Αφηρημένο

Ταυτοποίηση των προφίλ γονιδιακής έκφρασης των καρκινικών βλαστικών κυττάρων μπορεί να έχει σημαντικές επιπτώσεις στην κατανόηση της βιολογίας του όγκου και για το σχεδιασμό νέων θεραπειών που στοχεύουν αυτά τα κύτταρα. Εδώ αναφέρουμε ένα δυναμικό προφίλ της γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων του καρκίνου των ωοθηκών προέρχονται από απομονωμένες πλευρά πληθυσμό του φρέσκου ασκίτη που λαμβάνονται από γυναίκες με προχωρημένο στάδιο θηλώδη ορώδες αδενοκαρκίνωμα ωοθηκών υψηλής ποιότητας. Affymetrix U133 Plus 2.0 μικροσυστοιχίες χρησιμοποιήθηκαν για να ανακρίνει τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια μεταξύ των πλευρικών πληθυσμού (SP) και κύριος πληθυσμός (ΜΡ), και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με t-test χρησιμοποιώντας BRB-ArrayTools. Εντοπίσαμε 138 έως ρυθμιζόμενα και 302 κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ όλων των 10 SP /ζεύγη MP. δεδομένων των μικροσυστοιχιών επικυρώθηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR and17 /19 (89,5%) των γονιδίων έδειξε ισχυρή συσχέτιση μεταξύ των μικροσυστοιχιών και τα δεδομένα έκφρασης qRT-PCR. Η ανάλυση Pathway Studio εντοπίστηκαν πολλά γονίδια που εμπλέκονται στην κυτταρική επιβίωση, διαφοροποίηση, πολλαπλασιασμό και την απόπτωση που είναι μοναδικές για τα κύτταρα SP και έναν μηχανισμό για την ενεργοποίηση της σηματοδότησης Notch ταυτοποιείται. Για την επικύρωση αυτών των ευρημάτων, έχουμε εντοπίσει και να απομονωθούν κύτταρα SP εμπλουτισμένα για καρκίνο βλαστικών κυττάρων από ανθρώπινα κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών. Οι πληθυσμοί SP είχαν μια υψηλότερη απόδοση σχηματισμού αποικιών σε σύγκριση με το MP ομόλογό του και, επίσης, ικανή για βιώσιμη ανάπτυξη και διαφοροποίηση στο SP και βουλευτής φαινοτύπων. 50000 SP κύτταρα παρήγαγαν όγκου σε γυμνούς ποντικούς, ενώ τον ίδιο αριθμό κυττάρων MP απέτυχε να δώσει οποιαδήποτε όγκου σε 8 εβδομάδες μετά την ένεση. Τα κύτταρα SP κατέδειξαν εξαρτώμενη από την δόση ευαισθησία σε ειδικούς γ-σεκρετάσης αναστολείς εμπλέκουν τον ρόλο του μονοπατιού σηματοδότησης Notch στην κυτταρική επιβίωση SP. Περαιτέρω η παραγόμενη λίστα γονίδιο SP βρέθηκε να εμπλουτιστεί σε επαναλαμβανόμενες όγκους του καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Vathipadiekal V, Saxena D, Mok SC, Hauschka PV, Ozbun L, Birrer MJ (2012) Αναγνώριση ενός πιθανού ωοθηκών καρκινικά βλαστικά κυτταρική έκφραση γονιδίων Προφίλ από προχωρημένο στάδιο θηλώδες υδαρής καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 7 (1): e29079. doi: 10.1371 /journal.pone.0029079

Επιμέλεια: Xin-γιουάν Guan, Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 5 Ιουλίου 2011? Αποδεκτές: 21 του Νοέμ 2011? Δημοσιεύθηκε: 17 Ιανουαρίου 2012

