Αφηρημένο

Εισαγωγή

Έχουμε ήδη εντοπιστεί κοινά διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια (DE) στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης (BC). Στην παρούσα μελέτη αναλύσαμε σε βάθος, την έκφραση αρκετών ομάδων αυτών των γονιδίων DE.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα δείγματα από 30 ανθρώπινη ΣΔ και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών τους αναλύθηκαν με cDNA ολόκληρο το γονιδίωμα μικροσυστοιχίες, qRT-PCR και κηλίδωση Western. Η προσοχή μας επικεντρώθηκε στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και των γονιδίων επιδιόρθωσης βλαβών του DNA, τα γονίδια που σχετίζονται με την απόπτωση, μεταγωγή σήματος, την αγγειογένεση, όπως επίσης και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετάσταση. Τέσσερις διαθέσιμων στο κοινό GEO Σύνολα Δεδομένων αναλύθηκαν περαιτέρω, και τα δεδομένα έκφραση των γονιδίων ενδιαφέροντος (GOIs) συγκρίθηκαν με αυτές της παρούσας μελέτης. Η σχέση μεταξύ των ΔΑΙ ερευνήθηκε επίσης. GO και KEGG ανάλυση μοριακού μονοπατιού έγινε για τον εντοπισμό πιθανών εμπλουτισμός των γονιδίων με συγκεκριμένες βιολογικές θέματα.

Αποτελέσματα

Ανεξέλεγκτη ανάλυση διασποράς των δεδομένων των μικροσυστοιχιών DNA αποκάλυψε μια σαφής διάκριση στην π.Χ. εναντίον δείγματα ελέγχου και χαμηλή εναντίον όγκων υψηλού βαθμού. Γονίδια με τουλάχιστον 2-φορές διαφορική έκφραση σε π.Χ. εναντίον ελέγχων, καθώς και σε μη-μυϊκό επεμβατική εναντίον των μυών επεμβατικές όγκους και σε χαμηλές εναντίον όγκων υψηλού βαθμού, εντοπίστηκαν και κατατάσσονται. Δόθηκε ιδιαίτερη προσοχή στις αλλαγές στην οστεοποντίνη (OPN, SPP1) έκφραση, οφείλεται σε πολλαπλές βιολογικές λειτουργίες του. Ομοίως, τα γονίδια που παρουσιάζουν ίση ή χαμηλή έκφραση π.Χ. εναντίον βαθμολογήθηκαν οι έλεγχοι. Σημαντικές ζεύγη συσχετισμοί στη γονιδιακή έκφραση βαθμολογήθηκαν. GO ανάλυση αποκάλυψε την πολυ-πτυχή χαρακτήρα της GOIs, δεδομένου ότι συμμετέχουν σε μια ποικιλία μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, του κυτταρικού θανάτου, του μεταβολισμού, το σχήμα των κυττάρων, και κυτταροσκελετικές αναδιοργάνωση. ανάλυση KEGG αποκάλυψε ότι η πιο σημαντική οδός ήταν εκείνη της ουροδόχου κύστης (p = 1,5 × 10

-31).

Συμπεράσματα

Η παρούσα εργασία προσθέτει στην τρέχουσα γνώση σχετικά με μοριακή υπογραφή ταυτοποίηση του BC. Τέτοια έργα θα πρέπει να προχωρήσει, ώστε να αποκτήσουν μεγαλύτερη κατανόηση μοριακών μηχανισμών της νόσου

Παράθεση:. Zaravinos Α, Λάμπρου GI, Βολάνη D, ΔΕΛΑΚΑΣ D, Spandidos DA (2011) Spotlight για διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων στον καρκίνο της ουροδόχου κύστεως. PLoS ONE 6 (4): e18255. doi: 10.1371 /journal.pone.0018255

Επιμέλεια: Ι Ο βασιλιάς της Ιορδανίας, Georgia Institute of Technology, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Οκτ. 2010? Δεκτές: 1 Μαρτίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 5 Απρ, 2011

Copyright: © 2011 Zaravinos et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο της ουροδόχου κύστεως (π.Χ.) είναι η πιο κοινή. κακοήθεια του ουροποιητικού συστήματος, υπεύθυνη για σημαντικές θνησιμότητας και νοσηρότητας παγκοσμίως. Στην Ευρώπη, οι κατ ‘εκτίμηση 105.000 νέες περιπτώσεις καρκίνου της ουροδόχου κύστης διαγιγνώσκονται ετησίως, ενώ περίπου 30.000 ασθενείς πεθαίνουν από καρκίνο της ουροδόχου κύστης κάθε χρόνο [1]. επίπτωση του αυξάνει άμεσα με την ηλικία, όντας σπάνια πριν την ηλικία των 50 ετών, και είναι τρεις έως τέσσερις φορές πιο συχνή στους άνδρες σε σύγκριση με τις γυναίκες. Σχεδόν όλοι οι καρκίνοι της ουροδόχου κύστης είναι καρκινώματα, που προκύπτουν από την μεταβατικό επιθήλιο. Η συμπεριφορά των μεταβατικών καρκίνωμα (TCC) είναι εξαιρετικά ποικίλες και ορίζεται από δύο ξεχωριστά, αλλά σχετικές διαδικασίες: υποτροπής και εξέλιξης του όγκου. Κατά την παρουσίαση, 75-85% των όγκων περιορίζονται στο βλεννογόνο, ή εισβάλλουν ο

χορίου βλεννογόνων

. Το υπόλοιπο παρόν με εισβολή του μυϊκού στρώματος του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης ή παρατείνει να perivesical ιστό, γειτονικά όργανα και το πυελικό τοίχωμα. Περισσότερο από το 60% των επιφανειακών όγκων θα επαναληφθεί τουλάχιστον μία φορά και η πρόοδος σε λιγότερο διαφοροποιημένες ή επεμβατική νεοπλάσματα με χειρότερη πρόγνωση σε ένα σημαντικό ποσοστό ασθενών [2]. Οι πιο χρήσιμο προγνωστικό παράμετροι είναι βαθμού όγκου, το στάδιο, το μέγεθος, πριν το ποσοστό υποτροπής και τη σύγχρονη παρουσία της ΚΑΚ [3]. Παρ ‘όλα αυτά, την καλύτερη κατανόηση της φυσικής ιστορίας του TCC μπορεί να αναμένεται από την διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών της TCC.

