Αφηρημένο

Ιστορικό

Η πολυφαρμακευτική αντίσταση (MDR) είναι ένα μείζον πρόβλημα στην επιτυχή θεραπεία των καρκίνων. Ανθρώπινα ABCG2, ένα μέλος της ΑΤΡ-σύνδεσης υπεροικογένειας μεταφορέα κασέτας, διαδραματίζει βασικό ρόλο στην MDR και έναν σημαντικό ρόλο στην προστασία των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου. Νοκ-άουτ του ABCG2 δεν είχε προφανή δυσμενή επίδραση στα ποντίκια. Έτσι, ABCG2 είναι ένας ιδανικός στόχος για την ανάπτυξη παραγόντων χημειο-ευαισθητοποίηση για την καλύτερη αντιμετώπιση των ναρκωτικών καρκίνων ανθεκτικά και βοηθώντας την εξάλειψη του καρκίνου βλαστικών κυττάρων.

Μέθοδοι /Προκαταρκτική Εκτίμηση

Χρησιμοποιώντας ορθολογική ελέγχου από εκπροσώπους μια χημική ένωση βιβλιοθήκης, βρήκαμε ένα νέο αναστολέα της ABCG2, PZ-39 (N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide), ότι έχει δύο τρόπους δράσης από την αναστολή της δραστικότητας ABCG2 και επιταχύνοντας λυσόσωμα εξαρτώμενη αποδόμησής της. PZ-39 δεν έχει επίδραση επί ABCB1 και ABCC1 μεσολάβηση αποβολής του φαρμάκου, αντίσταση, και την έκφραση τους, υποδεικνύοντας ότι μπορεί να είναι ειδικά για ABCG2. Οι αναλύσεις των αναλογικών ενώσεων του έδειξε ότι το φαρμακοφόρο του PZ-39 βενζοθειαζόλη συνδέεται με μια ραχοκοκαλιά δακτύλιο τριαζίνης.

Συμπέρασμα /Σημασία

Σε αντίθεση με τυχόν προηγουμένως γνωστούς αναστολείς μεταφορέα ABCG2, PZ-39 έχει ένα μυθιστόρημα δράση δύο-mode με την αναστολή της δραστηριότητας ABCG2, οξεία επίδραση, και επιταχύνοντας λυσόσωμα που εξαρτώνται από την υποβάθμιση, ένα χρόνιο φαινόμενο. PZ-39 είναι πιθανώς ένα πολύτιμο ανιχνευτής για μελέτες δομής-λειτουργίας των ABCG2 και ένωση μολύβδου για την ανάπτυξη θεραπευτικών στόχευση ABCG2 μεσολάβηση MDR σε συνδυαστική χημειοθεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Peng Η, Dong Ζ, Qi J, Γιανγκ Υ, Liu Υ, Li Ζ, et al. (2009) A Novel Δύο Τρόπος δράσης αναστολέας των ABCG2 Μεσολαβεί σε πολλαπλά Μεταφορών και αντίσταση στην χημειοθεραπεία του καρκίνου. PLoS ONE 4 (5): e5676. doi: 10.1371 /journal.pone.0005676

Επιμέλεια: Παύλος Cobine, Πανεπιστήμιο Auburn, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Μαρτίου του 2009? Αποδεκτές: 1η του Μάη 2009? Δημοσιεύθηκε: May 24, 2009

Copyright: © 2009 Peng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί R01 CA120221 και R01 CA113384. ZD και YY υποστηρίχθηκαν, εν μέρει, από την NRSA Τ32 DK07519 και Τ32 HL07910 από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, αντίστοιχα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αντίσταση σε πολλαπλά φάρμακα (MDR) είναι ένα μείζον πρόβλημα για την επιτυχή θεραπεία των καρκίνων. Υπερ-έκφραση ορισμένων μελών του μεταφορέα υπεροικογένειας ABC (ΑΤΡ-σύνδεσης κασέτα) έχει προταθεί ότι προκαλεί MDR. P-γλυκοπρωτεΐνη (MDR1 /ABCB1), αντίσταση σε πολλαπλά φάρμακα πρωτεΐνη 1 (MRP 1 /ABCC1), και πρωτεΐνη αντίστασης καρκίνου του μαστού (BCRP /ABCG2) είναι τρεις κύριοι μεταφορείς ABC που είναι σημαντικοί παίκτες στην κλινική ανάπτυξη των MDR [1]. Ένα από αυτά τα μέλη, ABCG2 που πιστεύεται ότι υπάρχουν και λειτουργούν ως ομο-ολιγομερή 8-12 υπομονάδες [2], [3], [4], έχει επίσης ενοχοποιηθεί για να παίξει ρόλο στην προστασία καρκινικά βλαστικά κύτταρα, με αποτέλεσμα τα ναρκωτικά αντοχή και την αποτυχία της χημειοθεραπείας του καρκίνου [5]. Anticancer υποστρώματα φαρμάκου ABCG2 περιλαμβάνουν αλλά δεν περιορίζονται στα συνήθως χρησιμοποιούμενα αντικαρκινικά φάρμακα όπως η αδριαμυκίνη, μιτοξαντρόνη, και τοποτεκάνη. Πράγματι, πρόσφατες κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερ-έκφραση του ABCG2 τόσο ενηλίκων και παιδική λευχαιμία συσχετίζεται πολύ καλά με κακή πρόγνωση (για μια επισκόπηση βλέπε [6]). Νοκ-άουτ του ABCG2 δεν είχε εμφανή αρνητική επίπτωση στην ανάπτυξη, τη βιοχημεία και τη ζωή των ποντικών [7]. Όλες αυτές οι προηγούμενες παρατηρήσεις κάνουν ABCG2 ένα ιδανικό στόχο για την ανάπτυξη των παραγόντων χημειο-ευαισθητοποίηση για την καλύτερη αντιμετώπιση των ναρκωτικών καρκίνων ανθεκτικά και δείχνουν ότι η αναστολή ABCG2 απίθανο να προκαλέσει οποιαδήποτε παρενέργεια, εάν ο αναστολέας είναι ειδικά για ABCG2.

