Abstract

Η χημειοθεραπεία είναι μια σημαντική επιλογή για τη θεραπεία διαφόρων μορφών καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα. Ωστόσο, η αντίσταση όγκου προς την κυτταροτοξική χημειοθεραπεία έχει γίνει πιο κοινά. Έχει αναφερθεί ότι αυτοφαγία είναι μία από τις διαδικασίες που συμβάλλουν σε αυτή την αντίσταση. Στην παρούσα μελέτη, βρέθηκε ότι η αντικαρκινική φάρμακο 5-fluorouraci (5-FU) θα μπορούσε να επάγει αυτοφαγία σε κύτταρα Α549. 5-FU θεραπεία θα μπορούσε να οδηγήσει στην μετατροπή της LC3 Ι /ΙΙ, η αυξητική ρύθμιση του Beclin-1, η ρύθμιση προς τα κάτω του Ρ62 και το σχηματισμό των όξινων φυσαλιδώδους οργανίδια (Avós) σε κύτταρα Α549. Προεπεξεργασία των καρκινικών κυττάρων με 3-ΜΑ ή siAtg7 θα μπορούσε να ενισχύσει 5-FU-επαγόμενη απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης των κασπασών, και ο αναστολέας κασπάσης z-VAD-fmk διασωθεί η μείωση κυτταρικής βιωσιμότητας. Επιπλέον, η αναστολή της autophagy διεγείρεται επίσης το σχηματισμό ROS και καθαρισμού των ROS από αντιοξειδωτική NAC παρεμπόδισε δραστικότητα κασπάσης-3, εμπόδισε την απελευθέρωση του cyt-c από τα μιτοχόνδρια και τελικά διασώθηκε καρκινικά κύτταρα από 5-FU-απόπτωση. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το 5-FU προκάλεσε αυτοφαγικά απάντηση παίζει προστατευτικό ρόλο έναντι των κυττάρων απόπτωσης και την παρεμπόδιση της αυτοφαγία θα μπορούσε να τους ευαισθητοποιήσει σε 5-FU που προκαλείται κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση μέσω της διέγερσης του σχηματισμού ROS.

Παράθεση : Pan X, Ζανγκ Χ, Ηλιόλουστη η, Zhang J, Γιαν Μ, Zhang η (2013) Autophagy Αναστολή Προωθεί 5-Fluorouraci-επαγόμενη απόπτωση με την τόνωση ROS Σχηματισμός ανθρώπων μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Α549 κύτταρα. PLoS ONE 8 (2): e56679. doi: 10.1371 /journal.pone.0056679

Επιμέλεια: Tetsuo Takehara, Osaka University Graduate School of Medicine, Ιαπωνία

Ελήφθη: 13η Οκτωβρίου 2012? Αποδεκτές: 12 Ιαν 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 του Φεβρουαρίου του 2013

Copyright: © 2013 Pan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ένα έργο της επαρχίας Shandong Ανώτατα Εκπαιδευτικά Επιστήμη και Τεχνολογία Πρόγραμμα (J10LC66) και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο. 81102828, 81273037, 81202516). Οι συγγραφείς ήθελαν να δείξουν την εκτίμησή μας προς το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Shandong της Κίνας (Αρ ZR2011HM011). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες στον κόσμο και την κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται σε πολλές χώρες. Κατά προσέγγιση το 85% των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα ανήκουν σε καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου (NSCLC) [1], [2]. Η χημειοθεραπεία είναι μια σημαντική επιλογή στη θεραπεία ή έλεγχο του καρκίνου του πνεύμονα. 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), η οποία ασκεί αντικαρκινικές επιδράσεις της μέσω της αναστολής της θυμιδυλικής συνθάσης και η ενσωμάτωση των δραστικών μεταβολιτών της σε RNA και DNA έτσι ώστε να επηρεάζουν το μεταβολισμό ουρακίλη και τελικά να οδηγήσει σε απόπτωση στο κύτταρο του καρκίνου [3] . Κατά τις τελευταίες δεκαετίες, συνδυαστικές θεραπείες 5-FU που βασίζονται στη συνήθη θεραπεία για πολλούς ασθενείς διαγνώστηκαν με διάφορους κακοήθεις όγκους, συμπεριλαμβανομένων των NSCLC [4] – [6]. Ωστόσο, μαζί με τη χρήση του, αντοχή στο 5-FU έχει γίνει κοινή και έχει αναγνωριστεί ως μια αιτία για την αποτυχία πολλούς καρκίνους θεραπεία [7], [8]. Ως εκ τούτου, πολλές προσπάθειες έχουν πραγματοποιηθεί με σκοπό να μειωθεί η αντίσταση και να ενισχύσει τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα της. Αν και πολλές επιθετικές θεραπείες, όπως τα νέα φάρμακα σε συνδυασμό με 5-FU, έχουν βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών, η επίδραση αυτών των θεραπειών παραμένει καθόλου ικανοποιητική προς το παρόν. Κατά συνέπεια, είναι επιθυμητό να βρείτε περισσότερες κατάλληλες θεραπευτικές ευκαιρίες για NSCLC. Στο παρόν, δεν αναφέρουν την επαγωγή της αυτοφαγία με 5-FU σε ανθρώπινα κύτταρα Α549 NSCLC.

