Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs), περίπου 22 νουκλεοτιδίων μη-κωδικοποίησης μόρια RNA, ρυθμίζουν ποικίλες κεντρικό φυσιολογικές ή παθολογικές διεργασίες, που περιλαμβάνουν εμβρυϊκή ανάπτυξη και ογκογένεση. Για να αποκτήσετε ολοκληρωμένη προφίλ έκφρασης των miRNAs σε ανθρώπινα έμβρυα, που χαρακτηρίζεται έκφραση των miRNAs σε εβδομάδες 4-6 της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης χρησιμοποιώντας miRNA microarrays και εντοπίστηκαν 50 ανθρώπινα έμβρυα ειδικά miRNAs (HES-miRNAs). Επιπλέον, επιλέξαμε τρία μη συντηρημένες ή πρωτευόντων ειδικών miRNAs, HSA-miR-638, -720, και -1280, και εξετάστηκαν τα επίπεδα έκφρασης τους σε διάφορες φυσιολογικών και καρκινικών ιστών. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση των περισσοτέρων miRNAs είναι εξαιρετικά χαμηλή κατά τη διάρκεια της πρώιμης ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης. Επιπλέον, η έκφραση ορισμένων μη συντηρημένες ή πρωτευόντων ειδικών miRNAs είναι σημαντικά διαφορετική μεταξύ του όγκου και των αντίστοιχων δειγμάτων κανονικού ιστού, που υποδηλώνει ότι οι miRNAs είναι στενά συνδεδεμένα με τις παθολογικές διαδικασίες διαφόρων όγκων. Η μελέτη αυτή παρουσιάζει την πρώτη ολοκληρωμένη επισκόπηση της έκφρασης των miRNAs κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης και προσφέρει άμεση απόδειξη της σχέσης ανάμεσα στην ανθρώπινη πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη και ογκογένεση

Παράθεση:. Λιν Υ, Zeng Υ, Zhang F, Xue L, Χουάνγκ Z, Λι W, et al. (2013) Χαρακτηρισμός της έκφρασης των microRNA και η ανακάλυψη νέων Τα microRNAs με την εμφάνιση καρκίνου κατά τη διάρκεια του Ανθρώπου εμβρυϊκά Ανάπτυξης. PLoS ONE 8 (8): e69230. doi: 10.1371 /journal.pone.0069230

Επιμέλεια: Wei Yan, Πανεπιστήμιο της Νεβάδα Ιατρική Σχολή, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Μαρ του 2013? Αποδεκτές: 6 του Ιουνίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 2 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό υψηλής Τεχνολογίας Έρευνας και Ανάπτυξης του Προγράμματος της Κίνας (863 Program) Επιχορήγηση 2006AA02A306, Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας Grant 30871245 και 31271511. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα microRNAs (miRNAs) είναι ~ 22 νουκλεοτιδίων (nt) μη κωδικοποίησης RNA μόρια που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση στο επίπεδο της αποικοδόμησης RNA αγγελιαφόρου ή μετάφραση, ασκούν ουσιώδεις λειτουργίες σε διαφορετικές βιολογικές διαδικασίες που κυμαίνονται από ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, διαφοροποίηση, και μεταβολισμό, στην κανονική ανάπτυξη των ιστών και του εμβρύου, και ακόμη και ογκογένεση [1-4] . Μεταβολές στην έκφραση miRNA εμπλέκεται στην έναρξη, την εξέλιξη και τη μετάσταση ανθρώπινων όγκων [5]. Σταδιακά όλο και περισσότερα στοιχεία δείχνουν μια άμεση σχέση μεταξύ miRNAs και πολλές ασθένειες, ιδιαίτερα του καρκίνου.

Χρησιμοποιώντας διάφορες πειραματικές μεθόδους, προηγούμενες μελέτες στην εμβρυογένεση σε ζώα διαπίστωσε ότι ορισμένες miRNAs συνεχώς αναφέρονται, και οι περισσότεροι παίζουν σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση ή τη συντήρηση της ταυτότητας των ιστών [6-10]. Ανθρώπινη ανάπτυξη κατά τις πρώτες 8 εβδομάδες εμβρυογένεσης είναι δυνητικά ένα από τους πλέον ενδιαφέροντες τομείς της βιολογικής έρευνας. Συγκεκριμένα, ορισμένες σημαντικές ιστούς και όργανα, συμπεριλαμβανομένου νευρογένεση και την ανάπτυξη του ήπατος, άρχισε να σχηματίζεται κατά τη διάρκεια της εβδομάδας 4-6 (Carnegie Στάδια 10-17) ανθρώπινης εμβρυογένεσης [11]. Πρόσφατα, η ερευνητική ομάδα μας και άλλοι έχουν χαρακτηρίσει τις μεταγραφικές προφίλ της έκφρασης mRNA του γονιδιώματος σε όλη τη διάρκεια της ανθρώπινης εμβρυογένεσης με τη χρήση μικροσυστοιχιών [12,13]. Ωστόσο, η ανθρώπινη έκφραση των miRNAs σε αυτήν την περίοδο μένει να διευκρινιστεί.

Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι τα miRNAs εμπλέκονται σε διάφορες πτυχές της ογκογένεσης και των ζώων εμβρυογένεση (κριτική στην 4,5,14-21). Το 1892, οι Γάλλοι βιολόγοι Lobstein και Recamier σκεφτεί την ιδέα της εμβρυϊκής προέλευσης των όγκων, για πρώτη φορά. Στη δεκαετία του 1970, ο Δρ Pierce πρότεινε το «καρκίνο, μια αναπτυξιακή βιολογία» θεωρία και επεσήμανε ότι η ογκογένεση ήταν στενά συνδεδεμένος με την αναπτυξιακή βιολογία, σε μεγάλο βαθμό [22-27]. Επί του παρόντος, όμως, τα σχετικά αποδεικτικά στοιχεία της σχέσης μεταξύ πρώιμη ανάπτυξη του ανθρώπινου εμβρύου και ογκογένεση είναι ακόμη περιορισμένη [28-32]. Για να καλύψει αυτό το σημαντικό κενό στη γνώση, ως εκ τούτου, περισσότερες μελέτες είναι απαραίτητες.

Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίστηκαν τα προφίλ έκφρασης των miRNAs κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης και χαρακτηρίζεται χρησιμοποιώντας miRNAs μικροσυστοιχίες. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι σχεδόν όλα τα miRNAs γνωστής λειτουργίας που είναι εντόνως εκφρασμένη ή εμφανίζουν μεταβολές έκφρασης κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης έχουν εμπλακεί σε αρκετές κακοήθεις παθήσεις. Επιπλέον, οι έρευνες έκφραση ιστού αρκετών miRNAs άγνωστης λειτουργίας που είναι εντόνως εκφρασμένα ή υφίστανται μεταβολές έκφρασης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του ανθρώπινου εμβρύου υποδεικνύουν ότι η έκφραση αυτών των miRNAs ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των δειγμάτων του καρκίνου και των αντίστοιχων φυσιολογικούς ιστούς, γεγονός που υποδεικνύει ότι αυτές οι miRNAs μπορεί επίσης να παίξει σημαντικό ρόλους στην ογκογένεση. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν ενδείξεις σχετικά με τη στενή σχέση μεταξύ της ανθρώπινης εμβρυογένεσης και της καρκινογένεσης, και περαιτέρω αποκαλύπτουν ότι miRNAs που σχετίζονται με την εμβρυϊκή ανάπτυξη με άγνωστες λειτουργίες μπορεί να εμπλέκονται στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

συλλογής εμβρύων και κυτταρική σειρά

Ανθρώπινο συλλογής εμβρύων διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Κατάλληλη γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τους ασθενείς και την έγκριση που έχει αποκτηθεί από την Επιτροπή Ιατρικής Δεοντολογίας των Zhongnan Νοσοκομείου στο Πανεπιστήμιο Γουχάν, ακολουθώντας εθνικές κατευθυντήριες γραμμές.

μικροσυστοιχιών και Βιοπληροφορική Αναλύσεις

Ο προσδιορισμός microRNAs μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένας πάροχος υπηρεσιών (LC Sciences). Η δοκιμασία ξεκίνησε με 2 έως 5 μg συνολικού RNA δείγμα, το οποίο ήταν το μέγεθος κλασματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μία ΥΜ-100 Microcon φυγοκεντρικού φίλτρου (Millipore). Τα απομονωμένα μικρά RNAs (& lt? 300 nt) ήταν 3′-επεκταθεί με μια ουρά πολυ (Α) χρησιμοποιώντας πολυ (Α) πολυμεράση. Μια ετικέτα ολιγονουκλεοτίδιο συνδέθηκε με την ουρά πολυ (Α) για μεταγενέστερη χρώση φθορίζουσα χρωστική? δύο διαφορετικές ετικέτες χρησιμοποιήθηκαν για τα δύο δείγματα RNA σε πειράματα διπλής δείγμα. Ο υβριδισμός διεξήχθη όλη τη νύχτα σε ένα

μ

Paraflo ™ μικοτσίπ χρησιμοποιώντας μια αντλία μικροκυκλοφορία (Ατακτικό Technologies) [33,34]. Στο μικοτσίπ, κάθε ανιχνευτής ανίχνευση αποτελείτο από χημικά τροποποιημένου νουκλεοτιδίου κωδικοποιητική τμήμα συμπληρωματικό προς στόχευση microRNA (από miRBase, https://www.mirbase.org/) ή άλλο RNA (έλεγχος ή ο πελάτης ορίζεται αλληλουχίες) καθώς επίσης και ένα spacer τμήμα πολυαιθυλενογλυκόλης για την επέκταση του τμήματος κωδικοποίησης μακριά από το υπόστρωμα. Οι ανιχνευτές ανίχνευσης δημιουργήθηκαν από το

in situ

σύνθεση χρησιμοποιώντας PGR (φωτοπαραγόμενο αντιδραστήριο) χημεία. Οι θερμοκρασίες τήξης υβριδισμού με βάση χημικές τροποποιήσεις των ανιχνευτών ανίχνευσης. Η υβριδοποίηση χρησιμοποιούνται 100 μί ρυθμιστικού διαλύματος 6xSSPE (0,90 Μ NaCl, 60 mM Na

2HPO

4, 6 mM EDTA, ρΗ 6.8) που περιέχει 25% φορμαμίδιο στους 34 ° C. Μετά την υβριδοποίηση, η ανίχνευση χρησιμοποιείται επισήμανση φθορισμού με ετικέτα-ειδική Cy3 και Cy5 βαφές. εικόνες υβριδισμού συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή λέιζερ (GenePix 4000B, Molecular Device) και ψηφιοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού ανάλυσης εικόνας Array-Pro (Media Cybernetics). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με πρώτα αφαιρώντας το υπόβαθρο και την ομαλοποίηση των σημάτων χρησιμοποιώντας φίλτρο Lowess (τοπικά ζυγισμένη παλινδρόμηση) [35]. Για πειράματα δύο χρωμάτων, η αναλογία των δύο συνόλων σημάτων ανιχνεύεται (log

2 μετασχηματίζονται, ισορροπημένη) και υπολογίστηκαν τιμές ρ του Τ-τεστ? διαφορικά σήματα ανιχνεύθηκαν ήταν αυτές με ρ-τιμές μικρότερες από 0.01. Η κανονικοποιημένη ένταση του σήματος από 8 δείγματα (Εβδομάδα 4 της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης: ZN18, ZN46 /47, ZN75? Εβδομάδα 5: ZN38, ZN43, ZN63-1? Εβδομάδα 6: ZN61, ZN70) χρησιμοποιήθηκε η ανάλυση ομαδοποίησης χρησιμοποιώντας το ένα ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) από έναν πάροχο υπηρεσιών (LC Sciences). έχουν κανονικοποιημένα δεδομένα για όλες τις σειρές έχουν κατατεθεί στο Gene Expression Omnibus (GEO) στο National Center for Biotechnology Information (NCBI), προσβάσιμη μέσω του αριθμού ένταξη GEO Σειρά GSE46795 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo /query/acc.cgi?acc=GSE46795).