Σε σύγκριση με οι πολύ γνωστό φάρμακο αντίσταση που προκαλούν ABC μεταφορείς όπως ABCB1 και ABCC1, ABCG2 ανακαλύφθηκε σχετικά πρόσφατα και, ως εκ τούτου, έχουν λίγες ειδικοί αναστολείς ABCG2 έχουν αναφερθεί. Ένα από τα γνωστά ειδικών αναστολέων ABCG2 είναι ο ισχυρός μυκοτοξίνη Fumitremorgin C (FTC) εκκρίνεται από

Aspergillus fumigatus

[8], [9]. Ωστόσο, η νευροτοξικότητα της FTC περιορίζει τη θεραπευτική δυναμικό της. Ανάλογα της FTC, όπως Ko132 και Ko143, έχουν αναπτυχθεί με χαμηλή τοξικότητα [10], αλλά δεν έχει ακόμη γνωστό εάν αποτελεσματική σε κλινικές δοκιμές. Επιπλέον, άλλοι αναστολείς της ABCG2 αναφερθεί [11], [12]. Ωστόσο, αυτοί οι παράγοντες, όπως GF120918, φαίνεται να στερούνται ειδικότητας λόγω της επίδρασης τους επί ABCB1 ή /και ABCC1 [13], [14]. Σαφώς, οι περισσότεροι ειδικοί αναστολείς ABCG2 που απαιτούνται για τη μελλοντική ανάπτυξη του δυναμικού χημειο-ευαισθητοποιητές στην καλύτερη απόλαυση ναρκωτικών καρκίνους ανθεκτικά.

Σε αυτό το έγγραφο, αναφέρουμε την ανακάλυψη ενός νέου ειδικού αναστολέα ABCG2, PZ-39 (Ν- ( 4-χλωροφαινυλο) -2 – [(6 – {[4,6-δι (4-μορφολινυλ) -1,3,5-τριαζιν-2-υλ] αμινο} -1,3-βενζοθειαζολ-2-υλ) σουλφανυλ ] ακεταμίδιο), η οποία είναι πολύ πιο αποτελεσματική στην αναστροφή ABCG2 μεσολάβηση αντοχή φαρμάκου και λιγότερο κυτταροτοξική σε καλλιεργημένα κύτταρα σε σύγκριση με το FTC. PZ-39 φαίνεται να έχει δύο τρόπους δράσεων προκαλώντας αποικοδόμηση ABCG2 (χρόνια) εκτός από την αναστολή της δράσης της (οξεία). Παρόμοια επίδραση των τριών PZ-39 σχετικών ενώσεων αποκάλυψε δομική βάση για το σχεδιασμό των πιο ισχυρό ειδικών αναστολέων ABCG2 στο μέλλον.

Αποτελέσματα

Επίδραση της ένωσης PZ-39 για συσσώρευση μιτοξαντρόνη

Χρησιμοποιώντας ένα ορθολογικό έλεγχο των εκπροσώπων των διαφόρων κατηγοριών μιας μικρής βιβλιοθήκης ενώσεων μόριο από Specs (www.specs.net) για δυνητικούς αναστολείς της ABCG2 μεσολάβηση αποβολής του φαρμάκου, εντοπίσαμε μια ένωση, N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide) με βενζοθειαζόλιο που συνδέονται με την σπονδυλική στήλη δακτύλιο τριαζίνης, (το όνομά του PZ-39 στη συνέχεια, βλ. Σχήμα 1) που αντιστρέφεται δραστικά τη συσσώρευση μιτοξαντρόνη σε κύτταρα MCF7 /AdVp3000 που υπερεκφράζουν ABCG2. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, PZ-39 ενισχυμένη συσσώρευση μιτοξαντρόνη σε MCF7 /AdVp3000 αλλά όχι τα γονικά ευαίσθητα MCF7 κύτταρα που δεν παράγουν ABCG2, υποδηλώνοντας ότι ABCG2 μεσολάβηση εκροής φαρμάκου έχει ανασταλεί. Επειδή τα κύτταρα MCF7 /AdVp3000 επίσης υπερ-εκφράζουν άλλους μεταφορείς ABC όπως ABCC3 επιπροσθέτως ABCG2 [15], PZ-39 μπορεί να αναστείλουν ABC μεταφορείς, εκτός από ABCG2, οδηγώντας σε αυξημένη συσσώρευση μιτοξαντρόνη. Για να εξεταστεί άμεσα εάν PZ-39 αναστέλλει ABCG2, εκτελέσαμε παρόμοιες μελέτες με τη χρήση κυττάρων ABCG2-επιμολυσμένα ΗΕΚ293 σταθερά (ΗΕΚ293 /ABCG2) [3]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, προ-επώαση των κυττάρων με PZ-39 ενισχυμένη ενδοκυτταρική συσσώρευση μιτοξαντρόνη σε ΗΕΚ293 /ABCG2 αλλά όχι στον φορέα-επιμολυσμένα ελέγχου (ΗΕΚ293 /Vec) κύτταρα. Έτσι, PZ-39 πιθανώς αναστέλλει ABCG2 μεσολάβηση μιτοξαντρόνη εκροής. Σχ. 2Α και 2Β δείχνουν επίσης ότι PZ-39 κατά 3,3 μΜ επιτευχθεί ισοδύναμο επίπεδο αποτελέσματος με τη γνωστή ειδικό αναστολέα ABCG2 FTC στα 10 μΜ, υποδεικνύοντας ότι η PZ-39 μπορεί να είναι περίπου 3 φορές πιο ισχυρό από FTC.

