Αφηρημένο

Ιστορικό

Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να διερευνήσει τις θεραπευτικές δυνατότητες της καταστολής ΜΑΡ κινάσης και PI3K /Akt μονοπάτια και αποακετυλάσης της ιστόνης (HDAC) για να επάγει την έκφραση του νατρίου /ιωδιούχου συμμεταφορέα (ΝΑΚ) και η πρόσληψη ραδιενεργού ιωδίου σε μη θυρεοειδούς καρκινικά κύτταρα.

Μέθοδοι

Δοκιμάσαμε τα αποτελέσματα του αναστολέα RDEA119 ΜΕΚ, το perifosine αναστολέα Akt, και τον αναστολέα HDAC SAHA επί της έκφρασης NIS σε δεκατρείς ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου που προέρχεται από μελάνωμα, ηπατικό καρκίνωμα, γαστρικό καρκίνωμα, καρκίνωμα του κόλου, καρκίνωμα του μαστού, και καρκίνων του εγκεφάλου. Εξετάσαμε, επίσης, η πρόσληψη ραδιενεργού ιωδίου και ακετυλίωση ιστονών στον υποκινητή ΝΑΚ σε επιλεγμένα κύτταρα.

Αποτελέσματα

Συνολικά, οι τρεις αναστολείς θα μπορούσαν να επάγουν την έκφραση ΝΑΚ, σε διάφορους βαθμούς, στο μελάνωμα και όλο το επιθηλιακό καρκίνωμα προερχόμενο κύτταρα αλλά όχι σε κύτταρα του καρκίνου που προέρχεται από εγκέφαλο. SAHA ήταν πιο αποτελεσματική και η επίδρασή της θα μπορούσε να ενισχυθεί σημαντικά από RDEA119 και perifosine. Η έκφραση των ΝΑΚ, σε επίπεδα τόσο του mRNA και της πρωτεΐνης, ήταν πιο ισχυρή στο κύτταρο μελανώματος Μ14, ηπατικό κύτταρο καρκίνωμα HepG2, και των στομαχικών κυττάρων καρκινώματος ΜΚΝ-7 κυττάρων. πρόσληψης ραδιενεργού ιωδίου ήταν αντίστοιχα που προκαλείται, η οποία συνοδεύεται από ισχυρή αύξηση στην ακετυλίωση των ιστονών στον υποκινητή ΝΑΚ, σε αυτά τα κύτταρα όταν έλαβαν θεραπεία με τις τρεις αναστολείς.

Συμπεράσματα

Αυτή είναι η πρώτη απόδειξη ότι καταστέλλοντας ταυτόχρονα η ΜΑΡ κινάσης και PI3K /Akt μονοπάτια και HDAC θα μπορούσε να προκαλέσει ισχυρή έκφραση NIS και η πρόσληψη ραδιενεργού ιωδίου σε ορισμένα μη θυρεοειδούς ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, παρέχοντας νέες θεραπευτικές συνέπειες για την επικουρική θεραπεία με ραδιενεργό ιώδιο αυτών των καρκίνων

Παράθεση:. Liu Ζ, Xing Μ (2012) Πρόκληση νάτριο /ιωδιούχου συμμεταφορέα (ΝΑΚ) Έκφραση και ραδιενεργό ιώδιο πρόσληψη σε κύτταρα μη-καρκίνο του θυρεοειδούς. PLoS ONE 7 (2): e31729. doi: 10.1371 /journal.pone.0031729

Συντάκτης: Marian Ludgate, Πανεπιστήμιο του Cardiff, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 12 Σεπ, 2011? Αποδεκτές: 12, Ιανουαρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 16η Φεβρουαρίου, 2012 |

Copyright: © 2012 Liu, Xing. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας R01 CA134225 επιχορήγηση Δρ Xing. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ως μία διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη εκφράζεται κυρίως σε επιθηλιακά κύτταρα των ωοθυλακίων θυρεοειδούς, ιωδιούχο νάτριο συμμεταφορέα (NIS) διαδραματίζει θεμελιώδη ρόλο στη μεταφορά του ιωδιούχου από τον εξωκυττάριο χώρο εντός του θυρεοειδούς κύτταρο για σύνθεση των θυρεοειδικών ορμονών του θυρεοειδούς αδένα [1] – [4]. Αυτή είναι η βιολογική βάση για την κλινική εφαρμογή του ραδιενεργού ιωδίου στη διάγνωση και τη θεραπεία μιας ποικιλίας των καλοήθων και κακοήθων νόσων του θυρεοειδούς. Ένα τυπικό παράδειγμα της χρησιμοποίησης αυτής της λειτουργίας του NIS είναι η εκτομή ραδιενεργό ιώδιο εφαρμόζεται ευρέως για τη θεραπεία του καρκίνου του θυρεοειδούς [5], [6]. θεραπεία με ραδιενεργό ιώδιο είναι συνήθως αποτελεσματική σε ασθενείς με καρκίνο του θυρεοειδούς, αλλά καθίσταται αναποτελεσματική, όταν ο καρκίνος του θυρεοειδούς κύτταρα έχουν χάσει την έκφραση των ΝΑΚ και δεν μπορεί πλέον να διαρκέσει έως ραδιενεργού ιωδίου, όπως συνήθως παρατηρείται σε φτωχά διαφοροποιημένο και αδιαφοροποίητο καρκίνων του θυρεοειδούς [7] – [10]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι οι αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC) θα μπορούσε να επάγει την έκφραση της ΝΑΚ σε θυρεοειδούς καρκινικά κύτταρα [11], [12]. Δείξαμε πρόσφατα ότι ο συνδυασμός του αναστολέα HDAC SAHA με αναστολείς της ΜΑΡ κινάσης και PI3K /Akt μονοπάτια θα μπορούσε να προκαλέσει ισχυρή και συνεργιστική έκφραση της NIS και η πρόσληψη ραδιενεργού ιωδίου στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα [13]. Αυτό έδωσε τη δυνατότητα για νέες αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου του θυρεοειδούς με ραδιενεργό ιώδιο που κατά τα άλλα είναι μη μανιώδεις για αυτό το ραδιοϊσότοπο.