Έχουμε ήδη εντοπιστεί κοινά διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια (DE) στα ούρα π.Χ. [4]. Στην παρούσα μελέτη, το ενδιαφέρον μας επικεντρώθηκε στην ανάλυση των διαφόρων ομάδων των γονιδίων DE, όπως γονίδια που εμπλέκονται στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, το DNA αποκατάστασης των ζημιών, απόπτωση, μεταγωγή σήματος, παράγοντες μεταγραφής, αγγειογένεση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την εισβολή και μετάσταση. Ερευνήσαμε το προφίλ έκφρασης σε π.Χ. εναντίον υγιή ιστό, σε μη-διηθητικό (στάδιο Τ1) έναντι διηθητικό όγκων (στάδιο Τ2-Τ4), και σε χαμηλό έναντι όγκων υψηλού βαθμού με ανάλυση μικροσυστοιχιών. Τα αποτελέσματα περαιτέρω επικυρωθεί με ανοσοϊστοχημεία, qPCR και κηλίδωση Western. Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε GEO υπολογιστική ανάλυση δεδομένων μικροσυστοιχιών που προέρχονται από άλλες διαθέσιμες δημόσια σύνολα δεδομένων, και τα συνέκριναν με τα αποτελέσματά μας.

Τα αποτελέσματά μας επικεντρώθηκε σε γονίδια τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στις πιο σημαντικές κυτταρικές διεργασίες και έδειξε μια μεγάλη διαφορά στα πρότυπα έκφρασης τους μεταξύ των δειγμάτων π.Χ. και ελέγχου. Γονίδια με τουλάχιστον 2-φορές διαφορική έκφραση σε π.Χ. εναντίον ελέγχων, καθώς και σε μη-διηθητικό vs. διηθητικό όγκων, και σε όγκους χαμηλής έναντι υψηλής ποιότητας, εντοπίστηκαν και κατατάσσονται.

Υλικά και Μέθοδοι

σχεδιασμός μελέτης και κλινικοπαθολογοανατομικές δεδομένων

Αξιόπιστες όγκου και φυσιολογικά δείγματα ιστού από μια συνεχόμενη σειρά 30 ασθενών με νέα διάγνωση ΣΔ που υποβάλλονται σε διουρηθρική εκτομή του όγκου της κύστης στο Τμήμα Ουρολογίας, » Ασκληπιείο »Γενικό Νοσοκομείο, Αθήνα, αποκτήθηκαν μετά το ύψος του ιστού είναι απαραίτητες για εξέταση ρουτίνας παθολογίας είχαν αφαιρεθεί (Πίνακας 1). Όλα τα δείγματα όγκων είχαν ταξινομηθεί και βαθμολογούνται από τον ίδιο παθολογοανατόμο. Οι ασθενείς με καρκίνο κατηγοριοποιήθηκαν συνεπώς σε διηθητικό (Τ2, Τ3 ή Τ4) και μη επεμβατική όγκους (Ta, T1, και CIS). Για συγκριτικούς σκοπούς με προηγούμενες εκθέσεις, το 1973, του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ) του συστήματος ταξινόμησης [χαμηλής ποιότητας (βαθμοί 1-2) και υψηλού βαθμού (βαθμός 3)] χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη, η οποία εξακολουθεί να είναι το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο σύστημα παρά το γεγονός ότι αντικατέστησε από τον WHO /Διεθνής Εταιρεία 2004 Ουρολογικής Παθολογίας (ISUP) ταξινομήσεων [5]. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς που περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Κρήτης. τα κριτήρια επιλεξιμότητας που χρησιμοποιήθηκαν επιλεκτικά εκτομή πρωτογενή ΣΔ και τη διαθεσιμότητα του DNA από κανονικό και όγκου ιστού για αναλύσεις βιομοριακής. Τα κριτήρια αποκλεισμού ήταν ένα ιστορικό προηγούμενων νεοπλασμάτων και χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση

Η

Τα δείγματα ιστού ελήφθησαν σε χειρουργική επέμβαση από τον όγκο και τα ακόλουθα τρία κατάφωρα κανονική επιλεγμένες τοποθεσίες (κρύο φλιτζάνι βιοψίες):. οπίσθιο τοίχο, trigone, και η περιοχή πλησίον του όγκου. Τμήματα των εκτομή φυσιολογικά δείγματα εστάλησαν για ιστοπαθολογική ανάλυση. Όγκου και φυσιολογικών ιστών καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο, μεταφέρονται και αποθηκεύονται στους -80 ° C μέχρι την εκχύλιση του DNA.

Οι ασθενείς με μη-διηθητικό BCs παρακολουθήθηκαν με περιοδική κυστεοσκοπική εξετάσεις και ενδοκυστικής θεραπείας όπως υποδεικνύεται. Οι ασθενείς με διηθητικό BCs προσφέρθηκαν ριζική κυστεκτομή με ή χωρίς συστηματική χημειοθεραπεία. Μετά από μια μέση παρακολούθηση 24 ± 3 μήνες, 8 (26,6%) ασθενείς είχαν επαναλαμβανόμενες όγκους. Σε Ta /T1 όγκοι Η συχνότητα επανάληψης ήταν 29,4% (5/17) σε σύγκριση με το 23% (3/13) των όγκων T2-T3. Σε ασθενείς με μη διηθητικό BCs, ο ρυθμός εξέλιξης ήταν 11,1% και 22,2% για το βαθμό 2 και βαθμού 3 όγκων, αντίστοιχα. Όλες οι υποτροπές αποδείχθηκε με βιοψία. Παχύ

Η ανοσοϊστοχημεία

Τμήματα, 3-mm, από φορμόλη σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη ιστού κόπηκαν και τοποθετήθηκαν σε πλάκες επικαλυμμένες με 3-aminopropyltriethoxysilone. Τα πλακίδια ξηράνθηκαν στους 56 ° C για 1 ώρα πριν την ανοσοϊστοχημική χρώση. Τομές ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο πριν επανυδάτωση σε διαβαθμισμένες αλκοόλες, και ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείσθηκε δι ‘επεξεργασίας με 3% Η

