Αφηρημένο

Η αγγειογένεση λαμβάνει χώρα κατά την ανάπτυξη των ιστών, την ανάπτυξη και την επούλωση των πληγών. Είναι επίσης αναγκαία για την εξέλιξη του όγκου και αντιπροσωπεύει μια ορθολογική στόχο για θεραπευτική παρέμβαση. ΚΤΜ-T-BMX-OS01 (BMX), που προέρχεται από την ημισύνθεση του osthole, ένα ενεργό συστατικό που απομονώνεται από κινεζικό χορτάρι

Cnidium monnieri

(L.) Cuss., Δείχθηκε πρόσφατα για την ενίσχυση της μάθησης και της μνήμης σε αρουραίους . Σε αυτή τη μελέτη, η οποία χαρακτηρίζεται Η αντι-αγγειογενετική δραστηριότητα του ΝΒΜ-Τ-ΒΜΧ-OS01 (ΒΜΧ), σε μια προσπάθεια για την ανάπτυξη νέων αναστολέων για την καταστολή της αγγειογένεσης και ανάπτυξης όγκου. ΒΜΧ ανέστειλε αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) επαγόμενη πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τον σχηματισμό ενδοθηλιακών σωλήνων σε ανθρώπινα ομφάλια ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVECs). BMX επίσης εξασθενημένος επαγόμενη από VEGF μικροαγγειακή βλάστησης από αορτικών δακτυλίων

ex vivo

και του καρκίνου μειώνεται HCT116 παχέος κυττάρων που προκαλείται από αγγειογένεση

in vivo

. Επιπλέον, ΒΜΧ ανέστειλε την φωσφορυλίωση του VEGFR2, FAK, Akt και ERK σε HUVECs που εκτίθενται σε VEGF. ΒΜΧ αποδείχθηκε επίσης ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCT116 και να καταστείλουν την ανάπτυξη των υποδόρια ξενομοσχεύματα κυττάρων HCT116

in vivo

. Στο σύνολό τους, η μελέτη αυτή αποδεικνύει ότι ΒΜΧ διαμορφώνει αγγειακή αναδιαμόρφωση των ενδοθηλιακών κυττάρων και οδηγεί στην αναστολή της αγγειογένεσης του όγκου. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν επίσης τον ρόλο των BMX ως πιθανό υποψήφιο φάρμακο και εγγυάται την κλινική ανάπτυξη στη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Yang ΗΥ, Hsu YF, Chiu PT, Ho SJ, Wang CH, Chi CC, et al. (2013) Αντικαρκινική δράση του παραγώγου Osthole, ΚΤΜ-Τ-BMX-OS01: Στόχευση αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα σηματοδότησης υποδοχέων και την αγγειογένεση. PLoS ONE 8 (11): e81592. doi: 10.1371 /journal.pone.0081592

Επιμέλεια: Masuko Ushio-Fukai, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5, Ιούν, 2013? Αποδεκτές: 15 του Οκτώβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 27 Νοεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο της Ταϊβάν [NSC98-2320-B-038-007]? χορηγούν [99TMU-WFH-02-4] από την Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο-Wan Fang Νοσοκομείο, Ταϊπέι, Ταϊβάν? και χορηγεί [LSH-2012-04] από το Landseed Νοσοκομείο, Taoyuan, Ταϊβάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. NatureWise Biotech & amp? Ιατρικές εξετάσεις Corporation είναι ο κύριος του έργου και κάτοχος του διπλώματος ευρεσιτεχνίας για BMX και των παραγώγων του σε διάφορες χώρες. όνομα Ευρεσιτεχνίας: κινναμωμικό ενώσεις και τα παράγωγα από αυτά για την αναστολή της αποακετυλάσης ιστόνης. αριθμός διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας: US7994357. Shiau-Jing Ho, Chi-Han Wang, Chih-Chin Chi, Cheng-Feng Lee και Ying-Shiuan Λι απασχολούνται από NatureWise Biotech & amp? Ιατρικές εξετάσεις Corporation. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Η αγγειογένεση είναι μια πολύπλοκη διαδικασία με την οποία τα νέα τα σκάφη που σχηματίζονται από προϋπάρχουσες αγγειακό σύστημα. Συμβάλλει όχι μόνο σε διάφορες φυσιολογικές διαδικασίες, αλλά επίσης παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της νόσου, μεταστατική εξάπλωση όγκων [1] – [3]. Όγκου αγγείωση συνήθως συσχετίζεται με κακή έκβαση. Tumor-κίνησε αγγειογένεση έχει έτσι ήταν ένας ελκυστικός στόχος για την ανάπτυξη των αντι-καρκινικών θεραπειών [4]. Κατά την αρχική άσηπτη την ανάπτυξη του όγκου, τα καρκινικά κύτταρα ξεπεράσει τον περιορισμό της απόστασης διάχυσης σε κοντινά αιμοφόρα αγγεία και να γίνει υποξικό. Η ισορροπία μεταξύ αγγειογενετική και αντι-αγγειογενετική σηματοδότηση μετατοπίζεται προς σχηματισμό αιμοφόρων αγγείων [5]. Αυτή η αγγειογενετική διακόπτη στη συνέχεια, ενεργοποιεί μια σειρά από γονίδιο μεταγραφές και εκκινεί την αγγειογένεση [6]. Πολυάριθμες αγγειογόνοι παράγοντες συμπεριλαμβανομένων αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) [7], βασικός αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών (bFGF) [8], [9], του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) και αγγειοποιητίνη [10] έχουν ενοχοποιηθεί στην αγγειογένεση των όγκων. Μεταξύ αυτών των αγγειογενετικών ρυθμιστές, VEGF-A, ένα μέλος της οικογένειας του VEGF, είναι η πιο κρίσιμη και ειδική μεσολαβητή που προάγει την αγγειογένεση [11], [12]. VEGF-A απαιτούνται για την χημειόταξη και διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών πρόδρομων κυττάρων, πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, αγγειογένεση και αγγειογόνων αναδιαμόρφωση [13]. Οι κυτταρικές αποκρίσεις σε VEGF-A διαμεσολαβείται από την κινάση τυροσίνης υποδοχέα VEGFR2 (επίσης γνωστή ως ΚΟΚ ή Flk-1) επί της επιφανείας των ενδοθηλιακών κυττάρων [14]. Η ενεργοποίηση του VEGFR2 ενεργοποιεί τις εν σειρά σηματοδότησης συμπεριλαμβανομένων των εξωκυτταρικών κινάση σήματος ρυθμιζόμενη (ΕΚΚ), Akt (επίσης γνωστό ως πρωτεϊνική κινάση Β), κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ) και κινάσες Src οικογένειας [15]. Η οδός σηματοδότησης Akt ρυθμίζει μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων, πολλαπλασιασμό και την απόπτωση [16]. ERK οδός ενεργοποιείται από VEGF έχει εμπλακεί σε διάφορες κυτταρικές δραστηριότητες όπως πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, κυτταρική κινητικότητα και την επιβίωση [17]. FAK συμβάλλει επίσης στην κακοήθεια όγκων [18]. Για τους λόγους αυτούς, ο VEGF και VEGFR2 αναγνωρίζονται ως ελκυστικοί στόχοι για θεραπευτική παρέμβαση του καρκίνου [19]. Πολλές στρατηγικές για την αναστολή της σηματοδότησης VEGF αξιολογούνται επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές. Αυτά περιλαμβάνουν διαλυτούς υποδοχείς που απομονώνουν VEGF [20], τα αντισώματα που στοχεύουν τον VEGF ή VEGFR [21], και μικρού μορίου αναστολείς VEGFR2 [22]. Επιπλέον, ορισμένοι αναστολείς μικρού μορίου όπως το sorafenib και sunitinib έχουν ήδη εγκριθεί από τις Ηνωμένες Πολιτείες Τροφίμων και Φαρμάκων για τη θεραπεία συγκεκριμένων τύπων καρκίνου [23].

Cnidium monnieri

(L. ) Cuss. έχει από καιρό χρησιμοποιείται ευρέως στην ασιατική ιατρική για τη βελτίωση της ασυλίας και την ανακούφιση της ηπατίτιδας. Osthole, ένα βιοδραστικό συστατικό που εξάγεται από τους σπόρους του

Cnidium monnieri

(L.) Cuss., Έτσι αναμένεται να έχει ανοσορυθμιστικές δραστηριότητες. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν επίσης ότι osthole κατέχει νευροπροστατευτική [24], το συκώτι [25], αντι-διαβητικό [26], και αντικαρκινικές δραστηριότητες [27], [28]. ευρύ φάσμα Δεδομένης osthole των βιολογικών δραστηριοτήτων, φαίνεται να είναι μια πολλά υποσχόμενη ένωση μολύβδου για την ανακάλυψη φαρμάκων. Πρόσφατα, ΝΒΜ-T-ΒΜΧ-OS01 (ΒΜΧ) (Σχ. 1), ένα παράγωγο ημισυντεθούν από osthole, ταυτοποιήθηκε ως ένας ισχυρός αναστολέας αποακετυλάσης ιστόνης και δείχθηκε την ενίσχυση της μάθησης και της μνήμης σε αρουραίους [29]. Σε μια προσπάθεια να ανακαλύψουν αναστολείς της αγγειογένεσης των όγκων, που έτσι αξιολογούνται τα αντι-αγγειογενετική ιδιότητες του BMX. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι ΒΜΧ ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό που επάγεται από VEGF κυττάρου, μετανάστευση, και το σχηματισμό σωλήνα σε ανθρώπινα ομφάλια ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVECs). φωσφορυλίωση επαγόμενη από VEGF του VEGFR2, Src, ERK, Akt και ΡΑΚ επίσης κατέστειλε σε HUVECs που εκτίθενται σε BMX. Με τη χρήση του HCT116 ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα μοντέλο ξενομοσχεύματος αγγειογένεση, ΒΜΧ δείχθηκε περαιτέρω για την καταστολή που σχετίζονται με όγκους αγγειογένεση. Επιπλέον, ΒΜΧ ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό HCT116 ορθοκολικό καρκίνο των κυττάρων και κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν το δυναμικό της ΒΜΧ ως θεραπευτικού παράγοντα με διπλή δραστικότητα έναντι τόσο του πολλαπλασιασμού των όγκων και την αγγειογένεση.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

3 – [4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ] -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ), τολουϊδίνης μπλε Ο, και μέσον McCoy5A ήταν από την Sigma (St Louis, ΜΟ). Μέσο 199 (Μ199), ορό εμβρύου μόσχου (FBS), και όλα τα αντιδραστήρια κυτταρικής καλλιέργειας αγοράσθηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Αντισώματα έναντι CDK4, VEGFR2, VEGFR2 φωσφορυλιώνεται σε τυροσίνη 1175 (Y1175), VEGFR2 φωσφορυλιώνεται σε τυροσίνη 1214 (Y1214), ERK1 /2, ERK1 /2 φωσφορυλιώνεται σε θρεονίνη 202 /τυροσίνη 204 (T202 /Y204), Akt, Akt φωσφορυλιώνεται στη σερίνη 473 (S473), FAK και ΡΑΚ φωσφορυλιωμένο στο τυροσίνης 397 (Y397), Src και Src φωσφορυλιωμένο στο τυροσίνης 416 (Y416) αγοράστηκαν από την Cell Signaling (Danvers, ΜΑ). Αντισώματα ειδικά για ρ21 αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Αντισώματα έναντι GAPDH, α-τουμπουλίνης, survivin και cyclinD1 και αντι-ποντικού IgG και αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αντι-κουνελιού αγοράστηκαν από GeneTex Inc (Irvine, CA). Η ενισχυμένη κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας ήταν από την GE Healthcare (Μικρή Chalfont, UK). Κυτταρικού πολλαπλασιασμού κιτ προσδιορισμού ELISA, BrdU αποκτήθηκε από τη Roche (Indianapolis, IN). Όλα τα υλικά για ανοσοαποτύπωση αγοράστηκαν από την GE Healthcare (Μικρή Chalfont, UK). Όλα τα άλλα χημικά ελήφθησαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ).

ΚΤΜ-T-BMX-OS01 (BMX)

BMX, (

E

) -2 – (4-μεθοξυβενζυλοξυ) -3-πρενυλ-4-μεθοξυ

Ν

-hydroxycinamide, δόθηκε από NatureWise Biotech & amp? Ιατρικές εξετάσεις Corporation (Ταϊπέι, Ταϊβάν), και καθαρότητες τους (& gt? 99%) επιβεβαιώθηκαν με

ανάλυση 1Η-NMR και HPLC.

1Η NMR φάσματα καταγράφηκαν σε φασματόμετρο Bruker Avance DRX-500 ΜΗζ μετασχηματισμού Fourier σε θερμοκρασία δωματίου.

1Η NMR (DMSO

d

6

, 500 MHz) δ: 7,70 (1Η, d,

J

= 16.0 Hz), 7.46 (1Η, d,

J

= 8,5 Hz), 7,40 (2Η, d,

J

= 8,5 Hz), 6,97 (2Η, d,

J

= 8,5 Hz), 6,87 (1Η , d,

J

= 8,5 Hz), 6,38 (1Η, d,

J

= 16.0 Hz), 5.11 – 5.5 (1Η, m), 4.65 (2Η, s), 3,82 (3Η, s), 3,78 (3Η, s), 3.28 (2Η, d,

J

= 7,0 Hz), 1,64 (3Η, s), 1,60 (3Η, s). Πρωκτικός. HPLC

t

R = 9,57 min (καθαρότητα 99,3%). Αναλυτική HPLC καθαρότητα υν εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα JASCO LC-2000Plus και την ακόλουθη μέθοδο. Για τη μέθοδο στα 210 nm, μία Phenomenex Luna 5 μm, 250 mm × 4,60 mm C18 (2) στήλη χρησιμοποιήθηκε με ταχύτητα ροής 1.0 mL /min και μία κινητή φάση μεθανόλης /νερού (ν /ν = 80:20 ) πάνω από 30 λεπτά.

ηθική δήλωση

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Τα πρωτόκολλα όπως περιγράφεται παρακάτω εγκρίθηκαν από την Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο Εργαστήριο Φροντίδα Ζώων και Επιτροπή Χρήσης (Αριθμός Άδειας: LAC-100 – 0097). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγινε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο ομφάλιου αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVEC) ελήφθησαν από τη Συλλογή Bioresource και Ερευνητικό Κέντρο ( Hsinchu, Ταϊβάν). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο Μ199 που περιέχει αγγειακό συμπλήρωμα ανάπτυξης ενδοθηλιακών κυττάρων (ECGS) (Millipore), 10% FBS, 5 U /ml ηπαρίνης, 20 mM HEPES, 100 U /ml πενικιλλίνης G, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε μία υγροποιημένη 37 ° C επωαστήρα. HCT116 ορθοκολικού καρκίνου κυτταρική γραμμή λήφθηκε από τη Συλλογή Bioresource και Research Center (Hsinchu, Ταϊβάν). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε McCoy5A που περιέχει 10% FBS, 100 U /ml πενικιλλίνης G, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε υγροποιημένο επωαστή 37 ° C.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με την χρωματομετρική δοκιμασία 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ) όπως περιγράφεται προηγουμένως [30].

Γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) προσδιορισμό απελευθέρωσης

διαρροή LDH μετρήθηκε να ποσοτικοποιηθεί κυτταροτοξικότητα με κιτ CytoTox96 μη ραδιενεργή δοκιμασία κυτοτοξικότητας (Promega). Τα υπερκείμενα καλλιέργειας αναλύθηκαν με βάση τις κατευθυντήριες γραμμές του κατασκευαστή. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm σε έναν αναγνώστη μικροπλάκας. Το ρυθμιστικό διάλυμα λύσεως προστίθεται για 10 λεπτά χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για την πλήρη κυτταρικής νέκρωσης. Τα δεδομένα στη συνέχεια υπολογίζεται ως το ποσοστό της λύσης ομάδα ρυθμιστικού φάρμακο.

Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού κυττάρων (δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU)

HUVECs (2 × 10

4 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 96 -Καλά πλάκες ιστοκαλλιέργειας και επωάστηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πέθαναν σε μέσο Μ199 που περιέχει 2% FBS απουσία συμπληρωμάτων ανάπτυξης ενδοθηλιακών κυττάρων για άλλες 16 ώρες. Μετά ασιτία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προ-θεραπεία για 30 λεπτά με διάφορες συγκεντρώσεις ΒΜΧ, που ακολουθείται από την διέγερση με VEGF (20 ng /ml) για άλλες 24 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ELISA, BrdU (χρωματομετρική) κιτ (Roche) με βάση την χρωματομετρική ανίχνευση της ενσωμάτωσης BrdU, ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

HUVECs στερήθηκαν τροφής με 2% FBS Μ199 απουσία συμπληρωμάτων ανάπτυξης ενδοθηλιακών κυττάρων για 16 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με ΒΜΧ σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 30 λεπτά ακολουθούμενη από την κατεργασία με VEGF (20 ng /ml) για άλλες 24 ώρες. Στο τέλος των πειραμάτων, αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και την επισήμανση αννεξίνη V-FITC όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Η διπλή σήμανση πραγματοποιήθηκε στους 37 ° C με κατεργασία κυττάρων με ΡΙ (50 μg /ml) και αννεξίνη V-FITC (2 μg /ml) για 15 λεπτά στο σκοτάδι.

πληγών δοκιμασία μετανάστευσης μηδέν

Μετά την ασιτία σε μέσο Μ199 που περιέχει 2% FBS για 16 ώρες, HUVECs μονοστιβάδα τραυματίστηκαν από το ξύσιμο με ρύγχη πιπετών και πλένονται με PBS. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις του ΒΜΧ απουσία ή παρουσία VEGF (20 ng /mL) για άλλες 16 ώρες. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή σε 0 ώρες και 16 ώρες μετά την αγωγή VEGF. Ο ρυθμός της κυτταρικής μετανάστευσης προσδιορίστηκε με μέτρηση του αριθμού των κυττάρων που μετανάστευσαν κάτω από μικροσκόπιο ανεστραμμένης φάσης αντίθεσης (Nikon, Ιαπωνία).

Transwell δοκιμασία εισβολής

δοκιμασία μετανάστευση έγινε όπως περιγράφεται προηγουμένως [32 ]. Εν συντομία, η όψη του πυθμένα του φίλτρου στην πλάκα transwell (Corning, ΝΥ, USA) επικαλύφθηκε με 0,2% ζελατίνη. Οι κάτω θάλαμοι πληρώθηκαν με μέσο Μ199 που περιέχει 2% FBS με την παρουσία VEGF (20 ng /ml) και HUVECs (10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο) σε 200 μικρόλιτρα μέσου Μ199 (χωρίς αυξητικούς παράγοντες) σπάρθηκαν στην κορυφή θαλάμους. Η κορυφή του θαλάμου περιείχε φορέα ή διάφορες συγκεντρώσεις του ΒΜΧ. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 16 ώρες. Μη μετεγκατάσταση κυττάρων (στην άνω πλευρά του φίλτρου) ξύστηκαν με μια μπατονέτα, και μετανάστευσαν κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 0,5% μπλε τολουϊδίνης σε 4% παραφορμαλδεΰδη. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν και ποσοτικά με μέτρηση του αριθμού των χρωματισμένων κυττάρων κάτω από μικροσκόπιο ανεστραμμένης φάσης αντίθεσης (Nikon, Ιαπωνία).

Matrigel του σχηματισμού σωλήνα προσδιορισμού

Η δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [32]. Matrigel, μια μήτρα βασικής μεμβράνης (Becton Dickinson, Mountain View, CA), πολυμερίζεται στους 37 ° C για 30 λεπτά. HUVECs αιωρούμενα σε μέσο Μ199 που περιέχει 2% FBS παρουσία ή απουσία του VEGF (20 ng /ml) σπάρθηκαν επί του Matrigel. Αυτά στη συνέχεια κατεργάστηκαν με όχημα ή ΒΜΧ στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Μετά από 16 ώρες, τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία αντίθεσης φάσης.

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

αναλύσεις ανοσοστυπώματος διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν σε ένα ρυθμιστικό εκχύλισης που περιέχει 10 mM Tris (ρΗ 7.0), 140 mM NaCl, 2 mM PMSF, 5 mM DTT, 0,5% ΝΡ-40, 0,05 mM πεπστατίνη Α, και 0,2 mM λευπεπτίνη. Δείγματα ίσες ποσότητες πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη NC που μετά επωάστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα TBST που περιείχε 5% άπαχο γάλα. Οι πρωτεΐνες έγιναν ορατές με επώαση με ειδικά πρωτογενή αντισώματα που ακολουθείται από συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερογενή αντισώματα. Η ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε με βάση ενισχυμένης χημειοφωταύγειας σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ποσοτικά δεδομένα λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα υπολογιστικό πυκνόμετρο με ένα σύστημα επιστημονικής απεικόνισης (Biospectrum AC System, UVP).

αορτικού δακτυλίου βλάστησης δοκιμασία

Δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Αορτικό τόξο αποκόπηκε από 8 έως 10 εβδομάδων αρουραίους Sprague-Dawley. Μετά την αφαίρεση των γύρω ινο-λιπώδη ιστό και καλά ξέπλυμα με μέσο καλλιέργειας Μ199, οι αορτές κόπηκαν σε 1 τμήματα mm δαχτυλίδι. Οι αορτικών δακτυλίων βυθίστηκαν σε Matrigel στα φρεάτια της πλάκας 48 φρεατίων. VEGF (20 ng /ml) με ή χωρίς ΒΜΧ στη συνέχεια προστέθηκε στα φρεάτια. Οι αορτικούς δακτυλίους καλλιεργήθηκαν σε 37 ° C με 5% CO

2 και το καλλιεργημένο μέσο αλλάχθηκε κάθε 3 ημέρες. Καλλιέργεια λαχανάκια των ενδοθηλιακών κυττάρων παρατηρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν κατά την ημέρα 8. Οι εικόνες φωτογραφήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο, και βλάστησης περιοχή προσδιορίστηκε για τις εικόνες υπολογιστή-ψηφιοποιημένο με το Image-Pro Plus (Media Cybernetics) λογισμικού. Η ανάλυση της βλάστησης περιοχή έγινε από έναν παρατηρητή που τυφλώθηκε στην ομάδα θεραπείας. Όλα τα πρωτόκολλα έχουν εγκριθεί από το Εργαστήριο Ζώων Φροντίδα και Χρήση Επιτροπή Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

όγκου των κυττάρων που προκαλείται από αγγειογένεση Matrigel δοκιμασία βύσμα

3-5 εβδομάδων nude

nu /nu ποντίκια ήταν λαμβάνεται από BioLasco (Ταϊπέι, Ταϊβάν) και στεγάζεται σε καθαρό ελεύθερο (SPF) δωμάτια ειδικά παθογόνα. κύτταρα HCT116 συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε PBS. Κύτταρα (5 × 10

6 κύτταρα) σε όγκο 150 μΐ με την παρουσία ηπαρίνης (20 υ) αναμίχθηκαν με Matrigel (150 μΐ) και στη συνέχεια εγχέεται υποδορίως στην δεξιά πλευρά κάθε ποντικού. Μετά την εμφύτευση, τα ζώα τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδα ελέγχου και ομάδες αγωγής, οι οποίες έλαβαν ΒΜΧ 20 mg /kg /ημέρα. Η θεραπεία χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκώς μία φορά την ημέρα για 10 ημέρες. Στο τέλος της θεραπείας, τα ζώα θυσιάστηκαν, βύσματα Matrigel απομακρύνθηκαν και οι περιβάλλοντες ιστοί κομμένα. επίπεδα αιμοσφαιρίνης των βυσμάτων Matrigel αξιολογήθηκαν με κιτ αντιδραστηρίου Drabkin (Sigma-Aldrich) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης υπολογίζεται με βάση ένα σύνολο προτύπων αιμοσφαιρίνης. Επιπλέον, ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές βάφτηκαν με ένα CD31-ειδικό αντίσωμα (Santa Cruz) για να ανιχνευθεί η πυκνότητα σκάφος στο Matrigel βύσμα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Όλα τα πρωτόκολλα έχουν εγκριθεί από το Εργαστήριο Ζώων Φροντίδα και Χρήση Επιτροπή Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

Ποντίκι μοντέλο ξενομοσχεύματος

3-5 εβδομάδων nude

nu /nu ποντικών ελήφθησαν από BioLasco (Ταϊπέι , Ταϊβάν) και στεγάζεται σε καθαρό ελεύθερο (SPF) δωμάτια ειδικά παθογόνα. κύτταρα HCT116 συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε PBS, και 5 × 10

6 κυττάρων σε ένα όγκο 0.3 κ.εκ. εγχύθηκαν υποδορίως στην δεξιά πλευρά κάθε ποντικού. Μόλις ο όγκος φθάσει περίπου 150 mm

3, τα ζώα τυχαιοποιήθηκαν στην ομάδα ελέγχου και την ομάδα θεραπείας που λαμβάνει ΒΜΧ 20 mg /kg /ημέρα. Η θεραπεία χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκώς μία φορά την ημέρα για 22 ημέρες. Οι όγκοι μετρήθηκαν καθημερινά από ένα ψηφιακό παχύμετρο. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο

V

(mm

3) = [

ab

2] × 0,52, όπου

μια

είναι το μήκος και

b

είναι το πλάτος του όγκου [34]. Στο τέλος της θεραπείας, τα ζώα θυσιάστηκαν και οι όγκοι αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν. Όλα τα πρωτόκολλα έχουν εγκριθεί από το Εργαστήριο Ζώων Φροντίδα και Χρήση Επιτροπή Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

Η στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± Τ.Α. από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ακολουθούμενη από την δοκιμή Newman-Keuls, όπου χρειάζεται, για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα της διαφοράς μεταξύ μέσων. Ένα

σ

αξία των & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

BMX αναστέλλει την επαγόμενη από VEGF πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε HUVECs

πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων είναι. ένα ουσιαστικό βήμα στην πορεία της αγγειογένεσης. Για την εκτίμηση της αντι-αγγειογενετική δραστηριότητα του ΒΜΧ (Εικ. 1), αξιολογήσαμε την πρώτη ανασταλτικά αποτελέσματα της επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε VEGF διεγείρεται HUVECs. Τα κύτταρα στερήθηκαν με 2% FBS που περιέχει μέσο για 16 ώρες και στη συνέχεια διεγείρεται από VEGF (20 ng /ml) παρουσία ή απουσία ΒΜΧ για άλλες 24 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, η θεραπεία των κυττάρων με ΒΜΧ εξάρτηση από τη συγκέντρωση μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων σε VEGF διεγείρεται HUVECs όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία ΜΤΤ. ανάλυση σήμανσης BrdU κατόπιν χρησιμοποιούνται για να επιβεβαιώσουν εάν BMX προκαλούμενη μείωση στη βιωσιμότητα κυττάρου ήταν οφείλεται στην αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Σύκο. 2Β δείχνει ότι το ποσοστό των BrdU-επισημασμένων κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά μετά από θεραπεία με VEGF 24 ώρες σε σύγκριση με την ομάδα που υπέστη αγωγή με φορέα. ΒΜΧ ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που επάγεται με VEGF σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Για να καθοριστεί εάν ΒΜΧ ασκείται καμία κυτταροτοξική επίδραση σε HUVECs που εκτίθενται σε VEGF, ένας προσδιορισμός LDH χρησιμοποιήθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, η θεραπεία των κυττάρων με ΒΜΧ στα 10 μΜ για 24 ώρες δεν αύξησε σημαντικά την απελευθέρωση LDH. Επίσης χρησιμοποιήσαμε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και την επισήμανση V-FITC αννεξίνης για την ανίχνευση απόπτωσης σε κύτταρα VEGF-διεγείρονται παρουσία ΒΜΧ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2D, BMX δεν μετέβαλε σημαντικά το ποσοστό της αννεξίνης V

+ PI

– κύτταρα (κάτω δεξιά τεταρτημόριο, πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων) και η αννεξίνη V

+ PI

+ κύτταρα (άνω δεξιά τεταρτημόριο , προηγμένη αποπτωτικών κυττάρων ή /και νεκρωτικών κυττάρων). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι ΒΜΧ μπορεί να ασκήσει αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα χωρίς να προκαλούν κυτταρολυτική ή αποπτωτικό αποτέλεσμα σε HUVECs που εκτίθενται σε VEGF.

(Α) HUVECs στερήθηκαν τροφής σε 2% FBS που περιείχε μέσο χωρίς ECGS για 16 ώρες. Μετά ασιτία, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του ΒΜΧ που ακολουθείται από την διέγερση με VEGF (20 ng /ml) για άλλες 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε στη συνέχεια με δοκιμασία ΜΤΤ. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± S.E.M. πέντε ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν *

ρ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε αγωγή μόνο με VEGF. (Β) HUVECs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο (Α), και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στην ενότητα «

Υλικά και Μέθοδοι

» ενότητα. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το μέσο ± SEM από πέντε ανεξάρτητα πειράματα εκτελέστηκαν εις διπλούν. *

ρ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε αγωγή μόνο με VEGF. (Γ) HUVECs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο (Α), και κυτταροτοξικότητα ΒΜΧ προσδιορίστηκε με δοκιμασία LDH. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρου (ολική λύση) για να χρησιμεύσει ως θετικός έλεγχος. (D) HUVECs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο (Α), το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων στη συνέχεια αναλύθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, όπως περιγράφεται στην ενότητα «

Υλικά και Μέθοδοι

» ενότητα. Το κάτω αριστερό τεταρτημόριο του κάθε πάνελ (αννεξίνη V

ΡΙ

-) δείχνει τα βιώσιμα κύτταρα, τα οποία εξαιρούν ΡΙ και είναι αρνητικά ως προς τη δέσμευση αννεξίνης V. Το κάτω δεξιά τεταρτημόριο (αννεξίνη V

+ PI

-) αντιπροσωπεύει τις αρχές του αποπτωτικά κύτταρα, Αννεξίνη V θετική και αρνητική PI, επιδεικνύοντας ακεραιότητα κυτταροπλασματική μεμβράνη. Η άνω δεξιά τεταρτημόριο (αννεξίνη V

+ PI

+) περιλαμβάνει προηγμένα αποπτωτικών κυττάρων και νεκρωτικές κύτταρα, τα οποία είναι θετικά για την πρόσδεση αννεξίνης V και την πρόσληψη ΡΙ. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

ΒΜΧ αναστέλλει VEGF-επαγόμενη μετανάστευση και τον σχηματισμό τριχοειδών δομή του HUVECs

μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων είναι ένα κεντρικό βήμα για την αγγειογένεση [35]. Η επίδραση του BMX σε HUVEC κινητικότητα προσδιορίστηκε με τη μετανάστευση μηδέν πληγή και επικοινωνούντα δοκιμασίες εισβολής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, ΒΜΧ ανέστειλαν σημαντικά την επαγόμενη από VEGF μετανάστευση HUVEC σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο. ΒΜΧ στα 5 μΜ επίσης μείωσε σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων που μετανάστευσαν μέσα από το φράγμα μεμβράνης transwell όταν χρησιμοποιούν VEGF ως χημειοελκτικό (Σχ. 3Β). Η αγγειογένεση είναι μια πολύπλοκη διαδικασία και σωληνοειδή σχηματισμό ενδοθηλιακών κυττάρων είναι επίσης ένα βασικό βήμα στην αγγειογένεση. Για να αξιολογηθεί η επίδραση του ΒΜΧ επί του σωληνοειδούς σχηματισμού των ενδοθηλιακών κυττάρων, HUVECs σπάρθηκαν πάνω στην επιφάνεια του Matrigel με την παρουσία VEGF υποβλήθηκαν σε θεραπεία είτε με BMX ή όχημα ως έλεγχος. Τα κύτταρα στην ομάδα υπό αγωγή με όχημα έγινε επίμηκες και σχηματίζεται τριχοειδή δομή που μοιάζει εντός 16 ωρών. VEGF αυξήθηκαν σημαντικά τύπου τριχοειδούς δικτύου. Ωστόσο, η θεραπεία του ΒΜΧ εξάρτηση από τη συγκέντρωση κατέστειλε τον σχηματισμό τριχοειδών που μοιάζει δίκτυο (Σχ. 3C). Είμαστε δίπλα διερευνηθούν οι πιθανές επιπτώσεις των BMX στην επαγόμενη από VEGF αγγειογένεση χρησιμοποιώντας έναν αρουραίο αορτικού δακτυλίου μικροαγγειακή δοκιμασία βλάστησης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3D, VEGF ενεργοποίησε σημαντικά μικροαγγείων βλάστησης, οδηγώντας στο σχηματισμό ενός συμπλόκου δίκτυο μικροαγγείων γύρω αορτικών δακτυλίων, ενώ η αγωγή με BMX (5 μΜ) ανταγωνίστηκε την βλάστησης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ΒΜΧ μπορεί να εμφανίζουν αντι-αγγειογενετική δραστικότητα μέσω αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, η μετανάστευση και ο σχηματισμός σωλήνα των ενδοθηλιακών κυττάρων.

(Α) HUVECs στερήθηκαν τροφής σε 2% FBS που περιείχε μέσο χωρίς ECGS για 16 ώρες. Κυτταρική μονοστιβάδα στη συνέχεια γδαρμένο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα ή ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις του ΒΜΧ παρουσία VEGF για ένα άλλο 16 ώρες. Ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν προσδιορίστηκε στη συνέχεια. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± S.E.M. από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. *

ρ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε αγωγή μόνο με VEGF. (Β) Μετά από ασιτία, όπως περιγράφεται στο (Α), τα κύτταρα στη συνέχεια σπείρονται σε άνω θάλαμο υπό την απουσία ή την παρουσία του ΒΜΧ (5 μΜ) χρησιμοποιώντας VEGF ως χημειο-προσελκυστικό. Μετά από 16 ώρες, τα κύτταρα εισέβαλαν μέσω της μεμβράνης επικαλυμμένα με ζελατίνη χρωματίστηκαν και ποσοτικοποιούνται. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± S.E.M. από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. *

ρ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε αγωγή μόνο με VEGF. (Γ) HUVECs σπάρθηκαν επί Matrigel παρουσία VEGF (20 ng /ml) με ή χωρίς ΒΜΧ στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Τα κύτταρα ακολούθως φωτογραφήθηκαν κάτω από μικροσκοπία αντίθεσης φάσης μετά από 16 ώρες. ιστογράμματα δείχνουν τα συγκεντρωμένα στοιχεία του μέσου όρου των αριθμών φυτρώνουν τόξο (n = 4). *

ρ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε αγωγή μόνο με VEGF. (D) Rat αορτικών δακτυλίων τοποθετήθηκαν σε Matrigel και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με VEGF (20 ng /ml) παρουσία ή απουσία ΒΜΧ (5 μΜ). Η επίδραση του BMX στο σχηματισμό των βλαστών σκάφους από διάφορα δείγματα αορτή εξετάσθηκε κατά την ημέρα 8. γραφήματα Bar δείχνουν τα συγκεντρωμένα στοιχεία του μέσου όρου της ζώνης μικροαγγείων (n = 4). *

σ

& lt?. 0.05, σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε αγωγή μόνο με VEGF

Η

BMX αναστέλλει την επαγόμενη από VEGF ERK και φωσφορυλίωση της Akt

VEGF σηματοδότηση μέσω VEGFR2 είναι το πιο σημαντικό μονοπάτι για την επαγωγή του πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων, μετανάστευση και σχηματισμό σωλήνα, οδηγώντας σε αγγειογένεση [36]. VEGF δέσμευση σε VEGFR2 επάγει διμερισμό VEGFR2 και ακολούθως αυτοφωσφορυλίωση επί υπολειμμάτων τυροσίνης της. Takahashi et al αποκάλυψε ότι τα υπολείμματα τυροσίνης 1175 και 1214 είναι τα δύο κύρια VEGF-εξαρτώμενη θέσεις αυτοφωσφορυλίωσης του VEGFR2 [37]. Έτσι καθοριστεί αν BMX επηρεάζει VEGFR2 Y1175 και Υ 1214 φωσφορυλίωση σε VEGF-διεγείρονται HUVECs. Εξετάσαμε επίσης την κατάσταση φωσφορυλίωσης του Src, Akt, ΕΚΚ και ΡΑΚ, τα οποία είναι τα βασικά πρωτεϊνικών κινασών που εμπλέκονται στην σηματοδότηση VEGFR2. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, ΒΜΧ ανέστειλε VEGFR2 Y1175 και Y1214 φωσφορυλιώσεις σε VEGF-διεγερμένα HUVECs (Σχ. 4Β). ΒΜΧ επίσης αποδειχθεί ότι καταστέλλει την φωσφορυλίωση της Src (Εικ. 4C), FAK (Εικ. 4D), Akt (Εικ. 4Ε) και ERK (Σχ. 4F) σε VEGF διεγείρεται HUVECs. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ΒΜΧ εξασκείται αγγειογένεση δράση αναστέλλοντας την ενεργοποίηση VEGFR2 και κλείδωμα καταρράκτες σηματοδότησης VEGFR2 μεσολάβηση.

Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις ΒΜΧ για 30 (20 ng /ml) για άλλα 5 (VEGFR2 και Src) ή 30 (ΡΑΚ, Akt και ERK1 /2) λεπτά. κατάσταση φωσφορυλίωσης του VEGFR2, Src, ΡΑΚ, Akt, και ERK1 /2 στη συνέχεια προσδιορίζεται με ανοσοκηλίδωση. Αριθμητικά φαίνεται στο (Α) είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα. Τα καταρτίζονται αποτελέσματα της VEGFR2 Y1175 και Y1214 (Β), Src Y416 (C), FAK Y397 (D), Akt S473 (Ε), και ERK1 /2 T202 /Y204 (F) φωσφορυλιώσεις δείξει. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± S.E.M. από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. *

σ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου? #

σ

& lt?. 0.05, σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε αγωγή μόνο με VEGF

Η

BMX αυξάνει p21

CIP /έκφρασης WAF1, αλλά μειώνεται cyclinD1, CDK4 και εκφράσεις survivin

το πέρασμα διαμέσου του κυτταρικού κύκλου ρυθμίζεται από σύμπλοκα κυκλίνης-ΟϋΚ, ετεροδιμερής πρωτεΐνη κινάσες [1] – [3]. Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει ότι η επαγωγή ή έκτοπη έκφραση της ρ21

CIP /WAF1, ένας αρνητικός ρυθμιστής των CDK αναστέλλει, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και προκαλεί τη διαφοροποίηση σε διάφορους τύπους κυττάρων. p21

CIP /WAF1 είναι επομένως ένας σημαντικός ρυθμιστής του πολλαπλασιασμού κατά την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και την ογκογένεση [38]. Επιπλέον, survivin, ένας αναστολέας της απόπτωσης (ΙΑΡ) μέλος της οικογένειας, βρέθηκε ότι υπερ-εκφράζεται στους ανθρώπινους καρκίνους και αναφέρθηκε ότι παίζουν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της προόδου του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, και ογκογένεση [39] – [42] . Από ΒΜΧ κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των HUVEC χωρίς να προκαλεί απόπτωση, όπως περιγράφεται παραπάνω, εξετάσαμε αν ΒΜΧ επηρεάζει τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ21

CIP /WAF1 και survivin σε HUVECs. Τα επίπεδα των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου, όπως cyclinD1 και CDK4 προσδιορίστηκαν επίσης σε ΒΜΧ-διεγερμένα HUVECs. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5, η επεξεργασία της HUVECs με ΒΜΧ για 24 h προκάλεσε μια αύξηση στο επίπεδο πρωτεΐνης ρ21

CIP /WAF1 (Εικ. 5Β). Σε αντίθεση, τα επίπεδα της πρωτεΐνης της κυκλίνης D1 (Σχ. 5C), CDK4 (Σχ. 5D) και survivin (Σχ. 5Ε) μειώθηκαν στα ΒΜΧ-διεγερμένα HUVECs. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ΒΜΧ-ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε HUVECs μπορεί επίσης να προκαλούνται μέσω μεταβολών των επιπέδων πρωτεΐνης ρ21

CIP /WAF1, cyclinD1, CDK4 και survivin.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του ΒΜΧ για 24

CIP /WAF1, cyclinD1, CDK4 και survivin στη συνέχεια προσδιορίζεται με ανοσοκηλίδωση. Αριθμητικά φαίνεται στο (Α) είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα. Τα καταρτίζονται αποτελέσματα της p21

CIP /WAF1 (Β), cyclinD1 (C), CDK4 (D), και survivin (ε) τα επίπεδα της περιόδου αυτής. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± S.E.M. από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. *

ρ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

ΒΜΧ κατέστειλε προκαλούμενη από όγκο αγγειογένεση σε γυμνούς ποντικούς

Στη συνέχεια, θα χρησιμοποιείται ένας αγγειογένεση προκαλούμενη από όγκο μοντέλο για να διερευνηθεί περαιτέρω κατά πόσο BMX αναστέλλει την προκαλούμενη από όγκο αγγειογένεση. Καρκίνο του παχέος εντέρου HCT116 κύτταρα αναμίχθηκαν με Matrigel και εγχύεται στα πλευρά των ποντικών. βύσματα Gel συλλέχθηκαν 10 ημέρες μετά την εμφύτευση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, κύτταρα HCT116 βαθιά επάγεται σχηματισμού αιμοφόρων αγγείων στο βύσμα (Σχ. 6Α). Ωστόσο, το χλωμό χρώμα των βυσμάτων αφαιρέθηκαν από τα ποντίκια χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά με BMX (20 mg /kg /ημέρα) έδειξε ότι τα κύτταρα HCT116 που επάγεται λιγότερο νεοαγγείωση κατά την περίοδο των 10 ημερών. Πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική χρώση CD31 για να ανιχνεύσει την πυκνότητα μικροαγγείων σε βύσματα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Β, βύσματα που λαμβάνονται από ποντικούς ΒΜΧ-αγωγή παρουσίασαν μείωση στην πυκνότητα μικροαγγείων σε σύγκριση με εκείνα από ποντίκια ελέγχου υπό αγωγή με όχημα. Έχουμε ποσοτικοποιείται επίσης το επίπεδο της αγγειογένεσης με τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας αιμοσφαιρίνης των βυσμάτων. Μια σημαντική μείωση της νεοαγγείωση δείχθηκε σε βύσματα από ΒΜΧ-αγωγή ποντικούς όταν συγκρίθηκαν με εκείνα από ποντίκια ελέγχου υπό αγωγή με όχημα (Εικ. 6C). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η συστηματική χορήγηση με ΒΜΧ κατέστειλε σημαντικά την αγγειογένεση σε αυτό το

in vivo

δοκιμασία.

(Α) HCT 116 ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα αναμίχθηκαν με Matrigel και στη συνέχεια με ένεση υποδορίως στην δεξιά πλευρά του γυμνούς ποντικούς. Μετά την εμφύτευση, τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή ενδοπεριτοναϊκώς με φορέα ή ΒΜΧ 20 mg /kg /ημέρα για 10 ημέρες. βύσματα Matrigel αφαιρέθηκαν από τα ποντίκια χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά με όχημα ή ΒΜΧ δείχθηκαν. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε στη συνέχεια με δοκιμασία ΜΤΤ. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε στη συνέχεια με δοκιμασία ΜΤΤ.