υψηλής πυκνότητας πολλαπλών όγκων οργάνων και φυσιολογικό μικροσυστοιχίες ιστού (κατάλογος MC5003), που περιέχει 18 τύπους όγκων (20 περιπτώσεις ανά τύπο) και κανονική αντίστοιχη ελέγχους (5 περιπτώσεις ανά τύπο), αγοράστηκαν από την US Biomax. Τα miRNA και κωδικοποιημένα ολιγονουκλεοτίδια για

in situ υβριδισμού

αγοράστηκαν ως επισημασμένο με διγοξιγενίνη κλειδωμένο νουκλεϊκό οξύ (LNA) ανιχνευτές από Exiqon (Δανία). Η αλληλουχία των ανιχνευτών ανίχνευσης LNA ήταν: LNA-638: 5′-DIG-AGGCCGCCACCCGCCCGCGATCCT-3 ‘? LNA-720: 5’-DIG-TGGAGGCCCCAGCGAGA-3 ‘? και LNA-1280: 5’-DIG-GGGTGGCAGCGGTGGGA-3 ‘. LNA-U6: 5’-DIG-CACGAATTTGCGTGTCATCCTT-3 ‘και LNA-σκαρφάλωμα: 5′-DIG-GTGTAACACGTCTATACGCCCA-3’ χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός και αρνητικός έλεγχος ανιχνευτές, αντίστοιχα. Η

in situ υβριδισμού

της συστοιχίας ιστού για miRNAs experssion πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός παροχέα υπηρεσιών (Shaanxi Chaoying Biotechnology Co, LTD, Shaanxi της Κίνας), και διαφάνειες διαβάστηκαν από δύο ανεξάρτητους ερευνητές. Η ένταση της χρώσης βαθμολογήθηκε ως αρνητικό (- /0)., Η ασθενής (+ /1), μέτρια (++ /2), ή ισχυρά (+++ /3) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36,37]

miRNA σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

δοκιμασία miRNA RT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός παροχέα υπηρεσιών (LC Sciences). Εν συντομία, miRNA ποσοτικοί προσδιορισμοί εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας TaqMan

® microRNA Αναλύσεις και TaqMan® Οικουμενική PCR Master Mix και αναλύονται με ΑΒΙ PRISM 7000 Sequence Detection System. RNU24 χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για να προσδιοριστεί σχετική έκφραση miRNA. Κάθε δείγμα έγινε εις τριπλούν.

Στατιστικές αναλύσεις

Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των κανονικοποιημένων δεδομένων για εβδομάδες 4-6 για τον εντοπισμό miRNAs των οποίων η έκφραση αλλάξει. Για να συγκρίνετε έκφραση miRNAs σε ανθρώπινο φυσιολογικό και καρκίνος ιστούς, δίπλευρη

t

δοκιμές έγιναν με τη χρήση των παραπάνω βαθμολογίες των δειγμάτων.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Χαρακτηρισμός του Student των miRNA προφίλ έκφρασης κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης

Για να προσδιορίσετε τα προφίλ έκφρασης των miRNAs ανθρώπινων εμβρύων, miRNA δοκιμασίες μικροσυστοιχίες πραγματοποιήθηκαν σε δείγματα ανθρώπινου εμβρύου (εβδομάδες 4, 5, και 6 μετά τη γονιμοποίηση) με τη χρήση της τεχνολογίας μParaflo®, και τις μικροσυστοιχίες ακατέργαστα δεδομένα αναλύθηκαν. Η σειρά καλύπτει όλες τις μεταγραφές miRNA διαθέσιμα στη βάση δεδομένων Sanger miRBase (αφήστε 10.1). Για λεπτομέρειες, δείτε τις πειραματικές διαδικασίες και συμπληρωματικά στοιχεία (Πίνακας S1 διαθέσιμα στο διαδίκτυο). Κατά συνέπεια, miRNAs δυνάμεις παρουσιάζουν σήμα μεγαλύτερο από 32 θεωρήθηκαν ως ανιχνεύεται έκφραση. Μετά την κανονικοποίηση, μια ισχυρή κατώφλι σήμα ανίχνευσης miRNA ορίστηκε ως 500 (σχήμα 1). Έχουμε ορίσει αυτά τα 50 miRNAs (~ 6%), στην οποία το σήμα έκφραση ήταν μεγαλύτερη από 500 οποιουδήποτε σταδίου στις εβδομάδες 4, 5, ή 6 κατά την ανθρώπινη εμβρυϊκή ανάπτυξη, καθώς ανθρώπινου εμβρύου-ειδικό miRNAs (HES-miRNAs) (Πίνακας 1 ).

επίπεδα έκφρασης των miRNAs κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης (εβδομάδες 4, 5, και 6 μετά τη γονιμοποίηση) με την ισχύ του σήματος μεγαλύτερη 32 θεωρήθηκαν ως ανιχνεύεται έκφραση. Ένα ισχυρό όριο σήμα ανίχνευσης miRNA ορίστηκε ως 500 μετά από κανονικοποίηση. MiRNAs με ένα σήμα φθορισμού μεγαλύτερο από 500 σε οποιοδήποτε στάδιο στις εβδομάδες 4, 5 ή 6 ορίστηκαν ως HES-miRNAs.

Η miRNA

Εβδομάδα 4

Εβδομάδα 5

Εβδομάδα 6

hsa-miR-1031020.97589.63775.30hsa-miR-106a3717.471283.56988.08hsa-miR-106b705.36336.58217.08hsa-miR-107837.20446.95520.07hsa-miR-10b1679.971511.97688.29hsa-miR-1224805.009396.8510671.26hsa-miR-1246356.13816.55100.26hsa-miR-125a-5p387.96827.091146.67hsa-miR-125b558.09937.533407.28hsa-miR-126513.43257.52195.18hsa-miR-126867.10212.18725.03hsa-miR-1275238.04928.53413.71hsa-miR-1280189.87292.811238.08hsa-miR-130a522.76130.33161.38hsa-miR-130b827.85593.00936.95hsa-miR-151-5p713.59579.19423.27hsa-miR-15b1041.17788.21368.30hsa-miR-161080.15395.87286.75hsa-miR-174108.911437.681210.55hsa-miR-181a312.21269.73741.07hsa-miR-181b192.98187.58873.77hsa-miR-182341.78579.71453.59hsa-miR-191482.51483.55631.69hsa-miR-199a-3p1284.651201.391165.51hsa-miR-19b758.72559.73223.40hsa-miR-206791.121067.481658.21hsa-miR-20a3614.131105.53804.23hsa-miR-20b1471.15540.45323.50hsa-miR-2142654.733566.049605.29hsa-miR-23b745.25594.28767.96hsa-miR-251871.251553.321021.11hsa-miR-26a4645.233390.432536.21hsa-miR-320a1849.633185.424495.39hsa-miR-320b1358.111904.943209.74hsa-miR-320c1666.092358.804068.96hsa-miR-320d790.281072.821897.73hsa-miR-361-5p751.92719.17643.41hsa-miR-423-5p553.06888.43400.99hsa-miR-432499.71807.49534.52hsa-miR-4511355.12622.2018.66hsa-miR-483-5p480.512580.411537.07hsa-miR-574-5p163.53375.89709.17hsa-miR-6384622.856092.422891.58hsa-miR-663290.15525.9244.41hsa-miR-720101.92181.661255.10hsa-miR-92a11338.0811838.016909.45hsa-miR-92b4171.404315.192556.64hsa-miR-93872.20552.87445.45hsa-miR-936323.52512.7235.61hsa-miR-99b510.57635.731232.78Table 1. Κατάλογος των ανθρωπίνων εμβρύων-ειδικά-miRNAs.