PZ -39, N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide, και τα ανάλογά της C6, C8 και Ε2 όλα περιέχουν μια βενζοθειαζόλη συνδέεται με ένα σκελετό δακτύλιο τριαζίνης. Οι τρεις άθικτα δακτύλιοι επισημαίνονται ως Α, Β και C.

Η

Α και Β, η συσσώρευση μιτοξαντρόνη σε MCF7 ή ανθεκτικά σε φάρμακο υπογραμμή MCF7 /AdVp3000 (Α) και ΗΕΚ293 κύτταρα του επιμολυσμένα με φορέα ή ABCG2 (Β) μετά από μια επώαση 30 λεπτών σε απουσία ή παρουσία του PZ-39 (3,3 μΜ) ή FTC (10 μΜ). Τα δεδομένα είναι μέσα ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα (* Ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με φορέα DMSO). Γ και Δ, απόκριση δόσης του PZ-39 και FTC στην αποκατάσταση συσσώρευση μιτοξαντρόνη σε ABCG2-επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293. Η παχιά γραμμή δείχνει το επίπεδο της συσσώρευσης μιτοξαντρόνη σε φορέα-επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293, που χρησιμεύει ως μάρτυρας.

Η

Για να διερευνήσει περαιτέρω την ισχύ του PZ-39 για ABCG2, την επίδραση δόσης απόκρισης του PZ-39 για συσσώρευση μιτοξαντρόνη σε ΗΕΚ293 /κύτταρα ABCG2 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, η ενδοκυτταρική επίπεδο μιτοξαντρόνη αυξήθηκε κατά PZ-39 με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Στο 3,3 μΜ, PZ-39 αποκατασταθεί πλήρως ενδοκυτταρικό επίπεδο μιτοξαντρόνη σε κύτταρα /ABCG2 ΗΕΚ293. FTC, από την άλλη πλευρά, επιτυγχάνεται παρόμοιο επίπεδο επίδραση μόνο στα 10 μΜ (Εικ. 2D), υποστηρίζοντας την άποψη ότι PZ-39 είναι πιο ισχυρή από ό, τι FTC (βλέπε παραπάνω).

Ευαισθητοποίηση αντοχής φαρμάκου με PZ-39

για να διερευνηθεί η πιθανή χρήση του PZ-39 ως χημειο-ευαισθητοποιητής αντοχής φαρμάκου ABCG2 μεσολάβηση, η επίδραση του PZ-39 με την ανταπόκριση του φαρμάκου των κυττάρων /ABCG2 ΗΕΚ293 προσδιορίστηκε με την απουσία ή παρουσία 0,1 μΜ μιτοξαντρόνη που μόνο παρήγαγε ~ 10% θανάτωση κυττάρου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α και 3Β, PZ-39 δεν είναι κυτταροτοξική σε ΗΕΚ293 /κύτταρα ABCG2 και IC του

50 δεν είναι μετρήσιμος εντός του εύρους συγκέντρωσης που χρησιμοποιούνται, ενώ το IC

50 του FTC είναι ~ 24 μΜ. Το IC

50 PZ-39 και FTC που απαιτούνται για να ευαισθητοποιήσει την αντίσταση μιτοξαντρόνη είναι -15 nM και ~387 nM, αντίστοιχα. Ο δείκτης δραστικότητα του PZ-39 υπολογίζεται να είναι & gt? 1600 ενώ αυτή του FTC είναι μόνο ~62 (Πίνακας 1)

Α και Β, ο δείκτης δραστικότητα του PZ-39 σε σύγκριση με FTC στην αναστροφή αντίστασης μιτοξαντρόνη. . ΗΕΚ293 κύτταρα /ABCG2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς ή με 0,1 μΜ (IC

10) μιτοξαντρόνη απουσία ή παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων του PZ-39 (Α) ή FTC (Β) που ακολουθείται από δοκιμασία SRB. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. Γ και Δ, δείκτης ευαισθητοποίηση του PZ-39 (C) σε σύγκριση με FTC (D) σε κύτταρα /ABCG2 ΗΕΚ293. ΗΕΚ293 κύτταρα /ABCG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις της μιτοξαντρόνης απουσία ή παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων του PZ-39 ακολουθούμενη από δοκιμασία SRB. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. Ε, ο δείκτης ευαισθητοποίηση σε πολλαπλά φάρμακα του PZ-39 σε κύτταρα MCF7 /AdVp3000 ναρκωτικά επιλέξει. κύτταρα MCF7 /AdVp3000 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις αδριαμυκίνης (ADR), καμπτοθεκίνη (CPT), ή μιτοξαντρόνη (ΜΧ) παρουσία DMSO (οχήματος), 200 ηΜ PZ-39, ή FTC που ακολουθείται από δοκιμασία SRB. δείκτης Ευαισθητοποίηση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας IC

50 μιτοξαντρόνης σε απουσία ή παρουσία PZ-39 ή FTC. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται είναι μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η ανασταλτική δράση της PZ-39 για ABCG2, τα αποτελέσματα της PZ-39 για μιτοξαντρόνη κυτταροτοξικότητα σε ΗΕΚ293 /ABCG2 κύτταρα εκτιμήθηκαν με την παρουσία τριών διαφορετικών συγκεντρώσεων του PZ-39 (50, 200, και 500 ηΜ) ή του ελέγχου του οχήματος (0,1% DMSO). Όπως φαίνεται στο Σχ. 3C, PZ-39 στους 50 ηΜ μείωσε σημαντικά το IC

50 μιτοξαντρόνης με δείκτη ευαισθητοποίηση του 0,4 (Πίνακας 2). Στα 500 nm, ο δείκτης ευαισθητοποίηση του PZ-39 είναι 0,04 ενώ εκείνη του FTC στην ίδια συγκέντρωση είναι 0,26 (Σχ. 3D και Πίνακας 2). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι PZ-39 είναι ένας πολύ ισχυρός αναστολέας ABCG2 νέα.

