Αφηρημένο

φαινοφορμίνης (phenethylbiguanide? Ένα αντι-διαβητικό παράγοντα) συν Οξαμικός [γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) αναστολέας] ελέγχθηκε ως πιθανή αντικαρκινική του θεραπευτικού συνδυασμού. Στις

in vitro μελέτες

, φαινφορμίνη ήταν πιο ισχυρό από ό, τι η μετφορμίνη, ένα άλλο διγουανίδιο, πρόσφατα γνωστό ότι έχουν αντικαρκινικές επιδράσεις, όσον αφορά την προώθηση θάνατο των καρκινικών κυττάρων στην περιοχή από 25 φορές σε 15 εκατομμύρια φορές σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές . Η αντικαρκινική δράση του φαινφορμίνη είχε σχέση με συγκρότημα Ι αναστολή στα μιτοχόνδρια και την επακόλουθη υπερπαραγωγή του αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS). Η προσθήκη οξαμικό ανέστειλε δραστηριότητα LDH και γαλακτικό παραγωγή από τα κύτταρα, η οποία είναι μια σημαντική παρενέργεια της διγουανίδια, και που προκαλείται από περισσότερο ταχύ θάνατο των καρκινικών κυττάρων με τη μείωση της παραγωγής ΑΤΡ και την επιτάχυνση της παραγωγής ROS. Φαινφορμίνη συν οξαμικό ήταν πιο αποτελεσματικό από φαινφορμίνη συνδυασμό με LDH knockdown. Σε ένα συγγενικό μοντέλο ποντικού, φαινφορμίνη με οξαμικό αυξημένη απόπτωση του όγκου, μείωσε το μέγεθος του όγκου και

18F-φθοροδεοξυγλυκόζης (FDG) πρόσληψη σε τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων /αξονική τομογραφία σε σχέση με τον έλεγχο. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η φαινφορμίνη είναι πιο κυτταροτοξικά προς τα καρκινικά κύτταρα από ό, τι η μετφορμίνη. Επιπλέον, φαινφορμίνη και οξαμικού έχουν συνεργιστική αντικαρκινική δράση μέσω ταυτόχρονη αναστολή των πολύπλοκων εγώ στα μιτοχόνδρια και LDH στο κυτταρόπλασμα, αντίστοιχα

Παράθεση:. Miskimins WK, Ahn HJ, Kim JY, Ryu S, Jung YS , Choi JY (2014) συνεργική αντι-καρκίνο Επίδραση της φαινφορμίνη και οξαμικού. PLoS ONE 9 (1): e85576. doi: 10.1371 /journal.pone.0085576

Επιμέλεια: Rafael Moreno-Sanchez, Instituto Nacional de Cardiologia, Μεξικό

Ελήφθη: 9η Μαΐου, 2013? Αποδεκτές: 29, Νοεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιανουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Miskimins et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από τη Susan G. Komen για τον αριθμό βραβείο Cure KG100497 (WKM), από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας αριθμού βραβείο 1R01CA180033 (WKM), από το Εθνικό Ινστιτούτο Γενικών Ιατρικών Επιστημών του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας αριθμός βραβείο 015P20GM10358 (WKM), από τη βασική επιστήμη ερευνητικό πρόγραμμα μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας αριθμό βραβείο 2011-0013087, και από τη Samsung Medical Center αριθμό απονομής επιχορήγησης SMR1120911. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παρατηρήσεις ότι η μετφορμίνη (1,1-dimethylbiguanide), η πιο συχνά συνταγογραφούμενο φάρμακο για τον διαβήτη τύπου ΙΙ μειώνει τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου έχουν προωθήσει έναν ενθουσιασμό για τη μετφορμίνη ως αντικαρκινική θεραπεία [1], [2]. Τώρα κλινικές δοκιμές στον καρκίνο του μαστού με τη χρήση μετφορμίνης μόνο ή σε συνδυασμό με άλλες θεραπείες είναι εν εξελίξει [3], [4].

φαινφορμίνη, ένα άλλο διγουανίδιο (1-phenethylbiguanide) εισήχθη ταυτόχρονα η μετφορμίνη, σε τα τέλη της δεκαετίας του 1950 ως ένα αντι-διαβητικό φάρμακο. Φαινφορμίνη είναι σχεδόν 50 φορές τόσο ισχυρή όσο η μετφορμίνη, αλλά συσχετίστηκε επίσης με υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης γαλακτικής οξέωσης, μια σημαντική παρενέργεια της διγουανίδια. Φαινφορμίνη είχε αποσυρθεί από την κλινική χρήση σε πολλές χώρες στα τέλη της δεκαετίας του 1970, όταν μια ένωση με γαλακτική οξέωση και αρκετά θανατηφόρα αναφορές περιστατικών αναγνωρίστηκε [5]. Κατά συνέπεια, η επίδραση της φαινφορμίνη στον καρκίνο σπάνια έχει μελετηθεί.

Για να αποτραπεί η ανάπτυξη ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων, ταχεία και πλήρη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων από χημειοθεραπεία είναι σημαντική. Συνεπώς, είναι πιθανό ότι φαινφορμίνη μπορεί να είναι μια καλύτερη αντικαρκινικό παράγοντα από μετφορμίνη λόγω υψηλότερη δραστικότητα της. Σε μια

in vivo

μελέτη, που ιδρύθηκε όγκους του μαστού που έλαβαν θεραπεία με μετφορμίνη δεν έδειξαν σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου, ενώ η φαινφορμίνη κατέδειξε σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου [6].

Οι μηχανισμοί με τους οποίους η μετφορμίνη αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου και την ανάπτυξη του όγκου δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Προτεινόμενη μηχανισμοί περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση του ΑΜΡ-ενεργοποιημένης κινάσης πρωτεΐνης (ΑΜΡΚ) [7], η αναστολή της δραστικότητας του mTOR [8], Akt αποφωσφορυλίωση [9], η διατάραξη του UPR μεταγραφής [10], και διακοπή του κυτταρικού κύκλου [11]. Πρόσφατα, αποκαλύφθηκε ότι η αντιδιαβητική δράση της μετφορμίνης σχετίζεται με την αναστολή της συμπλόκου Ι της αναπνευστικής αλυσίδας των μιτοχονδρίων [12], [13]. Ωστόσο, συμπλόκου Ι δεν έχει ποτέ μελετηθεί όσον αφορά το αντικαρκινικό αποτέλεσμα των διγουανιδίων.

Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη στοχεύσαμε στην πρώτη δοκιμή αν φαινφορμίνη έχει μια πιο ισχυρή αντικαρκινική δράση από ό, τι η μετφορμίνη και αν ναι, , τη διερεύνηση του μηχανισμού αντι-καρκίνου. Υποθέσαμε ότι φαινφορμίνη έχει μια πιο ισχυρή αντικαρκινική δράση από τη μετφορμίνη και ότι ο μηχανισμός κατά του καρκίνου του περιλαμβάνει την αναστολή της συμπλόκου Ι

Επιπλέον, συνδυάσαμε οξαμικό, έναν αναστολέα της γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH), με φαινφορμίνη να μειωθεί η παρενέργεια της γαλακτικής οξέωσης. Οξαμικό εμποδίζει τη μετατροπή του πυροσταφυλικού σε γαλακτικό στο κυτοσόλιο και έτσι εμποδίζει γαλακτική οξέωση. Είναι ενδιαφέρον, γαλακτική οξέωση είναι ένα κοινό φαινόμενο στο μικροπεριβάλλον του καρκίνου και σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, μετάσταση, και την αναστολή της ανοσολογικής απόκρισης έναντι καρκινικών κυττάρων [14], [15]. Πρόσφατα πειράματα έδειξαν ότι LDH knockdown παρεμπόδισε την ανάπτυξη του καρκίνου [16], [17], επομένως προσθήκη οξαμικού όχι μόνο μπορεί να βελτιώσει τον παρενέργεια φαινφορμίνη αλλά θα μπορούσε επίσης η ίδια αναστέλλουν την ανάπτυξη και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων.

Όχι μελέτες έχουν δοκιμαστεί φαινοφορμίνης σε συνδυασμό με οξαμικό, είτε

in vitro

ή στο ανοσοποιητικό αρμόδια συγγενή ποντίκια. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ερευνήσει εάν φαινφορμίνη και οξαμικού έχουν μια συνεργική αντικαρκινικές επιδράσεις με ταυτόχρονη αναστολή της συμπλόκου Ι στα μιτοχόνδρια και LDH στο κυτταρόπλασμα μέσω αμφοτέρων

in vitro

δοκιμασίες και σε ένα συνγονιδιακό μοντέλο ποντικού.

Υλικά και Μέθοδοι

Τέσσερις ομάδες συγκρίθηκαν σε αυτήν την μελέτη: ομάδα ελέγχου (ομάδα C), ομάδα φαινφορμίνη (ομάδα Ρ), ομάδα οξαμικό (ομάδα Ο), και ένας συνδυασμός ομάδα φαινφορμίνη και οξαμικό (ομάδα PO). Όλες οι μετρήσεις σε

in vitro

μελέτες διεξήχθησαν 1 ημέρα μετά την φαρμακευτική αγωγή, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά.

Χημικά και Πολιτισμού κυττάρων

Η μετφορμίνη (1,1-dimethylbiguanide), φαινφορμίνη ( 1-phenethylbiguanide), και νάτριο οξαμικού αγοράστηκαν από τη Sigma Chemicals και αραιώθηκαν με αποστειρωμένο νερό σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. αναστολέας PARP (INH2BP, 5-ιωδο-6-αμινο-1,2-βενζοπυρόνη) αγοράστηκε από την Calbiochem και αναστολέα κασπάσης (Q-Val-Asp-ΟΦ) αγοράστηκε από την ΜΡ Biomedicals. Οι κυτταρικές σειρές MCF7 (καρκίνος του μαστού), B16F10 (μελάνωμα), CT26 (καρκίνος του παχέος εντέρου), Α549 (καρκίνος του πνεύμονα), και DU145 (καρκίνος του προστάτη) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Η E6E7Ras (καρκίνο των αμυγδαλών) ελήφθη από το Dr J Lee (Sanford Έρευνας, Cancer Biology Research Center) [18], [19]. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου και συμπληρωμένο με 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2. Τα φάρμακα χορηγήθηκαν σε ένα κύτταρο συρροή 70%.

Προσδιορισμός Φαρμάκου Δοσολογία

CT26, άνω και κάτω τελεία κυτταρική σειρά καρκίνου από ποντικούς BALB /c, επιλέχθηκε ως το κύριο σύστημα της μελέτης λόγω CT26 κύτταρα είναι σχετικά ανθεκτικά σε φαινφορμίνη αλλά έδειξε μια δραματική συνεργιστική δράση με την προσθήκη οξαμικού. Επιπλέον, συγγενή πειράματα ποντικού μας διεξήχθησαν σε ποντίκια BALB /c.

κύτταρα ΜΟΡ10Α, ένα μη-μετασχηματισμένο ανθρώπινου μαστικού επιθηλιακή κυτταρική γραμμή, παρέμεινε ανεπηρέαστη με την παρουσία μέχρι και 1 mM φαινφορμίνη συν 40 mM οξαμικού για 1 εβδομάδα. Ωστόσο, υψηλότερες δόσεις προκάλεσε θάνατο των κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται 1 mM φαινφορμίνη, 40 mM οξαμικό, και 1 mM φαινφορμίνη συν 40 mM οξαμικό για περαιτέρω πειράματα.

Μέτρηση του κυτταρικού θανάτου με δοκιμασίες εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου και Κυτταρομετρίας Ροής

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε τρυβλία 35 mm και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς φάρμακα. Για τη δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου, ένα κυτταρικό εναιώρημα κηλιδώνεται με 0,02% κυανούν τρυπανίου. Trypan blue θετικά και αρνητικά κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο. Για μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής, 7-αμινοακτινομυκίνης D (7ΑΑϋ? 5 μΐ) προστέθηκε σε εναιώρημα 500 μΐ κυττάρων και επωάστηκε για 20 λεπτά σε πάγο. Όλα μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση μιας ροής BD Accuri C6 κυτταρόμετρο (BD Biosciences).