Μετά την κανονικοποίηση, ένα ισχυρό σήμα κατώφλι ανίχνευσης miRNA ορίστηκε ως 500 (σχήμα 1), και 50 miRNAs (~ 6%, 50/835), στην οποία το σήμα έκφραση ήταν μεγαλύτερη από 500 οποιουδήποτε σταδίου εβδομάδες 4 , 5 ή 6 κατά την ανθρώπινη εμβρυϊκή ανάπτυξη, χαρακτηρίστηκαν ως ανθρώπινα-εμβρύου-ειδικό miRNAs (HES-miRNAs). CSV Λήψη CSV

Η έκφραση προφίλ δείχνουν ότι η έκφραση της πιο miRNAs είναι χαμηλή κατά τη διάρκεια της πρώιμης ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης, στην οποία περίπου το 80% των miRNAs (666 από 835 miRNAs) που εμφανίζει την ισχύ του σήματος θεωρήθηκαν ως απαρατήρητα έκφρασης (Σχήμα 1 και Πίνακας S1). Τα στοιχεία αυτά είναι παρόμοια με τα ευρήματα που οι περισσότεροι miRNAs δεν ανιχνεύθηκαν κατά την πρώιμη zebrafish ανάπτυξης [10]. Οι προσδιορισμοί Ιεραρχική σύμπλεγμα της έκφρασης HES-miRNA (Σχήμα 2Α) και 169 miRNAs επιδεικνύουν την ισχύ του σήματος πάνω από 32 (Σχήμα S1) κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης δείχνεται. Στο Σχήμα 2Α, προσδιορίστηκαν οι ακόλουθες τρεις συστάδες HES-miRNAs εκφράσεις: Ομάδα Α, ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά την εβδομάδα 6? Cluster β, μειωτικά την εβδομάδα 6? και Cluster c, ρυθμίζεται προς τα πάνω την εβδομάδα 4. Στην Εικόνα S1, εντοπίστηκαν τέσσερις συστάδες των 169 miRNAs: συμπλέγματα 1, 2, 3, και 4. Cluster ένα miRNAs στο Σχήμα 2Α αυξήθηκε κατά τα τρία ανθρώπινα εμβρυϊκά στάδια (εβδομάδα 6 & gt? εβδομάδα 5 & ​​gt? εβδομάδα 4), και περιλαμβάνονται ορισμένα είδη miRNA αναφερθεί να εμπλουτιστεί σε διάφορες αναπτυξιακές και ασθένειας διεργασίες (π.χ., HSA-miR-122, -206, -214, -181 οικογένεια, και -125 οικογένεια) [38]. Cluster γ miRNAs που μειώθηκε κατά τα τρία ανθρώπινα εμβρυϊκά στάδια (εβδομάδα 4 & gt? Εβδομάδα 5 & gt? Εβδομάδα 6) περιλαμβάνονται ορισμένα miRNAs που ήταν επίσης εμπλουτισμένη με διάφορες αναπτυξιακές και ασθένειας διεργασίες (π.χ., HSA-miR-451, -106, -16 , και -17) (Σχήμα 2Α) [38]. Ωστόσο, η έκφραση πολλών μελών του συμπλέγματος B, το οποίο αυξήθηκε από την εβδομάδα 4 έως την εβδομάδα 5, αλλά μειώθηκε από την εβδομάδα 5 έως την εβδομάδα 6, έχουν άγνωστες λειτουργίες στις διαδικασίες ανάπτυξης και της ασθένειας.

(Α) Πενήντα HES-miRNAs ήταν χωρίζεται σε 3 συστάδες: Οι συρροές a, b, και c. Το βέλος δείχνει τα miRNAs που επιλέχθηκαν για την επικύρωση περαιτέρω τα δεδομένα μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας microRNA qRT-PCR (Σχήμα 3). Ο αστερίσκος δείχνει την μη-διατηρημένο ή πρωτευόντων ειδικών HES-miRNAs (Σχήμα S4). Το κοίλο τρίγωνο δείχνει miRNAs harborring την ίδια αλληλουχία περιοχής σπόρων μεταξύ συμπλέγματος γ. (Β) Σχήμα 2Β δείχνει την ώριμη ακολουθία των έξι miRNAs (miR-17, -106a, -106b, -20a, -20b, -93) με το ίδιο περιοχής σπόρων ετικέτα με το φως κόκκινη σκιά. (C) πίτα γράφημα δείχνει τη λειτουργική ανάλυση μοτίβο (Gene Ontology) των συντηρημένων στόχων (1245 μεταγραφές), που προβλέπεται από TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_60/), από τις έξι miRNAs.

Μεταξύ των HES-miRNAs (Πίνακας 1 και Σχήμα 2Α), ενώ ορισμένοι έχουν επιβεβαιωθεί πειραματικά για να παίξει καθοριστικό ρόλο στην διαφοροποίηση και την ασθένεια. Για παράδειγμα, το θηλαστικό συκώτι-ειδική miRNA, miR-122, το οποίο είχε το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης σε εβδομάδα 6 της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης, συχνά καταστέλλεται σε πρωτογενείς ηπατοκυτταρικά καρκινώματα [39,40], και είναι επίσης απαραίτητη για την ηπατίτιδα RNA του ιού C συσσώρευση σε καλλιεργημένα κύτταρα του ήπατος [10,41-47]. HSA-miR-214 σχετίζεται με την ανάπτυξη των μυών και το σχηματισμό των οστών και εμπλέκεται σε γαστρικό και ωοθηκικό καρκίνο [48-53]. HSA-miR-92a /b, ως μέλη της οικογένειας miR-17 ~ 92, εμπλέκεται σε πολλές συμπαγείς όγκους και λευχαιμία [54-57]. HSA-miR-106a εμπλέκεται στη ρύθμιση της επαγόμενης πολυδύναμων βλαστοκυττάρων γενιάς, μετα-μεταγραφική ρύθμιση της ιντερλευκίνης-10 έκφραση, γαστρικό καρκίνο, και αστροκύτωμα [58-61]. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν σθεναρά την ιδέα ότι υπάρχει εντυπωσιακή ομοιότητα μεταξύ της πρώιμης εμβρυϊκής ανάπτυξης και ογκογένεση [22].