Η

Για να διερευνηθεί εάν PZ-39 μπορεί να αντιστρέψει ABCG2 μεσολάβηση πολυφαρμακευτικής αντίστασης σε φάρμακο ανθεκτική κυτταρική σειρά καρκίνου, χρησιμοποιήσαμε το ναρκωτικά επιλεγμένα κύτταρα MCF7 /AdVp3000 και δοκιμάζονται δύο επιπλέον υποστρώματα αντικαρκινικό φάρμακο της ABCG2, αδριαμυκίνη και καμπτοθεκίνη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Ε, PZ-39 στα 200 nm μείωσε δραστικά την αντοχή του MCF7 /AdVp3000 να Adriamycin και καμπτοθεκίνη παρόμοια με μιτοξαντρόνη, ενώ ο έλεγχος FTC έδειξε πολύ λιγότερη επίδραση ευαισθητοποίησης και για τα τρία φάρμακα σε σύγκριση με PZ-39 στην ίδια συγκέντρωση.

Δύο τρόπους δράσης

Για να κατανοήσουμε το μηχανισμό της PZ-39 δράση στην αναστολή ABCG2 μεταφορά μέσω των ναρκωτικών, ερευνήσαμε πρώτα την κινητική της PZ-39 αναστολή χρησιμοποιώντας απομονωθεί μέσα-έξω μεμβράνη κυστίδια [16] . Προσδιορίσαμε την μεταβολή στην πρόσληψη μιτοξαντρόνη στην παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων του PZ-39. Όπως φαίνεται στο διάγραμμα Lineweaver-Burk (Σχ. 4Α), το Km και Vmax μεταφοράς μιτοξαντρόνης απουσία PZ-39 εκτιμήθηκε ότι ήταν 2,3 μΜ και 455 pmol /mg πρωτεΐνης, αντίστοιχα. Φαίνεται ότι τόσο η Km και Vmax μιτοξαντρόνης μεταφοράς έχουν μειωθεί με την παρουσία του PZ-39 με εκτιμώμενο Κί ~0.52 μΜ, υποδεικνύοντας ότι PZ-39 συμπεριφέρεται ως αναστολέας μικτού τύπου μιτοξαντρόνης μεταφοράς [17]. Επειδή ήταν επίσης αρχικά σκέφτηκε ότι ορισμένοι αναστολείς θα ανταγωνιστεί με το σημείο σύνδεσης ATP για ABCG2 μεταφορέα, εκτελέσαμε ένα άλλο πείραμα, χρησιμοποιώντας ΑΤΡ ως διαφορετικό υπόστρωμα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, τόσο η Km και Vmax μιτοξαντρόνης μεταφοράς επίσης μεταβληθεί από PZ-39. Έτσι, η μελέτη μας έδειξε ότι η διαδικασία της μεταφοράς μιτοξαντρόνης και δεσμευτικών ΑΤΡ μπορεί να ανασταλεί από PZ-39 με ένα μικτό τύπο του μηχανισμού. Πιθανόν, PZ-39 δεσμεύεται σε μια διαφορετική θέση για ABCG2 τόσο από μιτοξαντρόνη και ATP, δεν είναι ανταγωνιστικός αναστολέας της κάθε μία από αυτές.

Μέσα-έξω κυστίδια μεμβράνης πλάσματος από ΗΕΚ293 /κύτταρα ABCG2 επωάστηκαν με 0.6, 1.2 , και 1.8 μΜ [

3Η] μιτοξαντρόνη (Α) ή με 0,1, 0,2, 0,5, 1, και 5 mM ΑΤΡ μαζί με 0.6 μΜ [

3Η] μιτοξαντρόνη (Β) απουσία ή παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων του PZ-39 στους 37 ° C για 5 λεπτά που ακολουθείται από προσδιορισμό της πρόσληψης μιτοξαντρόνης. Τα δεδομένα που δεικνύονται είναι μέσος όρος ± Τ.Α. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν PZ-39 πιθανώς αναστέλλει ABCG2 ολιγομερισμό αφού ABCG2 έχει προταθεί να λειτουργεί ως ένα ομοδιμερές ή υψηλότερες μορφές ολιγομερών και ολιγομερισμού μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως στόχος για θεραπευτικό φάρμακο ανάπτυξη [2], [3]. Για το σκοπό αυτό, συν-ανοσοκαταβύθιση των δύο διαφορικά tagged ABCG2 διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [2] μετά από θεραπεία 6-ώρες με PZ-39 στο 3,3 μΜ. Ωστόσο, καμία επίδραση της PZ-39 για ABCG2 συνανοσοκαθίζησης βρέθηκε (συμπληρωματική Εικόνα. S1), γεγονός που υποδηλώνει ότι PZ-39 δεν επηρεάζει ABCG2 ολιγομερισμό.