Με δεδομένη την μοναδική λειτουργία της NIS για τη μεταφορά ιωδιούχου στα κύτταρα του θυρεοειδούς και την κλινική επιτυχία χρησιμοποιώντας ραδιενεργό ιώδιο για θυρεοειδούς θεραπεία του καρκίνου εκτομή, έχει εδώ και καιρό έχουν προταθεί και δοκιμαστεί ότι εξωγενώς προκαλούμενη έκφραση NIS χρησιμοποιώντας στοχευμένη μεταφορά γονιδίων μπορεί να προσδώσει μη θυρεοειδούς καρκινικά κύτταρα ραδιενεργό ιώδιο απληστία για θεραπεία με ραδιενεργό ιώδιο εκτομή [2] – [4], [14]. Οι μελέτες αυτές είναι πολλά υποσχόμενη, αλλά δεν έχουν ακόμη καταλήξει σε αξιόπιστα κλινικές εφαρμογές. Σημαντική προσπάθεια για να βελτιωθεί αρκετές βασικές πτυχές αυτής της προσέγγισης, συμπεριλαμβανομένης και της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας, την εξειδίκευση, την ασφάλεια, και την τεχνική πολυπλοκότητα. NIS μπορεί να εκφραστεί σε διάφορα φυσιολογικά μη θυρεοειδούς ιστούς, αν και σε χαμηλά επίπεδα, συμπεριλαμβανομένων, για παράδειγμα, των σιελογόνων, δακρυϊκό, του μαστού, του στομάχου, του εντέρου, του πνεύμονα, των νεφρών και των ιστών [15] – [19]. χαμηλού επιπέδου έκφραση του NIS αναφέρθηκε επίσης σε ορισμένους μη θυρεοειδούς καρκίνους όπως καρκίνωμα του μαστού [20]. Δείξαμε πρόσφατα ότι η καταστολή της ΜΑΡ κινάσης και μονοπάτια PI3K /Akt θα μπορούσε να προκαλέσει την έκφραση της NIS και η πρόσληψη ραδιενεργού ιωδίου σε κύτταρα μελανώματος [21]. Δεδομένης της συνέργεια σε εύρωστα επαγωγή της γονιδιακής έκφρασης του θυρεοειδούς και η πρόσληψη ραδιενεργού ιωδίου στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα με ταυτόχρονη αναστολή HDAC και την κινάση ΜΑΡ και μονοπάτια PI3K /Akt [13], στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε τις δυνατότητες αυτής της νέας θεραπευτικής στρατηγικής για την επαγωγή της έκφρασης ΝΑΚ για την πρόσληψη ραδιενεργού ιωδίου σε ένα εκτεταμένο πίνακα των μη θυρεοειδούς καρκινικά κύτταρα.

Αποτελέσματα

η επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου ΝΑΚ σε μη θυρεοειδούς καρκινικά κύτταρα από την καταστολή της ΜΑΡ κινάσης και μονοπάτια /ΑΚΤ PI3K και HDAC

Δοκιμάσαμε τα αποτελέσματα του αναστολέα RDEA119 ΜΕΚ, το perifosine αναστολέα Akt, και τον αναστολέα HDAC SAHA επί της έκφρασης του

NIS

γονίδιο σε 13 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα (Πίνακας 1). Αυτές περιελάμβαναν κύτταρα μελανώματος και τα κύτταρα καρκινώματος που προέρχονται από επιθηλιακά ηπατοκαρκινώματος, γαστρικό καρκίνωμα, καρκίνωμα κόλον και του καρκίνου του μαστού, καθώς και γλοιοβλαστώματος T98G κύτταρο και αστροκύτωμα κύτταρο SNB-78. Για την απόδειξη των στοχοθετημένων επιδράσεις των φαρμάκων των τριών αναστολέων σε αυτά τα κύτταρα, ελέγξαμε πρώτα αποτελέσματά τους στην μορίων στόχων τους στα μονοπάτια σηματοδότησης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, μετά από 30 ώρες θεραπείας, RDEA119 στα 0.5 μΜ και perifosine στα 5 μΜ θα μπορούσαν να αναστέλλουν σημαντικά την φωσφορυλίωση ERK (ρ-ERK) και την φωσφορυλίωση του ΑΚΤ (ρ-ΑΚΤ), αντίστοιχα, σε όλα σχεδόν τα κύτταρα εκτός από τα SNB-78 κυττάρων. SAHA σε 0,5 μΜ για 30 ώρες θα μπορούσε να ενισχύσει δραματικά την ακετυλίωση της ιστόνης Η3 σε αυτά τα κύτταρα εκτός από τα λίγα κύτταρα, όπως T98G και SNB78, στην οποία δεν υπήρχε ή μόνο μια μικρή αύξηση ακετυλίωσης ιστόνης. Τα αποτελέσματα αυτά, συνολικά, κατέδειξε τα αναμενόμενα αποτελέσματα στόχος αυτών των αναστολέων.