Επιπλέον, αυτά τα υψηλής έκφρασης miRNAs, καθώς και εκείνες που έχουν χαμηλή έκφραση, μπορεί να παίζουν διαφορετικούς ρυθμιστικούς ρόλους σε διαφορετικά στάδια της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης. Εναλλακτικά, αυτά τα miRNAs με υψηλά επίπεδα έκφρασης έχουν ισχυρή εξειδίκευση του ιστού, όπως HSA-miR-122.

Μεταξύ συστάδα c, είναι εκπληκτικό το γεγονός ότι έχουμε παρατηρήσει 6 miRNAs (HSA-miR-17, -106a, -106b , -20a, -20b και -93), τα οποία περιέχουν την ίδια περιοχή σπόρο sequcence AAAGUG (Σχήμα 2Β), ρυθμίστηκαν προς τα κάτω κατά την εβδομάδα 6 της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης, και θα μπορούσε να παίξει τα παρόμοιες βιολογικές λειτουργίες στο ανθρώπινο εμβρυογένεση. Τα εργαστήρια Hannon και Hammond παρέχονται άμεσα πειραματικά αποτελέσματα ότι αυτά τα microRNAs, που κωδικοποιείται από το σύμπλεγμα miR-17-92 και παράλογα του (το miR-106a-363 ​​cluster και miR-106b-25 clusters), έχουν ογκογόνο δράση σε συμπαγή όγκο [62 ]. Ventura και οι συνεργάτες τεκμηριωμένη ισχυρές αποδείξεις ότι η διαγραφή του συμπλέγματος miR-17-92 οδήγησε σε σοβαρά υποπλαστικών πνεύμονες και μείωση των προ-Β αριθμούς κυττάρων σε ποντίκια, οδηγώντας τελικά σε μικρότερα έμβρυα ακόμα και άμεση μεταγεννητική θάνατο [63]. Λαμβάνοντας υπόψη το ζωτικό ρόλο αυτών των miRNAs στην ανάπτυξη και ογκογένεση, είχαμε προβλέψει όλους τους στόχους αυτών των 6 miRNAs από TargetScan, και στη συνέχεια αναλύθηκαν περαιτέρω οι συντηρημένες στόχοι (1245 μεταγραφές). Κατά τα πρώτα στάδια της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης, ένα σημαντικό γεγονός που σχετίζεται με την αναπτυξιακή μετάβαση από τη φάση νωρίς τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων να οργανογένεσης και ιστογένεσης είναι ότι ο αριθμός των βλαστικών κυττάρων ή μη διαφοροποιημένων κυττάρων είναι μειωμένη επειδή περισσότερο κύτταρα αρχίζουν να διαφοροποιούνται σε διαφορετικές οργάνου /του ιστού ειδικούς τύπους κυττάρων. Κατά τα πρώτα στάδια της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης, ένα σημαντικό γεγονός που σχετίζεται με την αναπτυξιακή μετάβαση από τη φάση νωρίς τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων να οργανογένεσης και ιστογένεσης παρουσιάζεται. Λειτουργική ανάλυση μοτίβο (Gene Ontology) από την διατηρημένη στόχο (1245 μεταγραφές) 6 miRNAs δείχνει ότι η μεγάλη πλειοψηφία αυτών των γονιδίων στις κατηγορίες GO σχετίζονται με βιολογικούς ρύθμιση, ρύθμιση της βιολογικής διαδικασίας, μεταβολική διαδικασία, κυτταρική διαδικασία, πολυκύτταρους διαδικασία οργανισμικό και αναπτυξιακή διαδικασία (Σχήμα 2C). Πρόσφατα αναφέρθηκαν μερικά στόχους του miR-17 ~ 92 οικογένεια, όπως CDKN1A (p21) [64], BIM [65], RUNX1 [66], και τα δύο από αυτά περιλαμβάνονται σε αυτές τις κατηγορίες GO, που δείχνουν ότι αυτά τα γονίδια είναι αναντικατάστατο θέση στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, την κυτταρική απόπτωση, και διαφοροποίηση των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων. Και τα αποτελέσματα αυτά θα μπορούσαν να μας βοηθήσουν να κατανοήσουμε καλύτερα το ρόλο του HES-miRNAs σε ανθρώπινο εμβρυογένεση και ογκογένεση.

Επιπλέον, για την επικύρωση της ποιότητας των δεδομένων μικροσυστοιχιών miRNA, τέσσερις miRNAs (HSA-miR-125b, -720 , -1280, και -20b, Σχήμα 3 και Σχήμα S2) των οποίων η έκφραση των επιπέδων μεταβληθεί σημαντικά κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης επικυρώθηκαν με χρήση TaqMan® πραγματικού χρόνου δοκιμασίες RT-PCR miRNA. Οι τάσεις της έκφρασης των miRNAs ήταν σύμφωνο με αυτό που παρατηρήθηκε στα δεδομένα μικροσυστοιχιών miRNA (Σχήμα 3Β, C, D, και Ε).

Τέσσερις miRNAs [HSA-miR-125β (Β), HSA-miR-720 (C), HSA-miR-1280 (D), και HSA-miR-20b (Ε)], οι οποίες εκφράζονται διαφορικά (ρ & lt? 0,05, Σχήμα 3Α) και (ρ & lt? 0,10, Εικόνα S2) κατά τη διάρκεια εβδομάδας 4, 5 , και 6 της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης, επιλέχθηκαν. qRT-PCR και U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για να προσδιοριστεί η σχετική έκφραση των miRNAs.

