙΡ-10 σε προχωρημένο ιστούς γαστρικό καρκίνωμα (δεξιά). (Β) κύτταρα SNU-638 επιμολύνθηκαν παροδικά με το

PML

siRNA ή ελέγχουν siRNA. Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επωάστηκαν απουσία ή παρουσία ΙΡΝ-γ (10 ng /ml) για 8 ώρες. ΙΡ-10 πρωτεΐνης από τα υπερκείμενα καλλιέργειας αναλύθηκε με ELISA και ομαλοποιήθηκε η συγκέντρωση πρωτεΐνης κυττάρου. Η σχετική συγκέντρωση υπολογίστηκε ως η κανονικοποιημένη ποσό διαιρείται δια της κανονικοποιημένης ποσότητα SNU-638 κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν παροδικά με siRNA ελέγχου υπό την παρουσία ΙΡΝ-γ, και η συγκέντρωση από γονικά κύτταρα αυθαίρετα καθορίστηκε σε 100%. (C) SNU-638 γαστρικά καρκινικά κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με κενό φορέα ή φορέα έκφρασης PML IV. Ημέρα μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς ΙΡΝ-γ (10 ng /ml) για 8 ώρες και τα υπερκείμενα της καλλιέργειας ελήφθησαν και υποβλήθηκαν σε ELISA όπως περιγράφεται στο έκφρασης πρωτεΐνης Β PML επαληθεύτηκε για κάθε ανάλυση με ανοσοκηλίδωση. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών πειραμάτων. Μπαρ, SD. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

IP-10 εξουδετέρωσης μειώνει τη μετανάστευση των Τ-κυττάρων

Όπως SNU-638-

PML

κύτταρα siRNA που περιέχουν εκφράζουν μειωμένα επίπεδα της PML πρωτεΐνης έδειξε αύξηση της πρόσληψης των Τ-κυττάρων και την έκκριση ΙΡ-10 σε απόκριση στην ΙΡΝ-γ (Σχήματα 2 και 4), εξετάσαμε έπειτα αν η αύξηση του ΙΡ-10 επίπεδα διευκόλυνε τη μετανάστευση των Τ-κυττάρων προς ρυθμισμένο μέσο από SNU-638 γαστρικό καρκίνο κύτταρα διεγερμένα από IFN-γ. SNU-638-

PML

κύτταρα siRNA αναπτύχθηκαν σε απουσία ή παρουσία της ΙΡΝ-γ για 8 ώρες, και τα συλλεγέντα υπερκείμενα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ένα αντίσωμα εξουδετέρωσης αντι-ΙΡ-10 ή τον έλεγχο μη ειδικής IgG για 1 ώρα, πριν από την έναρξη της δοκιμασίας transwell. υπερκείμενα εξουδετέρωσης αντισώματος ή IgG-περιέχον τοποθετήθηκαν στα κάτω θαλάμους, και τη μετανάστευση των κυττάρων Jurkat από το ανώτερο προς κάτω θαλάμους αναλύθηκε με εξέταση κύτταρα που συλλέγονται από τα κάτω θαλάμους. Συμπερίληψη ΙΡ-10-εξουδετερωτικά αντισώματα ανέστειλαν Jurkat μετανάστευση των Τ-κυττάρων προς ρυθμισμένο μέσο από SNU-638-

PML

siRNA κύτταρα (Σχήμα 5Α). Αυτά τα ευρήματα συμφωνούν με τα στοιχεία που λαμβάνονται από κύτταρα ΝΙΗ3Τ3? ένα ΙΡ-10-εξουδετερωτικό αντίσωμα ανέστειλε EL-4 μετανάστευση των Τ-κυττάρων προς ρυθμισμένο μέσο από NIH3T3-

PML

κύτταρα siRNA (Σχήμα 5Β).