Κατά τις τελευταίες δεκαετίες, η επαγωγή της απόπτωσης ήταν η σημαντική εκτίμηση για την ανάπτυξη φαρμάκων κατά του καρκίνου. Ωστόσο, τα καρκινικά κύτταρα ενεργοποιούν πολλαπλά μονοπάτια για να ξεφύγουν από την απόπτωση [1]. Πρόσφατα, autophagy έχει μελετηθεί ευρέως στη θεραπεία του καρκίνου. Εκτός από την καθαριότητα της ρόλο στην απομάκρυνση misfolded ή συσσωρευμένων πρωτεϊνών, εκκαθάριση καταστραφεί οργανίδια και την εξάλειψη των ενδοκυττάριων παθογόνων, αυτοφαγία έχει πολλαπλές φυσιολογικές και παθοφυσιολογικές λειτουργίες στη θεραπεία του καρκίνου. Πολλές μελέτες έχουν επικεντρωθεί στη σχέση μεταξύ αυτοφαγία και παθογένεση όγκων, την ανάπτυξη και τη θεραπεία. Ωστόσο, αυτοφαγία φαίνεται να παίζει μια παράδοξη ρόλο στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και του θανάτου. Σε χημειοθεραπεία, όταν τα κύτταρα αντιμετωπίζουν ορισμένα αντικαρκινικά φάρμακα, αυτοφαγία επάγεται για την προστασία των καρκινικών κυττάρων ενάντια σε απόπτωση για την επιβίωση των κυττάρων. Αυτών autophagy αναγνωρίζεται ως κυτταροπροστατευτικό διαδικασία [7], [9] – [11]? Εν τω μεταξύ, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η αναστολή της επάγει autophagy μείωσε αποπτωτικό επίπεδο, ως εκ τούτου, αυτοφαγία συμμετέχει στην προς τα πάνω ρύθμιση της απόπτωσης [12], [13]? Επιπλέον, όπως και απόπτωση, αυτοφαγία είναι επίσης μια εναλλακτική διαδρομή του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, που ονομάζεται τύπου II προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο [14] – [16]. Προφανώς, ο ρόλος της αυτοφαγία μπορεί να εξαρτάται από τον τύπο του όγκου και ερεθίσματα, το στάδιο της ογκογένεσης και αποπτωτικών κατάσταση σε κύτταρα όγκου. Κατάλληλη τροποποίηση του αυτοφαγία, η αναστολή των κυτταροπροστατευτικών αυτοφαγία για την ενίσχυση της απόπτωσης των κυττάρων του όγκου σε απόκριση προς αντικαρκινικούς παράγοντες θα μπορούσε να βελτιώσει τα αποτελέσματα της χημειοθεραπείας [9]. Έτσι, εκτός από την αποπτωτική απόκριση, η μελέτη των αυτοφαγία είναι μια προοπτική κατεύθυνση για την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων.

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), παίζουν σημαντικό ρόλο σε μια ποικιλία κυτταρικών προγραμμάτων κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής ως καθώς και παθολογικών καταστάσεων. Όταν παράγεται σε μέτριες ποσότητες, ROS δρουν ως μόρια σηματοδότησης σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος για τη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης, την επιβίωση, τη φλεγμονή και την ανοσολογική απόκριση [17]. Από την άλλη πλευρά, όταν παράγονται υπερβολικά, μοιράζονται την ικανότητα να προκαλέσουν οξειδωτική βλάβη σε ζωτικά βιολογικά μόρια, όπως το DNA, τα λιπίδια και τις πρωτεΐνες, η οποία μεταβάλλει τη λειτουργικότητα τους και προκαλεί χειροτέρευση της κυτταρικής ακεραιότητας [18]. Κατά τα τελευταία χρόνια, αυξανόμενες αποδείξεις δείχνουν ότι ROS εμπλέκονται στην αυτοφαγία επαγωγή στη θεραπεία του καρκίνου [19] – [21], υποδηλώνοντας ότι ROS διαδραματίζουν έναν κρίσιμο ρόλο σε απόκριση θεραπευτικών του καρκίνου, η απορρύθμιση του σχηματισμού ROS συνδέεται με την έναρξη του καρκίνου, η πρόοδος και της αντίστασης στα φάρμακα.

σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την μηχανισμός που διέπει τις αντικαρκινικές επιδράσεις της 5-FU σε καρκίνωμα Α549 πνεύμονα. Βρήκαμε ότι το 5-FU που επάγεται αυτοφαγία σε κύτταρα Α549 και η αναστολή της αυτοφαγία θα μπορούσε να οδηγήσει στην ενίσχυση της 5-FU-απόπτωση. Επιπλέον, αποδείξαμε το μηχανισμό που αναστολής αυτοφαγία ευαισθητοποιημένο κύτταρο σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο ήταν αυξάνοντας το σχηματισμό των ROS που τελικά διευκόλυνε την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια, το οποίο στη συνέχεια ενισχύεται κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Τα ανθρώπινα NSCLC κύτταρα Α549 ελήφθησαν από το Type Culture Collection της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και αντιβιοτικά (100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη) στους 37 ° C υπό υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95 % αέρα και

2 5% CO. Τα κύτταρα στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη.