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τις επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (5R01CA142832-02 216288 2009A051746, 1RC4CA156551-01 217.168 2010A053125 και εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα του Εθνικού Ινστιτούτου για τον Καρκίνο) για να MJB. PVH και DS υποστηρίζονταν από επιχορηγήσεις από τον CDMRP-DOD (W81XWH-06-1-0422 και W81XWH-09-1-0292), Susan G. Komen για τη θεραπεία (BCTR 0600935), και η Ορθοπαιδική Ιδρύματος Χειρουργικής, Νοσοκομείο Παίδων Βοστώνη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών είναι η πέμπτη αιτία. θανάτου στις γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες. Το 2010, θα υπάρχουν περίπου 21.880 νέες περιπτώσεις και 13.850 θάνατοι από ωοθηκών Caner στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Αν και το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι κύτταρα SP διαδήλωναν διαφορετικά γονίδια που συνδέονται με ένα ενεργό αντι μηχανισμό της απόπτωσης (Εικόνα 2Β)

(Α) ανάλυση Gene οντολογία των δεδομένων των μικροσυστοιχιών (Ρ τιμή & lt? 0,01):. Το διάγραμμα πίτας δείχνει τις βιολογικές λειτουργίες του διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ SP και βουλευτής κύτταρα. Το γονίδιο υπογραφή εμπλουτίστηκε για τα γονίδια σε γονιδιακή οντολογία βιολογικές διεργασίες απόπτωσης, κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τη μεταφορά, μεταγωγή σήματος, μεταγραφή, μετάφραση, τροποποίηση πρωτεϊνών, του μεταβολισμού και πρωτεόλυση. Άλλες αντιπροσωπεύει γονίδια που εμπλέκονται στην αντίδραση της άμυνας, αγγειογένεση, στην πήξη του αίματος, οπτική αντίληψη, οντογένεση, πρόσφυση κυτταρικής μήτρας, και την έναρξη της αρχέγονης αύξησης των ωοθυλακίων. (Β) Γραφική αναπαράσταση των παράγωγων λογοτεχνίας γεγονότα σχετικά με τις βιολογικές οδούς που εμπλέκονται στα κύτταρα SP. Pathway Studio 6.0 λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των ενεργοποιημένων οδών σε κύτταρα SP. Στερεά σύμβολα που αντιπροσωπεύουν τα γονίδια (EGFR, TNFRSF6, BCL2L11, FOXO3a, RUNX1), όπως προβλέπεται ρυθμίζεται στα κύτταρα SP, τα ανοικτά σύμβολα αντιπροσωπεύουν τις ρυθμίζεται προς τα πάνω γονίδια (EphB4, ΕΡΗΒ2, PAWR, ΑΚΤ1) και γκρι σύμβολα είναι τα γονίδια των οποίων η έκφραση δεν άλλαξε σημαντικά μεταξύ SP και κύτταρα MP. (Γ) Το Notch μονοπάτι σηματοδότησης: Το σχήμα δείχνει το σχηματικό των στοιχείων μεταγωγής σήματος της Notch. Οι υπερεκφράζεται πρωτεΐνες στα κύτταρα SP (FPTG, ST3GAL6 και ADAM19) εμφανίζεται σε μπλε χρώμα. Μετα-μεταφραστική τροποποίηση του προδρόμου Notch-πρωτεΐνη περιλαμβάνει διάσπαση από πρωτεάσες και γλυκοζυλιώσεις στην trans-Golgi. Η προσκόλληση του Notch εξωκυτταρικό τομέα (ECN) με Notch ενδοκυτταρική περιοχή (ICN) οδηγεί σε ώριμα ετεροδιμερή Notch και μεταφέρονται στην κυτταρική μεμβράνη. αλληλεπίδραση υποδοχέα με τους συνδέτες της οικογένειας DSL (Delta, Serrate, Lag3) σε γειτονικά κύτταρα ρυθμίζεται από γλυκοσυλιώσεις της ΕΔΑ. Η επιτυχής αλληλεπίδραση του εξωκυτταρικές περιοχές συνδέτη με δίκην EGF επαναλήψεις του ECN οδηγούν στα πρωτεολυτικές διασπάσεις του Notch διαμεμβρανική περιοχή με δύο διαδοχικά στάδια από πρωτεάσες ADAM και προσενιλίνες με δραστικότητα γ-σεκρετάσης. Η απελευθερωμένη Notch ενδοκυτταρική περιοχή μετατοπίζεται με την νουκλεάση όπου αλληλεπιδρά με CSL1, αντικαθιστώντας καταστολείς CSL και σχηματίζει ένα σύμπλοκο μεταγραφής με Εγκέφαλος-παρόμοιους παράγοντες και μεταγραφικές συνενεργοποιητές. Αυτό μεταγραφικό σύμπλοκο ενεργοποιεί καθοδικά γονίδια στόχοι και μπορεί να ευθύνεται για την επιβίωση των κυττάρων του καρκίνου του βλαστού, αυτο-ανανέωση και συντήρηση του όγκου σε ωοθήκη.

Η

Έχουμε εντοπίσει αρκετά γονίδια που μπορεί να προσδίδουν χαρακτηριστικά βλαστική ικανότητα προς κύτταρα SP ωοθηκών. Λόγω της ετερογένειας του κυτταρικού πληθυσμού στο SP, αναμένουμε ότι η σαφής οδοί μπορεί να μην είναι προφανώς υπάρχουν. ADAM19, FPGT και ST3GAL6 βρέθηκαν να είναι πάνω από εκφράζεται σε κύτταρα SP και μπορεί να είναι εν δυνάμει γονίδια του καρκίνου βλαστικών κυττάρων όπως σχετίζονται. Με βάση το προφίλ έκφρασης των FPGT, ST3GAL6 και ADAM19 στη λίστα υπογραφή γονίδιο SP, προτείνουμε ένα πιθανό μηχανισμό, που μπορεί να είναι ενεργή στα SP κύτταρα που ευθύνεται για την επιβίωση SP κυττάρων, διαφοροποίηση και διατήρηση του όγκου σε ωοθήκη (Σχήμα 2C). Το σχήμα δείχνει την εμπλοκή των τριών ενζύμων στην ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης Notch. FPTG ενεργοποιεί τη σύνθεση του ΑΕΠ-φουκόζη και η οποία ενσωματώθηκε με τους υποδοχείς Notch από τρανσφεράσες φουκοσυλ. Το ένζυμο ST3GAL6 μπορεί να ενεργοποιήσει την προσθήκη τερματικό υπόλειμμα σιαλικού οξέος, την προώθηση των πρωτεολυτικές διασπάσεις του Notch διαμεμβρανική περιοχή στο εξωτερικό του κυττάρου καταλύθηκε με ADAM19.

Προσδιορισμός των πλευρικών πληθυσμού (SP) κύτταρα από καρκίνο των ωοθηκών κύτταρο γραμμές

Εντοπίσαμε κύτταρα SP από τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών χρησιμοποιώντας ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του αποκλεισμού της βαφής σύνδεσης DNA, Hoechst33342. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε βεραπαμίλη, η οποία εμποδίζει τη δράση των πρωτεϊνών μεταφορέων ναρκωτικών, εμποδίζοντάς τους να effluxing τη βαφή. Το Σχήμα 3Α δείχνει την φθορίζουσα ενεργοποιούμενη διαλογή προφίλ κύτταρο SKOV3 και A224 κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών. Τα περίφραξη κύτταρα SP που περιγράφονται και παρουσιάζονται ως το ποσοστό του συνολικού πληθυσμού των κυττάρων. Το SP αποκόπτεται όταν βεραπαμίλη συμπεριλαμβάνεται στην επώαση Hoechst. Διαπιστώσαμε κύτταρα SP στις τέσσερις καρκινικές κυτταρικές σειρές που αξιολογήθηκαν, SKOV3 (1,54%), A224 (1,02%), OVCAR-3 (0,08%), και UCI-107 (0,12%). Περαιτέρω για να ελέγχουν τη γνησιότητα των κυττάρων πλευράς πληθυσμού απομονωθεί, qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε τυχαία επιλεγμένα γονίδια από τη λίστα γονίδιο ασθενή SP (ADAM19, FPGT, ST3GAL6, LLGL1 και ΤΚ2). Όλα τα γονίδια ήταν καλά πιστοποιηθεί σε SP κύτταρα που απομονώνονται από SKOV3 υποστηρίζουν τον εμπλουτισμό του καρκίνου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν σε απομονωμένα κύτταρα του πλευρά πληθυσμών (Σχήμα 3Β). Η υπερβολική έκφραση ADAM 19 και FPGT στα κύτταρα SP επικυρώθηκαν σε επίπεδο πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας ανοσοφθορισμού και δυτικές μεθόδους αποτύπωση αντίστοιχα (Σχήμα S4). Για να επικυρώσετε τα γονίδια Notch μονοπατιού που προσδιορίζονται με τη χρήση της οδού στούντιο, αξιολογήσαμε τα γονίδια-στόχους Notch χρησιμοποιώντας qRT-PCR στους πληθυσμούς SP και βουλευτής. Μια σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων στόχων Notch συμπεριλαμβανομένων των

HES1

και

Notch1

ανιχνεύθηκε σε πληθυσμό SP σε σύγκριση με το MP ομόλογό (Σχήμα S5).

(Α) Προσδιορισμός της SP κύτταρα σε καθιερωμένες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών. SKOV3 και κυτταρικές σειρές A224 σημάνθηκαν με χρωστική Hoechst 33342 και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα SP, το οποίο εξαφανίστηκε παρουσία Βεραπαμίλη (αναστολέας μεταφορέα πολυφαρμάκου), σκιαγραφούνται και φαίνονται ως το ποσοστό του συνολικού πληθυσμού των κυττάρων. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για τρεις ανεξάρτητες μετρήσεις. (Β) Επικύρωση τυχαία επιλεγμένων γονιδίων από τη λίστα γονίδιο SP στην SP και τα κύτταρα ΜΡ απομονώθηκαν από τις κυτταρικές σειρές SKOV3. (C, D) σχηματισμού αποικίας δοκιμασία απόδοσης: Αποικία αποδοτικότητα των ταξινομημένων SP και κυττάρων MP από SKOV3 και κυτταρικές σειρές A224 σχηματισμού. Για την ανάλυση του σχηματισμού αποικίας απόδοσης (CFE), SP και ΜΡ κύτταρα ταξινομήθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε ίσους αριθμούς σε καλλιέργεια έξι φρεατίων ιστού και αναπτύχθηκαν για 14 ημέρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες διάλυμα για να μετρήσει τον αριθμό των αποικιών με μικροσκοπία. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. (Ε, F) Αριθμός Πέρασμα: σχηματισμού αποικιών αποδοτικότητα των ταξινομημένο SP και κυττάρων MP από SKOV3 και κυτταρικές σειρές A224 αξιολογήθηκαν ως συνάρτηση του αριθμού διόδου. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες.

Η

Βιολογικά επικύρωση των κυττάρων SP απομονώνονται από κυτταρικές σειρές

Η αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικίας (CFE) του SP και κυττάρων MP απομονωμένος από SKOV3 και κυτταρικές σειρές A224 αξιολογήθηκαν. κύτταρα SKOV3 MP είχαν CFE 13,0 ± 2,0% σε σύγκριση με ένα CFE 27 ± 1,0% για τα κύτταρα SP (

Ρ = 0.0077

) (Σχήμα 3C). κύτταρα A224 MP έδειξαν CFE 3,0 ± 1,0% σε σύγκριση με ένα CFE από 9,0 ± 1,0% για τα κύτταρα SP (

Ρ = 0.0043

) (Σχήμα 3D). Οι μη-χρωματισμένα αποικίες του SP και ΜΡ κύτταρα SKOV3 από αυτές τις πλάκες θρυψινοποιήθηκαν και τα κύτταρα και πάλι τοποθετήθηκαν σε μια πλάκα καλλιέργειας έξι φρεατίων σε 100 κύτταρα ανά φρεάτιο και αναπτύχθηκαν για άλλες 14 ημέρες και η CFE εκτιμήθηκε. κύτταρα SKOV3 MP είχαν CFE 8,0 ± 1,5% σε σύγκριση με ένα CFE από 44,0 ± 4,0% για τα κύτταρα SP. Το αρχικό 2-πλάσια διαφορά στην CFE μεταξύ MP και SP των SKOV3 βρέθηκε να αυξηθεί σε 5-φορές μετά την πρώτη δίοδο (

P & lt? 0.001

) (Σχήμα 3Ε). Μια παρόμοια τάση παρατηρήθηκε για τα κύτταρα A224 SP (Σχήμα 3F). Η αύξηση του CFE ως συνάρτηση της διόδου υποδεικνύει τον εμπλουτισμό των καρκινικών κυττάρων stem-σαν παρούσα στο SP κλάσμα SKOV3 και A224, και την ικανότητά της για συνεχή επέκταση.

Για να εκτιμηθεί η αγκύρωση ανεξάρτητη ανάπτυξη του SP και κύτταρα MP από κάθε κυτταρική γραμμές, η ικανότητά του να σχηματίσει αποικίες σε μαλακό άγαρ αξιολογήθηκαν. Τα κύτταρα A224 SP διαμορφώνεται περίπου 90 αποικίες /5000 κύτταρα ανά πιάτο, ενώ τα κύτταρα A224 MP σχηματίζεται ένα ζευγάρι από μόνο αποικίες (

P & lt? 0.001

) αποδίδοντας μια αποτελεσματικότητα επένδυση 1,8% στα κύτταρα SP. Σε περίπτωση κυττάρων SKOV3, η βελτίωση της αποτελεσματικότητας επιμετάλλωση ήταν 4.8% και 1.6% για την SP και τα κύτταρα ΜΡ αντιστοίχως (Σχήμα 4Α, Β).

(Α, Β) Anchorage ανεξάρτητη ανάπτυξη της ταξινομημένο SP και ΜΡ κύτταρα από SKOV3 και κυττάρων A224 γραμμές. (C, D) ανάλυση ενός κυττάρου σε πλάκες 96: Ενιαία κύτταρα A224 και κυττάρων SKOV3 SP και ΜΡ καλλιεργήθηκαν σε μεμονωμένα φρεάτια. Τα μονά κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 14 ημέρες και η αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικιών εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας χρώση κρυσταλλικού ιώδους. (Ε)

In vivo

την ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων SKOV3 SP και βουλευτής σε θηλυκούς αθυμικούς γυμνούς ποντικούς.

Η

Για να εξακριβωθεί μόνο αποδόσεις κλωνοποίηση κυττάρων του SP και κυττάρων MP, καλλιέργειες και μόνο κύτταρο A224 και κύτταρα SKOV3 SP και ΜΡ παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας FACS σε πλάκες 96 φρεατίων. Οι πλάκες αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 14 ημέρες και η αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικιών εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο χρώσης με κρυσταλλικό ιώδες. κύτταρα A224 MP είχαν CFE 3,0 ± 1,5% σε σύγκριση με ένα CFE των 17 ± 1,0% για τα κύτταρα A224 SP (

P = 0,005

), ενώ τα κύτταρα SKOV3 MP είχαν CFE 2,0% σε σύγκριση με ένα CFE του 6,0 ± 1,0% για τα κύτταρα SKOV3 SP (Σχήμα 3C, D). Επιπλέον, οι αποικίες που παράγονται από κύτταρα SP αναπτύχθηκαν σε περισσότερο από το 80% του κάθε φρεάτιο ενώ οι αποικίες που σχηματίζονται από τα κλάσματα ΜΡ καταδείχθηκαν περιορισμένη ανάπτυξη στα φρεάτια (Σχήμα S6).

Για να αξιολογηθεί η

in vivo

ογκογόνο δυναμικό των SP και κυττάρων MP από SKOV3, 5 × 10

4 κύτταρα σε 100 μL PBS εγχύθηκαν υποδορίως στην ραχιαία περιοχή των γυμνών ποντικών. Η ανάπτυξη του όγκου παρατηρήθηκε σε τρεις από τρία ζώα στις 8 εβδομάδες μετά την ένεση σε κύτταρα SP, ενώ τα ζώα εγχύθηκαν με ίσο αριθμό κυττάρων MP δεν είχαν ανιχνεύσιμους όγκους την εποχή εκείνη (Σχήμα 4Ε).