(Α) SNU-638-

PML

κύτταρα siRNA αναπτύχθηκαν σε απουσία ή παρουσία ΙΡΝ-γ (10 ng /ml) για 8 ώρες, και το υπερκείμενο συλλέχθηκε και προκατεργάστηκαν με ΙΡ-10 αντισώματα εξουδετέρωσης (5 μg /ml) ή IgG (5 μg /ml) για 1 ώρα πριν από την έναρξη της δοκιμασίας μετανάστευσης transwell. Ο αριθμός των μεταναστευτικών κυττάρων Jurkat λήφθηκε από τον κατώτερο θάλαμο αναλύθηκε με φθορίζοντα καταμέτρηση-χάντρα μεσολάβηση καταμέτρηση σε έναν κυτταρομετρητή ροής. (Β) Transwell μετανάστευση των EL-4 κυττάρων σε υπερκείμενα καλλιέργειας από κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 παροδικά επιμολυσμένα με το

PML

siRNA παρουσία εξουδετερωτικών ΙΡ-10 αντίσωμα ή IgG ελέγχου. Σχετική κυτταρική μετανάστευση προσδιορίστηκε από τον αριθμό των κυττάρων που μετανάστευσαν διαιρείται με τον αριθμό των κυττάρων που μεταναστεύουν σε υπερκείμενα χωρίς ΙΡΝ-γ, και την τιμή από γονικά κύτταρα αυθαίρετα καθορίστηκε σε 1. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών πειραμάτων. Μπαρ, SD. *

P

& lt?. 0.05

Η

PML νοκ ντάουν βελτιώνει IP-10 ενεργοποίηση υποκινητή

Όπως IP-10 έκφρασης αυξήθηκε σε PML νοκ ντάουν κύτταρα, είμαστε ακόμη διερευνηθεί αν έκφραση PML πρωτεΐνης επηρεάζεται δράση προαγωγού IP-10. Το μυϊκό ΙΡ-10 υποκινητής περιέχει ένα υποθετικό GAS στοιχείο που μοιάζει βρίσκεται μεταξύ nts -246 και -238 (ΤΤΝ

5AA) (Σχήμα 6Α). Αναφέραμε προηγουμένως ότι PML ρυθμίζει αρνητικά τη μεταγραφική δραστικότητα του STAT-1 [17]. Για να εξακριβωθεί αν PML επηρεάζονται IFN-γ επαγόμενη έκφραση ΙΡ-10 γονίδιο

μέσω

ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει STAT-1, απομονώσαμε και δημιουργείται ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή που αρχίζει στη θέση -330 του μυϊκού ΙΡ-10 υποκινητή που περιέχει την υποθετική GAS-σαν στοιχείο, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Η ΙΡ-10-

luc

ρεπόρτερ που περιέχει το GAS στοιχείο σαν διαμολύνθηκε παροδικά σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 επωάστηκαν με ή χωρίς ΙΡΝ-γ για 24 ώρες και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης. IFN-γ που προκαλείται από δραστικότητα προαγωγού ΙΡ-10 ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 επιμολυσμένα με

PML

siRNA, συγκριτικά με κύτταρα που λαμβάνουν ελέγχου siRNA (Σχήμα 6Β). Μετά την επιμόλυνση των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 με τον φορέα έκφρασης PML IV, η ενεργοποίηση IFN-γ που προκαλείται ΙΡ-10 υποκινητής ήταν σημαντικά κατασταλεί. Προς τα κάτω ρύθμιση της PML έκφρασης χρησιμοποιώντας το

PML

siRNA και υπερέκφραση της PML από φορέα έκφρασης PML IV επαληθεύτηκαν με ανοσοαποτύπωση. Για να καθορισθεί εάν συνέβη η ανασταλτική δράση της PML επί ΙΡΝ-γ που προκαλείται από δραστικότητα προαγωγού ΙΡ-10 σε γαστρικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές, εκτελέσαμε παρόμοια πειράματα με SNU-638 γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Τα μοτίβα της αύξησης και μείωσης της δραστηριότητας λουσιφεράσης σε SNU-638 ήταν παρόμοια με εκείνη των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 (Σχήμα 6C). Το επίπεδο της έκφρασης πρωτεΐνης PML σε SNU-638 κύτταρα επιμολυσμένα με είτε

PML

siRNA ή φορέας έκφρασης PML IV επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωμα (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

(α) το μυϊκό IP- 10 προαγωγέα περιέχει ένα υποθετικό στοιχείο GAS-σαν (υπογραμμισμένη). (Β) κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 συν-επιμολύνθηκαν με το ΙΡ-10-Luc ανταποκριτή που περιέχει ένα στοιχείο GAS-όπως και /ή

PML

siRNA, ή ο φορέας έκφρασης της πρωτεΐνης PML IV. Τα κύτταρα είτε μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με ποντικού ΙΡΝ-γ (10 ng /ml) για 24 ώρες, και στη συνέχεια δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε. Ο φορέας ρΟΜν-β-γαλακτοσιδάσης συμπεριλήφθηκε να ομαλοποιήσει την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε ως προς το δραστικότητα απουσία της ΙΡΝ-γ και την δραστηριότητα από γονικά κύτταρα αυθαίρετα καθορίστηκε σε 100% (RLA? Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης). Αυξημένη ή μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης PML σε λύματα κυττάρων επιμολυσμένων είτε με φορέα έκφρασης PML IV ή

PML

siRNA επαληθεύτηκε με ανοσοαποτύπωση, αντίστοιχα. (C) SNU-638 γαστρικά καρκινικά κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με το ΙΡ-10-Luc ανταποκριτή που περιέχει ένα στοιχείο GAS-όπως και /ή

PML

siRNA, ή το φορέα έκφρασης της πρωτεΐνης PML IV και αναλύονται όπως περιγράφεται σε Β οι τιμές είναι ο μέσος όρος ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα. Μπαρ, SD. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.001

Η

PML νοκ ντάουν αυξήσεις IFN-γ που προκαλείται STAT-1 DNA δεσμευτική έως την ΠΕ -10 υποστηρικτής

Η επίδραση της PML σε IFN-γ που προκαλείται STAT-1 σύνδεση με το IP-10 προαγωγός DNA εξετάστηκε περαιτέρω. PML πρωτεΐνης υπερέκφραση σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3, μετά από παροδική επιμόλυνση με τον φορέα έκφρασης PML IV, μερικώς μπλοκαριστεί ΙΡΝ-γ που προκαλείται STAT-1 σύνδεση με το ΙΡ-10 υποκινητή DNA, συμπεριλαμβανομένης της ακολουθίας σε -246 έως -238 (Εικόνα 7Α, συγκρίνετε διαδρομές 3 και 5). Ανταγωνισμός χρησιμοποιώντας ένα 100-μοριακή περίσσεια μη επισημασμένου ολιγονουκλεοτιδίου που κωδικοποιεί την ΙΡ-10 υποκινητής καταργηθεί το σχηματισμό συμπλόκου (λωρίδα 6). Τα επίπεδα της PML και η έκφραση πρωτεΐνης STAT-1 σε λύματα ολόκληρων κυττάρων (WCL) και η έκταση της STAT-1 φωσφορυλίωση τυροσίνης σε πυρηνικά εκχυλίσματα (ΝΕ) επαληθεύτηκαν με ανοσοκηλίδωση. Αξιοποιώντας ΒΑ από NIH3T3-

PML

κύτταρα siRNA που λαμβάνονται μετά από 0,5 ώρες της θεραπείας ΙΡΝ-γ, ισχυρή σύνδεση με το μυϊκό ΙΡ-10 υποκινητή παρατηρήθηκε (Σχήμα 7Β, άνω πάνελ, λωρίδα 5), σε σύγκριση με δέσμευση δει σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 siRNA ελέγχου (διαδρομή 3). Τα ίδια τα ΑΣ εκτέθηκαν στην συναινετική ολιγονουκλεοτίδιο STAT-1 και STAT δέσμευσης-1 DNA ενισχύθηκε σε ΒΑ από NIH3T3-

PML

κύτταρα siRNA (Σχήμα 7Β, μεσαίο πάνελ, συγκρίνετε διαδρομές 3 και 5). Χρησιμοποιώντας SNU-638 γαστρικά καρκινικά κύτταρα, βρήκαμε επίσης ότι δέσμευσης STAT-1 DNA του

pML

siRNA επιμολυσμένα κύτταρα SNU-638 ενισχύθηκε σε σύγκριση με εκείνη του ελέγχου κυττάρων siRNA επιμολυσμένα, μετά από θεραπεία με IFN-γ (Σχήμα 7C, συγκρίνετε διαδρομές 3 και 5). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι PML αναστέλλει μερικώς STAT-1 σύνδεση με το ΙΡ-10 υποκινητή, και ότι αυτό το αποτέλεσμα συσχετίζεται με αυξημένη ΙΡΝ-γ που επάγεται ΙΡ-10 μεταγραφή απουσία του PML.

(Α) Πυρηνικά εκχυλίσματα (ΝΕ) από κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 παροδικά επιμολυσμένα με τον φορέα έκφρασης της πρωτεΐνης PML IV και υφίσταται κατεργασία με ΙΡΝ-γ (10 ng /ml) για 30 λεπτά επωάστηκαν με την παρουσία ενός ραδιοσημασμένου ανιχνευτή DNA που περιέχει το GAS στοιχείο που μοιάζει με του ΙΡ-10 υποκινητή, και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA). μετατοπίζονται σύμπλοκα ανιχνευτή-πρωτεΐνης που υποδεικνύεται από το βέλος. Η αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης PML σε προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου (WCL) επιμολυσμένα με φορέα έκφρασης PML IV επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωμα. Η ποσότητα της ιστόνης σε ΝΕ παρουσιάζεται σαν ένας έλεγχος. (Β) ΑΣ από κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 παροδικά επιμολυσμένα με είτε

PML

siRNA ή ελέγχουν siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΙΡΝ-γ (10 ng /ml) για 30 λεπτά επωάστηκαν με την παρουσία ραδιοεπισημασμένου ανιχνευτών DNA που περιέχει το GAS- σαν στοιχείο του ΙΡ-10 υποκινητή ή μία αλληλουχία συναίνεσης STAT-1, και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε EMSA. Ειδικότητα σύνδεσης ελέγχθηκε με την προσθήκη αυξανόμενων συγκεντρώσεων ψυχρού ανιχνευτή (ανταγωνιστής). Αποτελεσματική siRNA μεσολάβηση καταστολή της έκφρασης της πρωτεΐνης PML επαληθεύτηκε για κάθε ανάλυση με ανοσοκηλίδωση. (C) SNU-638 γαστρικά καρκινικά κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με

PML

siRNA ή ελέγχουν siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΙΡΝ-γ (10 ng /ml) για 30 λεπτά. ΑΣ ελήφθησαν, επωάστηκαν παρουσία ραδιοεπισημασμένων ανιχνευτών DNA που περιέχει ένα STAT-1 συναινετική αλληλουχία, και στη συνέχεια αναλύθηκαν για EMSA όπως περιγράφεται στο Β Τα επίπεδα της PML και η έκφραση πρωτεΐνης STAT-1 σε WCL και την έκταση της STAT-1 τυροσίνης φωσφορυλίωση στη βορειοανατολική επαληθεύτηκαν με ανοσοαποτύπωση. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών πειραμάτων.

Η

Συζήτηση

Η ιστοπαθολογική μελέτες έχουν δείξει ότι η φλεγμονώδης μικροπεριβάλλον των όγκων χαρακτηρίζεται από την παρουσία των μονοπύρηνων κυττάρων διηθήσεις, τόσο στη στήριξη στρώματος και του όγκου των περιφερειών. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί με τους οποίους μονοπύρηνα κύτταρα διηθούν σε και υπέστη μέσα στους ιστούς του καρκίνου σήμερα δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Στην παρούσα μελέτη, προσφέρουμε απόδειξη ότι η απώλεια της έκφρασης της πρωτεΐνης καταστολέα όγκου, PML, συμβάλλει στην ενίσχυση της διείσδυσης των λεμφοκυττάρων στο γαστρικό καρκινικό ιστό,

μέσω

ρύθμιση του ΙΡ-10 έκφρασης.

Εξετάσαμε τη λειτουργία της PML σε σχέση με την πρόσληψη των λεμφοκυττάρων χρησιμοποιώντας δείγματα ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου ιστό,

PML

+ /+ και

PML

– /- ΠΜΑ και PML knockdown τόσο ΝΙΗ3Τ3 και SNU-638 κύτταρα. Τα δεδομένα που λαμβάνονται και από τις δύο δοκιμές ανθρώπινο ιστό και τις δοκιμασίες μετανάστευσης μεταξύ φρεατίων έδειξαν ότι η απώλεια της PML προωθεί διακίνησης των λεμφοκυττάρων? Έτσι, αναζήτησε τους μηχανισμούς που θα μπορούσαν ενδεχομένως να εξηγήσουν αυτές τις παρατηρήσεις. Δείχνουμε ότι η αύξηση της ΙΡ-10 επίπεδα σε καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα του PML συμβάλλει στην πρόσληψη των λεμφοκυττάρων.