Μια καμπύλη δόσης-απόκρισης, ΕΚ

50, και ο δείκτης συνδυασμού (CI) λήφθηκε με χρήση λογισμικού CalcuSyn (Έκδοση 2.1 , BIOSOFT).

Μέτρηση του pH και του γαλακτικού

ρΗ του μέσου καλλιέργειας μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα πεχάμετρο (Accumet AB15 Βασική και BioBasic pH /mV /° C μέτρο, Fisher Scientific). Γαλακτική σε μέσα καλλιέργειας μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας γαλακτικό νάτριο (Eton Bioscience, Inc.) και ανάγνωσης μικροπλάκας (απορρόφηση 490 nm, SpectraMax Plus

584, Molecular Devices) με ποσοτικό τρόπο με τα πρότυπα γαλακτικό. Παραγωγή γαλακτικού τυποποιήθηκε ανά 10

5 κύτταρα.

συγκρότημα Ι Δραστηριότητα

Έχω δραστηριότητα Complex προσδιορίστηκε από το ρυθμό οξείδωσης του NADH (Fluka) ανά mg πρωτεΐνης. Τα κυτταρικά ιζήματα σε υπερήχους για 20 δευτερόλεπτα σε πάγο σε ρυθμιστικό ΙΜΕ (50 mM ιμιδαζόλιο, 2 mM MgCl

2, 1 mM EDTA, αναστολείς πρωτεάσης) και εκχύλισμα 80 μg κυττάρων προστέθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης [1 mM EDTA, 50 mM KCl , 1 mM KCN, 1.2 μΜ αντιμυκίνη Α, 10 mM Tris-HCl (ρΗ 7.4)]. Λίγο πριν τη μέτρηση, 150 μΜ NADH και 100 μΜ συνένζυμο Q1 (Sigma), ως δέκτη ηλεκτρονίων, προστέθηκαν. Η απορρόφηση στα 340 nm μετρήθηκε επί 2 λεπτά χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο στους 30 ° C. NADH οξείδωση δεν εμποδίζεται από ροτενόν (ένα συγκρότημα που αναστολέα, 2.5 μΜ) αφαιρέθηκε από τον υπολογισμό για τη μέτρηση της οξείδωσης NADH που συμβαίνουν σε πολύπλοκες εγώ μόνο. ​​

Για να επικυρώσετε ένα ρόλο για συμπλόκου Ι αναστολή από φαινφορμίνη, 0,5 mM μεθυλο ηλεκτρικό (Sigma) προστέθηκε για να ολοκληρωθεί μέσα ανάπτυξης με φαινφορμίνη συγχρόνως να παρατηρηθεί εάν αντιστράφηκαν επιδράσεις κυτταρικού αντικαρκινικές φαινφορμίνη του. Μεθυλο ηλεκτρικό χρησιμεύει ως μια εναλλακτική πηγή ενέργειας που παρακάμπτει συγκρότημα εγώ στην αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων. Ο θάνατος των κυττάρων μετρήθηκε 24 ώρες μετά τη θεραπεία.

LDH δραστηριότητας

δραστικότητα LDH προσδιορίστηκε με παρακολούθηση του ρυθμού κατανάλωσης NADH κατά την προσθήκη του πυροσταφυλικού. Τα κυτταρικά ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 0,1 Μ ΚΗ

2 ΡΟ

4 (ρΗ 7,2), 2 mM EDTA, και 1 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT), κατεργασία με υπερήχους σε 300 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος ανιχνεύσεως (50 mmol /L φωσφορικού καλίου, ρΗ 7.4) , και φυγοκεντρήθηκε στα 10.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο προστέθηκε σε 50 mM φωσφορικό κάλιο (ρΗ 7,4), 2 mM πυροσταφυλικού, και 20 μΜ NADH. Η απορρόφηση μετρήθηκε επί 10 λεπτά χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο σε διέγερση 340 nm και 30 ° C. δραστηριότητα LDH τυποποιήθηκε ανά 10

5 κύτταρα.

Η κατανάλωση οξυγόνου Rate (OCR) και εξωκυτταρικά Οξίνιση Rate (ECAR)

OCR και ECAR μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το Seahorse XF24 εξωκυττάριο ροή αναλυτή ( Seahorse Bioscience, Billerica, ΜΑ, USA). Η συσκευή αυτή χρησιμοποιεί ένα φυσίγγιο μιας χρήσης αισθητήρα που είναι ενσωματωμένο με οπτικό βιοαισθητήρων που βασίζονται σε φθορισμό (οξυγόνο και πρωτόνια) που επιτρέπει την ταυτόχρονη εξωκυτταρικό πραγματικό χρόνο μετρήσεις ακέραια κύτταρα που αναπτύσσονται ως μονοστιβάδες. CT26 σπάρθηκε στα 40.000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες πολλαπλών φρεατίων XF24 V7 και προ-επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C σε 5% CO

2. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με μέσο προσδιορισμού, και στη συνέχεια επωάζονται χωρίς CO

2 στους 37 ° C για μία ώρα σε μέσο προσδιορισμού (βάση DMEM, 4 mM γλουταμίνη, 143 mM NaCl, 25 mM γλυκόζη σε ρΗ 7.4 ). Μετά την ίδρυση δύο βασική OCR και ECAR αναγνώσεις, μελέτησε τα φάρμακα χορηγήθηκαν με ένεση και οι μετρήσεις συνεχίστηκε για 70 λεπτά. Μετά από εβδομήντα λεπτά, 10 mM γλυκόζη εγχύθηκε και OCR και ECAR μετρήθηκαν για άλλα 20 λεπτά. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τετραπλούν.

μιτοχονδριακού δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS)

μιτοχονδριακού ROS ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας κόκκινο μιτοχονδριακό υπεροξειδίου δείκτη (MitoSOX ™, Molecular Probes). MitoSOX ™ είναι ένα φθορογόνου χρωστικής ουσίας για εξαιρετικά επιλεκτική ανίχνευση του υπεροξειδίου στα μιτοχόνδρια των ζώντων κυττάρων. Μόλις στα μιτοχόνδρια, MitoSOX ™ Red αντιδραστήριο οξειδώνεται από το υπεροξείδιο και παρουσιάζει κόκκινο φθορισμό. Κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε ένα ποτήρι 35-mm τρυβλίο πυθμένα καλλιέργειας (Mat Tak Corporation) επωάστηκαν με 5 μΜ MitoSOX ™ και 100 ηΜ Mitotracker Πράσινη ® (Molecular Probes) για μιτοχόνδρια χρώση για 10 λεπτά στους 37 ° C προστατευμένο από το φως. Τα κύτταρα πλένονται απαλά τρεις φορές με θερμό ρυθμιστικό διάλυμα και τοποθετήθηκαν σε θερμό ρυθμιστικό για την απεικόνιση. Ολύμπου FV1000 ομοεστιακό μικροσκόπιο πραγματοποιήθηκε σε Ex /Em:. 510/580 nm

Για να επικυρώσετε τη σημασία της παραγωγής ROS, το οδοκαθαριστής ROS, Ν ακετυλο κυστεΐνη (NAC, Sigma, 1 mM) προστέθηκε για να ολοκληρωθεί ανάπτυξης μέσον 6 ώρες πριν από τη χορήγηση φαρμάκου δοκιμής. Ο θάνατος των κυττάρων μετρήθηκε 24 ώρες μετά τη θεραπεία.

επιπέδων ΑΤΡ

επιπέδων ΑΤΡ προσδιορίστηκαν με μία λουσιφερίνης-λουσιφεράσης βασίζεται σε δοκιμασία με ένα κιτ ΑΤΡ βιοφωταύγεια Δοκιμασία (Molecular Probes, Invitrogen). Η ανάλυση βασίζεται στην απαίτηση της λουσιφεράσης για την ATP για την παραγωγή φωτός. Οι μετρήσεις ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο (GloMax® 96 Microplate Luminometer, Promega) σε μία μέγιστη εκπομπή περίπου 560 nm για 300 sec. ΑΤΡ πρότυπα έτρεξαν ταυτόχρονα με κάθε πείραμα για να παραχθεί μία πρότυπη καμπύλη, και οι υπολογισμοί έγιναν με βάση τη καμπύλη για τον προσδιορισμό κυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ. ΑΤΡ εκφράστηκε ανά 10

5 κύτταρα.

Βλάβη DNA

βλάβη στο DNA μετρήθηκε ποσοτικά με 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) στα μέσα μαζικής ενημέρωσης, πυρήνες, και τα μιτοχόνδρια. 8-OHdG είναι μια πολύ συγκεκριμένη υποπροϊόν της οξειδωτικής βλάβης του DNA και αντανακλά την ενδοκυτταρική οξειδωτικό στρες. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πιάτα 35 mm για την ανίχνευση 8-OHdG σε μέσα και πυρήνες, και σε πιάτα 100 mm για μιτοχονδριακή 8-OHdG. Οι πυρήνες και τα μιτοχόνδρια διαχωρίστηκαν με διαφορική φυγοκέντρηση. DNA εκχυλίστηκε από πυρήνες και τα μιτοχόνδρια χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ εκχύλισης DNA. DNA μετατράπηκε σε μονόκλωνο DNA με επώαση στους 95 ° C για 5 λεπτά και ταχέως ψύχεται επί πάγου. Το μετουσιωμένο δείγμα DNA μετά υποβλήθηκε σε πέψη προς νουκλεοζίτες με επώαση με 10 μονάδες νουκλεάσης Ρ1 για 2 ώρες στους 37 ° C σε 20 mM οξικό νάτριο (ρΗ 5.2), που ακολουθείται από κατεργασία με 10 μονάδες αλκαλικής φωσφατάσης επί 1 ώρα στους 37 ° C σε 100 mM Tris (ρΗ 7,5). Το μίγμα της αντίδρασης φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στα 6000 g και το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για το κιτ ELISA 8-OHdG (OxiSelect ™, Cell Biolabs). Το υπόλοιπο διαδικασία έγινε ακολουθώντας το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή του κιτ ELISA 8-OHdG. βλάβη στο DNA τυποποιήθηκε ανά 10

6 κύτταρα.

LDH Knock Down

Η έκφραση της LDHA χτυπήθηκε κάτω από siRNA. Η αλληλουχία στόχος της LDHA ήταν CAACUGCAGGCUUCGAUUA. Thermo Scientific DharmaFECT Επιμόλυνση αντιδραστήρια χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τον κατασκευαστή. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα και κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο siRNA (μη στόχευσης) ή τα siRNA δοκιμή παρασκευάστηκαν εις τριπλούν. 165.000 κύτταρα επωάστηκαν σε τρυβλία καλά 35 mm για 1 ημέρα και επιμολύνθηκαν με 15 μλ siRNA και 6,8 μl Dharmafect για 2 ημέρες. Η φαρμακευτική αγωγή άρχισε μετά από 24 ώρες από την επιμόλυνση. LDH knockdown επιβεβαιώθηκε με ανάλυση στυπώματος Western μετά από 2 ημέρες επιμόλυνσης (αντίσωμα αντι-LDHA, 1:1000, # ab47010, Abcam®).

Cancer Cell Death

κηλίδωση Western και συνεστιακή μικροσκοπία διεξήχθησαν για να ανιχνεύσουν διασπασμένης ΡΑΚΡ [πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης] και παράγοντας επαγωγής απόπτωσης (AIF). PARP είναι ένα υπόστρωμα για κασπάσες και διασπασμένη PARP (cPARP) είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση. ΟΕΕ είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της PARP που εξαρτώνται από τον κυτταρικό θάνατο. Επίσης χρησιμοποιήσαμε αναστολέα κασπάσης και ο αναστολέας PARP για να ελεγχθεί αν αυτοί οι αναστολείς αποκλείουν θάνατο των καρκινικών κυττάρων.