2O

2 σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. αποκάλυψη αντιγόνου διεξήχθη με 30 λεπτά επώασης στους 80 ° C σε 10 mM κιτρικό τρινάτριο (ρΗ 6.1). Ανοσοχρώση και αποκάλυψη πραγματοποιήθηκαν σε μια αυτοματοποίηση Dako. Τα πλακίδια επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου με πρωτογενές πολυκλωνικό κατσίκα αντισώματα έναντι αντι-ErbB2 (1:800? Dako), κυκλίνη D1 (1:100? SP4? Epitomics), μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι αντι-p53 (1:250? Ε26? Epitomics) και μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι αντι-Ki-67 (1:100? SP6? Epitomics). Επίτοποι του πρωτογενούς αντισώματος ήταν εντοπισμένες με την τεχνική ανοσοϋπεροξειδάσης χρησιμοποιώντας το δευτερεύον αβιδίνης-βιοτίνης και υπεροξειδάσης κιτ υποστρώματος αντίσωμα (kit 5001, Dako), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι τομές στη συνέχεια σε επεξεργασία με Chromagen 30-30 διαμινοβενζιδένιο τετραϋδροχλωρική για τον εντοπισμό των τόπων ανοσοκαταβύθιση με οπτικό μικροσκόπιο. Τέλος, τα τμήματα πλύθηκαν, αντίθετα με αιματοξυλίνη, και τοποθετημένο κάτω από καλυπτρίδες. Καμία συγκεκριμένη χρώση παρατηρήθηκε όταν το πρωτογενές αντίσωμα παραλείφθηκε από το πρωτόκολλο (αρνητικός έλεγχος). Ιδιαιτερότητα της ανοσοχρώση επιπροσθέτως ελέγχεται με ταυτόχρονη χρώση των δειγμάτων καρκίνου του μαστού με γνωστές ErbB2, κυκλίνη D1, ρ53 και πρότυπα έκφρασης Κί67. Ένας έμπειρος παθολόγος σημείωσε την ένταση χρώσης σε τέσσερα επίπεδα (αρνητικό, ασθενές, μέτρια και ισχυρή), λαμβάνοντας υπόψη τόσο την ένταση του χρώματος και του αριθμού των χρωματισμένων κυττάρων. Εν συντομία, ο όρος αναλογία αντιπροσώπευε το εκτιμώμενο ποσοστό των θετικών-χρώση καρκινικών κυττάρων (0 = 0%? 1 = 1%? 2 = 1 έως 10%? 3 = 10 σε 33%? 4 = 33 σε 66%? 5≥ 67%), και η βαθμολογία ένταση εκπροσωπούνται τα βάθη της χρώσης των καρκινικών κυττάρων (1 = ασθενώς θετικός? 2 = μέτρια θετική?. 3 = ισχυρά θετική)

καθαρισμού RNA και cDNA παρασκευή

απομονώσαμε πλήρες RNA από δείγματα βιοψίας ακατέργαστο όγκου χρησιμοποιώντας ένα ομογενοποιητή δύναμη και το αντιδραστήριο TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6], [7]. Χρησιμοποιήσαμε 2 μg ολικού RNA ως αρχικό υλικό για την παρασκευή cDNA. Πραγματοποιήσαμε το πρώτο και το δεύτερο σκέλος σύνθεση του cDNA με τη χρήση του StrataScript First-Strand Synthesis System, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8].

μικροσυστοιχιών ανάλυση

Τα ολιγονουκλεοτίδια μικροσυστοιχιών μάρκες (γονίδια ~57K) ήταν λαμβάνεται από GE Healthcare (IL) και AppliedMicroarrays (MA) (CodeLink 57K Ανθρωπίνων ολόκληρο το γονιδίωμα). Ο υβριδισμός πραγματοποιήθηκε με το κιτ ενίσχυσης και Labeling CodeLink RNA, χρησιμοποιώντας την φθορίζουσα χρωστική Cy5. Διαφάνειες σαρώθηκαν με ένα σαρωτή μικροσυστοιχιών (ScanArray 4000XL). Οι εικόνες που δημιουργούνται με λογισμικό απόκτησης ScanArray μικροσυστοιχιών (GSI Lumonics, USA). cRNAs από τρεις πειραματικές διατάξεις που χρησιμοποιούνται σε πειράματα με ενιαία εσωτερική αιχμές ως έλεγχοι. Οι πειραματικές διατάξεις αποτελούνταν από 10 δείγματα ούρων π.Χ. διαφορετικών ιστολογίες (Τ1 /2-βαθμού 3, T1-βαθμού 1/2, Τ3-βαθμού 3) και 5 δείγματα ελέγχου. Οι σαρωμένες εικόνες σε περαιτέρω επεξεργασία με την CodeLink Έκφρασης Ανάλυση v5.0 λογισμικού από την Amersham Biosciences. Η πειραματική διάταξη αναλύθηκε με βάση το σχεδιασμό αναφοράς, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9], [10], [11]. Όλα τα δείγματα όγκων συγκρίθηκαν ενάντια στην μέση τιμή των δειγμάτων ελέγχου. διόρθωση Ιστορικό πραγματοποιήθηκε αφαιρώντας από το διάμεσο παγκόσμια υποβάθρου από το διάμεσο τοπικό παρασκήνιο από την ένταση του σήματος. Ένα όριο του 2 ορίστηκε ως cut-off, που σημαίνει ότι η ένταση σημείο για τουλάχιστον ένα κανάλι θα πρέπει να είναι διπλάσια από εκείνη του υποβάθρου. δεδομένα μικροσυστοιχιών ομαλοποιήθηκαν διαιρώντας σημείο εντάσεις από την παγκόσμια μέση. Κανονικοποιημένα δεδομένα εξήχθησαν, προ-επεξεργασία και διαλογή με το Microsoft Excel®. δεδομένων Array είναι διαθέσιμα στο Gene Expression Omnibus (National Center for Biotechnology Information) με αριθμούς πρόσβασης GSM678186 μέσω GSM678385 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE27448). Επιπλέον, κάθε γονίδιο δοκιμάστηκε για τη σημασία του σε διαφορική έκφραση χρησιμοποιώντας ένα z-test. Γονίδια θεωρήθηκαν σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων αν ληφθεί μια τιμή p & lt? 0,05. Η ψεύτικη Discovery Rate υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12], [13], [14]. Γονίδια περαιτέρω ταξινομούνται χρησιμοποιώντας αμφίδρομη (γονιδίων-εναντίον δείγματα) μέση-σύνδεση ιεραρχική ομαδοποίηση με Ευκλείδεια απόσταση χρησιμοποιώντας το λογισμικό Genesis 1.7.2 (Technische Universitaet-Graz, Αυστρία) [15].

Σε πραγματικό χρόνο PCR επικύρωση

Μεταγραφή προϊόντα υποβλήθηκαν σε πραγματικό χρόνο PCR δοκιμασία με SYBR Green Ι σε ένα προγραμματιζόμενο συσκευή θερμικής ελεγκτή Mx3000P (Stratagene, La Jolla, CA). Τα ζεύγη εκκινητών σχεδιάστηκαν ώστε να καλύπτουν τουλάχιστον ένα ιντρόνιο, προκειμένου να αποφευχθεί η ενίσχυση του μολυσματικού γονιδιωματικού DNA μαζί με cDNA. αλληλουχία τους και τα αντίστοιχα μεγέθη PCR προϊόντος παρατίθενται στον Πίνακα S1. GAPDH και ACTB γονίδια χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι [16].

Ένα μικρολίτρο cDNA από φυσιολογικά ή TCC δειγμάτων, αντίστοιχα, ενισχύθηκε σε μια αντίδραση PCR με 2χ Brilliant SYBR® Πράσινη QPCR Master Mix (που περιέχει 2.5 mM MgCl

2), 300 ηΜ του κάθε εκκινητή και 30 μΜ Rox παθητική χρωστική αναφοράς σε ένα τελικό όγκο 20 μΙ. Μετά την αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε 40 κύκλους ενίσχυσης περιλαμβάνει μετουσίωση στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, αναδιάταξη στους 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και επιμήκυνση στους 72 ° C για 30 sec. Ενίσχυση και επιμήκυνση βήματα ακολουθήθηκαν από μία ανάλυση καμπύλης τήξης στην οποία η θερμοκρασία αυξήθηκε από 55 ° C έως 95 ° C σε μια γραμμική ταχύτητα 0,2 ° C /sec. συλλογή των δεδομένων πραγματοποιήθηκε κατά τη διάρκεια τόσο ανόπτηση και επέκταση, με δύο μετρήσεις σε κάθε βήμα και σε όλη τη διάρκεια του τήγματος ανάλυση καμπύλης. Για να επαληθεύει τα αποτελέσματα της ανάλυσης καμπύλης τήξης, τα προϊόντα qPCR αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε 2% πηκτή αγαρόζης, χρωματίστηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο και φωτογραφήθηκαν σε ένα υπεριώδες φως transilluminator (Εικόνα S1). Σε κάθε αντίδραση qPCR συμπεριλήφθηκαν δύο αρνητικούς μάρτυρες, ένας χωρίς εκμαγείο cDNA και ένας χωρίς θεραπεία αντίστροφη μεταγραφή. Όλα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία εις διπλούν. τα επίπεδα μεταγραφής γονιδίων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την μέθοδο ΔΔCt, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17], [18].

Σύνολο εκχύλιση πρωτεϊνών και κηλίδα Western ανάλυση

Μετά την προσθήκη 250 μΙ παγωμένου ΟδΤ ρυθμιστικού λύσης Ψάρια (10% γλυκερόλη, 50 mM Tris (ρΗ 7.4), 100 mM NaCl, 1% (ν /ν) Nonidet Ρ-40, 2 mM MgCl

2, και ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Diagnostics GmbH, Γερμανία), τα δείγματα ομογενοποιημένου ιστού φυγοκεντρήθηκαν σε 14,000 xg για 15 λεπτά στους 4 ° C, για να απομακρυνθεί το αδιάλυτο υλικό και το υπερκείμενο συλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C. η συγκέντρωση πρωτεΐνης του κάθε δείγματος προσδιορίσθηκε με τη μέθοδο του Bradford χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο βαφής ποσοτικού προσδιορισμού πρωτεΐνης (Bio-Rad, Hercules, CA). τα δείγματα διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό δείγματος LDS (Invitrogen) και θερμάνθηκε στους 70 ° C για 7 λεπτά. Ίσες ποσότητες των δειγμάτων (20-30 μα) υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε NuPAGE 4-12% Bis-Tris γέλης (Invitrogen) και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης 0.45- μm (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Η μεμβράνη βυθίσθηκε σε 5% άπαχο γάλα ή BSA, 0,1% Tween 20 και διαλύθηκε σε Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα για να εμποδίσει την μη ειδική σύνδεση. Οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: πολυκλωνικά αντι-HRAS (αραιωμένο 1:1,000? Abnova, CA), μονοκλωνικό ποντικού αντι-CDKN2A (αραιωμένο 1:500? Abnova, CA), μονοκλωνικό ποντικού αντι -ρ53 (αραιωμένο 1:500? κλώνος DO-7? BD Transduction Laboratories), μονοκλωνικό ποντικού αντι-VEGFA (αραιωμένο 1:500? Santa Cruz Biotechnology, CA), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-ΤGFβ1 (αραιωμένο 1:1000? Novus Biologicals, CO) και μονοκλωνικά ποντικού αντι-OPN (αραιωμένο 1:500? Santa Cruz Biotechnology, CA). Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν για 90 λεπτά. σε RT με ένα δευτερογενές αντίσωμα που περιελάμβανε υπεροξειδάση αρμορακίας συζευγμένη κατσίκας αντι-κουνελιού ή αντι-ποντικού IgG (αραιωμένο 1:1,500? Santa Cruz Biotechnology). Western blots ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντι

αντίσωμα β-ακτίνης (αραιωμένο 1:5,000? Sigma Chemicals, St. Louis, ΜΟ). Τα ειδικά σήματα απεικονίστηκαν με αντιδραστήριο ECL (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ) μετά έκθεση σε φιλμ ECL. Η σχετική πυκνότητα των πολυπεπτιδίου ζώνες ανιχνεύθηκαν στην ταινία ECL προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το εργαλείο σημείο DENSO του λογισμικού AlphaEaseFC.

GEO συνόλου δεδομένων υπολογιστική ανάλυση

Υπολογιστική ανάλυση διεξήχθη για να διερευνήσει περαιτέρω τις διαφορές στις η OPN, VEGFA, TGFβ1, FGF2, EGFR, EGF, ρ14

ARF, p16

ΙΝΚ4 &, p53, KRAS, HRAS, ΕΡΑ, Araf, BRAF, RAF1, RKIP, ΜΜΡ2, ΜΜΡ9, TIMP1, Timp2 και CyclinD1 επίπεδα μεταγραφής μεταξύ των διαφόρων τύπων ουροδόχου καρκίνου της ουροδόχου κύστης, μεταστατικό αντίστοιχό του και της σχετικής φυσιολογικό ιστό. Τέσσερις διαθέσιμες στο κοινό γονιδιακής έκφρασης Omnibus (GEO) σύνολα δεδομένων αναλύθηκαν για το λόγο αυτό, με αριθμούς προσχώρησης σειρά GEO GSE89, GSE7476, GSE3167 και GSE12630 [19], [20], [21]. πρότυπα έκφρασης των γονιδίων εξήχθησαν από τις κανονικοποιημένες σύνολα δεδομένων και εκφράστηκαν ως μέσος όρος των επιπέδων του ημερολογίου

2 έντασης (Πίνακας S2).

Γονιδιακή οντολογία (GO) και του Κιότο Εγκυκλοπαίδεια γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG ) ανάλυση

Γονιδιακή οντολογία (GO) και του Κιότο Εγκυκλοπαίδεια γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) ανάλυση μοριακού μονοπατιού έγιναν για τον εντοπισμό πιθανών εμπλουτισμός των γονιδίων με συγκεκριμένες βιολογικές θέματα (https://www.genome.jp/kegg /pathway.html).

η στατιστική ανάλυση

δεδομένα μικροσυστοιχιών ομαλοποιήθηκαν από την παγκόσμια μέση τιμή των εντάσεων τόπου. Κάθε γονίδιο ελέγχθηκε για τη σημασία του σε διαφορική έκφραση χρησιμοποιώντας ένα z-test. επίπεδα έκφρασης ΔΑΙ αξιολογήθηκαν για πρώτη φορά από τη δοκιμή ενός δείγματος Kolmogorov-Smirnov Καλοσύνη-of-Fit, προκειμένου να διαπιστωθεί αν ακολουθούσαν ένα κανονικό πρότυπο κατανομής. Η μη παραμετρική Spearman rank συσχέτιση χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί κατά ζεύγη συσχετισμοί μεταξύ των επιπέδων του mRNA και την ένωσή τους με συνεχείς μεταβλητές (ηλικία, κάπνισμα, όγκου στάδιο /βαθμός). Το Mann-Whitney U χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει την κατάσταση έκφρασης των γονιδίων με τα διάφορα κλινικοπαθολογικών παραμέτρων μετά διαστρωμάτωσης. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η συνολική επιβίωση ως συνάρτηση του χρόνου. διαφορές επιβίωσης αξιολογήθηκαν από Log-rank (Mantel Cox) και δοκιμές Gehan-Breslow-Wilcoxon. Οι αριθμητικές τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD), και διάμεσοι. Τα δεδομένα προέρχονται από τις βάσεις δεδομένων GEO ήταν στατιστικώς σε σύγκριση με το Mann-Whitney U. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο επίπεδο του 95% (p & lt? 0,05). Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με SPSS 11.5 (SPSS, Chicago, IL).

Αποτελέσματα

Ανοσοϊστοχημική αποτελέσματα

δείγματα όγκου χρωματίστηκαν με αντισώματα για ErbB2, κυκλίνη D1, ρ53 και Ki-67 (Σχήμα 1). Εάν υπάρχει, αντι-ErbB2 χρώση σε δείγματα όγκων είναι μια χρώση μεμβράνη, διάχυτη στο ουροθήλιο. Όλα τα δείγματα π.Χ. (100%) παρουσίασαν μέτρια /strong (++, +++) ανοσοχρώση, ενώ κανένα δείγμα BC δεν έδειξε /αδύναμο ανοσοχρώση (0, +) για ErbB2. Κατώτατα όρια για υψηλούς δείκτες επισήμανση τέθηκαν για Ki-67 σε ≥10% πυρήνες θετικά όγκου και για την p53 σε 10 και 20%. T1-βαθμού 1/2 όγκων έδειξαν ασθενή χρώση για αντι-Ki-67 (7,5% και 40%, αντίστοιχα), ενώ Τ1 /2-βαθμού 3 όγκους παρουσίασαν την ισχυρότερη ανοσοχρώση (+++, & gt? 70%). Παρομοίως, T1-βαθμού 1/2 όγκων έδειξαν ασθενή χρώση για αντι-ρ53 (10% και 35%, αντίστοιχα), ενώ Τ1 /2-βαθμού 3 όγκους παρουσίασαν την ισχυρότερη ανοσοχρώση (53-70%). Αναφορικά με κυκλίνη D1, όλοι οι όγκοι εμφάνισαν έντονη χρώση για αντί-Κυκλίνη D1, ενώ εκείνες ενός υψηλότερου βαθμού παρουσίασαν συγκριτικά χαμηλότερο ανοσοχρώση. Για T1-βαθμού 1/2 όγκους, χρώση για αντί-Κυκλίνη D1 ήταν 80%? ενώ για T1 /2-βαθμού 3 όγκους ανοσοχρώση ήταν 50%.

Οι όγκοι υπέστησαν χρώση με αντι-cerbB2, αντι-Κί67, αντι-ρ53 και αντι-κυκλίνη D1. H & amp?. Ε, Εκπρόσωπος διαφάνειες αιματοξυλίνη-ηωσίνη

Η

έκφρασης μικροσυστοιχιών και ομαδοποίησης σε ένα 22-γονίδιο που

Έχουμε ήδη εντοπιστεί 831 γονίδια που εκφράζονται διαφορικά σε όλα τα δείγματα 10 π.Χ., ταυτοχρόνως. Από αυτούς, 33 γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω και 85 γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω σε όλα τα δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με τα 5 φυσιολογικούς ιστούς, ταυτόχρονα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε αμφίδρομη μέσο-σύνδεση ιεραρχική ομαδοποίηση με Ευκλείδεια απόσταση για ένα 22-γονίδιο σύνολο που περιλάμβανε τα ακόλουθα γονίδια: VEGFA, Araf, BRAF, OPN (SPP1), ΜΜΡ2, KRAS, ΕΡΑ, TGFβ1, ΑΚΤ1 , HRAS, TIMP1, EGF, RKIP (PBP), FGF2, EGFR, RAF1, CDKN2D, TP53, CDKN2A (p14

ARF /p16

ΙΝΚ4 &), ΜΜΡ9 και MKI67, σε 10 δείγματα π.Χ. εναντίον 5 ελέγχων. Μια λεπτομερής άποψη του δενδρογράμματος συμπλέγματος δείγμα εμφανίζεται στο Σχήμα 2Α. Αναλύσαμε το αρχείο καταγραφής

2 μεταμορφωθεί μοτίβο φορές την έκφραση της κυβέρνησης της Ινδίας και κατανεμήθηκε τους όγκους σε 3 κύριες ομάδες ανάλογα με τη διαφορική έκφραση αυτών των γονιδίων 22: Η πρώτη αρχή υποκατάστημα που περιέχονται Τ1-βαθμού 3, Τ2-βαθμού 3, Τ1 βαθμού 2 και Τ3-βαθμού 3 όγκους. Το δεύτερο σκέλος αποτελείται από Τ1-βαθμού 2 και Τ2-βαθμού 3 όγκους. Το τρίτο σκέλος αποτελούνταν όγκων με in situ καρκίνωμα, Τ2-βαθμού 3 (CIS). Το σύνολο των 22 γονιδίων χωρίστηκε σε δύο κύριες ομάδες. Η πρώτη ομάδα αποτελούνταν από γονίδια που ήταν υπερ-εκφράζεται (VEGFA, Araf, BRAF, OPN, ΜΜΡ2, KRAS, ΕΡΑ, TGFβ1, ΑΚΤ1, HRAS και TIMP1) και η δεύτερη συστάδα περιείχε τα γονίδια που ήταν εξίσου ή υπο-εκφράζεται (EGF , RKIP /PBP, FGF2, EGFR, RAF1, CDKN2D, TP53, CDKN2A, ΜΜΡ9 και MKI67) σε TCC εναντίον φυσιολογικό ιστό. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του GOIs σε κάθε ομάδα όγκου εκφράζεται ως αναλογία των κανονικοποιημένων επιπέδων έκφρασης από την ομάδα των όγκων στα μέσα επίπεδα των φυσιολογικών ιστών, η οποία ορίστηκε σε 1,0 (Σχήμα 2Β και Πίνακας S2).

Κάθε γραμμή στο διάγραμμα αντιπροσωπεύει ένα γονίδιο και κάθε στήλη ένα δείγμα όγκου. Ο κορεσμός χρώμα αντιπροσωπεύει διαφορές στην έκφραση των γονιδίων μεταξύ των δειγμάτων του όγκου? κόκκινο δείχνει την έκφραση υψηλότερη από τη μέση (μαύρο), και το πράσινο υποδεικνύει την έκφραση χαμηλότερη από τη μέση. Η ένταση του χρώματος υποδηλώνει βαθμός της γονιδιακής ρύθμισης (Α). Διπλώστε έκφραση του GOIs σε σχέση με την ιστολογία του όγκου, όπως ανιχνεύεται με ανάλυση μικροσυστοιχιών (Β).

Η

Ο φορές έκφρασης (μέση ± SD) της GOIs σε κάθε μία από τις τρεις ομάδες όγκου σε σύγκριση με ο φυσιολογικός ιστός, όπως αποκτήθηκε από την ανάλυση μικροσυστοιχιών μας, απεικονίζεται στο (Σχήμα S2)

Επαλήθευση του mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε σχέση με τα χαρακτηριστικά κλινικοπαθολογοανατομικές

η έκφραση του mRNA των γονιδίων:. VEGFA, Araf, BRAF, OPN (SPP1), ΜΜΡ2, KRAS, ΕΡΑ, TGFβ1, ΑΚΤ1, HRAS, EGF, RKIP (PBP), FGF2, EGFR, RAF1, TP53, CDKN2A (p14

ARF /p16

ΙΝΚ4 &) , ΜΜΡ9 προσδιορίστηκε με qPCR τόσο καρκίνο της ουροδόχου κύστης και του φυσιολογικού ιστού (Πίνακας S3). οικόπεδα Scatter κατασκευάστηκαν για καλύτερη οπτικοποίηση των γονιδίων που ήταν πάνω ρυθμισμένα (& gt? 2 φορές), ρυθμίζεται προς τα κάτω (& lt? 2 φορές) ή εξίσου εκφράζονται (2-πλάσια κατώφλι διαφορά) μεταξύ της BC και των ελέγχων. οικόπεδα ηφαίστειο γραφικά του αρχείου καταγραφής

2 της πτυχής αλλαγή στην έκφραση του κάθε γονιδίου μεταξύ των δειγμάτων π.Χ. εναντίον του p-value του από το t-test, επίσης κατασκευαστεί (Εικόνα 3).

Το μαύρο γραμμή δείχνει φορές αλλαγές 1. Οι ροζ γραμμές δείχνουν το όριο της γονιδιακής έκφρασης πολλαπλή μεταβολή (2-φορές διαφορά). qPCR αποκάλυψε πάνω και κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια σε καρκίνο της ουροδόχου κύστεως. Ολικό RNA από το φυσιολογικό γειτονικό ιστό του καρκίνου και της ουροδόχου κύστης χαρακτηρίστηκαν σε τεχνικά τριπλούν, και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης για κάθε γονίδιο σε δύο τύπους ιστού σχεδιάστηκαν έναντι μεταξύ τους στο Scatter Plot. VEGFA, OPN, p14

ΙΝΚ4 &, ρ6

CDKN2A, ΕΡΑ και TGFβ1 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω, ενώ FGF2 και EGF ήταν κάτω ρυθμίζεται από τουλάχιστον δύο φορές (εκτός των μωβ γραμμές). Τα γονίδια KRAS, ΜΜΡ2, ΑΚΤ1, ρ53, EGFR, ΜΜΡ9 και HRAS παρουσίασαν ίση έκφραση μεταξύ καρκίνου της ουροδόχου κύστης και του φυσιολογικού ιστού (Α). Το Volcano Plot γραφήματα το αρχείο καταγραφής

2 της πτυχής μεταβολή στην έκφραση του κάθε γονιδίου μεταξύ των δειγμάτων BC έναντι p-value του από το t-test. Η μαύρη γραμμή υποδεικνύει φορές αλλαγές 1. Οι ροζ γραμμές δείχνουν το όριο της γονιδιακής έκφρασης πολλαπλή μεταβολή (2-φορές διαφορά). Η μπλε γραμμή δείχνει το κατώφλι για την p-τιμή του t-test (0.01) (Β).

Η

Τα γονίδια OPN, VEGFA, TGFβ1, p16

ΙΝΚ4 &, p53, RKIP και NRAS ήταν σημαντικά υπερ-εκφράζεται σε π.Χ. εναντίον φυσιολογικό ιστό (ρ & lt? 0,001? t-test) (Σχήμα S3A). Οι τιμές έκφρασης μέση mRNA μεταξύ π.Χ. και φυσιολογικού ιστού για κάθε γονίδιο απεικονίζεται στον Πίνακα 2.

Η

Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της p14 γονιδίων

ARF, ΑΚΤ1, HRAS, Araf, BRAF, RAF1 , ΜΜΡ9, EGFR και KRAS, δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ π.Χ. και ιστού ελέγχου (p & gt? 0,01? t-test). Οι τιμές έκφρασης μέσες mRNA μεταξύ BC και φυσιολογικού ιστού για κάθε γονίδιο, είχαν ως εξής: p14

ARF, 0,0325 ± 0,0488 έναντι 0,0100 ± 0,0118 (p = 0,1087)? ΑΚΤ1, 0,0321 ± 0,0230 έναντι 0,0262 ± 0,0174 (p = 0,3632)? HRAS, 0,0015 ± 0,0021 έναντι 0,0015 ± 0,0021 (p = 0,9752)? Araf, 0,9931 ± 0,0047 έναντι 0,9942 ± 0,0040 (p = 0,5201)? BRAF, 0,8933 ± 0,0657 έναντι 0,9053 ± 0,0486 (p = 0,8999)? RAF1, 0,9348 ± 0,0527 έναντι 0,9419 ± 0,0293 (p = 0,6681)? ΜΜΡ9, 0,0014 ± 0,0015 έναντι 0,0023 ± 0,0054 (p = 0,1265)? EGFR, 0,0078 ± 0,0073 έναντι 0,0049 ± 0,0048 (p = 0,0948)? . KRAS, 0,0876 ± 0,0997 έναντι 0,0773 ± 0,0900 (p = 0,4035? Mann-Whitney U test) (Σχήμα S3b)

EGF, FGF2 και ΜΜΡ2 παρουσίασαν σημαντική υπο-έκφραση π.Χ. εναντίον φυσιολογικό ιστό: EGF , 0.00004 ± 0,000047 έναντι 0.000151 ± 0.000235 (p = 0,0017)? FGF2, 0,0003 ± 0,0004 έναντι 0,0023 ± 0,0019 (p & lt? 0.0001)? ΜΜΡ2, 0,0752 ± 0,0858 έναντι 0,1341 ± 0,0834 (p = 0.0007? Mann-Whitney U test) (Σχήμα S3C)

Η έκφραση του mRNA των γονιδίων που επέδειξαν υπερβολική, ίση ή υπο-έκφραση, σύμφωνα με. ανάλυσή μας qPCR ερευνήθηκε επίσης σε σχέση με το στάδιο /βαθμός των όγκων. Όλα τα στατιστικά σημαντικές διαφορές στην έκφραση του κάθε γονιδίου μεταξύ των ομάδων του όγκου Τ2 /Τ3-βαθμού 3, T1-βαθμού 3 και βαθμού T1-2, απεικονίζονται στο Σχήμα 4.

ζεύγη ομάδων ήταν στατιστικά σε σύγκριση με τη χρήση του Mann -Whitney τεστ U. Ράβδοι απεικονίζουν τις διάμεσες τιμές (Α). Scatterplot απεικονίζει τα επίπεδα mRNA των γονιδίων που εκφράζονται εξίσου μεταξύ ουροδόχου καρκίνους της ουροδόχου κύστης διαφόρων σταδίου /βαθμός, και φυσιολογικό ιστό. ζεύγη ομάδων ήταν στατιστικά σε σύγκριση με τη χρήση του Mann-Whitney U. Ράβδοι απεικονίζουν τις διάμεσες τιμές (Β). Scatterplot απεικονίζει τα επίπεδα mRNA των γονιδίων που ήταν υπό-εκφράζεται σε διάφορους καρκίνους ουροδόχου κύστης του διαφορετικό στάδιο /βαθμός, έναντι φυσιολογικό ιστό. ζεύγη Ομάδα συγκρίθηκαν στατιστικώς χρησιμοποιώντας το Mann-Whitney U. Μπαρ απεικονίζουν τις μέσες τιμές (C).

Η

Η έκφραση της OPN (SPP1), TGFβ1, VEGFA, CDKN2A (p14

ARF /p16

ΙΝΚ4 &), HRAS και TP53, ήταν επαλήθευσε επίσης στο πρωτεϊνικό επίπεδο, με πυκνομετρική ανάλυση των κηλίδων Western (Σχήμα 5). Οι κανονικοποιημένες επίπεδα πρωτεΐνης στα π.Χ. εναντίον φυσιολογικό ιστό ήταν ως ακολούθως: ΟΡΝ, 0,645 ± 0,287 έναντι 0,261 ± 0,020 (ρ = 0,0286)? TGFβ1, 0,837 ± 0,114 έναντι 0,300 ± 0,195 (ρ = 0,0286)? VEGFA, 0,678 ± 0,183 έναντι 0,295 ± 0,133 (ρ = 0,05)? CDKN2A, 0.687 ± 0.157 έναντι 0.429 ± 0.088 (p = 0,0286)? HRAS, 0,663 ± 0,258 έναντι 0,420 ± 0,121 (p = 0,1143)? p53, 0.760 ± 0.167 έναντι 0.448 ± 0,295 (p = 0,2000? Mann-Whitney τεστ U)..

β-ακτίνης (43 kDa) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης

Η

Συσχέτιση μεταξύ mRNA /πρωτεΐνης έκφραση του GOIs και τα ποσοστά επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Ένα σύνολο 30 ουροδόχου κύστης περιπτώσεων καρκίνου διερευνήθηκαν για τα συνολικά ποσοστά επιβίωσης. Οι ασθενείς με όγκους σταδίου 1 παρουσιάζεται καλύτερη συνολική επιβίωση σε σύγκριση με εκείνους της, χ

2 = 14.32, Log-rank (Mantel Cox) δοκιμή 3 [σ στάδιο 2 ή = 0,0008? p = 0,0041, χ

2 = 8,260, δοκιμή Gehan-Breslow-Wilcoxon]. Επιπλέον, οι ασθενείς με βαθμού 2 όγκους παρουσίασαν καλύτερη συνολική επιβίωση έναντι εκείνων του βαθμού 3 όγκων [p = 0,0475, χ

2 = 6.094, Log-rank (Mantel Cox) δοκιμή].

Το μεσαίο τιμή για έκφραση mRNA ΜΜΡ2 στα δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης ήταν 0.038. Οι περιπτώσεις χωρίστηκαν σε δύο ομάδες με την έκφραση πάνω και κάτω από αυτή τη μέση τιμή. Ομοίως, χωρίσαμε τις υποθέσεις σε ομάδες με βάση τις μέσες τιμές για ΜΜΡ9 (0,0007), OPN (0.031), VEGFA (0.141), TGFβ1 (0,0001), FGF2 (0.0002), Ρ14

ARF (0.011), p16

ΙΝΚ4 & (0.013), p53 (0.013), ΑΚΤ1 (0.025), EGFR (0.005), EGF (0,00002), HRAS (0.0011), KRAS (0.051), οι ΕΡΑ (0.024), Araf (0.994), BRAF (0.916 ), RAF1 (0,956), RKIP (0,764) mRNA έκφραση (Πίνακας 2)

Οι περιπτώσεις των οποίων οι όγκοι εμφάνισαν χαμηλά επίπεδα VEGFA (& lt?. διάμεση τιμή, 0.141) και EGFR (& lt? διάμεση τιμή, 0,0051 ) mRNA έκφραση παρουσίασαν χειρότερη συνολικά ποσοστά επιβίωσης από τις περιπτώσεις που εκφράζουν αυξημένη VEGFA (& gt? μέση τιμή, 0.141) και EGFR (& gt? διάμεση τιμή, 0,0051) επίπεδα mRNA, αντίστοιχα [για VEGFA, p = 0,04? για EGFR, ρ = 0,02? Log-rank (Mantel Cox) Δοκιμή]. Οι ασθενείς με υψηλό TGFβ1, FGF2, p14

ARF, ΑΚΤ1, RKIP, KRAS και mRNA p53 επίπεδα έδειξαν επίσης μια καλύτερη μοτίβο συνολική επιβίωση, ωστόσο η συσχέτιση δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Οι Kaplan-Meier για όλες τις GOIs απεικονίζεται στο Σχήμα 6.

Οι περιπτώσεις των οποίων οι όγκοι εμφάνισαν χαμηλά επίπεδα VEGFA (& lt? μέση τιμή, 0.141) και EGFR (& lt? διάμεση τιμή, 0,0051) έκφραση του mRNA, παρουσίασαν χειρότερη συνολικά ποσοστά επιβίωσης, από τις περιπτώσεις που εκφράζουν αυξημένη VEGFA (& gt? μέση τιμή, 0.141) και EGFR (& gt? διάμεση τιμή, 0,0051) επίπεδα mRNA [για VEGFA, p = 0,04? για EGFR, ρ = 0,02? Log-rank (Mantel Cox) Δοκιμή]. Διαφορές στην επιβίωση αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία log-rank (Mantel Cox). Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο επίπεδο του 95% (p & lt? 0,05)

Η

σύγκριση GEO Σύνολα

Εμείς περαιτέρω σε σύγκριση με τα αποτελέσματα qPCR μας 4 διαθέσιμα στο κοινό π.Χ. σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών GEO:. GSE89 με Dyrskjot et al. (2003) [19]? GSE7476 από Μένχουαλ et al. (2009) [21]? GSE3167 από Dyrskjot et al. (2004) [20] και GSE12630 από Monzon et al. (2009) [22]. Σημαίνουν όλα αυτά log είναι

2 μεταμορφωθεί αναλογίες των δειγμάτων π.Χ. εναντίον των ελέγχων απεικονίζονται στον Πίνακα S2.

Σύνολο δεδομένων GSE12630 περιέχονται δεδομένα μόνο από καρκίνωμα του μεταβατικού επιθηλίου της ουροδόχου κύστης και των ουροφόρων μεταστατικό καρκίνωμα. Δεδομένου ότι δεν υπάρχουν στοιχεία από το φυσιολογικό ιστό ήταν διαθέσιμα για αυτό το σύνολο δεδομένων, εξάγαμε κανονική δεδομένων ιστού από το σύνολο δεδομένων GSE89, και υπολογίζεται ο μέσος όρος log

2 μεταμορφωθεί αναλογίες π.Χ. εναντίον αυτών εξάγονται δεδομένα, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (Πίνακας S2) .

συσχέτιση ανάλυση

Εμείς διερευνηθεί η συσχέτιση των επιπέδων mRNA του GOIs π.Χ., καθώς και σε φυσιολογικό ιστό, την εκτέλεση της δοκιμής κατάταξης Spearman (Πίνακας S4).