Για να εξετάσει περαιτέρω το μηχανισμό της PZ-39 επίδραση στην ABCG2, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση western blot της έκφρασης ABCG2 εξής PZ-39 αγωγή. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, το επίπεδο σταθερής κατάστασης του ABCG2 πρωτεΐνης μειώθηκαν δραστικά κατά την 1η ημέρα μετά PZ-39 της θεραπείας. Αλλά, είχε μόνο οριακή μείωση στις 2 ώρες μετά την αγωγή PZ-39. Όπως περιγράφεται παραπάνω, PZ-39 ήταν σε θέση να αναστείλουν ABCG2 μεσολάβηση μιτοξαντρόνη εκροής ανθεκτικών κυττάρων φαρμάκου με 1 ώρα επώασης. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η PZ-39 μπορεί να έχει δύο τρόπους δράσης αναστέλλοντας τη δράση (οξεία δράση) και την έκφραση (χρόνια επίδραση) του ABCG2 και συνεπείς με την παρατήρηση μας ότι PZ-39 είναι περίπου 3 φορές καλύτερη από FTC σε δοκιμασία συσσώρευση φαρμάκου ( οξεία επίδραση), αλλά περίπου 7 φορές πιο ισχυρό σε δοκιμασία ευαισθητοποίηση των ναρκωτικών (χρόνιο φαινόμενο).

Α, αποτέλεσμα της PZ-39 για ABCG2 επίπεδο σταθερής κατάστασης. ΗΕΚ293 κύτταρα /ABCG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με φορέα DMSO ή 3,3 μΜ PZ-39 για διάφορους χρόνους και συλλέχθηκαν για ανάλυση Western blot της έκφρασης ABCG2. Β, αποτέλεσμα της PZ-39 για τη σταθερότητα ABCG2. ΗΕΚ293 κύτταρα /ABCG2 υποβλήθηκαν αρχικά σε επεξεργασία με κυκλοεξιμίδη (5 μg /ml) που ακολουθείται από προσθήκη 3,3 μΜ PZ-39 ή DMSO για διάφορους χρόνους και συλλέχθηκαν για ανάλυση στυπώματος western. C, ο χρόνος ημιζωής του ABCG2. επίπεδα ABCG2 σε στύπωμα western όπως φαίνεται στο Β προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας Scion Image και συναρτήσει του χρόνου της θεραπείας. Τα δεδομένα που δεικνύονται είναι μέση τιμή ± Τ.Α τεσσάρων πειραμάτων. D, αποτέλεσμα της PZ-39 για 5D3 χρώση των ABCG2. ΗΕΚ293 /κυττάρων ABCG2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς (λεπτή γραμμή) ή με (παχιά γραμμή) όχημα DMSO, 10 μΜ PZ-39 ή FTC που ακολουθείται από χρώση με μονοκλωνικό αντίσωμα 5D3 και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Ε, επίδραση του FTC στην έκφραση ABCG2. ΗΕΚ293 κύτταρα /ABCG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10 μΜ FTC για διάφορους χρόνους και συλλέχθηκαν για ανάλυση Western blot της έκφρασης ABCG2. F, αποτέλεσμα της βαφιλομυκίνης Α

1 και MG-132 για PZ-39 που προκαλείται υποβάθμιση ABCG2. ΗΕΚ293 κύτταρα /ABCG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 3 μΜ PZ-39 σε απουσία ή παρουσία 10 ηΜ βαφιλομυκίνη A

1 ή 2 μΜ MG-132 για διάφορους χρόνους και συλλέχθηκαν για ανάλυση Western blot της έκφρασης ABCG2. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης σε όλα τα κηλίδα western αναλύσεις.

Η

Για να διαπιστώσετε εάν η χρόνια επίδραση της PZ-39 για την έκφραση ABCG2 είναι στο επίπεδο mRNA, πραγματοποιήσαμε σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR του MCF7 /AdVp3000 και ΗΕΚ293 /κυττάρων ABCG2 σε επεξεργασία με PZ-39 για διάφορους χρόνους μέχρι και 3 ημέρες. Καμία σημαντική αλλαγή βρέθηκε στο επίπεδο ABCG2 mRNA μετά PZ-39 της θεραπείας είτε σε κυτταρική σειρά (βλέπε συμπληρωματικό σχήμα. S2). Έτσι, PZ-39 επηρεάζει απίθανο έκφραση ABCG2 στο επίπεδο του mRNA της. Εμείς επόμενο Υποθέσαμε ότι ο μηχανισμός του PZ-39 με τη μεσολάβηση της αναστολής θα ήταν μια μετα-μεταγραφική διεργασία και εξέτασαν την πιθανότητα ότι PZ-39 μπορεί να επιταχύνει την αποικοδόμηση του ABCG2. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, κύτταρα ΗΕΚ293 /ABCG2 ήταν προ-επεξεργασία με κυκλοεξιμίδη, η οποία δρα με αναστολή επιμήκυνσης κατά τη διάρκεια της σύνθεσης πρωτεϊνών, που ακολουθείται από κατεργασία με PZ-39 για διάφορους χρόνους για να προσδιοριστεί ρυθμός αποικοδόμησης ABCG2. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β, η απώλεια ABCG2 σε κύτταρα κατεργασμένα με ένα συνδυασμό PZ-39 και κυκλοεξιμίδιο ήταν πολύ ταχύτερη από εκείνη του μάρτυρα χωρίς θεραπεία PZ-39. Ο χρόνος ημίσειας ζωής του ABCG2 παρουσία PZ-39 υπολογίζεται να είναι περίπου 5 ώρες ενώ είναι σταθερή με εκτιμώμενη ημίσεια ζωή της ~54 ώρες στον έλεγχο (Εικ. 5C). Έτσι, PZ-39 πιθανώς επιταχύνει την υποβάθμιση των πρωτεϊνών ABCG2.