Χημικά αντιδραστήρια και αντισώματα

5-FU, 3-ΜΑ, 3- (4,5-διμεθυλο-2-θειαζολυλ) -2,5-diphnyl-2Η-τετραζολίου (ΜΤΤ), 5,5 ‘, 6,6′-τετραχλωρο-1,1′, 3,3′-tetraethylbenzimidazolyl ιωδιούχο καρβοκυανίνη (JC-1) και 5- (και 6) -καρβοξυ-2’7’-dichlorodihydrofluorescein διοξεικό (DCFDA) ήταν όλα αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Αντι-LC3, αντι-Beclin1, αντι-Ρ62, αντι-κυτόχρωμα c, αντι-διασπάται caspase9, αντι-διασπάται caspase8, αντι-διασπάται caspase3 και αντι-διασπάται αντισώματα PARP αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA) . Αντι-ακτίνης αντισώματος και τα δεύτερα αντισώματα ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (CA, USA).

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμή ΜΤΤ. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων επίπεδου πυθμένα πλάκες μικροτίτλου σε μία πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /ml με 100 μL ανά φρεάτιο, επωάστηκαν για 24 ώρες και στη συνέχεια εκτίθενται σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της 5-FU για τους υποδεικνυόμενους χρόνους . Μετά την επεξεργασία, το διάλυμα ΜΤΤ 20 μΙ (5 mg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν σε υγροποιημένο 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C για 4 ώρες. Οι κρύσταλλοι κατόπιν διαλύθηκαν σε 100 μλ διμεθυλοσουλφοξειδίου /φρεάτιο. Η απορρόφηση του διαλύματος μετρήθηκε στα 490 nm με μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας μικροτιτλοδότησης (Bio-Tek ELX800). Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίσθηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: Κυτταρική βιωσιμότητα (%) = Α490 (δείγμα) /Α490 (έλεγχος) × 100. Τουλάχιστον τρεις επαναλήψεις πραγματοποιήθηκαν για κάθε επεξεργασία.

ανοσοφθορισμού για LC3

Το επίπεδο της LC3 εξετάστηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ανοσοφθορισμού, σύμφωνα με προηγούμενη αναφορά μας [22]. Εν συντομία, τα κύτταρα Α549 σπάρθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες. Μετά τη θεραπεία με 5-FU (10 μΜ) για 48 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία 3-ΜΑ (5 mmol /L), τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά. Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100 για 30 λεπτά και στη συνέχεια αποκλείστηκαν με 2% BSA για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά τον αποκλεισμό, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-LC3 (1:400 αραιώνονται σε ρυθμιστικό BSA) αντίσωμα σε 4 ° C όλη τη νύκτα και στη συνέχεια αντιδρά με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) IgG αίγας αντι-κουνελιού (1:100 αραιωμένο σε ρυθμιστικό BSA) για 1 ώρα στους 37 ° C. Ο πυρήνας βάφτηκαν με 1 mmol /L ϋΑΡΙ (Sigma-Aldrich) για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, LC3 puncta και βάφονται πυρήνα εντοπίστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού και συγχωνεύονται (Όλυμπος, Ιαπωνία).

Ανίχνευση των όξινων φυσαλιδώδους οργανίδια (Avos)

Για την ποσοτικοποίηση της ανάπτυξης των Avós, τα κύτταρα Α549 ήταν σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων επίπεδου πυθμένα πλάκες μικροτίτλου σε μία πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /ml με 1 mL ανά φρεάτιο και επωάστηκαν για 24 ώρες. Μετά την επεξεργασία με 10 μΜ 5-FU για 48 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία 3-ΜΑ (5 mmol /L), τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 1 μΜ πορτοκαλί της ακριδίνης στους 37 ° C στο σκοτάδι για 15 λεπτά, στη συνέχεια πλένονται δύο φορές με PBS. Εικόνες της χρώσης AO έγιναν ορατά αμέσως με τη χρήση μικροσκοπίου φθορισμού. Για την ποσοτικοποίηση του αριθμού των όξινων κυστιδίων στα επεξεργασμένα κύτταρα, άλλα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά από χρώση με ΑΟ σε PBS στους 37 ° C για 15 λεπτά, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και επαναιωρήθηκαν σε 200 μΙ PBS, μετά αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας. Green (500-550 nm, FL1 κανάλι) και κόκκινο (& gt? 650 nm, FL3 κανάλι) φθορισμό, η οποία φωτίζεται με μπλε (488 nm) φωτός διέγερσης, μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής με λογισμικό ανάλυσης CellQuest (Becton Dickinson)

ανίχνευσης απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής

Η ανίχνευση διεξήχθη με τη Αηηβχίην-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Diego, USA). Breifly, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε 10 μΜ 5-FU για 48 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία 3-ΜΑ (5 mmol /L). Μετά τη θεραπεία, περίπου 1 × 10

6 κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές σε PBS, και στη συνέχεια βάφονται με Annexin V-FITC και ΡΙ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το προκύπτον φθορισμός ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής με λογισμικό ανάλυσης CellQuest.

δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) Ανάλυση

Οι τιμές του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας χρώση JC-1 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 10 μΜ JC-1 για 30 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι. Τα θετικά κύτταρα στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής με λογισμικό ανάλυσης CellQuest.

Μέτρηση της αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS)

επίπεδα ROS προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη φθορίζουσα χρωστική 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein διοξική (DCFH-DA). Εν συντομία, τα κατεργασμένα κύτταρα υπέστησαν κατεργασία τρυψίνης, πλύθηκαν και επωάστηκαν με 10 μΜ DCFH-DA για 30 λεπτά στο σκοτάδι, και η ένταση του φθορισμού ακολουθήθηκε από κυτταρόμετρο ροής με λογισμικό ανάλυσης CellQuest.