κηλίδωση Western.

Αντισώματα προς PARP (# 9542, χρησιμοποιήθηκε σε 1:1000), και AIF ( # 4642, που χρησιμοποιείται στο 1:1000) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology. cPARP ανιχνεύθηκε σε προϊόντα λύσης ολόκληρου κυττάρου και AIF ανιχνεύθηκε σε πυρηνικά εκχυλίσματα. Για να αποκτήσετε πυρήνες για τη μέτρηση του ΟΕΕ, τα κύτταρα πλύθηκαν σε ψυχρό PBS και εναιωρήθηκαν σε 400 μΙ υποτονικό ρυθμιστικό παγωμένου [10 mM HEPES /KOH (ρΗ 7,9), 2 mM MgCl

2, 0,1 mM EDTA, 10 mM KCL , 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF (φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο) και 1% (ν /ν) ευκαρυωτικών πρωτεάσης κοκτέιλ αναστολέα] επί 10 λεπτά σε πάγο. Το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε απαλά σε 100 μΐ παγωμένο ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (50 mM HEPES /KOH (ρΗ 7,9), 50 mM ΚΟΙ, 300 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10% γλυκερόλη, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF, 1 % (ν /ν) ευκαρυωτικών πρωτεάσης κοκτέιλ αναστολέα) και επωάζεται επί πάγου επί 20 λεπτά. Το κυτταρικό εναιώρημα περιδινήθηκε και φυγοκεντρήθηκε στα 15,000 g για 5 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο λαμβάνεται ως το πυρηνικό λύμα και υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση SDS πηκτής πολυακρυλαμιδίου (PAGE) και ανάλυση κηλίδος western για να μετρηθεί ΟΕΕ.

συνεστιακή μικροσκόπηση.

Τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 4 % παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά. Για την ανίχνευση των ενδογενών πρωτεϊνών με ανοσοφθορισμό, κύτταρα διαπερατά σε 0,25% Triton Χ-100 για 5 λεπτά και στη συνέχεια πλένονται εντός PBS τρεις φορές. Αυτό ακολουθήθηκε από μπλοκάρισμα σε 10% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) σε PBS για 30 λεπτά και επώαση σε πρωτογενές αντίσωμα για 2 ώρες στους 37 ° C. Πρωτογενής αντίσωμα (1:100) παρασκευάστηκε σε 3% BSA σε PBS. Τα πλακίδια πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS και επωάστηκαν με Alexa Fluor 594-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα (1:200, Molecular Probes) για 45 λεπτά. Τέλος, τα πλακίδια πλύθηκαν σε PBS τρεις φορές και συναρμολογείται χρησιμοποιώντας μέσο Vectashield που περιείχε 4, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) (Vector Laboratories). Διαφάνειες παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Olympus FV1000 ομοεστιακό μικροσκόπιο.

αναστολέα της θεραπείας.

κύτταρα CT26 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με αναστολέα της κασπάσης 1 μΜ (Q-Val-Asp-ΟΦ, MP Biomedicals) ή αναστολέας PARP ( INH2BP, 5-ιωδο-6-αμινο-1,2-βενζοπυρόνη, Calbiochem) για 4 ώρες πριν από τη θεραπεία με φαινφορμίνη ή φαινφορμίνη συν οξαμικού. Το ποσοστό των νεκρών κυττάρων μετρήθηκε 24 ώρες μετά τη θεραπεία στην ομάδα Ρ και 12 ώρες μετά τη θεραπεία στην PO ομάδα με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας 7-AAD.

Ποντίκια

παλιά επτά εβδομάδων BALB /χρησιμοποιήθηκαν c ποντίκια (Orientbio Inc. Κορέα). Τα πειράματα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Samsung Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Ερευνών και εκτελέστηκαν σύμφωνα με τις φθάσει (Ζώα στην Έρευνα: Αναφορά σε in vivo πειράματα) κατευθυντήριες γραμμές [20]. Όλοι οι ποντικοί διατηρήθηκαν σε εγκατάσταση ζώων άνευ παθογόνων.

θεραπευτική αγωγή.

ποντικοί BALB /c έλαβαν φυσιολογικό ορό (Ομάδα C, n = 24), οξαμικό 300 mg /kg (Ομάδα Ο , n = 31), φαινφορμίνη 17 mg /kg (ομάδα Ρ, n = 31), ή φαινφορμίνη 17 mg /kg 300 mg /kg οξαμικό (ομάδα ΡΟ, n = 31). Οι ποντικοί υποδορίως εμβολιάσθηκαν με 1 χ 10

7 CT26 κύτταρα σε 0,2 ml PBS στο αριστερό πλευρό. Ειδικός φάρμακα της κάθε ομάδας χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά 3 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων. Όλα τα φάρμακα εγχύθηκαν σε ένα συνολικό όγκο 0.25 ml αραιωμένο με αποστειρωμένο νερό. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή καθημερινά για 21 ημέρες. Το σωματικό βάρος και το μέγεθος του όγκου μετρήθηκαν 3 φορές την εβδομάδα. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο εξωτερικά (Mitutoyo, Ιαπωνία). Το μέγεθος του όγκου εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας έναν τύπο = (d1 d2 ×

2) /2, όπου Δ1 και Δ2 είναι η μεγαλύτερη και η μικρότερη διάμετρος του όγκου, αντίστοιχα, το οποίο μετράται σε mm.

Την ημέρα 21 μετά την αγωγή, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με 2,5% enflurane σε O

2 και οι όγκοι αφαιρούνται και κόβονται στο μισό. Το μισό από κάθε όγκου ήταν θραύση κατεψυγμένα και το άλλο μισό μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη σε 0.1 Μ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C.

Προσδιορισμός απόπτωσης.

ιστοί όγκου τμήθηκαν σε ένα πάχος 10 μm χρησιμοποιώντας κρυοστάτη, απόψυξης τοποθετήθηκαν σε πλακίδια επικαλυμμένα με ζελατίνη και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C. Για την ανίχνευση απόπτωσης, τομές ιστών χρωματίστηκαν με την μέθοδο τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλτρανσφεράσης μεσολάβηση dUTP nick-άκρο επισήμανση (TUNEL) με τη χρήση του φλουορεσκεΐνη

in situ

κιτ ανίχνευσης θανάτου κυττάρου (αδιέξοδο ™ Φθορομετρικής TUNEL Σύστημα? Promega). Τα πλακίδια παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο συνεστιακό LSM700 (Zeiss, Germany). Τα ΡΙΤΟ-επισημασμένα κύτταρα που υφίστανται απόπτωση αναγνωρίστηκαν από πυρήνες με ισχυρά πράσινο φθορισμό. Για την ποσοτικοποίηση, TUNEL θετικά κύτταρα μετρήθηκαν σε τρία τμήματα (304 μm × 304 μm) σε × 20.

18F-FDG μικρό ζώο PET /CT.

PET /CT διεξήχθη 24 ημέρες μετά την ένεση CT26 και 21 ημέρες μετά την έναρξη φαρμακευτικές αγωγές. Ένα ειδικό μικρό ζώο PET /CT (Inveon πολυτροπικότητα System, Τομέας Υγείας της Siemens, Knoxville, TN, USA) χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση του ποντικιού. εγγενή χωρική ανάλυση και αξονικό τομέα-of-view ήταν 1,4 χιλιοστά και 12,5 cm, αντίστοιχα. Κατά την πρώτη, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνιο. Μετά από αξονική τομογραφία για διόρθωση εξασθένησης (τάση σωλήνα 60 kVp, ρεύμα σωλήνα 400 μΑ) πραγματοποιήθηκε, 7.4 ± 3 MBq του

18F-FDG εγχύθηκε μέσω της φλέβας της ουράς. ΡΕΤ scan εκπομπής για 5 λεπτά διεξήχθη 60 λεπτά μετά την ένεση του

18F-FDG. Ένα ποντίκι σε μια στιγμή είχε απεικονιστεί και να διατηρείται σε μια ζεστή παλέτα κατά τη διάρκεια της διαδικασίας απεικόνισης. Μετά την απόκτηση δεδομένων, εγκάρσιες εικόνες PET ανακατασκευάστηκαν με διέταξε υποσύνολο προσδοκία μεγιστοποίηση 3D αλγόριθμο (4 επαναλήψεις) με μέγεθος voxel των 0.776 × 0.776 × 0,796 χιλιοστά. CT εικόνες ανακατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα φιλτραρισμένο πίσω αλγορίθμου προβολής με ένα φίλτρο Shepp-Logan.

PET, CT και συγχωνευμένες εικόνες PET /CT εμφανίστηκαν και αναλύονται με το λογισμικό Inveon Έρευνας στο Χώρο Εργασίας (Τομέα Υγείας της Siemens). Ένας όγκος ενδιαφέροντος (VOI) που καλύπτουν ολόκληρο όγκοι που ορίζονται με βάση CT εικόνες. Μέση τυποποιημένη τιμή πρόσληψης (SUV

avg) του όγκου ελήφθη με τη χρήση του VOI από την εικόνα CT. SUV διορθώθηκε για ένεση δόση του

18F-FDG, το βάρος σώματος ποντικού και του όγκου του μεγέθους. Τα δεδομένα SUVavg εμφανίζονται ως ποσοστό της βασικής γραμμής, προκειμένου να εκτιμηθεί εύκολα σχετικές μεταβολές.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με το πρόγραμμα λογισμικού στατιστικών IBM SPSS (SPSS Inc., Chicago, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής ). Οι στατιστικές διαφορές μεταξύ των μέσων προσδιορίστηκαν με την

t-test

ή μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από δοκιμή του Tukey HSD. Ονομαστική κατηγορικά δεδομένα συγκρίθηκαν με τετραγωνικό chi κατά Pearson. Η στατιστική σημαντικότητα για p & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

φαινοφορμίνης Εκθέματα Ανώτατη Cancer Cell κυτταροτοξικότητα από μετφορμίνη

Τα περισσότερα διαθέσιμα στοιχεία σχετικά με τις επιπτώσεις της διγουανίδια για τον καρκίνο κύτταρα, και τη δική μας προηγούμενη εργασία [21] – [23], αφορούσαν μετφορμίνη. Έχουμε παρατηρήσει προηγουμένως μετφορμίνη κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα MCF7, αλλά αυτό απαιτείται υψηλότερες δόσεις για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα [21], [22]. Λόγω των υψηλών επιπέδων μετφορμίνης που απαιτούνται και την πιθανή υψηλότερη δραστικότητα του φαινφορμίνη [24], θέλαμε να συγκρίνει άμεσα την κυτταροτοξικότητα των δύο φαρμάκων σε πολλαπλές κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Σε κύτταρα E6E7Ras, ένα μοντέλο του HPV + κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα από πλακώδες επιθήλιο [18], [19], η ΕΚ

50 για τη μετφορμίνη και φαινφορμίνη για την προώθηση θάνατο των καρκινικών κυττάρων ήταν 504 mM και 0,6 mM, αντίστοιχα. Η ΕΚ

50 της μετφορμίνης ήταν 840 φορές υψηλότερη από εκείνη του φαινφορμίνη (Εικ. 1Α). Φαινφορμίνη έδειξε εξαιρετική κυτταροτοξικότητα σε διάφορες άλλες κυτταρικές γραμμές καρκίνου, όπου η μετφορμίνη έδειξε μικρή, εάν υπάρχει, αποτέλεσμα υπό αυτές τις συνθήκες (Εικ. 1 Β-Ρ). Το ΕΚ

50 μετφορμίνης ήταν 15.200.000 φορές, 448 φορές, 67 φορές, 26 φορές, και 25 φορές υψηλότερο από ό, τι φαινοφορμίνης σε B16F10 (μελάνωμα), MCF7 (καρκίνος του μαστού), CT26 (καρκίνος του παχέος εντέρου), Α549 (καρκίνος του πνεύμονα) και DU145 (καρκίνος του προστάτη), αντίστοιχα.

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 2 (Α) ή προσδιορίστηκε ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων (Β-ρ). (Α) κύτταρα E6E7Ras, ένα μοντέλο ποντικού της HPV + κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, (Β) κύτταρα μελανώματος B16F10 ποντικού, (C) κύτταρα αδενοκαρκινώματος Α549 ανθρώπινου πνεύμονα, (D) MCF7 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου μαστού, του παχέος εντέρου ποντικού (Ε) CT26 καρκινικά κύτταρα, και καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη (F) DU145. *:. Ρ & lt? 0,05

Η

φαινφορμίνη και οξαμικού παρουσίασαν Επίδραση Synergistic για τον Καρκίνο κυτταροτοξικότητας

διγουανίδια, π.χ. μετφορμίνη και φαινφορμίνη, είναι γνωστοί αναστολείς του συμπλόκου Ι της μιτοχονδριακής αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων και προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι τα μιτοχόνδρια είναι σημαντικοί στόχοι της μετφορμίνης σε καρκινικά κύτταρα του μαστού [22]. Αναστολή της μιτοχονδριακής μεταβολισμό προωθεί γλυκολυτικό μεταβολισμό και την παραγωγή γαλακτικού οξέος και των εξαγωγών. Ως εκ τούτου, σκέφθηκαν ότι αναστολή της μετατροπής του πυροσταφυλικού σε γαλακτικό θα προωθήσει την είσοδο του πυροσταφυλικού σε μιτοχονδριακό μεταβολισμό και την ενίσχυση των κυτταροτοξικών επιδράσεων φαινφορμίνη. Οξαμικό είναι ένας γνωστός αναστολέας της LDH [25]. Σε μελέτες που παρουσιάζονται εδώ, οξαμικό μόνος έδειξε μια ασθενή κυτταροτοξική δράση στην περιοχή από 0-80 mM (Σχ. 2Α). Φαινφορμίνη μόνος έδειξε κυτταροτοξικά αποτελέσματα, αλλά η δραστικότητα ήταν διαφορετική μεταξύ των διαφόρων καρκινικών κυτταρικών γραμμών (σχ. 2Β, 2C). Φαινφορμίνη και οξαμικού συγχορήγηση ωστόσο, εμφάνισε μια ισχυρή συνεργιστική δράση σχετικά με τον καρκίνο θανάτωσης κυττάρων σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν. δείκτη συνδυασμού (CI) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση πολλαπλής φάρμακο-αποτελέσματος του Chou-Talalay [26] στο πρόγραμμα CalcuSyn. ΠΙ αντανακλούν το είδος της αλληλεπίδρασης μεταξύ των συγχορηγούμενων φαρμάκων. τιμές CI στο εύρος 0.9 και 1.1 δείχνουν ένα προσθετικό αποτέλεσμα, ενώ CI τιμές των & lt? 0.9 δείχνουν συνέργεια και CI τιμές & gt? 1.1 δείχνουν ανταγωνισμό. Ο δείκτης συνδυασμού (CI) ήταν 0.494 σε E6E7Ras, 0.310 σε B16F10, 0.009 σε CT26, 0.227 σε Α549, και 0.067 σε DU145, και 0.503 σε MCF7 (ισχυρή συνέργεια) όταν συγχορηγούνται σε σύγκριση με μία απλή χορήγηση στο ΕΔ

50. Μεγαλύτερη θεραπεία (Εικ. 2Β) και υψηλότερες δόσεις (Σχ. 2C) οδήγησε σε αυξημένη κυτταροτοξικότητα σε φαινφορμίνη.

(Α) E6E7Ras κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 2 ημέρες με οξαμικό στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις (0-80 mM) και στη συνέχεια τα νεκρά κύτταρα μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (B, C) Τα αναφερόμενα κύτταρα γραμμές υπέστησαν κατεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις φαινφορμίνη, οξαμικό, ή συνδυασμούς των δύο φαρμάκων. Σε κύτταρα (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 1, 2, ή 3 ημέρες πριν από την καταμέτρηση των νεκρών κυττάρων. Σε κύτταρα (C) υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24 ώρες πριν από τον προσδιορισμό αριθμού των νεκρών κυττάρων. C: έλεγχος, P: φαινφορμίνη, O: οξαμικό, PO: φαινφορμίνη + οξαμικού. Στο (C) Οι αριθμοί κάτω από κάθε ράβδο δεικνύουν συγκεντρώσεις κάθε φαρμάκου σε mM (π.χ., P0.5O20 σημαίνει Ρ 0,5 mM + O 20 mM). * Υποδηλώνει μια συνεργική επίδραση στο PO ομάδα σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες.

Η

Επιπτώσεις της φαινφορμίνη και οξαμικού στην Γαλακτική Παραγωγής και pH

Τα διγουανίδια είναι γνωστό ότι ενισχύουν την πρόσληψη γλυκόζης, γλυκολυτικό μεταβολισμό , και έκκριση γαλακτικού. Οξαμικό, από την άλλη πλευρά, είναι ένας αναστολέας της LDH και αναμένεται να μειώσει την παραγωγή γαλακτικού οξέος από τα κύτταρα. Για να εξεταστεί κατά πόσο οι ενώσεις αυτές επηρεάζουν τις τεκμαίρεται κυτταρικούς στόχους, γαλακτικό στο μέσο καλλιέργειας μετρήθηκε σε CT26. Από γαλακτικό μεταφέρεται από το κύτταρο μαζί με ένα πρωτόνιο, μετρήθηκε επίσης το ρΗ του μέσου. Φαινφορμίνη αυξημένη παραγωγή γαλακτικού και μειωμένη μέσον ρΗ σε σύγκριση με τον έλεγχο, δείχνοντας αυξημένους ρυθμούς της γλυκόλυσης. Οξαμικό μειωμένη παραγωγή γαλακτικού και αυξημένο ρΗ, γεγονός που υποδηλώνει την αναστολή του αναμένοντας LDH. Η προσθήκη οξαμικό να φαινφορμίνη αντιστραφεί τόσο την αύξηση της παραγωγής γαλακτικού οξέος και τη μείωση του ρΗ που προκαλείται από κατεργασία φαινφορμίνη (Σχ. 3Α, 3Β).

κύτταρα CT26 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες ενώσεις για 1, 2, ή 3 (Α) ή το ρΗ του μέσου (Β) προσδιορίστηκε. P: φαινφορμίνη 1 mM, O: οξαμικό 40 mM, PO: φαινφορμίνη 1 mm + οξαμικό 40 mM, C: χωρίς θεραπεία ελέγχου. *: Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες. †: P & lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα C και Ρ

Η

κυτταροτοξικά αποτελέσματα φαινφορμίνη και οξαμικού σχετίζονται με συγκρότημα Ι και LDH Αναστολή, αντίστοιχα

Όπως περιγράφεται παραπάνω, η θεωρούμενη στόχοι φαινφορμίνη και οξαμικού είναι πολύπλοκες Ι της μιτοχονδριακής αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων και LDH, αντίστοιχα. Οι αλλαγές στην γαλακτικού ως απάντηση σε αυτές τις ενώσεις υποστηρίζουν αυτό το συμπέρασμα. Τα ακόλουθα πειράματα σχεδιάστηκαν για να καθορίσουν πιο άμεσα τις επιδράσεις των ενώσεων επί υποθετικών τους στόχους. Πρώτον, τα αποτελέσματα της φαινφορμίνη επί συμπλόκου Ι δραστικότητα μετρήθηκε απευθείας όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. θεραπεία φαινφορμίνη των κυττάρων αναστέλλεται ισχυρά μιτοχονδριακού συμπλόκου Ι δραστικότητα (Σχ. 4Α). Για να τεκμηριώσει περαιτέρω τη διαπίστωση αυτή, το μιτοχονδριακό οξειδωτικό μεταβολισμό μετρήθηκε από την Seahorse XF24-3 αναλυτή εξωκυττάριο ροή μετά την αγωγή των κυττάρων CT26 με τις ενώσεις. Φαινφορμίνη μείωσε το ρυθμό κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) όπως αναμένεται για ένα συγκρότημα Ι αναστολέα. Σε αντίθεση, οξαμικό αυξημένη OCR. Αυτό αναμένεται επίσης επειδή πυροσταφυλικό θα κατευθυνθούν προς μιτοχονδριακό οξειδωτικό μεταβολισμό, αν LDH αναστέλλεται. Είναι ενδιαφέρον, OCR ήταν χαμηλότερη στην φαινοφορμίνης συν οξαμικό ομάδα (Εικ. 4Β). Methyl ηλεκτρικό μπορεί να παρακάμψει τη μεταφορά ηλεκτρονίων μέσω συμπλόκου Ι γιατί δωρίζει ηλεκτρόνια κατευθείαν στο συγκρότημα ΙΙ της μιτοχονδριακής αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων. Η προσθήκη μεθυλο ηλεκτρικού να φαινφορμίνη μειωμένη την κυτταροτοξική δράση του φαινφορμίνη (Εικ. 4C), προτείνοντας και πάλι ότι η αναστολή συγκρότημα Ι είναι ένας σημαντικός στόχος του φαρμάκου.

(Α) κύτταρα CT26 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς φαινφορμίνη για 24 ώρες και στη συνέχεια εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν για τη μέτρηση συμπλόκου Ι δραστηριότητα όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Ο άξονας Υ είναι% του συμπλόκου Ι δραστηριότητας, όταν η δραστηριότητα του συμπλόκου Ι στην ομάδα ελέγχου θεωρείται ως 100%. (Β) Επίδραση των υποδεικνυόμενων ενώσεων σε κατανάλωση οξυγόνου από τα κύτταρα CT26 προσδιορίστηκαν ως δείκτης της μιτοχονδριακής οξειδωτικού μεταβολισμού. (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς φαινφορμίνη παρουσία ή απουσία του μεθυλίου ηλεκτρικό, το οποίο παρακάμπτει συμπλόκου Ι της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων. Μετά από 24 ώρες προσδιορίστηκε ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων στις καλλιέργειες. MS: μεθυλο ηλεκτρικό. C: έλεγχος, P: φαινφορμίνη 1 mM, O: οξαμικό 40 mM, PO: φαινφορμίνη 1 mm + οξαμικό 40 mm. *: P & lt? 0,05

Η

Επίσης μετρήθηκαν Οι άμεσες επιπτώσεις της φαινφορμίνη και οξαμικού σχετικά με τη δραστηριότητα της LDH.. Η επεξεργασία των κυττάρων με φαινφορμίνη αυξημένη δραστηριότητα LDH και κατεργασία με οξαμικό ανέστειλε δραστηριότητα LDH (Εικ. 5Α). Αυτό είναι σύμφωνο με τις γνωστές κυτταρικές δραστηριότητες των δύο φαρμάκων. Σημαντικά, οξαμικό επίσης έντονα ανέστειλε δραστηριότητα LDH σε κύτταρα κατεργασμένα φαινφορμίνη, υποδεικνύοντας ότι η φαινφορμίνη δεν είναι σε θέση να αντιστρέψει τις ανασταλτικές επιδράσεις του οξαμικού επί του ενζύμου.

(Α) κύτταρα CT26 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις ενώσεις, όπως αναφέρεται κατωτέρω κάθε μπαρ, για 24 ημέρες. Εκχυλίσματα στη συνέχεια παρασκευάζονται για τον προσδιορισμό της δραστικότητας του ενζύμου LDH. Ο άξονας Υ είναι% της δραστηριότητας LDH, όταν η δραστικότητα της LDH της ομάδας ελέγχου θεωρείται ως 100%. (Β) Το εξωκυτταρικό ρυθμό οξίνισης με την παρουσία των υποδεικνυόμενων φαρμάκων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα όργανο ιππόκαμπος XF24 όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.