Επίδραση του PZ-39 για ABCG2 διάπλαση και τη σταθερότητα

Η επιταχυνόμενη υποβάθμιση της ABCG2 από PZ-39 μπορεί να οφείλεται σε αυτό το PZ -39 επάγει διαμορφωτική αλλαγή και ABCG2 για την αποικοδόμηση στόχο. Για να προσδιοριστεί εάν PZ-39 δυνητικά προκαλεί διαμορφωτικές αλλαγές του ABCG2, χρησιμοποιήσαμε το μονοκλωνικό αντίσωμα 5D3 η οποία έχει αναφερθεί προηγουμένως να δεσμεύεται με ABCG2 στην επιφάνεια των κυττάρων ευκολότερα υπό την παρουσία αναστολέων ABCG2 προφανώς λόγω αναστολέα προκαλούμενη διαμορφωτικές αλλαγές [12] , [18]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5D, PZ-39 προκάλεσε αύξηση της χρώσης 5D3, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή διαμορφωτική αλλαγή του ABCG2 κατόπιν PZ-39 δέσμευσης. FTC αυξήθηκε επίσης χρώση 5D3 όπως αναμενόταν. Ωστόσο, δεν επηρέασε το επίπεδο της ABCG2 (Σχ. 5Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι η διαμορφωτική αλλαγή που προκαλείται από FTC και PZ-39 μπορεί να είναι διαφορετική. Έχει αναφερθεί πρόσφατα ότι υπάρχουν δύο διακριτές οδούς για την αποδόμηση του άγριου τύπου και μεταλλαγμένες πρωτεΐνες ABCG2 [19]. Ενώ άγριου τύπου και σωστά διπλωμένη πρωτεΐνη αποικοδομείται σε λυσοσώματα, το μεταλλαγμένο και misfolded πρωτεΐνη εμπλέκεται στην αποικοδόμηση της πρωτεΐνης διαμεσολαβείται από την ουβικουϊτίνη σε πρωτεασώματα. Για να προσδιοριστεί περαιτέρω ο μηχανισμός της ΡΖ-39-επαγόμενη αποικοδόμηση ABCG2, χρησιμοποιήσαμε βαφιλομυκίνη A

1, έναν αναστολέα της αποικοδόμησης πρωτεΐνης σε λυσοσώματα, και MG-132, έναν αναστολέα πρωτεοσώματος. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5F, συν-επεξεργασία των κυττάρων με βαφιλομυκίνη A

1 και ΡΖ-39 ανέστειλε PZ-39-επαγόμενη αποικοδόμηση ABCG2 ενώ συν-θεραπεία με MG-132 και PZ-39 δεν είχε, υποδεικνύοντας ότι PZ-39-επαγόμενη αποικοδόμηση ABCG2 είναι πιθανό λυσόσωμα-εξαρτώμενη. Στο σύνολό τους, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι PZ-39 προκαλεί διαμορφωτική αλλαγή ABCG2 και στοχεύει αυτό για την κανονική υποβάθμιση σε λυσοσώματα.

Επίδραση του PZ-39 για ABCB1- ή ABCC1 μεσολάβηση

μεταφορά ναρκωτικών

Για να προσδιοριστεί η ειδικότητα του PZ-39, εξετάσαμε την επίδραση της PZ-39 για τις άλλες δύο σημαντικές μεταφορείς ABC καλά γνωστές στην MDR, ABCB1 και ABCC1. Η επίδραση της PZ-39 για ABCB1 και ABCC1 διαμεσολαβούμενη μείωση στην ενδοκυτταρική συσσώρευση Αδριαμυκίνη ελέγχθηκε με τη χρήση MCF7 κύτταρα επιμολυσμένα με ABCB1 (BC19) [20] και ΗΕΚ293 κύτταρα επιμολυσμένα με ABCC1 (ΗΕΚ293 /ABCC1) [16], [21 ]. Εμείς δεν βρήκε καμία επίδραση της PZ-39 σχετικά με τη δραστηριότητα των ABCB1 και ABCC1 στη μείωση της συσσώρευσης Αδριαμυκίνη (βλέπε συμπληρωματικό σχήμα. S3A). Βρήκαμε επίσης καμία επίδραση του PZ-39 στο επίπεδο σταθερής κατάστασης της πρωτεΐνης των ABCB1 και ABCC1 μετά από 3 ημέρες θεραπείας (Εικ. S3b). Έτσι, πιθανότατα PZ-39 είναι ειδικό για ABCG2 μεταξύ αυτών των τριών γνωστά MDR προκαλούν μεταφορείς ABC που πιστεύεται ότι παίζουν σημαντικούς ρόλους στην κλινική αντοχή φαρμάκου.

Επίδραση του PZ-39 ανάλογα στις ABCG2

για να κατανοήσουμε καλύτερα την φαρμακοφόρο του PZ-39, που συνελήφθησαν 3 ανάλογα PZ-39 για την συσσώρευση του φαρμάκου και οι δοκιμασίες αντοχής χρησιμοποιώντας ΗΕΚ293 /κυττάρων ABCG2 σε σύγκριση με το PZ-39. Αυτά τα ανάλογα (C6, C8, και Ε2) έχουν όλα τις ίδιες άθικτο δακτύλιοι Α, Β και Γ, όπως PZ-39 αλλά με διαφορετικές πλευρικές ομάδες (Εικ. 1). Και τα τρία ανάλογα είχαν παρόμοια δραστηριότητα ως PZ-39 για την ενίσχυση της συσσώρευσης μιτοξαντρόνη (Εικ. 6Α) και ευαισθητοποίηση αντίσταση μιτοξαντρόνη σε ΗΕΚ293 /ABCG2 (Εικ. 6Β). Για τον προσδιορισμό της χρόνιας επίδραση αυτών των αναλόγων στην έκφραση ABCG2, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση Western blot μετά από θεραπεία με C6, C8, και Ε2 για διάφορους χρόνους μέχρι και 3 ημέρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6C, και τα τρία ανάλογα προκάλεσε την μειωμένη έκφραση ABCG2. Επιπλέον, όλες αυτές ανάλογα προκάλεσαν επίσης διαμορφωτικές αλλαγές σε ABCG2 παρόμοια με ΡΖ-39 (Εικ. 6D). Έτσι, πιθανότατα ο βενζοθειαζόλιο συνδέεται με ένα σκελετό δακτύλιο τριαζίνης μπορεί να είναι η βασική δομή για δέσμευση σε και την αναστολή της λειτουργίας ABCG2 και σταθερότητα.