Η

Ανθρώπου-Mouse Συγκριτική Ανάλυση των miRNA έκφραση κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη

Για να συγκρίνετε το miRNA προφίλ έκφρασης μεταξύ των ανθρώπων και την εμβρυϊκή ανάπτυξη του ποντικιού, πραγματοποιήσαμε μια συγκριτική ανάλυση σε σχέση με το παρελθόν που δημοσιεύθηκε προφίλ έκφρασης microRNA σε έμβρυα ποντικού που καλύπτουν προγεννητική ανάπτυξη (Ε9.5, Ε10.5, Ε11.5 και) [8], τα οποία αντιστοιχούν εβδομάδες 4, 5, και 6 της εμβρυϊκής ανάπτυξης του ανθρώπου [67,68]. Λαμβάνοντας υπόψη τα ίδια miRNAs σε ανθρώπινο και το ποντίκι, κατασκευάσαμε μια ανάλυση τομής μεταξύ 835 ανθρώπινα miRNAs σε αυτή τη μελέτη και 390 miRNAs το ποντίκι, και εντόπισε 195 ομόλογο miRNAs (Πίνακας S2). Οι ιεραρχικές αναλύσεις ομαδοποίηση των miRNAs ομολογία ανθρώπου-ποντικού που φαίνεται στο Σχήμα S3A και τα διαγράμματα Β Βεν (Εικόνες S3C και S3D) έδειξε ότι το 38 ή 32 miRNAs ομολογία ανθρώπου-ποντικού υπερεκφράζεται ή μειωτικά, αντίστοιχα, κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης ανθρώπου και ποντικού. Μεταξύ αυτών των miRNAs ας-7 μέλη της οικογένειας, miR-34a, miR-221/222, miR-145, miR-125b, miR-15a, και miR-223 έχουν αποδειχθεί για να παίξει πολυσχιδή ρόλο κατά την ανάπτυξη και παθογένεση σε διάφορα θηλαστικά όργανα [38]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι ορισμένα ομόλογα miRNAs ανθρώπου-ποντικού είναι σημαντικά για την ανάπτυξη και την παθογένεση, ενώ εκείνα που δεν είναι ομόλογα είναι πιθανόν εμπλέκονται σε διάφορες διαδικασίες ανάπτυξης που αντικατοπτρίζουν την αναπτυξιακή διάσταση μεταξύ ανθρώπου και ποντικού.

Συντηρητική ιδιότητες HES-miRNAs

μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι πολλά γνωστά γονίδια miRNA έχουν ένα τυπικό μοτίβο της διατήρησης, επίμονη διάρκεια των clusters, γεγονός που υποδηλώνει την εξελικτική και λειτουργική επιπτώσεις [69]. Ωστόσο, ένα σημαντικό μέρος των microRNAs επιβεβαιώνονται ως μη συντηρημένο ή πρωτευόντων ειδικών miRNAs επειδή πολλά νέα ανθρώπινα miRNAs έχουν συνεχώς εντοπιστεί [70]. Για να ορίσετε τη διατήρηση των HES-miRNAs, χρησιμοποιήσαμε το miRviewer [71], η οποία δείχνει τη διατήρηση των γονιδίων miRNA είναι ομαδοποιημένες κατά όνομα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S4, τα περισσότερα HES-miRNAs είναι εξαιρετικά διατηρημένες, και οι λειτουργίες τους είναι γνωστές. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μεταξύ των HES-miRNAs, οκτώ miRNAs, HSA-miR-638, -663, -720, -936, -1246, -1268, -1275, -1280 και είναι εξαιρετικά μη-συντηρημένο, αν και οι περισσότεροι είναι primate- συγκεκριμένο (Σχήμα S4) [70,72]. Εμφανώς, οι τιμές αιχμής έκφραση 5 από αυτά τα miRNAs, miR-638, -663, -936, -1246, -1275 και είναι στις 5 εβδομάδες της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης. Με άλλα λόγια, αυτά τα miRNAs μπορεί να λειτουργούν μόνο σε ένα συγκεκριμένο αναπτυξιακό στάδιο εμβρυϊκά άνθρωπο. Επιπλέον, γνωρίζουμε πολύ λίγα για τις βιολογικές λειτουργίες αυτών των miRNAs στην οργανογένεση και την παθογένεση των θηλαστικών. Ωστόσο, επειδή η έκφραση αυτών των μη-διατηρημένο ή πρωτευόντων ειδικών miRNAs είναι υψηλή κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης, αυτά τα miRNAs πιθανό να παίξει καθοριστικό ρόλο στην οργανογένεση ή /και την παθογένεση των θηλαστικών. Στην πραγματικότητα, μερικές μελέτες δείχνουν ότι αυτές οι μη-συντηρημένο ή πρωτευόντων ειδικών HES-miRNAs μπορεί να σχετίζεται με όλα τα είδη των ασθενειών [73-82]. Η λειτουργία αυτών των μη συντηρημένες ή πρωτευόντων ειδικών HES-miRNAs μένει να καθοριστεί.

συγκριτικές αναλύσεις της έκφρασης της HSA-miR-638, -720, και -1280 σε φυσιολογικούς και κακοήθεις ιστούς

Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι τα miRNAs που εμπλέκονται σε διάφορες πτυχές των ζώων αναπτυξιακών διαδικασιών και της νόσου [4,16-21,38,83-89]. Για να επικυρώσετε περαιτέρω τη σχέση μεταξύ του HES-miRNAs και διαφόρων στερεών κακοήθων όγκων, έχουμε επικεντρωθεί σε τρεις μη-συντηρημένο ή πρωτεύον ειδικές HES-miRNAs, HSA-miR-638, -720, και -1280 (Πίνακας 1), υψηλής ρητή ή εμφανίζουν μεταβολές έκφρασης κατά τη διάρκεια της εβδομάδας 4-6 της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης για την περαιτέρω λειτουργική έρευνα. Εξετάσαμε κατά πόσο η έκφραση των τριών HES-miRNAs διαφέρει σημαντικά μεταξύ των διαφόρων ανθρώπινων όγκων και το αντίστοιχο κανονικό ιστό.

Χρησιμοποιώντας το MC5003 μικροσυστοιχία ιστό και υψηλής ειδικότητας και ευαισθησίας LNA-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο ανιχνευτές, τα προφίλ έκφρασης του 3 miRNAs σε φυσιολογικούς και καρκινικούς ιστούς ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας

in situ υβριδισμού

. U6 snoRNA και αγωνίζομαι-miR ανιχνευτές χρησιμοποιήθηκαν ως θετικές και αρνητικές ανιχνευτές ελέγχου, αντίστοιχα. Τα στατιστικά αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση του HSA-miR-638 είναι σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε ηπατοκυτταρικό ιστούς καρκίνου του ήπατος (n = 20), έναντι της φυσιολογικής ηπατικής ιστούς (n = 5) (ρ = 0,0092), και τραχήλου της μήτρας ιστούς καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων ( n = 18) έναντι των φυσιολογικών ιστών τραχήλου της μήτρας (n = 7) (p = 0,0003). Σε αντίθεση, η έκφραση του HSA-miR-638 ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε ιστούς αδενοκαρκίνωμα στομάχου (n = 19) έναντι των φυσιολογικών ιστών του στομάχου (n = 6) (p = 0.0095) (Σχήμα 4Α). Αυτά τα δεδομένα συμφωνούν με τα αποτελέσματα από Tsukamoto et al. που δείχνει προς τα κάτω ρύθμιση αυτού του miRNA στον καρκίνο του στομάχου [90]. HSA-miR-720 έκφραση είναι σημαντικά αυξητικά σε τραχήλου της μήτρας ιστούς καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (η = 18) έναντι των φυσιολογικών ιστών τραχήλου της μήτρας (n = 6) (p = 0,0086), σε πνεύμονα ιστούς καρκινώματος πλακωδών κυττάρων /αδενοκαρκίνωμα (n = 17) έναντι των φυσιολογικών ιστών του πνεύμονα (n = 6) (p = 0,0386), σε κύτταρα ωοθηκών ιστούς κυσταδενοκαρκίνωμα /αδενοκαρκίνωμα (n = 18), έναντι της φυσιολογικής ωοθηκικό ιστό (n = 6) (ρ = 0,04045), και σε ιστούς καρκινώματος urothelial (n = 17 ) έναντι φυσιολογικών ιστών ουροδόχος κύστη (n = 5) (ρ = 0,03504) (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, η έκφραση HSA-miR-720 είναι σημαντικά προς τα κάτω σε εντερικό βλεννογόνο κακοήθεις ιστούς (n = 19) έναντι των φυσιολογικών ιστών του δέρματος (η = 9) (p = 0.0017) (Σχήμα 4Β). Η έκφραση της HSA-miR-1280 είναι σημαντικά προς τα κάτω σε πλακώδες ιστούς καρκίνωμα της κεφαλής και του λαιμού του δέρματος (n = 20) έναντι των φυσιολογικών ιστών του δέρματος (n = 9) (ρ & lt? 0,0001), σε εντερικό βλεννογόνο κακοήθεις ιστούς (n = 20 ) έναντι των φυσιολογικών ιστών του δέρματος (n = 9) (p = 0,0009), και σε παγκρεατικά ιστούς αδενοκαρκίνωμα (n = 17), έναντι της φυσιολογικής παγκρεατικής ιστούς (n = 6) (p = 0.0270) (Σχήμα 4C). Αντίθετα, η έκφραση HSA-miR-1280 είναι σημαντικά αυξορρυθμίζεται τραχήλου της μήτρας ιστούς καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (n = 17), έναντι της φυσιολογικής τραχήλου της μήτρας ιστών (n = 7) (ρ = 0,01076) (Σχήμα 4C). Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα τριών miRNAs που εκφράζονται διαφορικά σε ιστούς όγκων έναντι κανονικών ιστών που φαίνεται στα Σχήματα 5, S5, S6, S7 και. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι αυτά τα HES-miRNAs είναι στενά συνδεδεμένα με τις παθολογικές διαδικασίες των διαφόρων όγκων.

υψηλής πυκνότητας πολλαπλών όγκων οργάνων και φυσιολογικό μικροσυστοιχίες ιστού που περιέχει 500 ιστο-τελείες με 18 τύπους όγκων και φυσιολογικών ιστών αντίστοιχο έλεγχο . Διγοξιγενίνη-σημασμένο κλειδωμένο νουκλεϊκό οξύ (LNA) ανιχνευτές (LNA-638, LNA-720, και LNA-1280) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση ειδικώς την έκφραση miRNA στο τσιπ ιστού. (Α) Η ανώμαλη έκφραση του HSA-miR-638 στην μικροσυστοιχία ιστού. Σημαντική αυξητική ρύθμιση του miR-638 μπορεί να παρατηρηθεί σε ηπατοκυτταρικό καρκίνο του ήπατος και τραχήλου της μήτρας καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων. miR-638 κάτω ρύθμιση βρίσκεται σε αδενοκαρκίνωμα του στομάχου έναντι των αντίστοιχων φυσιολογικών ιστών (p = 0,0092, p = 0,0003, και ρ = 0.0095, αντίστοιχα) (Β) Η ανώμαλη έκφραση του HSA-miR-720 στην μικροσυστοιχία ιστού. HSA-miR-720 είναι σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε τραχήλου της μήτρας καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα πλακώδους κυττάρου, αδενοκαρκίνωμα ωοθήκης, και καρκίνωμα ουροθηλίου έναντι των αντίστοιχων φυσιολογικών ιστών (p = 0,0086, p = 0,0386, p = 0,0404, και ρ = 0,035, αντίστοιχα ). HSA-miR-720 είναι σημαντικά προς τα κάτω σε εντερικό βλεννογόνο κακοήθεις ιστούς έναντι των φυσιολογικών ιστών του δέρματος (ρ = 0,0017). (Γ) Η ανώμαλη έκφραση του HSA-miR-1280 επί microarray ιστού. HSA-miR-1280 ρυθμίζεται μειωτικά σε καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, τον εντερικό βλεννογόνο κακοήθη ιστό, και του παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα έναντι των αντίστοιχων φυσιολογικών ιστών (ρ & lt? 0,0001, ρ = 0,0009, και ρ = 0.0270, αντίστοιχα). HSA-miR-1280 απορυθμίζεται σημαντικά σε τραχήλου της μήτρας ιστούς πλακώδες καρκίνωμα σε σχέση με την κανονική τραχήλου της μήτρας ιστούς (p = 0,01076). επίπεδα έκφρασης miRNA (άξονας γ) με σκορ = 0, 1, 2, ή 3, δείχνουν αρνητικό, ασθενές, μέσο ή ισχυρή ένταση χρώσης, αντίστοιχα. η δείχνει τον αριθμό των δειγμάτων που μελετήθηκαν. NT δείχνει δείγματα φυσιολογικού ιστού? CT δείχνει δείγματα ιστού καρκινώματος. Δίπλευρη φοιτητής

t

δοκιμές έγιναν για να συγκρίνουν την έκφραση των miRNAs σε φυσιολογικές και καρκινικούς ιστούς.

Η

Πίνακες ένας με δείγματα αδενοκαρκινώματος show στομάχι t και τα πάνελ u μέσω z show φυσιολογικό ιστό του στομάχου . Το μπλε σήμα χρώση υποδεικνύει την έκφραση της HSA-miR-638. Το κόκκινο χρώση δείχνει στον πυρήνα του κυττάρου (κλίμακα 200 μm ως εικόνα 5α). J2 δείχνει μεγαλύτερη μεγέθυνση (5χ) της ενδεικνυόμενης περιοχής στην εικόνα 5j, και Ζ2 δείχνει μεγαλύτερη μεγέθυνση (5χ) της ενδεικνυόμενης περιοχής στο σχήμα 5Ζ.

Η

Εν περιλήψει, οι μελέτες μας αποκαλύπτουν ότι εδώ η έκφραση τα επίπεδα των πιο miRNAs κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης εμβρυογένεσης είναι πολύ χαμηλές. Έχουμε ορίσει 50 (~ 6%) των 835 miRNAs ρυθμίζεται εβδομάδα 4 έως 6 της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης ως HES-miRNAs, και απέδειξαν ότι ορισμένοι μη-διατηρημένο ή πρωτευόντων ειδικών HES-miRNAs εμπλέκονται στην ογκογένεση, υποστηρίζοντας έτσι την υπόθεση ότι την πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη μετοχών πολλές ομοιότητες με την ανάπτυξη καρκίνου σε βιολογική συμπεριφορά, καθώς και μοριακά [22]. Ωστόσο, οι λειτουργίες του μη-συντηρημένο ή πρωτεύον ειδικές HES-miRNAs μένει να καθοριστεί πειραματικά, η οποία θα μας βοηθήσει να κατανοήσουμε περαιτέρω το δίκτυο πολύπλοκη μοριακή διαφοροποίηση που εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Ιεραρχική ομαδοποίηση αναλύσεις της έκφρασης των miRNAs 169 παρουσιάζουν τα δυνατά σήμα μεγαλύτερο από 32 miRNAs (n = 169) χωρίστηκαν σε 4 συστάδες: συμπλέγματα 1, 2, 3, και 4. Το βέλος δείχνει τα miRNAs που επιλέχθηκαν να επικυρωθεί με microRNA qRT-PCR (Σχήμα 3). Ο αστερίσκος δείχνει το μη-συντηρημένο ή πρωτεύον ειδικές HES-miRNAs (Σχήμα S4)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0069230.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Clustering αναλύσεις της έκφρασης των miRNAs (

σ

& lt? 0.10) κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης Κόκκινα και πράσινα δείχνουν υψηλά και χαμηλά επίπεδα έκφρασης, αντίστοιχα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0069230.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

συντηρημένη miRNA πρότυπα έκφρασης και βιολογικά χαρακτηριστικά των ομολόγων ανθρώπου-ποντικού κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Ανεξέλεγκτη ιεραρχική συσταδοποίηση αναλύσεις της έκφρασης miRNA pro fi les σε ανθρώπους (εβδομάδα 4, 5, και 6, το Σχήμα S3A) και τα δείγματα έμβρυο ποντικού (Ε9.5, Ε10.5, Ε11.5 και, Εικόνα S3b). Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών εμβρύου ποντικού που δημοσιεύθηκε το 2006 από Mineno και οι συνεργάτες του. Το χρώμα σε κάθε πλέγμα εκ νέου fl ECTS το επίπεδο έκφρασης του miRNA στο αντίστοιχο δείγμα. Οι αυξανόμενες εντάσεις κόκκινου δείχνουν ότι ένα συγγραφή fi γ miRNA έχει υψηλότερη έκφραση στο δεδομένο δείγμα. Οι αυξανόμενες εντάσεις των πράσινων δείχνουν ότι αυτό το miRNA έχει χαμηλότερη έκφραση. Διαγράμματα Venn απεικονίζουν τις miRNAs τομής μεταξύ ανθρώπων (εβδομάδα 4, 5, και 6) και τα δείγματα έμβρυο ποντικού (Ε9.5, Ε10.5, Ε11.5 και) και δείχνουν ότι 38 και 32 miRNAs ομολογία ανθρώπου-ποντικού απορυθμίζεται (C .) και ρυθμίζεται προς τα κάτω (D), αντίστοιχα, κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του ανθρώπου και του ποντικού

doi: 10.1371 /journal.pone.0069230.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

Διατήρηση αναλύσεις του HES-miRNAs. Η miRviewer δείχνει τη διατήρηση των γονιδίων HES-miRNA, ομαδοποιημένες κατά όνομα. Τα miRNAs που μόνο μπορεί να ανακαλυφθεί σε ανθρώπους ή άλλα πρωτεύοντα θηλαστικά, συμπεριλαμβανομένων των miR-638, -663, -720, -936, -1246, -1268, -1275, -1280 και, χωρίστηκαν στη συνέχεια. Οι αυξανόμενες εντάσεις των πράσινων δείχνουν ότι ένα συγγραφή fi γ miRNA (ή την οικογένειά miRNA) έχει υψηλότερη διατήρησης των εκάστοτε ειδών. Οι αριθμοί στις παρενθέσεις δείχνουν τους αριθμούς των miRNAs σε μια δεδομένη οικογένεια miRNA. Οι περισσότεροι μοιράζονται παρόμοια αποτελέσματα διατήρηση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0069230.s004

(ΔΕΘ)

Εικόνα S5.

HSA-miR-638 έκφρασης σε τράχηλο της μήτρας αδενοκαρκίνωμα και αντίστοιχοι φυσιολογικοί ιστοί. Πίνακες Α έως δείγματα αδενοκαρκίνωμα τραχήλου της μήτρας t δείχνουν και τα πάνελ u μέσω z δείχνουν κανονική τραχήλου της μήτρας ιστούς. Το μπλε σήμα χρώση υποδεικνύει την έκφραση της HSA-miR-638. Η κόκκινη χρώση δείχνει τον πυρήνα του κυττάρου (κλίμακα 200 μm ως σχήμα S5A)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0069230.s005

(ΔΕΘ)

Εικόνα S6.

HSA-miR-720 έκφρασης σε τράχηλο της μήτρας αδενοκαρκίνωμα και αντίστοιχοι φυσιολογικοί ιστοί.