Ο αναστολέας RDEA119 ΜΕΚ, ο perifosine αναστολέας Akt, και ο αναστολέας HDAC SAHA χρησιμοποιήθηκαν για να στοχεύσουν αντίστοιχα αυτές τις οδούς σηματοδότησης ή μόρια. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 30 ώρες με 0.5 μΜ RDEA119, 5 μΜ perifosine ή 0.5 μΜ SAHA όπως υποδεικνύεται. DMSO ή PBS χρησιμοποιήθηκε παράλληλα ως έλεγχος του οχήματος. Τα κύτταρα λύθηκαν για κηλίδωση Western μετά θεραπείες για να αποκαλύψει τα επίπεδα φωσφορυλιωμένης ERK (ρ-ΕΚΚ), φωσφορυλιωμένου Akt (ρ-Akt), και ακετυλιωμένη ιστόνη (Ac-His) με ειδικά αντισώματα. «+», Η θεραπεία με την υποδεικνυόμενη αναστολέα? «-«., Η θεραπεία με όχημα

Η

Στη συνέχεια εξέτασαν τα αποτελέσματα των τριών αναστολέων σε αυτές τις συγκεντρώσεις, μεμονωμένα ή σε συνδυασμούς, στην έκφραση του

NIS

γονίδιο στα κύτταρα 13 χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1,

NIS

εκφράσεως είναι αυξημένο σε διάφορους βαθμούς σε όλα τα κύτταρα, εκτός από τις δύο μη επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα T98G και SNB78 που δεν είχαν καμία απάντηση σε αυτές τις φαρμακευτικές αγωγές. Η επαγόμενη

NIS

έκφραση ήταν πιο ισχυρή στο κύτταρο μελανώματος Μ14, το ηπατοκαρκινώματος HepG2 κύτταρο, και του γαστρικού καρκινώματος ΜΚΝ-7, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω μελέτες, όπως παρουσιάζονται στις παρακάτω ενότητες. Ξεχωριστά, RDEA119 και perifosine καθένα είχε μικρότερη επίδραση και SAHA εμφανίζονται οι πιο έντονες επιπτώσεις στην έκφραση του

NIS

. Ένα συνεργιστικό αποτέλεσμα παρατηρήθηκε όταν ο αναστολέας ΜΕΚ ή ο αναστολέας Akt ήταν κάθε συνδυάζεται με SAHA και τα συνεργιστικά αποτελέσματα ήταν ακόμη πιο ισχυρή όταν τα τρία φάρμακα συνδυάστηκαν, με εξαίρεση ότι σε HepG2 κύτταρα perifosine δεν ενίσχυσε περαιτέρω την εύρωστη επίδραση του SAHA .

Μετά την επίδειξη της έκφρασης του mRNA της NIS με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου σε μελάνωμα και καρκίνωμα επιθηλιακών κυττάρων, εμείς δίπλα επεδίωξε να εξετάσει την έκφραση του NIS στο πρωτεϊνικό επίπεδο σε αυτά τα κύτταρα, χρησιμοποιώντας το κύτταρο μελανώματος Μ14 , HepG2 ηπατοκαρκινώματος κυττάρων, και των γαστρικών κυττάρων καρκινώματος ΜΚΝ-7 ως αντιπρόσωποι που εμφανίζεται την πιο ισχυρή έκφραση της NIS (Πίνακας 1). Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, συνδυασμένη θεραπεία αυτών των κυττάρων με RDEA119, perifosine και SAHA αυξήθηκε σημαντικά την έκφραση της πρωτεΐνης ΝΑΚ όπως ανιχνεύεται με κηλίδωση Western. Σε σύγκριση με κύτταρα Μ14 και HepG2, κύτταρα ΜΚΝ-7 επέδειξαν μία μέτρια αύξηση στην έκφραση της NIS πρωτεΐνης σε απόκριση στην θεραπεία συνδυασμού με τις τρεις αναστολείς, η οποία ήταν παρόμοια με τη πρότυπο έκφρασης NIS mRNA στα κύτταρα αυτά υπό αυτόν τον όρο φαρμακευτική αγωγή (Τραπέζι 1). Έτσι, την καταστολή της ΜΑΡ κινάσης και PI3K /Akt μονοπάτια και HDAC θα μπορούσε να προκαλέσει ισχυρή έκφραση της NIS σε αυτά τα κύτταρα τόσο σε επίπεδο μεταγραφής και μεταφράσεως.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 30 ώρες με συνδυασμό χρήσης των RDEA119, perifosine, και SAHA στις συγκεντρώσεις που περιγράφονται στο Σχ. 1, που ακολουθείται από πρότυπες στύπωση Western ανάλυση κυτταρολυμάτων χρησιμοποιώντας τον ειδικό πρωτογενές αντίσωμα έναντι ΝΑΚ. Το επίπεδο έκφρασης του β-ακτίνης αναλύθηκε παράλληλα για τον ποιοτικό έλεγχο. «Έλεγχος», επεξεργασία των κυττάρων με όχημα? «R + P + S», επεξεργασία των κυττάρων με συνδυασμένη χρήση RDEA119, perifosine και SAHA.

Η

Κινητή πρόσληψη ραδιοϊωδίδιο που προκαλείται από την καταστολή της κινάσης ΜΑΡ και ΡΙ3Κ /Akt οδοί και HDAC

με την επίδειξη ισχυρή έκφραση ΝΑΚ σε μη θυρεοειδούς καρκινικά κύτταρα από την καταστολή της ΜΑΡ κινάσης και μονοπάτια PI3K /Akt και HDAC, χρησιμοποιήσαμε Μ14, HepG2 και τα κύτταρα ΜΚΝ-7 για να ελέγξετε την απόλυτη λειτουργική σημασία αυτού του ευρήματος, εξετάζοντας το ικανότητα αυτών των κυττάρων να προσλαμβάνουν ραδιοϊωδίδιο μετά την επαγωγή της ΝΑΚ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, η πρόσληψη ραδιοϊωδίδιο σαφώς επάγεται σε αυτά τα κύτταρα με τη θεραπεία συνδυασμού με RDEA119, perifosine και SAHA. Μεταξύ των τριών κυττάρων, σημειώνονται ραδιοϊωδίδιο πρόσληψη ήταν ιδιαίτερα παρατηρήθηκε στο κύτταρο Μ14, συνεπής με το εύρημα ότι η έκφραση ΝΑΚ και στα δύο επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης ήταν πιο ισχυρή σε αυτό το κελί.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RDEA119, perifosine και SAHA, όπως περιγράφεται στο Σχ. 2, ακολουθούμενη από επώαση με Na