Α, αποτελέσματα της PZ-39 και αναλόγου ενώσεις του (3 μΜ) για συσσώρευση μιτοξαντρόνη σε κύτταρα /ABCG2 ΗΕΚ293. Τα δεδομένα που δεικνύονται είναι μέσος όρος ± Τ.Α. τριπλών πειραμάτων. Β, δείκτης ευαισθητοποίηση του PZ-39 και σχετικές ενώσεις σε κύτταρα ΗΕΚ293 /ABCG2. ΗΕΚ293 κύτταρα /ABCG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις της μιτοξαντρόνης απουσία ή παρουσία 50 ηΜ PZ-39, C6, C8, και Ε2 που ακολουθείται από δοκιμασία SRB. δείκτης Ευαισθητοποίηση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας IC

50 μιτοξαντρόνης απουσία ή παρουσία αναστολέων ένωσης. Τα δεδομένα είναι μέση τιμή ± Τ.Α. από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. C, το αποτέλεσμα των επιλεγμένων PZ-39 και των σχετικών ενώσεων σε ABCG2 επίπεδο σταθερής κατάστασης. ΗΕΚ293 κύτταρα /ABCG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με φορέα DMSO ή 3 μΜ PZ-39, C6, C8, ή Ε2 για διάφορους χρόνους και συλλέχθηκαν για ανάλυση Western blot της έκφρασης ABCG2. D, αποτέλεσμα του PZ-39 και σχετικές ενώσεις στις 5D3 χρώση των ABCG2. ΗΕΚ293 /κυττάρων ABCG2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς (λεπτή γραμμή) ή με (παχιά γραμμή) DMSO όχημα, 10 μΜ PZ-39 ή σχετικές ενώσεις του C6, C8, και Ε2 που ακολουθείται από χρώση με μονοκλωνικό αντίσωμα 5D3 και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε μια νέα ισχυρή ειδικός αναστολέας της ανθρώπινης ABCG2, PZ-39, ως πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για την ευαισθητοποίηση της αντίστασης στα φάρμακα στη χημειοθεραπεία του καρκίνου. PZ-39 περιέχει βενζοθειαζόλη συνδέεται με μια ραχοκοκαλιά δακτύλιο τριαζίνης. Ο μηχανισμός δράσης της φαίνεται να είναι με δύο τρόπους? μικτή αναστολή τύπου σε λειτουργία μεταφοράς των ναρκωτικών και την επίσπευση της λυσόσωμα εξαρτώμενη από την υποβάθμιση της ABCG2. PZ-39 δεν είναι η ίδια κυτταροτοξική με ένα IC

50 & gt?. 24 μΜ, ενώ είναι πολύ ισχυρή στην ευαισθητοποίηση MDR των καρκινικών κυττάρων που υπερεκφράζουν ABCG2

Πολλοί έχουν αναφερθεί στο παρελθόν αναστολείς ABCG2 έχουν ένα ευρύ φάσμα των στόχων ABC μεταφορέα. ABCG2 αναστολέα GF120918, για παράδειγμα, στην πραγματικότητα, αναστέλλει την λειτουργία ABCB1 ισχυρότερα από ABCG2. Μέχρι τώρα, έχουν πολύ λίγες ενώσεις έχουν ταυτοποιηθεί ως ειδικοί αναστολείς της ABCG2. Ένα τέτοιο παράδειγμα είναι η μη-τοξικό παράγωγο FTC, Ko143. Είναι πιο ισχυρή από άλλα ανάλογα FTC, και δεν έχει τοξικότητα σε ποντίκια σε /kg από του στόματος δόση 10-50 mg [10]. Πρόσφατα, δύο από τις ενώσεις φλαβόνης, 6-prenylchrysin και tectochrysin, έχουν δειχθεί ότι είναι ειδικό για ABCG2 και καμία αλληλεπίδραση ανιχνεύθηκε είτε με ABCB1 ή ABCC1 [22]. Χρησιμοποιώντας διαλογής υψηλής απόδοσης, Henrich et al. βρέθηκαν αρκετές ενώσεις που έχουν παρόμοια ή μικρότερη ανασταλτική δράση σε σύγκριση με το FTC [11], [12]. Παρ ‘όλα αυτά, καμία από αυτές που αναφέρθηκαν ειδικών αναστολέων ABCG2 έχει ελεγχθεί κλινικά.