Μέτρηση του κυτοχρώματος c Release

Το κλάσμα μιτοχονδρίων και cytosol κλάσμα παρασκευάστηκε με φυγοκέντρηση διαφορετικά ως Jie Li, MD περιγράφεται [3]. Εν συντομία, τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με PBS, στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε ένα ρυθμιστικό σακχαρόζης (250 mM σακχαρόζης, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl ρΗ 7,5 συμπληρωμένο με 1 mM PMSF, 1 μg /mL λευπεπτίνη, 1 μg /mL πεπστατίνη Α, 5 μg /mL απροτινίνη, και 5 mM DTT) σε πάγο για 30 λεπτά. Τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν και κατόπιν φυγοκεντρήθηκαν στα 1000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C για να απομακρυνθούν οι πυρήνες και τα μη σπασμένα κύτταρα. Το κλάσμα μιτοχονδρίων στη συνέχεια σφαιροποιήθηκε με φυγοκέντρηση στα 10.000 g για 20 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο φυγοκεντρήθηκε περαιτέρω στα 100.000 g για 60 λεπτά στους 4 ° C για να πάρετε την κυτοσόλιο κλάσμα.

δραστικότητα Caspase δοκιμασία

Η δραστηριότητα των κασπασών-3 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα κασπάσης χρωματομετρική δοκιμασία κιτ (Beyotime, Κίνα). Εν συντομία, μετά την κατεργασία με υποδεικνύεται παράγοντες, τα κύτταρα Α459 συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με PBS με φυγοκέντρηση στα 600 g για 5 λεπτά στους 4 ° C. Οι σβώλοι κυττάρων επαναιωρηματοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης και αφήνεται σε πάγο για 15 λεπτά. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στα 160.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C και το υπερκείμενο συλλέχθηκε για κασπάσης 3 προσδιορισμού δραστικότητας στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιέχει το Ac-DEVD-ρΝΑ σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ. Η συγκέντρωση του ρΝΑ μετρήθηκε στα 405 nm με αναγνώστη πλάκας μικροτίτλου, η οποία χρησιμοποιείται ως ενδεικτική της δραστικότητας κασπάσης 3.

Western blot ανάλυση

Α549 κύτταρα, επωάστηκαν με τις αντίστοιχες προϋποθέσεις, ήταν συλλέγονται και λύονται. Μία ίση ποσότητα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (5-15%) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι στυπώθηκαν μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκαν με τις επιθυμητές πρωτογενή αντισώματα (αραίωση 1:1000) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Στη συνέχεια, οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες έγιναν ορατές με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας συζευγμένο με υπεροξειδάση IgG δευτερογενή αντισώματα χρένου. Για την ποσοτικοποίηση ίση φόρτωση, μεμβράνη επανελέγχθηκε με αντίσωμα β-ακτίνης.

Εξέταση των autophagosome με ΤΕΜ

Α549 κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 2.5% γλουταραλδεΰδη σε 4 ° C όλη τη νύκτα, και σταθεροποιήθηκαν με 1% ΟΣΟ

4 για 1,5 h. Στη συνέχεια, τα κύτταρα βάφτηκαν με 70% αιθανόλη κορεσμένη με οξικό ουρανύλιο, ακολουθούμενη από κλίση αφυδάτωση με αιθανόλη-ακετόνη και τελικά ενσωματώνονται σε εποξική ρητίνη για την ενότητα. Οι υπέρλεπτες τομές έγιναν διπλά χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο και αναλύθηκε με μικροσκοπία μετάδοσης ηλεκτρονίου (ΤΕΜ)

παρεμβολή RNA του ATG7

ATG7 παρεμβολή RNA πραγματοποιήθηκε με επιμόλυνση κυττάρων Α549 με την Atg7- στοχευμένη siRNA και το siRNA ελέγχου (Universal Invitrogen? 100 pmol /φρεάτιο). Σύντομη ολιγο-RNAs επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά από 24 ώρες διαμόλυνσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-FU για επιπλέον 48 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανοσοστύπωση του ATG7, LC3 και PARP. Τα κύτταρα επίσης σε επεξεργασία για τη βιωσιμότητα των κυττάρων και την ανάλυση απόπτωσης.

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± το SD (n≥3). Η στατιστική ανάλυση μεταξύ των δύο ομάδων υπολογίσθηκε με τη χρήση t-test του Student, και πολλές ομάδες διεξήχθησαν με το πρόγραμμα λογισμικού SPSS 10.0.

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

5-FU αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα Α549

Για να διερευνηθεί 5-φθοριοουρακίλη του δυναμικό αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης σε κύτταρα Α549, η επίδραση της θεραπείας 5-FU επί κυττάρων εξετάσθηκε με μία δοκιμασία ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, 5-FU (0-200 μΜ) προκάλεσε τη δόση και χρονοεξαρτώμενη μείωση στην ανάπτυξη Α549 κυττάρων. Η IC50 για 48 ώρες θεραπείας 5-FU σε κύτταρα Α549 ήταν 10,32 ± 0,69 μΜ. Με βάση το αποτέλεσμα, 10 μΜ 5-FU για 48 ώρες σε Α549 κύτταρα χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω πειράματα. Επιπλέον, μορφολογικές αλλαγές ανέφερε επίσης ότι η θεραπεία με 5-FU μειωμένη κυτταρική πυκνότητα. Είναι ενδιαφέρον, 5-FU-επεξεργασμένα κύτταρα δεν εμφανίστηκαν πολύ προφανές αποπτωτικών χαρακτήρες αλλά πολλοί κενοτόπια στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 1Β). Αυτό μας ώθησε να εξετάσουμε αν η 5-FU επαγόμενη autophagy περιελήφθη επίσης σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

(Α) Cell βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με δοκιμασία ΜΤΤ μετά από επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της 5-FU για 24 ώρες και 48 ώρες . IC50 υπολογίστηκε με IC50 πρόγραμμα λογισμικού. (Β) Μορφολογικές αλλαγές παρατηρήθηκε μετά την αγωγή των κυττάρων με 10 μmol /L 5-FU για 48 ώρες με Ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus, Japan). Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

5-FU προκαλεί αυτοφαγία στα κύτταρα Α549

Στη συνέχεια, μικροσκοπία ηλεκτρονίων μετάδοσης χρησιμοποιήθηκε για να ελέγξει τον σχηματισμό αυτοφαγοσώματα σε 5- FU επεξεργασμένα κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, η θεραπεία με 5-FU για 6-48 h προκάλεσε τη συσσώρευση αυτοφαγικά κενοτόπια, που επέδειξε autophagosome ή /και autolysosomal χαρακτηριστικά, ενώ παρατηρήθηκαν μόνο λίγα κενοτόπια στα κύτταρα ελέγχου. Autophagy-ειδικοί δείκτες LC3, Beclin-1 και Ρ62 χρησιμοποιήθηκαν επίσης για να εξεταστούν τα επίπεδα αυτοφαγικά και το αυτοφαγικά ροή σε αυτή τη διαδικασία με ανάλυση ανοσοστυπώματος. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, η αυξητική ρύθμιση του Beclin-1, η ρύθμιση προς τα κάτω του Ρ62 και η μετατροπή της LC3 Ι /ΙΙ απέδειξαν αύξηση σχηματισμό αυτοφαγοσώματα σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα Α549.

κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10 μmol /L 5-FU για διαφορετικό χρόνο όπως υποδεικνύεται, τότε ανιχνεύθηκαν οι αυτοφαγοσώματα και τα αυτοφαγικά επίπεδα. (Α) Ο σχηματισμός αυτοφαγοσώματα σε επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχθηκαν με ΤΕΜ. (Β) LC3, Beclin-1 και ρ62 εξετάστηκαν με κηλίδα western. β-ακτίνη ήταν ένας έλεγχος φόρτωσης. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Στη συνέχεια, Για την περαιτέρω αποδείξει την αυτοφαγία που προκαλείται από 5-FU, παρουσιάσαμε 3-ΜΑ, η οποία είναι μια δημοφιλής αναστολέας της αυτοφαγία [3 ]. 5 mM 3-ΜΑ προστέθηκαν σε κύτταρα Α549 για 1 ώρα πριν από την 5-FU έκθεση. Τα κύτταρα διαιρούνται σε τέσσερις ομάδες: ελέγχου (χωρίς θεραπεία), 3-ΜΑ (επεξεργασία με 3-ΜΑ), 5-FU (θεραπεία με 5-FU), και ο συνδυασμός (επεξεργασία με τα δύο 5-FU και 3-ΜΑ) . κυτταρομετρία ροής διεξήχθη μετά από χρώση των κυττάρων με πορτοκαλί της ακριδίνης για την ποσοτικοποίηση των Avós. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο αριθμός των όξινων κυστιδίων στην ομάδα 5-FU αυξημένη προφανώς, η οποία αναστέλλεται από 3-ΜΑ, επιβεβαιώνοντας την επαγωγή αυτοφαγία (Σχ. 3Α και C). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης σε φθορισμό μικροσκοπική εξέταση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β, Α549 κύτταρα κατεργασμένα με 5-FU για 48 ώρες εμφανίζεται ένα μεγάλο αριθμό φθοριζόντων κυστιδίων στο κυτόπλασμα, ενώ λίγα μόνο φθοριζόντων κυστιδίων παρατηρήθηκαν στην ομάδα ελέγχου, ομάδα 3-ΜΑ και συνδυασμός ομάδας. Επιπλέον, LC3 ανοσοφθορισμό και ανοσοστύπωμα πραγματοποιήθηκαν επίσης. μικροσκοπία φθορισμού αποκάλυψε την διάστικτη κατανομή του φθορισμού LC3 ενισχυμένη σε 5-FU ομάδα (Σχ. 3D). κηλίδα Western έδειξε επίσης ότι η έκφραση του LC3 σε συνδυασμό ομάδα μερικώς επανήλθε στην αρχική του κατάσταση, την ίδια στιγμή, αντανακλώντας την πραγματική ανασταλτική δράση του 3-ΜΑ (Σχ. 3Ε). Αυτά τα αποτελέσματα απέδειξαν ότι αυτοφαγία προκλήθηκε σε 5-FU κατεργασία Α549 κύτταρα. Επομένως, αποφασίσαμε να διερευνήσει κατά πόσον η αναστολή της autophagy επηρεάζει την ευαισθησία του κυττάρου Α549 σε θεραπεία 5-FU.

Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 5 mmol /L 3-MA για 1 ώρα πριν την έκθεση σε 10 μmol /L 5-FU για 48 ώρες, στη συνέχεια πορτοκαλί ακριδίνης χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση Avós, τα κύτταρα ενεργοποιημένων με φθορισμό αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Α). Μετά την επεξεργασία τα κύτταρα χρωματίστηκαν με πορτοκαλί της ακριδίνης για παρατήρηση AVO. Τα κύτταρα έγιναν ορατά κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού κόκκινο φίλτρο (Β). Ποσοτικοποίησης των κυττάρων αναπτυσσόμενων AVO σε κύτταρα Α549, το ποσοστό των ανεπτυγμένων Avós υπολογίστηκε με βάση τα αποτελέσματα του κυττάρου ενεργοποιημένων με φθορισμό διαλογή δοκιμασίας (C). Μικροσκόπιο φθορισμού με χρώση ανοσοφθορισμού για LC3 στην κύτταρα κατεργασμένα-Α549 (D). Η ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθη για την ανίχνευση των επιπέδων πρωτεΐνης LC3. Οι κηλίδες εκ νέου αποδείχθηκε με αντι-β-ακτίνης ως ένας έλεγχος φορτίου (Ε). Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

αναστολή Autophagy ενισχύει 5-FU που προκαλείται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο

Κατ ‘αρχάς, να εξεταστεί κατά πόσον η αναστολή της αυτοφαγία ευαισθητοποιεί κύτταρα Α549 σε 5-FU-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, η επίδραση της θεραπείας εξετάστηκε με δοκιμασία ΜΤΤ (Εικ. 4Α). Στην ομάδα συνδυασμού, η βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 μειώθηκε ταχύτερα από ότι στην ομάδα 5-FU, η ομάδα συνδυασμού οδήγησε 65.75% των κυττάρων σε θάνατο, για αύξηση 39,28% σε σχέση με εκείνη στην ομάδα 5-FU. Αν και η βιωσιμότητα των κυττάρων στην ομάδα 3-ΜΑ μειώθηκε επίσης, η έκταση δεν ήταν σημαντική. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η 3-ΜΑ ενισχύει 5-FU κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε κύτταρα Α549. Στη συνέχεια, για να επικυρώσει την παρατήρηση ότι η αναστολή της autophagy επηρεάζει την ευαισθησία των κυττάρων σε 5-FU, Annexin V-FITC και χρώση ΡΙ διεξήχθη. Ροή κυτταρομετρικής ανάλυση έδειξε ότι ο αριθμός των από τον μέσο και AV /κύτταρα ΡΙ-θετικών αυξήθηκε σημαντικά σε ομάδα συνδυασμένης θεραπείας από το 5-FU μόνο ομάδα θεραπείας (Εικ. 4Β). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αυτού, οι δήμιοι, κασπάσης-8, κασπάσης-9, κασπάσης-3 και PARP εξετάστηκαν στη συνέχεια. Σε 5-FU-αγωγή ομάδες, ήταν όλα διασπαστεί σε ειδικές ενεργές μορφές τους, και η δραστηριότητα των 5-FU-κατεργασμένα κύτταρα με ανέστειλαν autophagy ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι σε κύτταρα κατεργασμένα με 5-FU μόνη της (σχ. 4C).

τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 5 mmol /L 3-MA για 1 ώρα πριν την έκθεση σε 10 μmol /L 5-FU για 48 ώρες. (Α) Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με μια δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη βοήθεια τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) ποσοστό κυτταρικός θάνατος αναλύθηκε με την δοκιμασία αννεξίνης V με κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. (Γ) Τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με αντισώματα προς τη κασπάση-9, κασπάσης-8, κασπάσης-3, PARP, και β-ακτίνης. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Ο ρόλος της αυτοφαγία στην 5-FU-κυτταροτοξικότητα μελετήθηκε περαιτέρω με να χτυπήσει κάτω από την έκφραση ATG7 χρήση siRNA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5, η έκφραση του ATG7 αξιοσημείωτα κατέστειλε σε κύτταρα Α549 επιμολύνονται με ATG7 siRNA, αλλά όχι εκείνοι με siRNA ελέγχου (εικ. 5Α). Κατά συνέπεια, κύτταρα επιμολυσμένα με ATG7 siRNA έδειξαν μειωμένη επίπεδο συσσώρευσης LC3-ΙΙ και αυξημένο επίπεδο clPARP μετά από 5-FU θεραπεία (Εικ. 5Α). Επιπλέον, η κυτταροτοξική δράση της 5-FU ήταν σημαντικά αυξημένη από το κλείδωμα έκφραση ATG7 και ο αναστολέας για τις κασπάσες Z-VAD-fmk διασωθεί η κυτταρικού θανάτου (Εικ. 5Β). Ομοίως, ο βαθμός απόπτωσης που επάγεται από την 5-FU ενισχύθηκε επίσης όταν χτυπήσει κάτω την έκφραση ATG7 και z-VAD-fmk μείωσε την κυτταρική απόπτωση σημαντικά (Σχ. 5C). Όπως συνοψίζεται στο Σχ. 5, knockdown του ATG7 επιταχύνουν επίσης την απόπτωση που επάγεται από την 5-FU. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν συνεπή με τη χρήση 3-ΜΑ, γεγονός που αποδεικνύει ότι autophagy που επάγεται από 5-FU παίζει ένα προστατευτικό ρόλο καρκινικών κυττάρων ενάντια σε απόπτωση, και αποκλεισμός των autophagy συνέχεια ενίσχυσε την απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης των κασπασών σε κύτταρα Α549.

τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ATG7 στοχευμένες siRNA και το siRNA ελέγχου για 24 ώρες πριν από την έκθεση σε 10 mmol /L 5-FU για 48 ώρες. (Α) Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με αντισώματα σε LC3, ATG7, PARP, και β-ακτίνης. βιωσιμότητας (Β) των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία. κυτταρικό θάνατο (Γ) Τα αποπτωτικά αναλύθηκε με την δοκιμασία αννεξίνης V /PI. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Αλλαγές της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η ενεργοποίηση των κασπασών οδηγήθηκε από cyt -c μέσω εγγενούς μιτοχονδριακής αποπτωτικό μονοπάτι [23], [24]. Ως εκ τούτου, η επίδραση του ανέστειλε autophagy για την 5-FU-μεσολαβούμενη απελευθέρωση των cyt-c από τα μιτοχόνδρια σε κυτοσόλιο διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας κύτταρο κλασματοποίηση. Τα αποτελέσματα που πήραμε προέκυψε ότι η αναστολή της αυτοφαγία σε 5-FU-επεξεργασμένα κύτταρα οδήγησε σε δραστική αύξηση στην συσσώρευση του κυτοχρώματος c στο κυτταρόπλασμα (Σχ. 6Α). Η επίδραση στην μιτοχόνδρια επιβεβαιώθηκε επίσης από μια πτώση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Β, η αναστολή της αυτοφαγία σε 5-FU-κατεργασμένων κυττάρων που επάγεται μια προφανή μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι μπορεί να απαιτηθεί απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης για 5-FU σε συνδυασμό 3-MA προκαλούμενη απελευθέρωση cyt-c στα κυτοσόλιο, τα οποία αργότερα προκάλεσε την ενεργοποίηση και διάσπαση των κασπασών και κατέληξαν κυτταρικής απόπτωσης.

Τα κύτταρα αντιμετωπίζονται όπως στο Σχ. 3. (Α) Τα μιτοχόνδρια και οι κυτοσόλιο κλάσματα απομονώθηκαν όπως περιγράφεται στα Υλικά και μέθοδοι, και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανοσοστύπωση για την ανίχνευση του κυτοχρώματος c. (Β) Η αλλαγή ΜΜΡ εκτιμήθηκε με χρώση JC-1 με κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Αναστολή του autophagy διεγείρει το σχηματισμό ROS, η οποία απαιτείται για 5-FU-απόπτωση σε κύτταρα Α549

Πρόσφατα, αρκετές αναφορές παρέχεται απόδειξη για την εμπλοκή του αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) στην επαγωγή της απόπτωσης και αυτοφαγία και κατέδειξε τη σημασία των ROS στην απελευθέρωση του cyt-c από τα μιτοχόνδρια [25], [26]. Ως εκ τούτου, αποφασίσαμε να αναλύσουμε αν η αναστολή της αυτοφαγία θα μπορούσε να τονώσει την παραγωγή των ROS σε 5-FU θεραπεία Α549 κύτταρα. Τα επεξεργασμένα κύτταρα βάφτηκαν με χλωρομεθυλο-2 ‘, 7’-διοξική διχλωροφθορεσκεϊνης (CM-Η2-DCFDA), ένα διαπερατό κύτταρο χρωστική φθορισμού που αντιδρά σε ένα ευρύ φάσμα των ROS. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Α, τα επίπεδα ROS αυξήθηκαν προφανώς στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 5-FU σε συνδυασμό με 3-MA σε σύγκριση με μονοθεραπεία 5-FU με κυτταρομετρία ροής, και τέτοια αύξηση αποτελεσματικά εξασθενημένα όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 10 mM Ν- ακετυλο κυστεΐνη (NAC) για 1 ώρα. Δεδομένου ότι το επίπεδο του ROS είναι αυξημένα σε κύτταρα με κατασταλεί αυτοφαγία, αναλύσαμε περαιτέρω κατά πόσον η αναστολή της ROS επηρεάζονται 5-FU μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο. Για το σκοπό αυτό, ο σχηματισμός των ROS αναστέλλεται από NAC και η απόπτωση μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Β, την ευαισθητοποίηση των κυττάρων σε 5-FU-επαγόμενη απόπτωση κυττάρων ήταν εντελώς αποκλεισμένη από αποτροπή σχηματισμού ROS. Τέλος, διερευνήσαμε κατά πόσον η αναστολή της ROS επηρέασαν την δραστηριότητα κασπάσης και την απελευθέρωση του cyt-c. Πράγματι, σάρωσης των ROS αναστέλλεται δραστικότητα κασπάσης-3, εμπόδισε την απελευθέρωση του cyt-c από τα μιτοχόνδρια, και διασώθηκε κύτταρα Α549 από 5-FU-απόπτωση (Σχ. 7C και D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν σαφώς ότι η παραγωγή ROS παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου σε απόκριση προς 5-FU.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 10 mM NAC για 1 ώρα πριν από τις 10 μmol /L 5-FU ( 48 h) κατεργασία παρουσία ή απουσία 3-ΜΑ. (Α) Η παραγωγή ROS ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας DCFDA με ένα κυτταρόμετρο ροής. Τα δεδομένα επεξεργάστηκαν με το λογισμικό CellQuest και αναλύθηκαν με πυκνομετρία. θάνατος (Β) των κυττάρων μετρήθηκε με χρώση αννεξίνης V /PI. (Γ) δοκιμασία δραστικότητας κασπάσης-3 διεξήχθη όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. (D) Το επίπεδο cyt-c στα κυτοσόλιο κλάσμα ανιχνεύθηκε με ανοσοκηλίδωση. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Συζήτηση

Σε καρκίνο του πνεύμονα, χημειοθεραπεία χρησιμοποιείται ευρέως για να θεραπεύσει και να επεκτείνει τη μετεγχειρητική επιβίωση ασθενών. 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) χρησιμοποιείται αποτελεσματικά ως φάρμακο στη θεραπεία μιας ποικιλίας ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα. Ο κυριότερος μηχανισμός στηρίζεται αντικαρκινική δράση της έχει αποδοθεί στην παρεμβολή του DNA και RNA σύνθεση. Τις τελευταίες δεκαετίες, η επαγωγή απόπτωσης από 5-FU ήταν η σημαντική εκτίμηση στη θεραπεία του καρκίνου [27] – [29]. Πρόσφατα, autophagy έχει εκτενώς παρατηρηθεί σε 5-FU θεραπεία [3], [7], [30] – [32]. Στη μελέτη μας, βρήκαμε ότι το 5-FU μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549 προφανώς (Εικ. 1Α), η οποία περιελάμβανε κυττάρων αυτοφαγία και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο (Σχ. 2,3,4 και 5). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν επίσης ότι και οι δύο LC3-ΙΙ και Beclin1, τα οποία έχουν θεωρηθεί ο δείκτης της autophagy [33], ήταν σημαντικά αυξημένη μετά τη θεραπεία 5-FU σε κύτταρα Α549 που συνοδεύεται από τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης Ρ62 (Σχ. 2Β). Εν τω μεταξύ, η αυξανόμενη σχηματισμός αυτοφαγοσώματα ή /και autolysosomal με το χρόνο ανιχνεύεται με ΤΕΜ (Σχ. 2Α) και το αυξημένο σχηματισμό χαρακτηριστικής Avós στην κυτταροπλασματική προβλέπεται ένα άλλο δύο αποδεικτικά στοιχεία (Σχ. 3Α-Γ). Όλα αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι autophagy προκλήθηκε από την 5-FU.

Autophagy είναι ένα ενδοκυτταρικό χύμα σύστημα αποικοδόμηση που βρίσκεται πανταχού παρούσες στα ευκαρυωτικά, η οποία είναι υπεύθυνη για την αποικοδόμηση των περισσοτέρων μακρόβιων πρωτεϊνών και μερικά οργανίδια. Οι Κυτταροπλασματικά συστατικά, συμπεριλαμβανομένων των οργανιδίων, απομονωμένος σε διπλό membraned αυτοφαγοσώματα και στη συνέχεια συντήκονται με λυσοσώματα για να σχηματίσουν autolysosomes όπου αποικοδομούνται το περιεχόμενό τους. Τα υποβαθμισμένα προϊόντα ανακυκλώνονται στο κυτταρόπλασμα για επαναχρησιμοποίηση [34]. Αυτοφαγία διεγείρεται σε απόκριση σε εξωτερικά στρεσογόνους παράγοντες και εσωτερικές ανάγκες για τη διατήρηση κυτταρικό μεταβολισμό, καθώς και την επιβίωση. Παρ ‘όλα αυτά, αυτοφαγία μπορεί επίσης να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο που ονομάζεται «θάνατος αυτοφαγικά κύτταρο» (προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος τύπου ΙΙ) με υπερβολική αυτο-πέψη και την υποβάθμιση των βασικών κυτταρικών συστατικών, υπό ορισμένες συνθήκες [18], [35]. Πρόσφατα, ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία δείχνουν το ρόλο της αυτοφαγία στην εξάπλωση του καρκίνου και την ανταπόκριση στη θεραπεία. Ωστόσο, στην χημειοθεραπεία του καρκίνου, αυτοφαγία φαίνεται να παίζουν ένα ρόλο σε διένεξη, πιθανώς προαγωγή ή αναστολή της απόπτωσης, στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και του θανάτου [9]. Προκειμένου να διερευνηθεί η συμβολή του αυτοφαγία στη διαδικασία της 5-FU επαγόμενη Α549 κυττάρου απόπτωση, χρησιμοποιήσαμε αναστολέα αυτοφαγία 3-ΜΑ, ένας ειδικός αναστολέας της διαδικασίας αυτοφαγικά πρώιμου σταδίου, σε αυτή τη μελέτη. Όπως αναμενόταν, 3-ΜΑ ανέστειλαν 5-FU που προκαλείται από αυτοφαγία (Εικ. 3). αναστολή Autophagy ενισχυμένη 5-FU-επαγόμενη απόπτωση κυττάρων μέσω της ενεργοποίησης των κασπασών σε κύτταρα Α549 (Εικ. 4). Για την περαιτέρω αποσαφήνιση του ρόλου της αυτοφαγία στο 5-FU που προκαλείται Α549 κυτταρικό θάνατο, χρησιμοποιήσαμε ATG7 siRNA να γκρεμίσουμε ATG7 και αξιολογείται ο ρόλος της αυτοφαγία πιο άμεσα. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα χρησιμοποιώντας 3-ΜΑ, επιμόλυνση ATG7 siRNA ανέστειλε αποτελεσματικά τη συσσώρευση LC3-ΙΙ, αυξημένη παραγωγή clPARP και ενίσχυσε την αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που επάγεται από την 5-FU σε κύτταρα Α549 (Εικ. 5).