125I για 1 ώρα. Παράλληλες κύτταρα επιπλέον επεξεργασία με τα ΝΑΚ blocker NaClO

4 για την απόκτηση μη-ειδική πρόσληψη ραδιενεργού ιωδίου /δέσμευσης με τα κύτταρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν, λύθηκαν, και μετρήθηκαν για ραδιενέργεια. κυτταρική πρόσληψη ραδιοϊωδίου παρουσιάζεται ως cpm /10

6 κύτταρα (επί του γ-άξονα του σχήματος) μετά τη διόρθωση για την μη-ειδική ραδιενεργό ιώδιο δεσμευτική. Λεπτομερείς πειραματικές διαδικασίες είναι όπως περιγράφονται στο Υλικά και Μέθοδοι. «Έλεγχος», επεξεργασία των κυττάρων με όχημα? «R + P + S», επεξεργασία των κυττάρων με συνδυασμό χρήσης RDEA119, perifosine και SAHA. ** Σε σύγκριση με τον έλεγχο, σ & lt?. 0.01

Η

Ενίσχυση της ακετυλίωση των ιστονών του υποκινητή της NIS από την καταστολή της ΜΑΡ κινάσης και PI3K /Akt μονοπάτια και HDAC

Η ακετυλίωση των ιστονών κατά τη περιοχή προαγωγέα προωθεί την έκφραση του γονιδίου [22]. Για να διερευνηθεί κατά πόσον αυτό ήταν ένας μηχανισμός που εμπλέκεται στην έκφραση των ΝΑΚ που προκαλείται από τις φαρμακευτικές θεραπείες σε μη καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς στην παρούσα μελέτη, έχουμε την επόμενη πραγματοποιήθηκε ανάλυση τσιπ ακετυλίωσης ιστόνης στον υποκινητή ΝΑΚ. Εξετάσαμε τρεις διαφορετικές περιοχές του υποκινητή ΝΑΚ για ιστόνης Η3 και Η4 ακετυλίωση στο M14, HepG2 και τα κύτταρα ΜΚΝ-7. Οι περιοχές αυτές αντιπροσωπεύουν το ελάχιστο απαραίτητο ΝΑΚ υποκινητή [23]. Βρήκαμε ότι η ακετυλίωση της ιστόνης σε αυτές τις περιοχές του προαγωγού ΝΑΚ αυξήθηκε σε διάφορα επίπεδα με επεξεργασία με SAHA σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 4α-γ). θεραπεία συνδυασμού με την ΜΑΡ κινάση και PI3K /Akt μονοπάτια και αναστολείς HDAC αυξήθηκε περαιτέρω ακετυλίωση των ιστονών στον υποκινητή ΝΑΚ. Συνολικά, αυτό ακετυλίωση ιστονών παρατηρήθηκε σε τόσο Η3 και Η4 των τριών κύτταρα εκτός από τα κύτταρα ΜΚΝ-7 στο οποίο δεν παρατηρήθηκε σημαντική μεταβολή ακετυλίωση παρατηρήθηκε σε Η3 (Εικ. 4γ). Όλες οι τρεις περιοχές του ελάχιστου αναγκαίου προαγωγέα ΝΑΚ εμφανίζεται ακετυλίωση ιστονών εκτός από την περιοχή Ρ1 σε κύτταρα Μ14 που δεν έδειξε αλλαγή σε ακετυλίωση Η3 μετά τις θεραπείες φαρμάκου (Εικ. 4α). Μέχρι περίπου 50 πτυχώσεις αύξησης ιστόνης Η4 ακετυλίωση στην περιοχή Ρ2 του υποκινητή ΝΑΚ σε κύτταρα Μ14 (Εικ. 4α) και περίπου 20 πτυχώσεις αύξησης ιστόνης Η4 ακετυλίωση στην περιοχή Ρ1 σε κύτταρα HepG2 (εικ. 4b) ήταν παρατηρηθεί. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ακετυλίωση της ιστόνης είναι ένας μηχανισμός που εμπλέκεται στην έκφραση ΝΑΚ που προκαλείται από την καταστολή της κινάσης ΜΑΡ και τις οδούς ΡΙ3Κ /Akt και HDAC σ ‘αυτές τις μη-θυρεοειδή καρκινικά κύτταρα. κύτταρα Μ14 έδειξε την πιο ισχυρή ακετυλίωση των ιστονών στον υποκινητή ΝΑΚ και τη δεύτερη μεγαλύτερη κύτταρα HepG2. κύτταρα ΜΚΝ-7 εμφανίζεται μια σχετικά μέτρια ακετυλίωση των ιστονών στον υποκινητή ΝΑΚ. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι αυτό το πρότυπο του βαθμού ακετυλίωσης ιστόνης στα τρία κελιά επανέλαβε καλά τα πρότυπα της έκτασης της έκφρασης NIS (Πίνακας 1, Σχ. 2) και η πρόσληψη ραδιοϊωδίου (Εικ. 3) σε αυτά τα κύτταρα, υποστηρίζοντας περαιτέρω ένα σημαντικό ρόλο των ακετυλίωση των ιστονών στην έκφραση ΝΑΚ που προκαλείται από τη στόχευση της ΜΑΡ κινάσης και μονοπάτια PI3K /Akt και HDAC. Αυτό δεν φαίνεται να ισχύει για το κύτταρο T98G οποία έδειξε κάποια ακετυλίωση ιστόνης κάτω από τη θεραπεία με SAHA (Εικ. 1), ενώ δεν υπήρχε καμία αύξηση στην έκφραση ΝΑΚ σε αυτό το κύτταρο (Πίνακας 1). Ωστόσο, αυτό το επίπεδο ακετυλίωσης ιστόνης ήταν ελάχιστη σε σύγκριση με ότι σε πολλά άλλα κύτταρα (Εικ. 1). Ως εκ τούτου, ο συσχετισμός της έκφρασης NIS με ακετυλίωση ιστόνης ήταν συνολικά σαφής σε διάφορα κύτταρα που εξετάστηκαν.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με SAHA μόνη ή SAHA σε συνδυασμό με RDEA119 και perifosine όπως περιγράφεται στο Σχ. 2. Τα επίπεδα ακετυλίωση των ιστονών στις τρεις περιοχές (Ρ1, Ρ2, και Ρ3) που αποτελούν το ελάχιστο βασικό υποκινητή του

NIS

γονίδιο αναλύθηκαν με χρωματίνη ανάλυση ανοσοκαθίζησης (μάρκας) όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. κατάσταση Ακετυλίωση ιστόνης τόσο Η3 και Η4 εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα για chip. Μη ειδικά αντισώματα IgG χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Τα αποτελέσματα για Μ14, HepG2 και τα κύτταρα ΜΚΝ-7 που παρουσιάζονται στα Σχ. 4α, 4β και 4γ, αντίστοιχα. Για κάθε κύτταρο, το άνω πάνελ δείχνει τα πραγματικά αποτελέσματα της PCR επί των θραυσμάτων DNA που λαμβάνονται με ChIP χρησιμοποιώντας μη ειδικό έλεγχο IgG, αντι-ακετυλιωμένο αντίσωμα Η3 (Anti Ac-Η3) ή αντι-ακετυλιωμένο Η4 αντίσωμα (Αντι Ac-H4) . Ταυτόσημα ποσότητες κυτταρολυμάτων προ-ανοσοκαταβύθιση από διαφορετικές συνθήκες αγωγής, χρησιμοποιήθηκαν για να ξεκινήσει η ανοσοκαθίζηση. Ένα κλάσμα του κυτταρικού λύματος πριν από την ανοσοκαταβύθιση χρησιμοποιήθηκε απευθείας για την απομόνωση DNA ως έλεγχος «Εισαγωγής». Τα αποτελέσματα της PCR αντικατοπτρίζουν τα επίπεδα ακετυλίωση των ιστονών. Παρουσιάζονται στο κάτω πλαίσιο για κάθε κύτταρο είναι ένα ιστόγραμμα που δείχνει ποσοτικά τα επίπεδα ακετυλίωσης Η3 και Η4 στις τρεις περιοχές του

NIS

προαγωγού βασίζεται σε πυκνομετρική μετρήσεις του άνω χωρίσματος. Τα αποτελέσματα κανονικοποιούνται διαιρώντας τα αντίστοιχα σήματα εισόδου και παρουσιάζονται ως ο λόγος της ενδεικνυόμενης θεραπείας έναντι του ελέγχου. «Έλεγχος», επεξεργασία των κυττάρων με όχημα? «SAHA», επεξεργασία των κυττάρων με SAHA μόνο? «R + P + S», η θεραπεία των κυττάρων με συνδυασμένη χρήση των RDEA119, perifosine και SAHA.

Η

Συζήτηση

ραδιενεργό ιώδιο κατάλυσης και επικουρική θεραπεία είναι κλασική και τυπική θεραπείες για τον καρκίνο του θυρεοειδούς , η οποία εκμεταλλεύεται το μοναδικό ιωδιούχου-μεταφορά λειτουργία της NIS στο θυρεοειδή κυτταρική μεμβράνη. Λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι η ΝΑΚ είναι επίσης συνήθως εκφράζεται, σε διάφορους βαθμούς, σε αρκετές μη-θυρεοειδή ιστών, στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε

έκφρασης και ραδιενεργό ιώδιο ΝΑΚ

πρόσληψη σε καρκινικά κύτταρα που προέρχονται από μη-θυρεοειδή ιστών με ταυτόχρονη καταστολή η ΜΑΡ κινάσης και μονοπάτια PI3K /Akt και HDAC. Αν και ο ρόλος της κινάσης ΜΑΡ και ΡΙ3Κ /Akt πορείες στην έκφραση της NIS διερευνήθηκε σε μελανώματος σε προηγούμενες μελέτες μας [21], ο ρόλος των HDAC και ακετυλίωση ιστονών στην έκφραση του

NIS

σε μελάνωμα δεν έχει διερευνηθεί. Ως εκ τούτου, περιλαμβάνονται επίσης τα κύτταρα μελανώματος στην παρούσα μελέτη.

Είχαμε τη δυνατότητα να επάγει την έκφραση του NIS, σε διάφορους βαθμούς, σε κύτταρα μελανώματος και ηπατική, γαστρικό, του παχέως εντέρου και καρκινώματος μαστού κύτταρα, αλλά όχι σε μη επιθηλιακά όγκος στον εγκέφαλο που προέρχονται από κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι αυτή η επαγώγιμη έκφραση NIS μπορεί να περιορίζεται σε κύτταρα καρκίνου του δέρματος και καρκινικών κυττάρων των επιθηλιακών κυττάρων. Αυτό είναι ενδιαφέρον ότι συμφωνεί με το πρότυπο κατανομής της φυσιολογικής πρόσληψης ραδιοϊωδίου στους ιστούς του δέρματος (φάση ανάρρωσης του εγκαύματος), του ήπατος, του στομάχου, του παχέος εντέρου, και του μαστού (θηλάζοντα φάση) για την σάρωση σώμα των ασθενών με καρκίνο του θυρεοειδούς μετά από θεραπεία με ραδιενεργό ιώδιο [24 ] – [27]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, δείξαμε επίσης την πρόσληψη ραδιενεργού ιωδίου μετά την επαγωγή της έκφρασης της NIS, σύμφωνα με τη λειτουργικότητα ΝΑΚ σε αυτές τις μη-θυρεοειδούς καρκινικά κύτταρα. Τα δεδομένα μας, επίσης, για πρώτη φορά, έδειξε ότι η αυξημένη ακετυλίωση των ιστονών σε το

NIS

υποστηρικτής ήταν ένας σημαντικός μηχανισμός που εμπλέκεται στην έκφραση της ΝΑΚ σε αυτές τις μη-θυρεοειδούς καρκινικά κύτταρα.

HDAC αναστολέας που προκαλείται έκφραση NIS είχε προηγουμένως καταδειχθεί σε κύτταρα HeLa και, όπως και στην ίδια μελέτη, σε κύτταρα HepG2 [28]. Για να πάρουμε ένα περαιτέρω βήμα, αποδείξαμε πρόσφατα μια συνεργική επίδραση του αναστολέα SAHA HDAC επί της έκφρασης ΝΑΚ που προκαλείται από την καταστολή της κινάσης ΜΑΡ και ΡΙ3Κ /Akt οδούς στον καρκίνο του θυρεοειδούς κυττάρων αν, σε αυτή τη μελέτη, ακετυλίωση ιστονών δεν εξετάστηκε [13]. Στην παρούσα μελέτη, για πρώτη φορά αποδεικνύεται άμεσα ότι η καταστολή της ΜΑΡ κινάσης και PI3K /Akt μονοπάτια αυξημένη ακετυλίωση των ιστονών σε το

ΝΑΚ

υποκινητή ως μηχανισμός για την έκφραση των ΝΑΚ που προκαλείται από ταυτόχρονη στόχευση του δύο μονοπάτια και HDAC σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα.

Επίδειξη της έκφρασης NIS και στα δύο επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης, καθώς και την πρόσληψη ραδιοϊωδίδιο σε αυτά τα κύτταρα καθιέρωσε την λειτουργική σημασία της επαγώγιμης έκφρασης του

NIS

γονίδιο σε αυτά τα μη-καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς. Το επίπεδο της επαγόμενης έκφρασης ΝΑΚ ποικίλλει μεταξύ των κυττάρων που εξετάστηκαν, με κύτταρο μελανώματος Μ14, ηπατικό κύτταρο καρκίνωμα HepG2, και γαστρικού κυττάρων καρκινώματος ΜΚΝ-7 που δείχνει την πιο ισχυρή έκφραση της NIS, γεγονός που υποδηλώνει ότι η έκφραση ΝΑΚ και η πρόσληψη ραδιενεργού ιωδίου μπορεί να προκληθεί κατά προτίμηση σε ορισμένες ειδικές περιπτώσεις αυτών των καρκίνων για ασαφείς λόγους. Πρόσθετοι παράγοντες που ενδέχεται να υπάρχουν ότι καθορίζουν την ικανότητα επαγωγής της έκφρασης NIS σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα, όπως αποδεικνύεται και από την κατάσταση υποδοχέα οιστρογόνου που καθορίζει την ικανότητα επαγωγής της έκφρασης NIS από όλα-trans ρετινοϊκού οξέος σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [29]. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης έχουν σημαντικές κλινικές επιπτώσεις. Μελάνωμα, ηπατικό καρκίνωμα, και γαστρικό καρκίνωμα είναι κοινά ανθρώπινους καρκίνους, όλα με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας, ιδιαίτερα σε μεταστατικό και προχωρημένες περιπτώσεις. Καθώς οι τελευταίες περιπτώσεις είναι συνήθως χειρουργικά εκτός λειτουργίας, νέες αποτελεσματικές ιατρικές θεραπείες είναι σήμερα επιτακτική ανάγκη. Με την ικανότητα επαγωγής της έκφρασης NIS και η πρόσληψη ραδιενεργού ιωδίου σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα αποδεικνύεται στην παρούσα μελέτη, μπορεί να είναι δυνατό για τη θεραπεία αυτών των καρκίνων χρησιμοποιώντας συμπλήρωμα ραδιοϊωδίου όπως στην θεραπεία για τον καρκίνο του θυρεοειδούς. Το γεγονός ότι η έκφραση επάγεται NIS ήταν ιδιαίτερα ισχυρή σε μερικές κυτταρικές γραμμές αλλά όχι άλλα που λαμβάνονται από αυτούς τους καρκίνους υποδηλώνει ότι αυτή η θεραπεία με ραδιενεργό ιώδιο μπορεί να είναι αποτελεσματική σε μια υποομάδα ασθενών με αυτούς τους καρκίνους.

Οι θεραπευτικοί παράγοντες που στοχεύουν σημαντικές οδούς σηματοδότησης, όπως αναστολείς ΜΕΚ και BRAF για την οδό της ΜΑΡ κινάσης και αναστολείς Akt και mTOR για την ΡΙ3Κ /Akt μονοπατιού, καθώς και ως αναστολείς HDAC, αναπτύσσονται σήμερα ενεργά κλινικώς [30] – [33]. Πολλοί από αυτούς έχουν δείξει ισχυρή θεραπευτικό δυναμικό σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους και μερικοί έχουν εγκριθεί για κλινική χρήση. Επομένως, είναι κλινικά δυνατή η χρήση αυτών των αναστολέων με στόχο την κινάση ΜΑΡ και μονοπάτια PI3K /Akt και μερικά από αυτά σε συνδυασμό με την καταστολή διπλή τις δύο οδούς για να προκαλέσει την έκφραση ΝΑΚ. Ο αναστολέας HDAC SAHA, η οποία έχει επίσης εγκριθεί για τη θεραπεία ορισμένων καρκίνων [34], μπορούν να συμπεριληφθούν σε αυτή την θεραπεία συνδυασμού φαρμάκων για την ενίσχυση της έκφρασης ΝΑΚ για θεραπεία με ραδιενεργό ιώδιο καρκίνων. Δεδομένου ότι αυτά τα φάρμακα είναι καθαυτά θεραπευτικά με απευθείας αναστολή ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων, η χρήση τους σε συνδυασμό με τη χρήση ραδιενεργού ιωδίου για περαιτέρω σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να κάνει την επεξεργασία ακόμη περισσότερο αποτελεσματική χημειοθεραπεία. Αυτό μπορεί να αποδειχθεί μία νέα και ιδιαίτερα αποτελεσματική θεραπευτική στρατηγική για το μελάνωμα και καρκινώματα του ήπατος και γαστρεντερικό σύστημα. Αυτό είναι τεχνικά εύκολο στρατηγική της χρησιμοποιώντας κλινικά αποδεδειγμένη φάρμακα για να προκαλέσει την έκφραση ΝΑΚ και η πρόσληψη ραδιενεργού ιωδίου σε μη θυρεοειδούς καρκινικά κύτταρα, αν επιβεβαιωθεί ότι είναι αποτελεσματικές σε μελλοντικές μελέτες, θα μπορούσε να αποδειχθεί ανώτερη έκφραση ΝΑΚ επιτυγχάνεται με μεταφορά γονιδίων προσεγγίσεις, δεδομένου ότι μπορεί να αποφύγει ορισμένες ασφάλεια, η ειδικότητα, η αποτελεσματικότητα, και τα τεχνικά ζητήματα πολυπλοκότητας που σχετίζονται με την ευρέως διερευνηθεί πλασμίδια ή ιός μεσολάβηση όργανο στόχευσης γονιδιακή μεταφορά ΝΑΚ [4], [14].

Είναι ενδιαφέρον ότι προηγούμενες μελέτες έδειξαν μια βασική έκφραση γονίδια του θυρεοειδούς στα κύτταρα του δέρματος και κύτταρα μελανώματος [35], [36]. Αυτό παρέχει μια βάση για το σθένος που προκαλείται από την έκφραση των γονιδίων του θυρεοειδούς και η πρόσληψη ραδιενεργού ιωδίου σε κύτταρα μελανώματος με τη στόχευση της ΜΑΡ κινάσης και μονοπάτια PI3K /Akt και HDAC στην παρούσα και τις προηγούμενες μελέτες μας [21]. Είναι επίσης δυνατό, αλλά απομένει να ερευνηθεί ότι μια χαμηλή βασική κατάσταση της έκφρασης των γονιδίων του θυρεοειδούς υπάρχει παρόμοια σε ασθενείς με ηπατική και γαστρικά καρκινώματα και άλλους καρκίνους που εξετάστηκαν στην παρούσα μελέτη που γίνεται δυναμικά ενεργό κατά την καταστολή των μεγάλων οδών σηματοδότησης.

Συνοψίζοντας, η παρούσα μελέτη, για πρώτη φορά καταδεικνύει ισχυρή έκφραση NIS και η πρόσληψη ραδιενεργού ιωδίου σε αρκετές μη θυρεοειδούς καρκινικών κυττάρων με ταυτόχρονη στόχευση της ΜΑΡ κινάσης και μονοπάτια PI3K /Akt και HDAC χρήση των αναστολέων τους. Όπως πολλοί από αυτούς τους αναστολείς έχουν ήδη αποδειχθεί ότι είναι κλινικά εφικτή και πολλά υποσχόμενη στην αναστολή διαφόρων καρκίνων, η χρήση τους να επάγουν επίσης την έκφραση ΝΑΚ για επικουρική θεραπεία με ραδιενεργό ιώδιο εκτός από την άμεση αναστολή τους των καρκινικών κυττάρων μπορεί να αποδειχθεί ότι είναι μία νέα και αποτελεσματική θεραπευτική στρατηγική για επιλεγμένες μη-θυρεοειδή καρκίνους.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του

Δεκατρείς ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, συμπεριλαμβανομένου του μελανώματος κύτταρα Μ14, UACC- 62 και Α375? κύτταρα ηπατικό καρκίνωμα HepG2 και SK-Hep-1? κύτταρα γαστρικού καρκινώματος ΜΚΝ-7 και NUGC-4? κύτταρα καρκινώματος του κόλου ΗΤ-29 και RKO? κύτταρα καρκινώματος μαστού ΒΤ-20 και MDA-MB-231? γλοιοβλαστώματος κυτταρική T98G? και αστροκύτωμα κυττάρων SNB-78. Αυτά τα κύτταρα από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και ΝΟΙ-Frederick Cancer DCTD Όγκων /Κυτταρική Γραμμή Repository (Frederick, MD). M14, UACC-62, ΜΚΝ-7, NUGC-4 και SNB-78 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Mediatech, Inc., Manassas, VA) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA). RKO, ΒΤ-20, MDA-MB-231, HepG2, SK-Hep-1, και T98G κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Eagle του Minimum Essential Medium (ATCC, Manassas, VA) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Τα κύτταρα ΗΤ-29 καλλιεργήθηκαν σε 5a μέσο McCoy (ATCC, Manassas, VA) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Τα κύτταρα Α375 καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ATCC, Manassas, VA) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2.

Υπό αυτές τις συνθήκες καλλιέργειας, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία, όπου υποδεικνύεται, με τη RDEA119 αναστολέα ΜΕΚ, το perifosine αναστολέα Akt, και το HDAC αναστολέα SAHA μεμονωμένα ή σε συνδυασμούς. DMSO και PBS χρησιμοποιήθηκαν παράλληλα ως έλεγχος του οχήματος.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA με πρότυπο αναστολείς πρωτεάσης (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) και η τυπική κηλίδωση Western αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37] χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων αντι-φωσφο-ΕΚΚ, αντι-φωσφο-Ακί, αντι-Ac-ιστόνης Η3, ή αντι-ακτίνης (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)? αντι-Ac-Η4 ιστόνης (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ)? ή αντι-NIS αντισώματα (Millipore Corp., Billerica, ΜΑ).

εκχύλιση RNA και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Μετά από θεραπεία 30 ωρών των κυττάρων με τις υποδεικνυόμενες αναστολείς, ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τρία μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας ολιγο-dT εκκινητές και εκθέτη III RT (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου προσχηματίστηκε να αναλυθεί η έκφραση του

NIS

γονίδιο χρησιμοποιώντας iTaq SYBR Green Supermix με ROX (Bio-Rad, Hercules, CA) σε ένα σύστημα ΑΒΙ 7900HT PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA). β-ακτίνη διεξήχθη παράλληλα με την τυποποίηση του cDNA εισόδου. Οι εκκινητές που σχεδιάστηκαν για

ΝΑΚ

και

β-ακτίνης

γονίδια και οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης του

ΝΑΚ

ήταν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13].

ραδιενεργό πρόσληψη ιωδιούχου δοκιμασία

Η δοκιμασία πρόσληψης ιωδιούχο ραδιενεργό διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Εν συντομία, μετά από μια θεραπεία 30 ώρες με τις υποδεικνυόμενες αναστολείς, τα κύτταρα επωάστηκαν με 1 μθί Na

125I και 5 μΜ μη ραδιενεργού NaI σε 2 ml μέσου σε πλάκες 6-φρεατίων στους 37 ° C για 1 ώρα. Για τον προσδιορισμό της NIS-ειδική πρόσληψη, παράλληλο κύτταρα παρομοίως σε επεξεργασία με τους αναστολείς επιπροσθέτως σε κατεργασία με 200 μΜ NaClO

4 για 30 λεπτά πριν από τη θεραπεία Na

125Ι. Το μέσο αναρροφήθηκε και τα κύτταρα πλένονται γρήγορα τρεις φορές με ισορροπημένο διάλυμα άλατος Hank (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη και λύθηκαν με 1 ml 0,33 Μ ΝαΟΗ. Παράλληλες πλάκες των κυττάρων πανομοιότυπα αγωγή με τους αναστολείς, αλλά χωρίς ραδιενεργού ιωδίου επώασης χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό του αριθμού των κυττάρων στο τέλος του πειράματος. Η ραδιενέργεια που συνδέεται με τα κύτταρα μετρήθηκε με ένα μετρητή γάμα και παρουσιάζονται ως cpm /10

6 κύτταρα μετά από διόρθωση για μη ειδική σύνδεση ραδιοϊωδίδιο των κυττάρων με την παρουσία NaClO

4.

χρωματίνης ανοσοκαθίζηση (chip) θα δοκιμασία

δοκιμασία ChIP πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το EZ-Magna ένα τσιπ σετ (Millipore Corp., Billerica, ΜΑ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, μετά φαρμακευτικές αγωγές, 1 × 10

7 κύτταρα με σταυροειδείς δεσμούς με 37% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από επώαση με το διάλυμα γλυκίνης που παρέχονται στο κιτ για 5 λεπτά. Μετά από 2 πλύσεις με PBS, τα κύτταρα λύθηκαν και επεξεργασία με υπερήχους 12 φορές επί 10 δευτερόλεπτα σε 20% της ισχύος του παλμού χρησιμοποιώντας τον Sonifier διάσπασης κυττάρων Model Micros-150D (Branson, Danbury, CT). Η διασυνδεδεμένη πρωτεΐνη /DNA ακολούθως επωάζεται όλη τη νύκτα με αντι-ακετυλιωμένης ιστόνης Η3, αντισώματα αντι-ακετυλιωμένης ιστόνης Η4 ή τον έλεγχο μη ειδικής IgG, και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας σφαιρίδια πρωτεΐνης Α. Μετά από πλύσιμο με τα ρυθμιστικά στο κιτ με τη σειρά ανά παρεχόμενων πρωτόκολλο, σφαιρίδια πρωτεΐνης Α με πρωτεΐνη /σύμπλοκα DNA επωάστηκαν με πρωτεϊνάση Κ στους 62 ° C για 2 ώρες με ανάδευση. θραύσματα DNA διαχωρίστηκαν στη συνέχεια με φυγοκέντρηση και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας στήλες περιστροφής. Τρία ζεύγη πριμοδοτών που καλύπτουν το ελάχιστο βασικό περιοχή υποκινητή του γονιδίου ΝΑΚ χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Τυπική τελικό σημείο PCR διεξήχθη ως εξής: μετά από 3 λεπτά μετουσίωσης στους 95 ° C, το μίγμα της αντίδρασης τρέξει για 32 κύκλους στους 94 ° C, 60 ° C, και 72 ° C ° το καθένα για 30 δευτερόλεπτα, που ακολουθείται από μια επιμήκυνση κατά 72 ° C για 8 λεπτά (για τα τρία ζεύγη των εκκινητών).

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ είναι εκπρόσωποι των τουλάχιστον δύο παρόμοια πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν ή τριπλούν. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν από

t

δοκιμασία και ένα

P

αξία μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε σημαντική.