Σε σύγκριση με μερικά από το παρελθόν γνωστή ειδική αναστολείς ABCG2, όπως FTC, η νέα ένωση PZ-39 έχει τρία χαρακτηριστικά πλεονεκτήματα. Πρώτον, PZ-39 είναι πολύ πιο ισχυρή από FTC σε αναστολή της λειτουργίας ABCG2. Στην δοκιμασία συσσώρευσης του φαρμάκου, PZ-39 επιτυγχάνονται σαφώς το ίδιο επίπεδο αναστολής σε 3.3 μΜ σε σύγκριση με FTC στα 10 μΜ. Στην δοκιμασία επιβίωσης των κυττάρων, PZ-39 στα 500 nm ήταν σε θέση να ευαισθητοποιήσει ABCG2 μεσολάβηση αντίσταση μιτοξαντρόνη με δείκτη 0,04 ενώ FTC στην ίδια συγκέντρωση έχει δείκτη ευαισθητοποίηση του 0,26, ~ 7-πλάσια διαφορά. Δεύτερον, PZ-39 έχει πολύ χαμηλή εγγενή κυτταροτοξικότητα in vitro (& gt? 24 μΜ), αλλά ο δείκτης δραστικότητα του είναι πολύ καλύτερη από ό, τι FTC (1600 έναντι 62). Έτσι, το παράθυρο του θεραπευτικού δείκτη της PZ-39 μπορεί να είναι μεγάλο. Ένα ιδανικό χημειο-ευαισθητοποιητής είναι ότι δεν πρέπει να είναι τοξική από μόνη της. Σαφώς, PZ-39 πληροί αυτή την απαίτηση σε in-vitro μελέτες. Ωστόσο, οι μελλοντικές μελέτες για να αξιολογηθεί η τοξικότητα του PZ-39 σε ζωικά μοντέλα. Τρίτον, PZ-39 φαίνεται να έχει δύο τρόπους δράσης. Εκτός από την ικανότητά της να αναστέλλει δραστικότητα ABCG2, PZ-39 επιταχύνει επίσης λυσόσωμα εξαρτώμενη αποδόμησής της. Αυτή η δεύτερη τρόπος δράσης είναι ένα διακριτικό χαρακτήρα και σαφώς αυξάνει την ισχύ του PZ-39 για ABCG2 ενδεχομένως από ανακυκλωμένα χρήση του PZ-39. Αυτή η φύση δεν έχει αναφερθεί για τυχόν προηγούμενα γνωστούς αναστολείς μεταφορέα ABC.

Οι δύο τρόποι δράσης κάνουν PZ-39 μια πολύ ενδιαφέρουσα, μυθιστόρημα, και πολλά υποσχόμενη αναστολέας ABCG2 για περαιτέρω εκμετάλλευση. Στον πρώτο τρόπο της οξείας επίδραση στη λειτουργία ABCG2, PZ-39 φαίνεται να ασκεί μια μικτή τύπος της αναστολής σε προσδιορισμό πρόσληψη φαρμάκου. PZ-39 μπορεί να αλληλεπιδράσουν με ABCG2 άμεσα, αλλά δεν φαίνεται να ανταγωνίζονται άμεσα με μιτοξαντρόνη ή δέσμευσης ΑΤΡ. Οι μελλοντικές μελέτες για να προσδιοριστούν οι θέσεις δέσμευσης PZ-39 στο ABCG2. Στον δεύτερο τρόπο, PZ-39 φαίνεται να επιταχύνει την αποικοδόμηση ABCG2 στα λυσοσωμάτια, μια χρόνια επίδραση. Είναι πιθανό ότι η δέσμευση του PZ-39 προκαλεί διαμορφωτική αλλαγή στην ABCG2 που στοχεύει για αποικοδόμηση στο λυσοσώματα. Είναι, ωστόσο, αξιοσημείωτο ότι η δέσμευση του FTC προκαλεί επίσης ABCG2 διαμορφωτική αλλαγή, αλλά δεν έχει επιταχύνει την αποικοδόμηση ABCG2. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η διαμορφωτική αλλαγή που προκαλείται από PZ-39 και FTC μπορεί να είναι διαφορετική. Προηγουμένως, έχει βρεθεί ότι η κυστεΐνη μεταλλαγμένο αποδόμηση ABCG2 είναι μέσω πρωτεόσωμα ενώ η κανονική αποικοδόμηση του άγριου τύπου ABCG2 είναι μέσω λυσόσωμα [19], με χρόνο ημίσειας ζωής ~37 ώρες [23]. Έχει επίσης βρεθεί ότι ο αγωνιστής προκαλούμενη αποικοδόμηση της β

2-αδρενεργικού υποδοχέα είναι μέσω λυσόσωμα ενδεχομένως με ενισχυμένη ενδοκυττάρωση [24]. Είναι δελεαστικό να προτείνει ότι η δέσμευση του PZ-39 για να ABCG2 είναι σε θέση να επιταχύνει την ενδοκύτωση και την εμπορία των επιφανειακών ABCG2 κυττάρων σε λυσοσώματα για αποικοδόμηση. Εκτεταμένες προσπάθειες για την περαιτέρω αξιολογήσει αυτή την υπόθεση είναι σε εξέλιξη στο εργαστήριό μας.

Τα ανάλογα της PZ-39, C6, C8 και Ε2 με την ίδια δομή πυρήνα όλα φαίνεται να λειτουργούν με τον ίδιο μηχανισμό όπως PZ-39. Σαφώς, περαιτέρω μελέτες θα πρέπει να εξετάζουν περισσότερα ανάλογα PZ-39 με περισσότερες μεταβολές στον πυρήνα βενζοθειαζολίου συνδέεται με ένα σκελετό δακτύλιο τριαζίνης και για να αποσαφηνιστεί η σχέση δομής-δραστικότητας του PZ-39 σε αναστολή ABCG2. Παρ ‘όλα αυτά, οι παρατηρήσεις από τη μελέτη αυτή δείχνουν σαφώς ότι PZ-39 μπορεί να χρησιμεύσει ως ένωση μολύβδου για περαιτέρω σχεδιασμό και βελτιστοποίηση των περισσότερων ειδικών αναστολέων ABCG2 για καλύτερη θεραπεία των ανθεκτικών στα φάρμακα ανθρώπινων καρκίνων σε συνδυαστική θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά